Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Medicine

Yaşlı Sıçanlarda Ortak Karotis Arter Tıkanıklığı ile Kalıcı Distal Orta Serebral Sahne Kortikal İskemi Sürekli Engelli Eğitim için

*1,2, *1,2, 3, 1, 4, 4,5,6, 7, 2, 1

1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, University of London, 2Department of Neuroimaging, James Black Centre, Institute of Psychiatry, King's College London, University of London, 3Institute of Neuroscience and Psychology, Wellcome Surgical Institute, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, 4Research Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 5Neurology Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 6Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Neuroscience Research Institute, Loyola University Chicago, 7Department of Oncology, The Gray Institute for Radiation, Oncology and Biology, University of Oxford

* These authors contributed equally
Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    Burada büyük kortikal infarkt ve sürekli açıklarını oluşturmak için karotis arter eşzamanlı tıkanıklığı olan yaşlı dişi farelerde kalıcı distal orta serebral arter oklüzyonu üretmek için bir protokol mevcut. Biz 24 saat ve inme sonrası 8 hafta yapısal MRI kullanarak lezyon büyüklüğü teyidini göstermektedir.

    Date Published: 2/23/2016, Issue 108; doi: 10.3791/53106

    Cite this Article

    Wayman, C., Duricki, D. A., Roy, L. A., Haenzi, B., Tsai, S. Y., Kartje, G., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. J. Vis. Exp. (108), e53106, doi:10.3791/53106 (2016).

    Abstract

    İnme, tipik olarak karotid (veya başka bir arteryel), ateroskleroz, yüksek tansiyon, obezite ve diyabet gibi eşlik eden bir dizi yaşlı kişilerde ortaya çıkar. Hayvanlarda inme tedavileri değerlendirirken Buna göre, mükemmel yüz geçerliliği olan bir model seçmek önemlidir. İskemik inme, tüm inmelerin% 80'ini ve bunların büyük çoğunluğu genellikle vücudun karşı tarafta kalıcı plegia veya parezi neden sensorimotor korteks etkileyen infarkt uyaran, orta serebral arter (MCA) topraklarında meydana gelir. Biz bu video sürekli sensörimotor sakatlık ve önemli kortikal infarkt neden yaşlı sıçanlarda iskemik inme, üretmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Özel olarak, bu arter kısa bir bölümü kapamak için diatermi forseps kullanılarak, yaşlı dişi farelerde sürekli uzak orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) neden olur. lezyona ipsilateral tarafta karotis arter p daha sonraermanently tıkanmıştır ve kontralateral karotid arter geçici 60 dakika kapatıldı. Biz 24 saat ve inme sonrası 8 hafta yapısal T2 ağırlıklı manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile infarkt boyutunu ölçmek. Bu çalışmada, ortalama enfarkt hacmi 24 saat sonra aynı taraftaki yarıkürenin% 2.0 (standart sapma) ±% 4.5 (Gerriet denklemi kullanarak şişme beyin için düzeltilmiş, s = 5). o patofizyolojik mekanizmalar ve yeni tedavilerin aydınlatılması açısından önemlidir sürekli sensörimotor açıkları uyarılmasını, izin gibi bu modelin mümkün ve klinik olarak önemlidir.

    Introduction

    İnme şu anda dünya çapında üçüncü ölüm en sık nedenidir ve sakatlık 1 önde gelen nedenidir. Tüm inmelerin% 80'ini oluşturur İskemik inme, sık sık etkilenen taraf 2-4 motor fonksiyon ve dikkat duyu kaybı (örneğin, propriyosepsiyon), neden kortekste infarkt sonuçlanır. Orta serebral arter (MCA) Willis çevresinden tedarik çizer ve internal karotis arter 5 kaynaklanıyor gemilerin en büyüğüdür. MCA bu bölgede inme tüm iskemik inme 6,7% 65 için muhasebe ile en yaygın iskemik inme etkilenen beyin damarı vardır. MCA oklüzyonu 7 tam yerini bağlı olarak değişir kortikal ve subkortikal bölgeler ve MCA inme nedeniyle nörolojik anormallikler hem tedarik etmektedir. Proksimal MCA tıkanıklıklar hem corti kapsayan geniş infarkt lenticulostriatal arterler ile derin toprakları etkiler ve nedencal ve subkortikal bölgeler. Buna karşılık, kan akımının sadece kortikal bölgeleri mahrum daha uzak tıkanıklıklar küçük kortikal infarktlar üretme eğilimindedir.

    Büyük popülasyon çalışmalarında, insan inme lezyonlar ipsilateral hemisferde 8,9 5-14% aralığında; Malign inme inmelerin% 10'unu ve intrakranial basıncı azaltmak için bir hemikraniektomi gerektiren, büyük infarktlar yol açmaktadır ve daha küçük lezyonları olan hastalar 10 hayatta kalmak için daha olasıdır. Biz birçok insan vuruş olarak yarımkürede benzer bir oranda işgal lezyonlar üreten bir tekrarlanabilir bir model ortaya koymaktadır.

    İnme heterojen bir hastalık olduğu; iskemik inmelerin% 75 (intrakranial küçük damarların tıkanması) ya laküner infarktlar tarafından uyarılmaktadır; kardiyoembolik inme; inmelerin% 30'unu veya büyük arter aterosklerozu. Semptomatik ateroskleroz en sık noktasında ortak c gözleniriç ve dış karotid arter 11 içine arotid arter (CCA) dalları.

    onun fizyopatolojisini simülasyonu ve inme risk faktörleri içermelidir mümkün olduğunca inme klinik öncesi modellerde insan durumuna benzer olmalıdır. Iskemik inme% 92 65 yaş üstü kişilerde ortaya çıkar ve daha önce 12 tartışıldığı gibi diğer risk faktörleri, obezite, yüksek tansiyon ve ateroskleroz yer alır. daha bu risk faktörlerini temsil etmek, doğal durumun patofizyolojik bazı özellikleri paylaşabilir bir model kullanılması tavsiye edilir. Bu protokol, biz karotid arter yoluyla ileri yaş ve tıkalı kan akışını dahil ettik.

    Orta serebral arter tıkanıklığı klasik modeli (MCAO) kan anterior akışı ve orta serebral arterler azaltır proksimal MCA tıkanıklığı, intraluminal filament modelidir. Bu modeli kullanarak kısa tıkanıklığı süreleri l odaklanırsubkortikal bölgeye esion, uzun tıkanma süreleri yaşlı farelerde daha yüksek bir ölüm oranı elde hem kortikal ve subkortikal alanlarda alanları, işe büyük lezyonlar neden olabilir oysa. Buna karşılık, bizim grup tarafından kullanılan model kraniotomi ve bipolar dağlama forseps kullanarak MCA küçük bir kısmının kan ve imha pıhtılaşması ardından dura açılmasını kullanılmasını içermektedir. Bu diatermi modeli Tamura ve ark 1981 kağıt uyarlanmıştır. 23 ve kranyektominin kullanımı intrakranial kapalı kafatasının bir özelliktir basıncı, ve daha yüksek tekrarlanabilirlik sonuçları ve cerrahi kohortta daha düşük ölüm oranına yükseltilmiş sınırlayabilir başka bir model 13 ile karşılaştırıldığında. Tekrarlanabilir infarkt ve sürekli sakatlık üretmek için biz (Chen ve diğ. 14 Biz kullanmak non-invazif T2-ağırlıklı manyetik rezonans görüntüleme başına MRG distal CCA kalıcı proksimal CCA tıkamak ve geçici tıkamak) Kapsamını ve beyin enfarktüsü konumunu ve sensorimotor kortekste şişme beyinde derecesini değerlendirmek için.

    Protocol

    Bu protokol, King College London tarafından belirlenen Kurumsal kurallar tarafından onaylandı ve 1986 Rehberinin Yasası kurumları arasında değişebilir UK Home Office kurallar ve Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) uyarınca gerçekleştirilmiştir; Bu yordamı denemeden önce kurumsal kurallarına bağlılığı emin olun. ekipman dokunurken aseptik teknik korumak için, alüminyum folyo büyük bir parça otoklav ve ekipmanları mikroskop ve anestezi makinede gibi kolları etrafında sarmak için kullanabilirsiniz. Steril sarılmak film (plastik sargı) de kullanılabilir.

    1. Hazırlık

    1. önce inme ameliyattan en az 48 saat süreyle jel sıvı paketleri (veteriner kurtarma jel) ve yumuşak yem ile sıçan alıştırın. hayvanlar sık ​​sık işlemden sonra yeme ve içme ile zorluk bulmak gibi neophobia en aza indirmek için, ameliyat öncesi bu öğelerin hayvanları tanıtmak. ahşap çiğnemek blo ile Ev yaşlı sıçanlarcks büyümüş dişlerin insidansını azaltmak için (Bölüm 6'ya bakınız).
    2. otoklav yoluyla (en az 121 ° C, 15 dakika boyunca 15 PSI) cerrahi işlemler başlamadan önce tüm cerrahi aletler sterilize edin. % 70 etanol içinde% 1 klorheksidin kullanılarak tüm çalışma yüzeyleri sterilize ve cerrahi örtüler kullanmak prosedür süresince aseptik teknik muhafaza.
    3. Tercih pençe yarımküre Kontrlateral Testis lezyonlar neden olur. Lezyon sol veya Montoya merdiven testi 15 (bakınız Şekil 4) 'de ameliyat öncesi taban tarafından belirlenen her sıçan tercih forepaw bağlı sağ hemisfer, ya tahsis. Bu yazıda, bu yordamı açıklayan Kolaylık olması açısından, sol pençe tercih pençe ve ameliyatlar sağ hemisfer üzerinde gerçekleştirilir. hızla öğrenmek gibi bu davranış testleri için Lister Kapşonlu veya Long Evans fareleri kullanın.
      Not: merdiven testi hem ince ve kaba yetenekli m değişiklikleri ölçmek için tasarlanmıştırmotor sistemi hasarı aşağıdaki ovements. Merdiven, merkezi bir platformun her bir yanında adımdan oluşur. merdiven testi için ekipman yoksa, silindir testi test ellilik için uygun bir alternatif, ama orada inme bu modelde bu testin sadece geçici bir açığı olduğunu ve bu nedenle aşağıdaki uzun vadeli iyileşme ölçmek için uygun olacağını unutmayın tedavi.
      1. Her adımın kuyuda üç şeker pelet (yan başına 21 pelet) yerleştirin. 10 dakika boyunca merdiven aygıtında sıçan yerleştirin ve alınan pelet sayısını ve her tarafta yerinden pelet sayısını kaydeder.
        Not: ameliyat sonrası göreve dahil olmak için, fareler başlangıçta% 75 pelet az almanız gerekir.

    2. Cerrahi

    1. 16-18 ay (250 gr 400) dişi yaşlı Lister-Leş sıçan kullanın ve 1.5 L% 5 izofluran ile anestezi neden / Anestezinin sağlanmasının ardından dk O 2. azaltmakizofluran düzeyi ve cerrahi için yeterli ama minimize derinlikte (örneğin, 1.5-2%) olarak onu korumak. Bir yüz maskesi ile hayvana anestezi sunun ve izofluran cerrahın maruz kalma sınırlamak için bir toplama sistemini kullanın.
      1. Bu prosedür davranışsal açıkları 16 üretebilir olarak, sahte hayvanlar üzerinde Kraniotomi dahil kadar tüm işlemleri gerçekleştirmek değil. MCAO deneyleri tasarlarken deneysel hedefleri göz önünde bulundurun ve dahil edilmelidir Kraniotomi kontrol etmek için bir sahte grubu olup olmadığına karar.
    2. ağrı kesici pre- yönetmek veya (Carprieve, 0.25 mg / kg, s. kesme) ameliyat peri-.
      1. steril% 0.9 tuzlu su stok çözelti yapmak ve 300 g sıçan başına 0.6 ml enjekte mi, 19 1 ml ilave edilir. Eski oda sıcaklığında stabil olduğu Carprieve kullanımı karprofen tercih edilir.
    3. Cildi maruz sağ hemisfer ventral boyun bölgesinde ve temporal bölgede kürk tıraş. Cerrahi sitesi U dezenfekteetanol bezlerden şarkı. epilasyon için yerel IACUC yönergeleri izleyin emin olun.
      1. Kesi yerinde kürk miktarını en aza indirmek için uzak çalışma alanından bu adımı gerçekleştirin.
    4. bir ısıtma yastığı sırtüstü pozisyonda steril bir örtü ile kaplı bir Corkboard sıçan yerleştirin. Baş ve boyun traş bölgelere lidokain krem ​​uygulayın. izlemek ve bir eşit sıcaklık sistemi 36,5-37,5 ° C arasında hayvanın sıcaklığı korumak için bir rektal prob yerleştirin.
      1. kurumasını önlemek için gözleri lacrilube merhem koy. sıçan nefes borusu salgıları azaltmak için atropin sülfat çözeltisi enjeksiyon (deri altından 600 ug / ml çözeltisinin 0.05 mi) verin.
        Not: Araştırmacılar, kan gazları ve basınç gibi fizyolojik değişkenlerin ölçüm düşünmelisiniz.
    5. Ameliyat başlamadan önce, arka pençe tutam çekilmesi kontrol ve tam anestezi onaylamak için refleksleri yanıp söner.
    6. Diseksiyon mikro altındakapsamı, bir neşter kullanılarak maruz boyunda 2 cm merkezi orta hat kesi yapmak. her iki tarafta trakea hafifçe yan tükürük bezleri taşıyın.
    7. Bir tarafta ortak karotid arter üzerinde uzanan cilt döngünün emilmeyen ipek dikiş. Yavaşça ipek sütür kullanılarak siteden cilt çekmeye ve karotis arter ortaya çıkarmak için cerrahi bant kullanarak Corkboard bu aşağı sopa. Dikkatle fasya ve ince forseps kullanılarak vagal sinirleri çevreleyen serbest arterler incelemek künt.
      1. Bu yutma ve nefes, beslenme zarar gibi, bu adımı sırasında kas veya vagus sinirleri zarar vermemek için dikkatli olun.
    8. karotis arter ortaya çıktığında, ilk ters ince forseps ile diseksiyon ve sinir ile temas kurmaya özen kalarak vagus sinirinden karotid ayıran, karotis izole etmek emilemeyen ipek sütür (5/0) kullanın. damar dikiş, t döngüye (ancak bağlı olmayan) edildikten sonraBu adım olma çözülmek önlemek için cerrahi bant kullanarak birlikte sütür uçlarını maymun. örten cilt geri tutan dikişlerle çıkarın.
    9. diğer taraf için de tekrarlayın (Bölüm 2,7-2,8)
    10. Ameliyat geri kalanı boyunca nemli dokuları tutmak için yaranın içine steril tuzlu batırılmış gazlı bez yerleştirin. Gevşek deriyi dikiş ve daha fazla su kaybını önlemek için alana ek bir tuzlu batırılmış gazlı bez yerleştirin.
    11. lateral pozisyonda sıçan yerleştirin ve sağ yörüngeye ve dış kulak yolu arasındaki orta noktada deride bir kesi yapmak. Daha sonra Corkboard tutturulmuş beş elastik, 3 mm kanca retraktörleri kadar kullanarak cilt geri çekin ve kafatası ortaya çıkarmak için temporal kas disseke künt.
    12. Bir açık sitenin üstünde başparmak tekerlek düzeltilmiş yerçekimi güdümlü tuzlu damla (akış hızı yaklaşık 2 ml / dak) yerleştirin ve kemik enkaz kaldırmak için ve (cerrahi bu fazı boyunca maruz siteden ufak bir kanama temizlemek için bir aspiratör sistemi kurmak Mezhepiyonları 2,13-2,16).
      1. kulağınıza yakın kafatasının en yüksek noktasında tuzlu teslim meme ve düşük noktada aspiratör memesini yerleştirin. iyi hayvanlar anestezi altında süreyi azaltarak, geminin dağlama herhangi kanamadan kaynağını görselleştirmek için bölgeye daha çok tuzlu tedarik kanamalar sırasında tekerleği ayarlayın.

    Şekil 1
    Şekil kalıcı uzak orta serebral arter tıkanıklığı modelinin 1. Cerrahi ayarlayın. Sağ hemisfer için gösterilen sıçan Kraniotomi için ayarlanmış kullanılan ekipman ve gömme, kraniektomi site çevresinde aspiratör ve tuzlu damla konumlandırma. Ayrıca gösterilen damarların temel özellikleri nelerdir; Orta serebral arter (kırmızı) ve alt serebral damarla (mavi) gösterilir ve arter koagülasyon meydana geldiği gölgeli alan işaret eder.Oklüzyon Onay alt serebral ven altında MCA keserek gerçekleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    1. maruz alana sondaj ederken sirküleri ve yanal basınç ve aşağı doğru basınç uygulamasını sağlamak, bir kaba 1,6 mm elmas kaplı matkap çapak yaklaşık 8.000 rpm ile diş matkap kullanarak maruz bölge üzerinde bir kraniotomi gerçekleştirmek (yaklaşık 5 mm x 5 mm) . Kemik tamamen şeffaf görünüyor yeterince ince olduğunda, forseps kullanarak çıkarın.
    2. onlar narin ve yırtılması kolay olduğu gibi dikkatle, geniş yüzey kan damarları önlemek için dikkatli olmak, dura açmak için, yaklaşık 180 ° yay şeklinde ince forseps bir ucu bükme tarafından yapılan ev yapımı dura kanca kullanın.
      Not: Beynin açıkta kalan alanı orta serebral arter (MCA) ortaya çıkaracaktır; istenilen bölümönlemler uzunluğu yaklaşık olarak 2 mm (bakınız Şekil 1, ek).
    3. Alt beyin damar haçlar yerden, arter çatallanma noktasına ve sonra tam tıkalı, 17 kadar diatermi forseps bir çift kullanarak MCA kaudal dalları boyunca MCA coagulate. 0,25 mm sivri uçları ile açılı Kuyumcu diatermi forseps kullanabilir.
      1. arter tıkanmasıyla zaman tuzlu kan damarı yapışmasını pıhtılaştırma forseps önlenmesi, serin bu alanda tutmak için gerekli akış değiştirmek. tıkalı olduğunda, kan damarı siyah görünür ve kan akışının hiçbir iz mevcut olmalıdır; kan akışı, kısmen tıkanmış damarların görülebilir.
      2. tam oklüzyon onaylamak için bu noktada MCA kesti. alt serebral ven MCA kesiştiği yere altında kesilmiş mikrovasküler makas, kullanma.
      3. Bir sonraki adıma geçmeden önce bir tuzlu batırılmış gazlı bezle maruz alanı kapsayacak.
    4. sırtüstü Tam kilitli geri sıçan çevirinyon karotis arterler yeniden ortaya çıkarmak için boyun gevşek bağlanmış dikiş yeniden ve. kalıcı geçici 60 için 125 g basıncı ile 13 mm paslanmaz çelik arter klibi kullanılarak tıkanır sol karotis iken, karotis etrafında ipek sütür bir düğüm atılarak tıkalı MCA (sağda) ile aynı tarafta karotis arter Arter min. Gevşekçe bu süre içinde boyun kesi kadar dikiş ve su kaybını önlemek için üstüne bir steril tuzlu batırılmış gazlı bez yerleştirin.
    1. Hayvanın sağ taraf sırtüstü konumlandırma verilen, cerrahın sol tarafta olacak unutmayın.
    2. sahte hayvanlar için, boyun ve temporal bölgelerin ventral bölümünü açın ve karotis arterler bulmak için kasları ayrı, fakat tıkamaz yok. Sahte hayvanlar kadar prosedürleri geçmesi ancak bu prosedür davranışsal açıkları 16 üretebilir olarak değil, kraniotomiye dahil var. Diğer t körleşmesini korumak için(daha sonra davranış testleri sırasında, örneğin) EAM üyeleri, kesi ve dikiş atmayı gerçekleştirin.

    şekil 2
    Şekil orta serebral arter tıkanıklığı sonrası 2. Tandem karotis tıkanıklığı. Sağ karotis arter (CCA) kalıcı (resmin sol tarafında) kan damarı etrafında bir ipek sütür (5/0) bağlanması ile tıkanır. (Sağ tarafta) sol CCA mikrovasküler kelepçe kullanarak 1 saat tıkanır. Bu ameliyatlar her iki tarafında (beyaz) üzerine vagus siniri ile temas kurmaya özen yapıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    1. sol karotis oklüzyonu 1 saat boyunca temporal bölgede kesi dikin.
    2. sıçanlar hidrasyon korumak için tuzlu su deri altından 20 ml (her bir kanat üzerinde iki bölge 5 mL) içerisinde ezilerek (bkz6.2).
    3. 60 dakika geçtikten sonra, klibi kaldırın. çevredeki kas topikal tuzlu uygulayın ve emilebilir dikişlerle (4/0) subkutan sürekli dikiş kullanarak boyun kesi kapatın.

    3. Mesaj Operatif Bakım

    1. en fazla 4 saat boyunca anestezi kurtarmak için, 31 ° C kuluçka makinesi içinde sıçan yerleştirin.
      Not: Araştırmacılar, yerel uygulamalara göre diğer sıcaklıkları ve süreleri kullanmayı tercih edebilirsiniz.
    2. 24 saat sonra ağrının giderilmesi için tekrarlayın carprieve (0.25 mg / kg). Tüm hayvanlar Carprieve aynı dozu için, bu faktör sistematik biçimde kontrol edilir. Carprieve Herhangi bir nöro-koruyucu etkisi ihmal olması muhtemeldir.
    3. en azından ilk üç gün su kaybını önlemek için günlük tuz enjeksiyonları ver. Bir sıçan kg vücut ağırlığı (her 24 saat) başına 65 ml sıvı gereksinimi olduğu varsayımına, her biri 300 gr sıçan günde ~ 22 ml sıvı almasını sağlamak.

    4. ConInfarkt Teyid

    1. enfarktüs hacmi yapısal MRG kullanmak ölçmek için.
      Not: alternatif bir yöntem, daha önce yapısal MRI verileri 18 ile korele edilmiştir tetrazolyum klorit (TTC) gibi histolojik lekeleme kullanmak olabilir. Ancak, bu sadece çalışmanın son noktasında kullanılan ve boyuna edilebilir.
      1. Yirmi dört saat MCAO indüksiyon sonrası, 0.9 L bir kareleme kuş kafesi manyetik rezonans bobin güvenli / dk Medikal Hava ve 1 L / dk O 2, izofluran (indüksiyon için% 5, bakım için% 1-1.5) ile sıçan uyutmak 7 Tesla yatay delik tarayıcı (43 mm çap) ve yer.
      2. zaman eko (TE) 60 milisaniye, tekrarlama zamanı (TR) 4000 msn, görüş alanı (FOV) 40 x 40 mm, satın alma matrisi 40 x 0.5 mm edinme 128 x 128, T2 ağırlıklı hızlı spin eko sekansı kullanarak taramaları elde yaklaşık 8 dakika içinde kalın dilim. Daha sonra, resampl kullanarak 20 x 1 mm kalınlığında dilimler halinde 40 dilim dönüştürmektıbbi görüntüleme yazılımı ing fonksiyonu.
    2. 20 hacim enfarkt kesit alanı ölçülerek, bir medikal görüntü sergileme paketinden lezyon hacimleri. kalınlıkta (1 mm), bu alanların toplam çarparak toplam hacmi elde edilir. grup hesaplayın hacmi ve standart sapma. Yüzde lezyon hacim hesaplamalarında, aynı zamanda ipsilesional ve contralesional hemisfer hacimleri kazanır.
    3. Gerriets 'formülleri 18 kullanarak bu değerleri ayarlamak, ödem nedeniyle şişme beyinde düzeltmek için. Sadece korteks içerir ve bu olumsuz lezyon hacimleri oluşturabilir olarak, aşırı düzeltme önlemek için standart sıçan atlas 19'a göre serebellum veya koku ampuller içermeyen dilimleri yer alır.
      1. Yine 8 hafta inme cerrahisi sonrası T2 ağırlıklı görüntüler elde edin.

    Nöroproteksiyon ve Davranış Kurtarma <değerlendirilmesi Gelecek Çalışmaları 5. Örnek Büyüklüğü Hesaplamalar/ P>

    1. Kullanarak üç farklı büyüklüklerin tedavi etkileri (% 25 azalma,% 50 azalma,% 75 azalma) tanımlamak için iki grup (. Tedavi vs kontrolü) ile gelecekteki hipotetik nöroprotektif deneylerde gerekli olacak minimum örnek büyüklüğünü tahmin etmek örneklem büyüklüğü hesaplamaları gerçekleştirin önsel algoritmalar güç analizi yazılımı 20 uyguladı.
      Not: kendi verileriyle benzer hesaplamalar yapmak okuyucuların etkinleştirmek için, serbestçe kullanılabilir güç analizi yazılımından ekran (Temsilcisi Sonuçlar bakınız) vardır. Aşağıdaki parametreleri kullanın: kabul edilebilir yalancı pozitiflik oranı (yani, tip I hata eşiği; α) ≤0.05 ve güç (1-p eşit olan) ≥0.80 (yani% 80'den fazla güç). Açıklamalar ve bir tartışma 21 için aşağıya bakın.

    6. Yaşlı Hayvan Refahı sonra İnme Cerrahisi

    1. Mevcut ek yumuşak Chow yapmaknd rehidrasyon jel fareler daha kolay ulaşmak için genişletilmiş ipuçları ile su şişeleri yanı sıra, ameliyat öncesi alıştırıldı bu paketleri. Buna ek olarak, yerine gevşek yatak kafesleri bir emilebilir kurtarma pedi sahip ilk 24 saat (yani, ahşap yonga önlemek) ve ekstra yuvalama yatak sağlamak. Yutma güçlüğü ile sıçanlar yutabilirler olarak püre gıda (örneğin, bebek maması) kullanmayın.
    2. 7 gün ayilmanizi için, her gün hayvanlardan tartılır. Zayıflama dehidrasyon ve stres birincil göstergesidir. Ameliyat sonrası ilk birkaç gün içinde kilo kaybı esas (azalan besleme yerine vücut ağırlığının kaybı) dehidratasyon yansıtır.
    3. Yaşlanan sıçan cerrahi olmayan ağırlık kaybını gösteren durumlarda, sıvıların eşdeğer ağırlığa sahip kayıp vücut ağırlığı yerine üst ve alt dişler kontrol edin. Dişler büyümüş olduğu yerlerde, (bölüm 2.1 gibi) izofluran ile sıçan uyutmak ve yatar pozisyonda yer
      1. te arkasında 1 ml şırınga varil yerleştirineth yumuşak dokuları korumak için. Yüksek döner hızda ama yavaş, sağlam el hareketleri (örneğin, 3 sn keser) ile bir el daire testere (örneğin, yaklaşık 3 cm çapında) kullanarak kesin. Sıçan dişleri kesimler arasında soğumasını bekleyin. testere dişleri dönme doğrultusuna bakacak şekilde dönen testere mandrel üzerine monte edilmiş olduğundan emin olun. Bu gibi durumlar için hazır ayrı ayrı sterilize, sarılmış döner testere tutmak değer.
        Not: Bir sabit pelet diyet tutulan bile aşırı çoğalma yaşlı sıçanlarda oluşabilir. Biz dişleri düzenli olarak yaşlı farelerde kontrol edilmesi önerilir.
    4. yaşlı bir sıçan kilo kaybı ve ameliyat ilgisi piloerection gösteren durumlarda, bir veteriner ile tedavi seçeneklerini tartışmak. hayvan öldürme insanca düşünün. Bu tür hayvanların MR çalışamaz ve ölümcül (genellikle yaşlı dişi sıçanlarda) bir hipofiz tümörü gösterebilir.

    Representative Results

    Kalıcı MCAO kalıcı ipsilesional karotis arter tıkanması ve contralesional karotis arter 60 dk tıkanıklığı ile birlikte diatermi ile orta serebral arterin koagülasyon ve imha izledi, sahne kraniyotomi ile oluşturuldu. Bir ekipmanın kurulumu şematik ve MCA tıkalı Şekil 1'de gösterildiği ve Şekil 2 (yukarıda) karotis arterlerin.

    İnme sonucu tıbbi bir resim görüntüleme paketinde İlgi araç kitinin Region kullanarak 24 saat ve (omurilik rostral sonuna kadar koku ampul rostral ucundan) 40 x 0,5 mm dilimleri üzerinde infarkt hacmini ölçerek inme sonrası 8 hafta değerlendirildi. Temsili T2 ağırlıklı yapısal MRI taraması 24 saat ve 8 hafta (Şekil 3A) aynı hayvan için gösterilmiştir. enfarktüs hacmi hiperintens sinyal gösteren sıçan beyin bölgelerinde tespit edilmiştir; T2 ağırlığınıned görüntüleri parlak beyaz alan olarak su veya plazma göstermektedir. Ödem ve beyin inme sonrası şişlik bir artış olduğu bilinmektedir ve bu enfarktüs hacmi 18 histolojik ölçümlerine korelasyon olan bir T2 ağırlıklı tarama ölçülebilir. Gerriet adlı formüller kullanılarak Bununla birlikte, mevcut ödem erken inme (örneğin, 24 saat sonra) sonra son lezyon hacminde (örn 8 haftalık) bir fazla tahmin edilmesine yol açabilir ve bu nedenle de mevcut ortalama infarkt hacimleri ayarlanabilir. Şekil 3B gelen ortalama verileri gösterir 62.8 olarak 24 saat sonra ham (düzeltilmemiş) lezyon hacmi mm 3 (25,4 mm 3 SD, üst grafik ±); Bu etkilenen yarımkürede (±% 4,2 SD, orta grafik) 9.8% kaplar. Bu değer% 4,5 (±% 2.0 SD, alt grafik) indirgenir Gerriets 'formülleri kullanarak şişme beyin için düzeltilmiş zaman.

    Inme şiddeti de Montoya merdiven testi 15 kullanılarak ölçüldü. Kısaca, a isenimals 4 hafta önce MCAO inme cerrahi şeker pelletleri almak için önceden eğitilmiş ve sürekli bir açık teyit etmek için, inme (Şekil 4), takip eden 8 hafta içinde test edilmiştir. Fareler, 10 dakika boyunca bir merdiven cihazına yerleştirildi ve alınan peletlerinin numarası (21 pelet üzerinden) kaydedilir ve bir yüzde (grup ± standart hata anlamına gelir) halinde sergilendi. Regresyon analizi veri hattı uyacak şekilde yapılmıştır.

    Şekil 5 (aday tedavilerinin potansiyel etkileri) enfarktüs hacmi verileri kullanarak örneklem büyüklüğü hesaplama gösterir, "iki bağımsız araçlarla (iki grup) arasındaki fark" seçeneğini kullanarak ve (düzeltilmemiş kullanarak t-testi için güç analizi yazılımı bir algoritma kullanılarak analiz ) anlamına gelir ve Şekil 3B standart sapmaları. Şekil 5 ve Tablo 1 gösterisinde bilgiler 12 sıçan inf azaltılmış bir tedaviyi saptamak için grup başına gerekli olacağını24 saat sonra% 50 oranında arct hacmi, Şekil 6 iken hayvanların değişen numaralarını kullanarak. Tablo 1 her zaman noktalarında için örneklem büyüklüğü hesaplamaları özetler elde gücün bir "XY arsa" gösterir.

    Şekil 3,
    Şekil 3. T2 ağırlıklı yapısal MR inme sonrası şişme enfarktüs ve beyin boyutunu ölçmek için kullanılır. (A) T2 ağırlıklı manyetik rezonans aynı sıçan beyin 24 saat görüntü ve inme indüksiyon sonrası 8 hafta. beyaz alan lezyon temsil eder, ama aynı zamanda 8 hafta gideren bazı vazojenik ödem içerir. (B) Enfarktüs hacimleri İlgi Toolkit bir tıbbi resim görüntüleme paketi Bölge kullanılarak ölçüldü ve kullanılan 3 zaman noktalarında (n = 6) için ± SD ortalama temsil eden bir grafik üzerinde işaretlenir. ed nedeniyle şişme beyinde için düzeltilmiş değil ham lezyon hacmi (ema), etkilenen yarımkürede yüzdesi lezyon (şişme için düzeltilmemiş) ve Gerriets 'formülleri kullanarak şişme beyin için düzeltilmiş yarımkürede yüzdesi lezyon burada gösterilir. SD Örneklem büyüklüğü hesaplamaları (bakınız Şekil 5) gerçekleştirmek için değil, SEM daha kullanıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 4,
    Şekil 4. merdiven testi tutup pelet alınırken bozuklukları gösterir. Bu inme modelinde çok az spontan iyileşme oldu. Yaşlı farelerde inme ısrarla ulaşan pelet "merdiven testi" kullanılarak haftalık test edilerek gösterilen beceri, bozar. Ankastre: davranışsal testi bir sıçan bir resmi. Grafik standı ± (ortalama gösterir21 arasında (alınan pelet ard hatası) sayısı, etkilenen forepaw tarafından haftada bir yüzdesi) olarak ifade edilmiştir. n = 5. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 5,
    Istenen terapötik etkiyi tespit etmek için gerekli olan sıçanların grup numaralarını belirlemek için Şekil 5. Örnek büyüklüğü hesaplamaları. Güç analiz yazılımı alınan bu ekran görüntüsü, grup başına 12 sıçan% 50 oranında enfarktüs hacmi azalır bir tedaviyi saptamak için gerekli olacağını göstermektedir 24 saat sonra. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 6,
    Şekil 6. Güç hayvanların çeşitli toplam numaralarını kullanarak elde etti. Güç analizi yazılımı bir "değerler bir dizi için XY arsa" yaşlı sıçanların çeşitli (toplam) numaralarını kullanarak deneyler için elde edilecek gücünü gösterir, parametreler verilen Şekil gösterilen 5. Tablo 1 tüm sonuçları özetlemektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    İnme sonrası Saat: Lezyon hacmindeki bir azalma tespit etmek için gerekli olan, grup başına sıçan sayısı:
    % 75 % 50 % 25
    24 saat 6 12 42
    8 hafta 4 5 17

    Tablo varsayımsal gelecek deneyler için grup başına numune boyutları 1. Hesaplamalar. Güç analizi yazılımı kullanılarak hesaplanmıştır (Şekil 5 ve bakın 6). Tablo Bu çalışmada zaman noktalarında her bir lezyon hacminin% 25,% 50 ve% 75 azalma tespit etmek için iki grup deney için gerekli grup başına sıçan göstermektedir.

    Discussion

    kemirgenlerde MCAO genellikle insan inme modellemek için kullanılan bir tekniktir. Bu model protokolü dikkat edilmesi gereken bir kaç detay var. İlk olarak, enfarktüs büyüklüğünü ve bir çalışmada ölümlerin sayısı etkilediği için deney boyunca hayvanın vücut ısısını korumak için esastır. Doğru CCA geçici oklüzyon sırasında izofluran durdurma ve izofluran maruz kalma azaltarak hayatta kalma oranlarını artırmak için bir ısıtılmış, sessiz bir ortamda sıçan tutmak mümkün olabilir. Araştırmacılar, ek indüksiyon stresinden daha ağır basar kısa anestezi süre olup olmadığını dikkate almalıdır. Sıçanların (örneğin, MCA dallanma) damar sistemi içinde ve hayvanlar 22 kohortu arasında değişmektedir. Yeni bir çalışma başlatırken bu akılda önemlidir. Farklı CCA oklüzyonu katı değerlendirilebilir (ör, 30, 45, 60 ve 90 dakika). Bu çalışmada, 60 dakikalık bir tıkanma süresi kullanılır. Diğer çalışmalarda, biz 45 buldukdk tıkanıklıklar aynı büyüklükte bir kortikal infarkt ama sağkalım oranları anekdot kanıtlar ile neden olmaktadır. Buna göre, cerrahlar kısa tıkanıklığı süre ile başlamak gerekiyor (örneğin, 30 dk) Gerektiğinde tıkanıklığı kez artırmak için ancak o zaman yeterli lezyon hacimleri (ve / veya gerekli davranışsal açıkları) elde edilir olmadığını görmek ve. Davranışsal açıkları aynı tıkanıklığı süreleri ile yaşlı sıçanlara kıyasla erişkin sıçanlarda devam edilmez.

    MR lezyon hacimleri çalışma hedeflerinize uygun olup olmadığını (belli bir tıkanıklık süre sonra) yargılamak için kullanılabilir. Küçük bir lezyon (40 üzerinden) az on 0,5 mm koronal dilim yayılan olacaktır. Bir orta boy lezyon on ve yirmi koronal dilimleri arasında yayılan olacaktır. Büyük bir lezyon yirmi otuz koronal dilimleri arasında yayılan olacaktır. Çok büyük bir lezyon kırk dilim fazla otuz yayılan olacaktır. bizim deneyim, çok büyük lezyonlarda (otuzdan fazla dilim) ve / veya herniasyon Acros kanıtı olan sıçanlars orta hat genellikle kötü prognoz: kısa tıkanıklığı süreleri düşünülebilir. MR da enfarktüs konumunu değerlendirmek için yararlıdır: biraz daha kaudal bulunan ve biraz daha rostrally bulunmaktadır.

    Her iki karotid arter vagus siniri ayıran ekstra özen gösterin. Ral (törpüleme) inme cerrahi sonrası oluşabilir ve nedeni henüz belli olmasına rağmen bu, bazı hayvanlarda sinir hasarına bağlı olabilir: bizim deneyim, prognoz bu hayvanlar için çok kötü olduğunu ve genellikle insanca onları öldürmek için tavsiye edilir.

    tekrarlanabilir kortikal infarktlar ve yaşlı sıçanlarda kabul post-operatif sağkalım oranları kalıcı diatermi MCAO model sonuçları. teknik, bununla birlikte, bir stereo mikroskop altında invaziv cerrahi gerektirir. Hayvanların ameliyat sonrası iyi kurtarmak istiyorsak aseptik teknik korumak için önemlidir. Bakım, teşhir ve arteri koagüle ederken MCA zarar vermemeye dikkat edilmelidirve kortikal yüzeye zarar enfarktüslü alanın bir parçası olabilir korteks, aksi açıkta kalan alanı en aza indirilmelidir. Prosedür geliştirmek ve çalışma, örneğin aday terapileri test gerçekleştirilmeden önce oklüzyon kez tutarlı infarkt elde etmek ve tespit etmek mümkün olduğu kadar çok bir deneyim alınması tavsiye edilir. Deneyci ( "blok randomizasyon") olası cerrahi oturumları içinde herhangi bir tedavi rastgele gerekir. Bu (geçici MCA ligasyon yerine diaterminin kullanılmadığı sürece) bu model MCA reperfüzyon içermeyen fazlalaştı. Ölüm bu büyük kortikal infarktlar yaşlı sıçanlarda yüksek olabilir ama kısa oklüzyon süreleri kullanarak ve mümkün olan yerlerde (örneğin oklüzyon sırasında) genel anesteziye maruz kalma minimize ederek ölümlerini azaltmak mümkün olmalıdır. Izofluran düşük düzeylerde izin verebilecek bir taşıyıcı olarak% 70 N 2 O ve% 30 O 2 kullanımı kullanılacak: isoflu bu azaltılmış pozlamaRANE yüksek hayatta kalma oranları ile sonuçlanabilir.

    Başka bir nokta dikkate Bu protokolde akut CCA oklüzyonu ile simüle oysa ateroskleroz, aşamalı bir süreç olmasıdır. Ancak, kan akımı ve sürekli açıklarında da önemli azalma birçok inme hastalarında meydana gelen tandem oklüzyonlarını simüle. Sıçanlarda kalıcı uzak MCAO tandem olmadan CCA oklüzyonu tekrarlanabilir 14 vuruş ikna etmek için başarısız: tandem CCA tıkanıklığı olmadan, dahası, biz bulduk önemli spontan iyileşme olduğunu 8 hafta boyunca felç tedavilerinin uzun süreli davranış değerlendirme engeller oluşur. Bunun aksine, distal MCAO tandem CCA oklüzyonu, yaşlı farelerde uzun vadeli açıkları indüklediğini göstermektedir.

    Sonuç olarak, sıçanlarda bu işlem bir yeni tedavilerin ve yeniden aydınlatılması test etkinleştirmek için kullanabileceğiniz sürekli engelli insan durumda görülenlerden boyutu ve konumu benzer felçlere neden oluriskemik inme sonrası çifti mekanizmaları.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Carprofen Norbrook Vm No; 02000/4229 give 0.25 mg/kg
    Atropine Sulfate AmTech RXATRINJ-100
    Alcohol swabs UHS 20021
    Lidocaine cream (Emla) AstraZeneca 0012901 Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions
    Homeothermic Blanket System Harvard Instruments 507222F
    Forceps Fine Science Tools 11019-12
    Isoflurane Abbott B506
    Silk sutures Harvard Apparatus 723288
    Cautery system Eschmann
    0.25 mm Jeweler cautery forceps Eschmann 8330349
    fine Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10
    Thumb driven saline drip system
    Vacusafe aspirator system INTEGRA BIOSCIENCES 158320
    1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs K801 104 016
    Handheld dental drill NSK NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)
    Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
    Microvascular scissors World Precision Instruments 501790
    4-0 Vicryl sutures Ethicon
    Vascular clip and applicator
    Operating microscope Zeiss
    Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas VetTech Solutions
    Carbon Steel Scalpel blades No. 10 Swann-Morton 201
    25 g needles Terumo NN-2525R
    syringes (1 ml and 5 ml) Terumo SS+01T1 / SS*05SE1
    Saline (Sodium Chloride 0.9%) Fresenius Kabi Pl 08828/0178
    cotton buds Johnson and Johnson 5000207582502 sterilize before use
    gauze sterilize before use
    Medical Imaging Package (Jim) Xinapse Free software
    Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) UCL Free software
    Power Analysis Software (G*Power) Universität Düsseldorf Free software

    References

    1. Pendlebury, S. T., et al. Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem. Stroke. 35, 2368-2371 (2004).
    2. Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke. Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331 (2010).
    3. Reep, R. L., et al. A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect. Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).
    4. Carey, L. M., et al. Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions. Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).
    5. Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Mohr, J. P., et al. Elsevier. 384-424 (2011).
    6. Sacco, R. L., et al. Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study. Neurology. 34, 847-847 (1984).
    7. Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. Cambridge University Press. 1-27 (2009).
    8. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).
    9. Brott, T., et al. Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
    10. Lövblad, K. O., et al. Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome. Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).
    11. Norrving, B. Ch. 2. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. Cambridge University Press. 28-39 (2009).
    12. Truelsen, T., et al. Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data. Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).
    13. Ord, E. N., et al. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).
    14. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
    15. Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).
    16. Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate? Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).
    17. Macrae, I. M. Ch. 5. Rodent Models of Stroke, Neuromethods. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).
    18. Gerriets, T., et al. Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging. Stroke. 35, 566-571 (2004).
    19. Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).
    20. Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).
    21. Button, K. S., et al. Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).
    22. Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 24, 2087-2093 (1993).
    23. Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter