Оценка чувствительности и Perigenital простаты тучных клеток активации в мышиной модели новорожденных материнской разъединении

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы измеряем активации perigenital механическую чувствительность и тучных клеток в простате у мужчин C57BL / 6 мышей, которые прошли в начале жизни стресс парадигму - новорожденных материнской разделения, для того, чтобы индуцировать доклинические модель простатита / синдрома хронической тазовой боли хронической.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fuentes, I. M., Pierce, A. N., O'Neil, P. T., Christianson, J. A. Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation. J. Vis. Exp. (102), e53181, doi:10.3791/53181 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Хронический простатит / синдром хронической тазовой боли (CP / ПКЮТО) имеет распространенность 14% жизни, и является наиболее распространенным урологическим диагнозом для мужчин моложе 50, но это наименее понятных и учился хронической тазовой боли расстройства. Существенное число пациентов с хронической тазовой боли доклада пережив стресс раннего жизни или злоупотребления, которые могут заметно повлиять на функционирование и регулирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (HPA) оси. Активация тучных клеток, который, как было показано, чтобы быть увеличена в моче и выражены секрета простаты СР пациентов / КППС, частично регулируется вниз по течению активации оси HPA. Неонатальный материнской разделение (НМС) была использована для более чем двух десятилетий, чтобы изучить результаты раннего стресса жизни в моделях грызунов, в том числе изменения в оси HPA и висцеральной чувствительности. Здесь мы предлагаем подробный протокол для использования NMS в доклинической модели CP / ПКЮТО у самцов мышей C57BL / 6. Мы описываем методологиюдля выполнения NMS, оценки perigenital механической аллодинии и гистологические признаки активации тучных клеток. Мы также предоставляем доказательства того, что в начале психологический стресс может иметь долгосрочные последствия на мужской мочеполовой системы у мышей.

Introduction

Хроническая тазовая боль сама по себе не болезнь, а скорее термин, связанный с продолжающимся спонтанным и / или вызывал боли, испытываемой пациентами с диагнозом синдром раздраженного кишечника (СРК), цистит / синдром болезненного мочевого пузыря интерстициальной (IC / PBS), вульводиния, или хронический простатит / синдром хронической тазовой боли (CP / ПКЮТО). Эти синдромы часто сопутствуют и имеют много общих характеристик, что у них нет сопутствующей патологии или выявила основные этиологии, хотя дисфункция в иммунной системе, центральной нервной системы, и периферической нервной системы, как было показано содействовать поддержанию и прогрессирования этих нарушений 1 -3. Пациенты с хронической тазовой болью, скорее всего, представит с симптомами, не входящим в тазовой связанных функциональных расстройств боли и расстройства настроения, в том числе тревоги, депрессии и панического расстройства 4-6, который был связан с изменением функционирования гипоталамо гипофизарнонадпочечников (HPA) оси 7-10. Воздействие стресса начале жизни или травмы значительным фактором риска для развития гПа нарушения и связанные с ними хронические болевые синдромы 10,11 и, как таковой, значительная группа пациентов с функциональными расстройствами тазовых боли сообщают, что испытали негативные события детства, такие как злоупотребления или пренебрежения 12-14.

Грызунов модели новорожденных материнской разделения (NMS), которая включает в себя удаление щенков от их плотины в течение установленного периода времени, в течение периода preweaning, были использованы в течение последних двух десятилетий, чтобы изучить результаты раннего стресса жизни. В общем, НМС, как было показано, чтобы увеличить HPA оси активации, и, как следствие тревоги, как поведение, непосредственно влияет на экспрессию генов в гипоталамусе, а также нарушения ниже по потоку от регулирования лимбических структурах 15-18. Нарушение нормального функционирования гПа оси, как было показано способствовать увеличению прямой кишки 19-22 16 Чувствительность отображается моделей грызунов NMS, но, несмотря на обширный характеристики долгосрочного эффекта послеродового воспаления мочевого пузыря 23-25, влияние стресса начале жизни в значительной степени пошли неизученным в мочеполовых органах. Таким образом, следующие исследования опишу, как выполнять NMS в мышей, а затем оценить perigenital механическую чувствительность и тучных клеток инфильтрации / активацию в простате, чтобы проверить использование мужских NMS мышей в доклинической модели для CP / СХТБ.

Из всех диагностированных хронических тазовых болевых расстройств, CP / ПКЮТО, пожалуй, не менее хорошо признаны и характеризуется синдром, несмотря на то, что распространенность жизни примерно на 14% 26 и ежегодные расходы пациента на сумму $ 4,400 (в два раза, что боли в пояснице или ревматоидный артрит 27). Пациенты с CP / CPPS отчета боли в промежности, прямой кишки, предстательной железы, полового члена, яичек и / или живот 28, опыт приветGher степень психологического стресса, чем пациентов контрольной 29 и обычно присутствует с симптомами или с диагнозом сопутствующих хронической тазовой боли или расстройства настроения 5,29-31. Периодические инфекции, вытекающей эпителий, нейрогенного воспаления, и аутоиммунные все были предположил в качестве потенциальных основных причин CP / КППС 2,32,33, а также активации тучных клеток и дегрануляции 34. Выраженные простаты выделениями из мужчин с CP / ПКЮТО возросло тучных клеток триптазы и фактора роста нервов (ФРН) уровни 34 и более позднее исследование подтвердило, что триптазой и карбоксипептидазы А (CPA3), маркер активации тучных клеток, также увеличилось в Моча больных СР / КППС 35. Потенциальная роль тучных клеток в начале и поддержания СР / СХТБ была основным направлением исследований на животных на этой синдрома до сих пор. Наиболее часто используется модель с грызунами используется для изучения CP / ПКЮТО является экспериментальный аутоиммунный простатит (EAP) модель поколениясоздававшие путем подкожной инъекции антигена простаты в полном адъюванте Фрейнда, что приводит к различным степеням железы воспаления в зависимости от вида и штамма используемых 34,36-39. Мачты инфильтрация и активация / дегрануляции было показано, чтобы увеличить следующий индукцию EAP 34,35,40. Трансгенные мыши с дефицитом либо в тучных клетках 34 или триптазы рецептора par2 35 не развиваются железы тактика чувствительность следующий EAP, в отличие от дикого типа EAP мышей. Хотя это доклинические модель воспроизводит многие из характеристик человеческого CP / СХТБ, протокол индукции не является признаком состояния человека, который имеет различной этиологии и часто не связаны напрямую воспаление, инфекции, травмы или предстательной железы.

Влияние стресса начале жизни на развитие CP / СХТБ у людей в основном пропали неизученными; Однако, исследование Ху и др. 41, показали, что мнеп, которые сообщили истории детства физического, эмоционального и / или сексуальное насилие значительно чаще испытывают симптомы, указывающие на CP / СХТБ. Кроме того, они показали, что боль и мочевыводящих оценки были повышены у пациентов с историей физического и эмоционального насилия. Ранее мы показали, что та же НМС парадигма в женской мышей C57BL / 6 производит влагалищное гиперчувствительность и аномальной экспрессии генов в обоих влагалища и мочевого пузыря наводит на мысль о неблагополучных HPA выхода оси 16. Это свидетельство в сочетании с высокой распространенностью CP / пациентов КППС представляющих с другими сопутствующими заболеваниями, в том числе 42 IC / PBS и расстройств настроения, которые более четко было показано, что связано с ранней жизни стресс воздействия 12-14, обеспечивает обоснование использования НМС модель для исследования CP / СПП у мышей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты, описанные в этом протоколе соответствует руководящим принципам NIH в соответствии с руководящими принципами, указанными в Университете Канзаса медицинский центр Уходу за животными и использованию комитета.

1. новорожденных матери Разделение (НМС)

  1. Монитор беременных плотин в день в течение мусора родов.
    Примечание: день мусор родился считается Р0.
  2. На P1, удалить дамбу из дома клетку и поместите в чистую емкость вторичного.
  3. Натрите несколько постельных принадлежностей между руками чистых перчатках, чтобы сохранить аромат домашней клетке.
  4. Добавить глубину 1 - 2 см от клетку постельные принадлежности в чистоте, надлежащим образом помечены 2 л стеклянный стакан. Добавить приблизительно половину какого-либо дополнительного обогащения подстилки, который присутствует в клетку, например, nestlet, курчавость бумаги, в стеклянном стакане.
  5. Аккуратно все щенков из одного помета, индивидуально, в тот же стакан.
  6. Сразу же местоСтакан в инкубаторе состоялась в 33 о С и 50% влажности в течение 180 мин.
  7. Удалить плотину из второго контейнера и вернуть ее в клетку. Возвращение домой клетку его надлежащего жилья месте, в виварии.
  8. Повторите эту процедуру для каждого помета переживает NMS, используя чистые перчатки и вторичные контейнеры для каждого помета / плотины.
  9. В конце периода разделения 180 мин, возвращают пометов в их клетки в том же порядке, как они были удалены.
  10. Получить клетку первого помета, который был отделен в начале дня. Удалить плотину из дома клетку и поместите в чистую емкость вторичного.
  11. Удалить первый стакан из инкубатора и втирать несколько постельных принадлежностей между чистыми руками в перчатках, чтобы сохранить аромат домашней клетке при обращении щенков.
  12. Аккуратно переместите щенков, индивидуально, из стакана в клетку.
  13. Вернуться любое обогащение и постельные принадлежности оставшиеся в стакане сГлавная клетка.
  14. Вернуться плотину из второго контейнера в клетку и вернуть его в соответствующем жилищном месте в виварии.
  15. Промыть стакан с водой и вернуть его в инкубатор. Используйте тот же стакан для каждого помета в течение всей процедуры разделения.
  16. Повторите эту процедуру для каждого помета переживает NMS в том же порядке, как они были помещены в инкубатор.
  17. Повторите всю процедуру для каждого помета прохождением NMS каждый день через P21.
  18. Отучить NMS и наивные щенков на P22 путем размещения однопометными того же пола вместе в чистых клетках в комплекте с пищей и водой. Наивные щенков следует родилась и размещены в тех же условиях, что и NMS мышей, но не претерпевают дополнительную обработку вне обычных задач животноводства.

2. Perigenital Механическая чувствительность

  1. фон Фрея Аппарат установки
    1. Принесите мышей в комнату тестирования и позволить им акклиматизироваться в течение 30мин, оставаясь в их клетках.
    2. Подготовка полигона путем размещения поглощающего лежащей снизу под повышенным проволоки сетки верхней таблице (79 см х 28 см), что обеспечивает достаточно места, чтобы следователь подходить с нижней без поразительные мышей, примерно 55 см в высоту.
    3. Поместите до 12 мышей, в индивидуальном порядке, в соответствии с четкими, перфорированные пластиковые камер (11 см х 5 см х 3,5 см) на верхней части таблицы проволочной сетки. Поместите тяжелые предметы на верхней палат, чтобы предотвратить мышей от побега.
    4. Акклиматизироваться мышей в течение дополнительных 30 мин на экране до порогового вывода оценки.
  2. Оценка Perigenital Механическая чувствительность
    1. Выполните вверх-вниз метод с использованием стандартного набора градуированных фон Фрея мононитей 43. Используйте следующие мононити: 1,65 г, 2,36 г, 2,83 г, 3,22 г, 3,61 г, 4,08 г, 4,31 г, 4,74 г и.
      1. Держите базы 3.22 г мононити и выставить втянутого мононить.
        Примечание: Некоторые модели могут не иметь восстанавливаемую мононити.
      2. Расположите зонд таким образом, что моноволокно вертикально ориентированных и когда мышь оповещения, неподвижно, а его вес тела распределяется равномерно между задних лап не применить его к левой или правой стороне мошонки, избегая среднюю линию, пока небольшое изгиб наблюдается в нити.
      3. Удерживая мононити на месте в течение 10 сек или пока животное показывает положительный ответ.
        Примечание: положительный ответ считается оживленных рывок или прыжок в ответ на мононити приложения или облизывание или едкой поведения, направленной на мононити. Если мышь перемещается во время мононити приложения 10 сек без отображения этого поведения, леска должна быть повторно после минимального 1 мин длительного периода покоя. Если мышь перемещается ни ни имеет любой из перечисленных выше поведения во время мононити приложения 10 сек, то считается, отрицательный ответ.
      4. Запишите ответ, либо отрицательный или положительный, в лабораторной тетради или ноутбук и повторите эту процедуру на всех остальных мышей с использованием 3,22 г мононити.
      5. Проверьте все еще раз, используя мышей следующий соответствующий мононити. Примечание: Если мышь выставлены отрицательный ответ на мононити 3,22 г, применить 3,61 г мононити таким же образом и записать ответ. Если мышь выставлены положительный ответ на 3.22 г мононити, применять 2,83 г мононити и записать ответ.
    2. Продолжить испытания каждого мышь, используя следующий больший или меньший мононити, в соответствующих случаях, для дополнительных приложений после 4 наблюдается первый положительный ответ.
    3. Вернуться на главную мышей клетки.
    4. Используйте значение конечного фон Фрея мононити применяется в серии опытов в единицах журнала для расчета 50% порог г снятие, как описано в Chaplan др. 43.
Название "> 3. Сотовый Окрашивание подкисленных Толуидин Голубой мачты

  1. Обработка ткани
    1. Рассеките простаты ткани 44 от мышей, которые были внутрисердечно перфузии с ледяной 4% параформальдегидом 45. Постфикс ткани в 4% параформальдегид в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем в cryoprotect 30% сахарозы в 1x PBS при 4 ° CO / N.
    2. Подготовьте небольшую (30 мл) ванну гептана и поместить его на сухом льду.
    3. Промойте ткань простаты в 1x PBS и высушите с помощью света обязанность уничтожить.
    4. Вставьте ткань простаты в холодным гептаном до тех пор, пока не будет заморожен.
    5. Сразу же место замороженные ткани простаты в cryomold содержащей монтажные средства массовой информации и место на сухом льду, пока не заморожен.
    6. Магазин cryomolds при -20 ° С.
    7. Поперечно резать ткани простаты на 7 мкм толщиной криосрезах использу криостат.
    8. Поместите 8 - 12 несерийные криосрезах, которые охватывают длину ткани, на положительно заряженных микроскопа.
    9. Магазин не закончил слайды при температуре -20 ° С до дальнейшей обработки.
  2. Подготовка подкисленной ТОЛУИДИН синий
    1. Добавить 1 г толуидинового синего O в 100 мл 70% этанола и вихревые пока в растворе, чтобы приготовить 1% исходного раствора. Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение трех недель.
    2. Добавить 1 г NaCl в 100 мл воды в химическом стакане помещается в верхней части мешалки.
    3. Доводят рН раствора NaCl не используя 12 М HCl до рН в диапазоне 0,5 - 1,0 достигается.
    4. Подготовка 0,25% рабочего раствора толуидин синий путем объединения 8 мл исходного раствора толуидин синий и 32 мл 1% раствора NaCl. Внесите вверх и вниз, чтобы гарантировать полную включение маточного раствора Толуидин Голубой и смешать с использованием вихрь. Рабочий раствор должен быть свежим и выбрасываются после использования.
  3. Окрашивание простаты криосрезы
    1. Удалить слайды должны быть обработаны с морозильной камерой и позволит уравновесить до комнатной температуры в течение примерно 30 мдюйм
    2. Промыть срезах тканей по отдельности погружением слайдов в течение примерно 1 сек в 50 мл коническую пробирку, содержащую достаточный объем 1x PBS, чтобы гарантировать, что срезы ткани слайд-смонтирован будет полностью погружен в воду. Разрешить слайды сухой воздух на бумажное полотенце.
    3. Место слайды в окрашивания стеклянный сосуд достаточно 0,25% рабочего раствора толуидин синий чтобы гарантировать, что срезы ткани слайд-смонтирован будет полностью погружен и инкубируют в течение 10 - 15 мин, а на платформе-качалке, установленной на 15 оборотов в минуту.
    4. Dip слайдов в 1x PBS в течение приблизительно 1 сек, чтобы смыть лишнюю толуидиновым синим.
    5. Поместите слайды в коробке слайдов или стойке таким образом, что слайды на их сторонах, чтобы позволить для дренажа.
    6. Сушат слайды в печи при 37 ° С в течение как минимум 2 ч или O / N при комнатной температуре.
    7. Дегидрировать слайды быстро, используя спирт, позволяя слайды к абсолютно сухой между экспозициями алкоголя. Сухие горки, слив на бумажное полотенце ай вытирая спины и ребер с легким обязанностей протрите.
      1. Погрузитесь слайдов в 95% этанола в течение приблизительно 1 сек и позволяют полностью высохнуть. Повторите эту процедуру 1 - 10 раз, пока ткань не сохнет синий, чем фиолетовый.
      2. Погрузитесь слайдов в 100% этанола в течение приблизительно 1 сек и позволяют полностью высохнуть. Повторите эту процедуру 1 - 10 раз, пока ткань не темно-синий и среднего, но не фиолетовый.
    8. Закрепить окраску путем инкубации слайды в 100% ксилола в течение 3 мин. Дать высохнуть.
    9. Покровное слайды с глицерином, PBS, или ксилола на основе постоянного крепления СМИ. Слейте лишнюю СМИ и магазин при комнатной температуре.
  4. Количественная тучных клеток
    1. Визуализируйте ТОЛУИДИН разделы сине-окрашенные ткани на 20-кратным увеличением с помощью световой микроскопии (рис 2).
    2. Подсчитайте общее количество тучных клеток, присутствующих в область отображения и различать не-дегранулированных и дегранулированных тучных клеток. 40X Magnificatион может быть необходимо, чтобы подтвердить статус грануляции в некоторых тучных клеток.
      Примечание: Не дегранулированных тучные клетки обладают плотной метахромазию с отсутствием или слабым ядерной набросков и / или не гранулированного экструзии вокруг клетки. Дегранулированных тучные клетки обладают менее интенсивный метахромазию и имеют очевидное четкие очертания ядра и / или свободных гранул в цитоплазме и за пределами границы ячейки.
    3. Продолжить, чтобы оценить общее количество не-дегранулированных и дегранулированных тучных клеток в объеме раздела текущего ткани. Повторите эту процедуру, по крайней мере 7 дополнительных отдельных секций, охватывающих длина каждой ткани.
    4. Рассчитывают процент дегранулированных (DG) в общем объеме тучных клеток для каждой ткани / мышь в соответствии со следующей формулой: (DG тучные клетки / Всего тучные клетки) х 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мыши, которые прошли НМС показали поведенческие доказательства, указывающего CP / СХТБ. При тестировании с градуированной серии фон Фрея мононити, 8-недельных мышей NMS (п = 4) отображается perigenital механической аллодинии, когда по сравнению с наивных коллег (п = 5, рис 2). Об этом свидетельствуют как значительное сокращение <0,01; т-критерий Стьюдента) в механической порог вывода, что вызвало положительную поведенческую реакцию, записанные в быстром рывке или скачка в ответ на мононити приложения или облизывание или едкой поведения, направленной на мононити ,

Мыши, которые были подвержены NMS также отображается гистологические признаки CP / СХТБ. Криостатные разделы ткани простаты окрашивали подкисленную о-толуидиновый синий наблюдать Триптаза гранулы размещенные в тучных клетках (3А-D). Процент тучных клеток, которые показали наличие активации, например, диффузного metachromaSIA, гранулы присутствуют пределами границы ячейки (рис 3D), была значительно увеличена в ткани простаты от 8-недельных мышей NMS, по сравнению с наивным <0,0001, т-тест Стьюдента, рис 3E). Общее количество внедренных тучных клеток, независимо от статуса грануляции, существенно не отличается от наивного (99,5 ± 15,2 клеток / раздела) и NMS мышей (108,2 ± 22,5 клеток / раздела).

Фигура 1
Рисунок 1. Процедурные линии времени. Схематическое излагается рекомендуемое время линию для выполнения описанной методологии. Неонатальный материнской разделение (НМС) осуществляется ежедневно с послеродовой день (P) 1 до P21 и мышей не отнимают от груди на P22. Мыши не остаются нетронутыми пределами нормальной животноводства до 8-недельного возраста, когда они проходят проверку на perigenital механических Sensitivity. Если же мышей будет оцениваться для окрашивания тучных клеток, одна неделя должна быть предоставлена ​​возможность пройти следующий поведенческий тестирование, чтобы для любых остаточных эффектов стресса по урегулированию.

Рисунок 2
Рисунок 2. Perigenital механическая чувствительность. Perigenital механическая чувствительность измерялась с помощью фон Фрея мононити приложения. Самцы мышей, которые были подвергнуты новорожденных материнской разделение (NMS) отображается значительное снижение порога вывода, по сравнению с наивных мышей, указывающих механической аллодинии. Данные представляют среднее SEM, п = 4 в каждой группе. * Р <0,05, т-критерий Стьюдента.

Рисунок 3
Рисунок 3. активации тучных клеток. Подкисленный толуидина синий был использован для визуализации триптазы гранулы и рассчитывают процент активированных / дегранулированных тучных клеток в криостата секций ткани простаты. Типичные микрофотографии показаны толуидинового синего окрашенных участков от наивных (а) и NMS (B) предстательной железы с стрелками, указывающими неповрежденными (без дегранулированных) и стрелок, указывающих активирована (дегранулированных) тучные клетки. Более высокие изображения с увеличением от наивных (С) и NMS (D) мочевого пузыря приведены для иллюстрации гистологические отличия от не-дегранулированных (С) и (D дегранулированных) тучные клетки. Значительно более высокий процент дегранулированных тучных клеток наблюдали в разделах простаты из NMS мышей по сравнению с простых мышей (E). Данные представляют среднее SEM, п = 4 в каждой группе. **** Р <0,0001, т-тест Стьюдента.= "_ Пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол обеспечивает методологию для использования у новорожденных стресс, в форме NMS, чтобы вызвать симптоматику, указывающую CP / ПКЮТО в взрослых самцов мышей. Как взрослые, НМС мыши обнаруживают значительное perigenital механической аллодинии, а также доказательства дегрануляции тучных клеток в ткани предстательной железы. Использование NMS является новый подход к разработке доклинические модель CP / СХТБ, в которой это воспроизводит начале жизни стресс, который часто сообщалось у пациентов с хронической тазовой боли 12-14, а также включения неинвазивный индукции, а в отличие от более широко используется, химико и иммунологически индуцированных воспаление предстательной железы 34,36-39. Кроме того, НМС в мышах было показано, чтобы произвести сопутствующего симптоматику, в том числе измененных тревогу, как и ангедонической поведения, повышенные скорости мочеиспускания и задней лапы гиперчувствительность (16; данные не представлены), похожи на сопутствующих соматических, настроение и висцеральных расстройств, проявляемых CP / ПКЮТО patieНТС 4-6.

Основное преимущество использования NMS, чтобы вызвать CP / СПП у мышей является то, что он использует психологическое вмешательство, чтобы инициировать физиологические изменения. Пациенты с CP / СХТБ у вариант этиологии, который во многом не связаны предыдущие инфекции или прямой травмы простаты 1-3. Несмотря на этот факт, опубликованные модели CP / ПКЮТО включили прямую или косвенную воспаление предстательной железы, чтобы вызвать гиперчувствительность perigenital региона и / или активации тучных клеток. Значительная часть CP / CPPS и хронических больных тазовой боли в общем, отчет пережив начале жизни невзгоды, которые в значительной степени ушла неизученным в моделях грызунов урогенитальных болевых синдромов. Предыдущая работа с нашей лаборатории показали, что НМС вызывает вагинальный гиперчувствительность и связанного нарушение правильного функционирования HPA оси 16. Будущая работа с использованием этой модели будет исследовать механизмы, которые приводятся в начале стресса жизни, чтобы произвести тон изменил фенотип в зрелом возрасте, а также изучить потенциальные фармакологические или образа жизни мер, которые могут быть применены в доклинических или клинических условиях.

Достижение оптимальных и воспроизводимых результатов этого протокола зависит от соблюдения нескольких важных шагов, которые, возможно, потребуется оптимизировать в зависимости от окружающей среды и используемого оборудования. Учитывая, что NMS резко влияет на функционирование оси HPA, важно для контроля внешних раздражителей и экологического стресса во время обоих новорожденных и взрослых периодах. Возраст соответствием, не-обработанные наивные мышей должно родиться и размещены в соответствии с каждой когорте NMS мышей для контроля за внешние раздражители, присутствующих в окружающей среде, которые могут повлиять на развитие оси гПа. Важно, чтобы определить количество мышей, необходимых для выполнения поставленной эксперимент до начала селекции или заказе беременных самок в средство животного. При выполнении НМС, в greatesт озабоченность отказ от щенков по плотине, поэтому важно сохранить аромат домашней клетке на протяжении протокола NMS. Чтобы свести к минимуму воздействие суточных ритмов, предложил момент отделения НМС является в середине светового цикла (с 11 до 2 вечера). Измерения Perigenital чувствительности должны быть получены в полной зрелости взрослых самцов мышей, примерно в возрасте 8 недель, и принято в то же время суток для каждой группы, предпочтительно в начале светового цикла совпадает с корыто в суточных ритмов. Чтобы уменьшить возникновение не-вызывала движений во время этой процедуры, оценка может быть проведена в контролируемой температурой, звукоизолирующим комнате с белым шумом воспроизведения (20 - 20000 Гц). Же следователь должен оценить все пороги отмены на протяжении всего исследования, чтобы поддерживать согласованность в соблюдении положительных и отрицательных ответов. В качестве альтернативы измерения 50% механической порог, частоту вывода на одной мононити куLD быть оценены или электронное устройство фон Фрея 46 могут быть использованы. Для визуализации тучных клеток, все скользит, которые должны быть проанализированы должны быть обработаны вместе, чтобы обеспечить равное окрашивание тучных клеток, а интенсивность окрашивания может варьироваться от экспериментов. РН ниже 1,0 необходимо для надлежащего контраста между темно-фиолетового тучных клеток и голубом фоне. Слишком много полосканий в алкоголя может смыть пятно с тучных клеток и отрицательно влияет на контрастность. Наконец, наложения сетки на ткань может быть полезным в подсчета клеток на протяжении всей секции ткани.

Несколько соображений должно быть сделано до применения НМС индуцировать CP / СПП или расстройств, связанных централизованного боли. Во-первых, подавляющее большинство публикаций, которые включены в начале стресс жизни было сделано в крыс моделей НМС, используя укороченную период разделения Р1 - P14. Многие группы показали, что эта парадигма формирует IBS-как симптоматику в гАТС и мышей 15; Однако, в нашем предыдущем исследовании Р1 - период отделения Р14 в C57BL / 6 мышей не генерировать значительное увеличение чувствительности влагалища 16, а также не генерируют колоректального гиперчувствительность (данные не показаны). Таким образом, виды и длины NMS может определить конкретный результат в зрелом возрасте, в том числе от тяжести симптоматики и конкретного органа (ов), пораженной. Во-вторых, поведенческие и молекулярные изменения, связанные с NMS в значительной степени из-за нарушения регуляции оси НРА 15-18, предполагая, что эффект централизованно опосредованной и может иметь сопутствующие результаты, в том числе изменения в anxiety- и / или депрессии, как поведение и повышенная чувствительность в других органах малого таза или более отдаленных местах. Это сопутствующее фенотип является показателем того, что обычно видно клинически и может быть более представительным пациентов CP / КППС в целом 5,28-31,42. В-третьих, на основе этих изменений, возникающих в результате HPA оси dysregulвания, влияние стресса должна быть предельной заботы, как во время процедуры NMS и последующего тестирования поведения и в пробирке анализа. Выход из оси гПа суточный, с большей продукции за более активного темного цикла и меньшей продукции за более спокойной светового цикла, которые могут повлиять на исход поведенческих или в пробирке анализа в зависимости от времени испытаний / пожертвовать 47. Точно так же, воздействие стресса, в том числе проходит perigenital механические испытания чувствительности, могут временно осуществлять функционирование HPA оси 18 и, возможно, изменить экспрессию генов, связанных в регионах мозга и периферических тканях ниже по течению.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 female mice  Charles River 027 Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s) Sigma-Aldrich CLS10002L Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic VWR International 414005-124 The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) Stoelting 58011 The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats) IITC 435 Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. 
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) IITC 410 Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose Sigma-Aldrich S5016 Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane Sigma-Aldrich 246654 Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold  VWR International 4557 To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound Sakura 4583 12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide VWR International 48311-703 75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161 Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-4 Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888 Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  BioExpress C-3394 Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover Fisher Scientific 08-815 Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological) Fisher Scientific X3P Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place VWR International 82003 Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box Fisher Scientific 22-363-400 These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific VWR International 4111 Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 VWR International 48393-106 A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope Nikon The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
  2. Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
  3. Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
  4. Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
  5. Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
  6. Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
  7. Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
  8. Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
  9. Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
  10. Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
  11. Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
  12. Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
  13. Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
  14. Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
  15. Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
  16. Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
  17. Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
  18. Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
  19. Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
  20. Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
  21. Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
  22. Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
  23. DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
  24. Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
  25. Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18 (2011).
  26. Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
  27. Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
  28. Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
  29. Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
  30. Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
  31. Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
  32. Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
  33. Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
  34. Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
  35. Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
  36. Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
  37. Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
  38. Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
  39. Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
  40. Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
  41. Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
  42. Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
  43. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
  44. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. e3791 (2012).
  45. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (2012).
  46. Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. e51212 (2013).
  47. Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics