Purification de souris vaisseaux cérébraux

Neuroscience

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Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

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Abstract

Dans le cerveau, la majeure partie du système vasculaire est constituée d'une barrière sélective, la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui régule l'échange des molécules et des cellules du système immunitaire entre le cerveau et le sang. En outre, l'énorme demande métabolique neuronale nécessite un règlement d'instant en instant de la circulation sanguine. Notamment, des anomalies de ces réglementations sont les caractéristiques étiologiques de la plupart des pathologies du cerveau; y compris un glioblastome, un accident vasculaire cérébral, l'oedème, l'épilepsie, les maladies dégénératives (ex: la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer), les tumeurs cérébrales, ainsi que des affections inflammatoires telles que la sclérose en plaques, la méningite et dysfonctionnements cérébraux induite par le sepsis. Ainsi, la compréhension des événements de signalisation modulant la physiologie vasculaire cérébral est un défi majeur. Beaucoup de perspicacité dans les propriétés cellulaires et moléculaires des différents types de cellules qui composent le système vasculaire cérébral peut être acquise à partir de la culture ou de la cellule primaire de tri du tissu cérébral fraîchement dissociée. cependant,propriétés telles que la polarité cellulaire, la morphologie et les relations intercellulaires ne sont pas maintenus dans de telles préparations. Le protocole que nous décrivons ici est conçu pour purifier des fragments des vaisseaux du cerveau, tout en maintenant l'intégrité structurelle. Nous montrons que des vaisseaux isolés constitués de cellules endothéliales scellées par des jonctions serrées qui sont entourés par une membrane basale continue. Pericytes, cellules musculaires lisses, ainsi que les astrocytes périvasculaires membranes de endfeet restent attachés à la couche endothéliale. Enfin, nous décrivons comment effectuer des expériences de immunocoloration sur les vaisseaux cérébraux purifiés.

Introduction

Le bon fonctionnement du système nerveux central (SNC) nécessite un environnement extracellulaire très réglementé, et ses besoins métaboliques sont énormes par rapport à d'autres organes 1. Le CNS est aussi extrêmement sensibles à un large éventail de produits chimiques, généralement inoffensifs pour les organes périphériques, mais à elle, neurotoxique. Pour assurer un fonctionnement correct, la majeure partie du système vasculaire du SNC »forme une barrière endothéliale; la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui commande l'écoulement des molécules et des ions ainsi que le passage des cellules immunitaires entre le sang et le cerveau, ce qui maintient approprié homéostasie 2, mais en limitant également l'entrée de médicaments thérapeutiques, les traitements entravant ainsi de troubles neurologiques 3. Au niveau cellulaire, le BBB est principalement soutenue par de vastes jonctions serrées entre les cellules endothéliales, l'expression polarisée des transporteurs d'efflux et un taux de transcytose très faible 4. Propriétés et fonctions de la BHE sont essentiellement induites par NEighboring 4 cellules. En particulier, les péricytes jouent un rôle important dans l'induction et le maintien de la BHE 5,6. Être cellules contractiles, péricytes régulent également le flux sanguin 7 comme les cellules musculaires lisses entourant les grands navires. Enfin, les astrocytes, les principales cellules gliales du cerveau, envoient de grandes procédés mentionnés endfeet autour de la majeure partie du système vasculaire du cerveau 8 et moduler Bureau intégrité et la quiescence immunitaire 9, le transfert de metabolites de neurones 10, et induire le couplage étroit entre l'activité neuronale et le flux sanguin 11,12.

La possibilité d'étudier les propriétés moléculaires et cellulaires du système vasculaire cérébral est crucial de mieux caractériser sa contribution à la physiologie du cerveau et de la physiopathologie. Pour aborder cette question, les stratégies visant à isoler le système cérébro-vasculaire du cerveau ont été développées, qui permettent pour la préparation de fragments des vaisseaux du cerveau intactes. Cerebral navire purification a d'abord été décrite en utilisant les encéphales 13 et améliorée et adaptée à d'autres espèces, en particulier les rongeurs 14. Dans cette dernière étude, l'utilisation de filtres de taille variable a été introduit pour séparer les vaisseaux cérébraux pour des fractions enrichies dans des récipients de diamètres différents. Fait intéressant, dans ces préparations, les cellules endothéliales ont gardé leurs propriétés métaboliques 15, la fonctionnalité de transporteur et de polarisation 16 17. Ici, nous décrivons en détail ce protocole et démontrent en outre que les navires isolés conservent la plupart de leur dans les structures in situ. Les cellules endotheliales restent liés par des jonctions serrées et entourés par une membrane basale continue. Péricytes et les cellules musculaires lisses restent attachés à la couche endothéliale, ainsi que des membranes d'astrocytes périvasculaires. Cependant, les astrocytes, les cellules de la microglie, les neurones et les oligodendrocytes sont éliminés. Enfin, nous décrivons une procédure pour effectuer immunocoloration sur les vaisseaux cérébraux isolés. Jusqu'à présent, la plupart des études moléculaires et cellulaires du système vasculaire cérébral concernant ont été effectués sur les cellules des vaisseaux cérébraux purifiés dissociées en utilisant des souches de souris journaliste cellulaires spécifiques ou des procédures sur la base de 18,19 immunocoloration-tri cellulaire. Bien que ces techniques permettent l'isolement de populations de cellules vasculaires cérébraux presque purs, des cellules isolées perdent totalement leur morphologie in situ et les interactions, qui à son tour, affecte grandement leurs propriétés moléculaires et cellulaires. Le protocole décrit ici, ce qui permet l'isolement de fragments cérébrovasculaires entières sans avoir besoin d'anticorps spécifiques ou les taches de souris transgéniques, offre une bonne alternative comme la structure globale des vaisseaux cérébraux isolés est conservée, ainsi, de diminuer répercussions sur leurs propriétés moléculaires. Vaisseaux isolés pourraient ensuite être utilisés pour l'étude de l'activité des gènes, la synthèse des protéines et de la réglementation à la BBB comme récemment décrit 20,21 22,23 Le présent Protocole est peu coûteux, facile à réaliser et rapidement adaptable pour tout laboratoire.

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Protocol

1. Les solutions et matériaux

  1. Préparer des solutions de navires d'isolement: B1, ajouter 1,5 ml de HEPES 1M à 150 ml de HBSS; B2, ajouter 3,6 g de dextrane à 20 ml de B1; B3, ajouter 1 g de BSA pour 100 ml de B1.
  2. Modifier le porte-filtre en coupant le fond de la partie supérieure de vissage.
  3. Préparer des solutions de immunocoloration: solution de fixation, 4% de paraformaldehyde dans PBS pH 7,4; Perméabilisation / solution de blocage, diluer du sérum de chèvre à 5% de Triton X100 et à 0,25% dans du PBS pH 7,4.
    Remarque: La fixation dépend du type d'anticorps primaires utilisés.

2. Dissection

Nota: Des conditions stériles ne sont pas nécessaires, à moins que les navires sont utilisés à des fins de culture de cellules.

  1. Préparer un bêcher de 150 ml avec 20 ml de B1. Garder sur la glace et couvrir avec du parafilm pour éviter la contamination de l'air.
  2. Profondément anesthésier la souris sous une capuche avec une petite serviette de papier trempé dans 1 ml d'isoflurane pur qui est int ajoutéso la cage. L'anesthésie est vérifiée par l'absence de réaction à un pincement de l'orteil. Tuez la souris par dislocation cervicale.
    Remarque: Ces étapes sont réalisées en conformité avec les réglementations nationales et institutionnelles.
  3. Facultatif: Procédez perfusion intracardiaque avec 20 ml de PBS 1x pour éliminer le contenu de sang 24.
  4. Section de la peau avec un scalpel à partir du cou au nez et retirez. Retirer tous les poils contaminantes avec PBS 1x.
  5. Pour ouvrir le crâne, d'abord insérer des ciseaux en avant vers le bulbe olfactif, et ouvrir les ciseaux pour rompre le crâne en deux parties.
  6. Retirez délicatement le cerveau à l'aide d'une spatule de cerveau. Disséquer les plexus choroïde des ventricules latéraux comme ils contaminer le vaisseau sanguin préparation 38.
    NOTE: En option: La préparation finale contiendra parenchyme et les méninges navires. Dans le cas contraire on le souhaite, des méninges peuvent être décollée suivant le mode opératoire décrit par 38.
  7. Transfert le cerveau dans le bécher contenant une solution de B1 sur la glace. Jusqu'à 8 cerveaux peuvent être traités ensemble.

3. Homogénéisation des tissus du cerveau

  1. L'utilisation de deux scalpels, manuellement et battre vigoureusement le cerveau dans la solution de B1 par la suite l'obtention de petits morceaux d'environ 2 mm.
  2. Homogénéiser la préparation avec un homogénéisateur Dounce automatisée, effectuant 20 coups à 400 tpm. Assurez-vous que le tube de verre est maintenue dans de la glace et que la partie supérieure de la douncer est en solution lors du déplacement de haut en bas, de manière à éviter la formation de poches d'air. Si plusieurs échantillons sont préparés, lavez la douncer avec de l'eau ionisée entre chaque homogénéisation.

Purification 4. navire

  1. Transfert de l'homogénat dans un tube en plastique de 50 ml et procéder à la centrifugation à 2000 g pendant 10 min à 4 ° C. Une grande interface blanche (la plupart du temps de la myéline) se forme sur le dessus de la pastille de la cuve (rouge si aucune perfusion a été effectuée).
  2. Jeter le surnageant. Le culot de la cuve et l'interface blanc resteront attachés ensemble. Ajouter 20 ml de solution de B2 glacée et agiter le tube manuellement et vigoureusement pendant 1 min.
  3. Passez à la deuxième centrifugation à 4400 g pendant 15 min à 4 ° C. La myéline va maintenant former une couche blanche dense à la surface du surnageant.
  4. Détacher soigneusement la couche de myéline des parois du tube en tenant le tube et le faisant tourner lentement pour permettre au surnageant de passer le long des parois. Jeter la myéline avec le surnageant. Le culot contenant les vaisseaux reste attaché au fond du tube.
  5. Tamponnez la paroi intérieure du tube avec un papier absorbant enroulé autour d'un 5 ml en plastique pipette et retirer tous les fluides résiduels, évitez de toucher le culot de navire. Garder le tube à l'envers sur un papier absorbant pour drainer tout liquide restant.
  6. Suspendre le culot dans 1 ml de solution de B3 glacée par pipetage de haut en bas avec des pointes à faible liaison, keeping le tube sur la glace, puis ajouter encore 5 ml de solution de B3. Assurez-vous que les navires sont dispersés autant que possible et ne forment pas d'agrégats.

5. Filtration

  1. Préparer un bêcher sur de la glace avec 30 ml d'une solution d'B3 glacée. Couvrir avec du parafilm pour éviter la contamination de l'air.
  2. Placer un filtre à mailles de 20 um sur un porte-filtre modifié sur le sommet d'un flacon de Becker et équilibrer en appliquant 10 ml de solution d'B3 glacée.
  3. Verser la préparation de la cuve du filtre et rincer les récipients avec 40 ml de solution d'B3 glacée.
  4. Récupérer le filtre à l'aide des pinces propres et plonger immédiatement dans le bêcher contenant la solution de B3. Détachez les navires de la filtre en le secouant doucement.
  5. Verser le contenu du bêcher dans un tube en plastique de 50 ml et on centrifuge à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C.
  6. Note: Alternativement, la suspension par les vaisseaux du cerveau de l'étape 4.6 peut être filtré sur un filtre de 100 um mesh.Dans ce cas, les grands navires sont préférentiellement retenues sur le filtre tandis que le flux continu contient microvaisseaux (principalement capillaires), qui sont ensuite filtrés sur un filtre de 20 um mesh comme ci-dessus.
  7. Reprendre le culot de microvaisseaux dans 1 ml de solution de B3 glacée et le transférer à la pipette dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Centrifuger à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C.

6. Fixation, Perméabilisation et le blocage

  1. Les navires de transfert par pipetage dans 0,2 ml tubes PCR contenant du PBS en utilisant un 1,0 ml faible pointe de liaison. Veillez à ne pas toucher les navires, car ils peuvent adhérer à la partie extérieure de la pointe. Effectuez toutes les étapes suivantes sous un microscope binoculaire.
  2. Pour chacune des modifications moyennes suivantes, laisser les tubes sur la glace jusqu'à ce que les navires ont atteint le fond, et la pipette sur la plupart des liquides en utilisant les embouts de pipettes gel chargement longs et chose.
  3. Retirer la plupart des PBS et ajouter 200 ul de solution de fixation.Suspendre les navires en agitant doucement et incuber pendant 20 min à température ambiante.
  4. Introduire à la pipette sur la solution de fixateur et le remplacer avec 200 pi de PBS 1x (premier lavage), incuber pendant 5 min à température ambiante et répétez cette étape 3 fois. Chaque fois, vérifier que les navires ont correctement coulé au fond des tubes et pipettes sur PBS 1x, assurant que les navires ne sont pas touchés.
  5. Après le dernier lavage, remplacer 1x PBS par le / la solution de blocage de perméabilisation et incuber 1 heure à température ambiante, la remise en suspension des vaisseaux en secouant délicatement de temps en temps.

7. Immunocoloration

  1. Remplacer la solution de perméabilisation / blocage avec le mélange d'anticorps primaires (voir les références des anticorps utilisés ici et dilutions dans les matériaux modèle de tableau) dilué dans le / la solution de blocage de perméabilisation, et incuber à 4 ° CO / N.
  2. Après 3 lavages en PBS à la température ambiante, incuber les vaisseaux avec le mélange d'anticorps secondaire dilué dans du PBS pendant 2 heuresà la température ambiante.
  3. Remarque: nous vous recommandons vivement d'effectuer une coloration nucléaire avec Hoechst (1: 2000) ou DAPI (1: 2000) afin de distinguer les navires de contaminants possible poils ou de poussières sous le microscope.
  4. Après 3 lavages dans du PBS, remettre en suspension les récipients dans 50 ul de PBS.

8. Montage et Observation

  1. Préparer une pointe avec un capillaire de verre siliconé: couper une pointe de pipette P200 aide d'un scalpel et d'ajuster le capillaire à l'intérieur. Le volume approximatif du capillaire est de 40 ul.
  2. Transférer les navires sur une lame de verre à l'aide du capillaire de verre siliconé et retirer délicatement le liquide avec un morceau de papier absorbant.
  3. Appliquer une seule goutte de milieu de montage sur les navires et maintenez une lamelle à 45º permettant la baisse de répandre le long du bord de la barbotine. Laissez aller au large de la lamelle et laisser moyen de se propager lentement. Laissez sécher O / N à la température ambiante à l'abri de la lumière. Les navires peuvent être observées sous un Déessent microscope confocal.

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Representative Results

Ici, nous décrivons un protocole permettant l'isolation mécanique des vaisseaux du cerveau 14. La figure 1 résume les principales étapes de cette technique. L'architecture des vaisseaux cérébraux est complexe et comprend plusieurs types de cellules, à savoir, les cellules endotheliales scellées par des jonctions serrées et les pericytes, entourés par les cellules musculaires lisses, et les procédés pour les pieds 9 astrocyte. Ainsi, suite à l'isolement des vaisseaux cérébraux, nous avons cherché à caractériser la structure des navires purifiés par immunocoloration de la manière décrite dans la seconde partie de notre protocole. Agrine, un composant de la membrane basale endothéliale en continu et de manière homogène à la surface marquée de endotheliales (Figure 2A). Zona occludens-1 (ZO-1), l'un des composants des jonctions serrées endotheliales a été immunocolorée sans discontinuité apparente, ce qui suggère que les jonctions serrées endotheliales ont été conservés (figure 2B). La couverture pericyte endothéliale, l'étiquetteed par NG2, apparu presque continue comme décrit précédemment 25 (figure 2C). Enfin, lisse étiquetage de l'actine de muscle a révélé la présence d'une couche de cellules musculaires lisses dense à la surface des gros vaisseaux purifiés (Figure 2D). Ces résultats ont montré que l'ensemble de la structure du récipient de cerveau in situ a été conservé dans les fragments des vaisseaux isolés.

Les astrocytes ont été montrés pour envoyer de grands procédés ou "endfeet 'à la surface des vaisseaux, revêtement presque entièrement le système vasculaire cérébral 8. Leur interaction étroite avec des navires et de leur rôle dans le maintien et la régulation de différentes fonctions vasculaires cérébraux, les désigne comme un élément crucial de l'unité neurovasculaire 9. Nous avons analysé en outre la couverture vasculaire des astrocytes de vaisseaux cérébraux isolés. Immunomarquage du filament intermédiaire astrocytes GFAP, normalement présent dans l'ensemble des astrocytes (figure 3A), was que partiellement présente sur les navires purifiés montrant quelques fibres courtes à la surface de l'endothélium (figure 3B-C). En revanche, la connexine 43, une protéine de jonction d'espace fortement enrichie en membranes astrogliales périvasculaires 26, a été fortement détectée à la surface des gros vaisseaux purifié (Figure 3D) et les capillaires (Figure 3E). De même, immunomarquage de Aquaporin-4 (AQP4), un membre de la famille de canal d'eau fortement exprimé au niveau des membranes d'astrocytes face aux vaisseaux 27, 26, décrivant les parois des vaisseaux isolés (Figure 3F-G). Bien que les astrocytes ne sont pas co-purifiés avec des navires, leurs membranes endfeet périvasculaires restés attachés durant la procédure d'isolement mécanique du vaisseau du cerveau.

Enfin, nous avons examiné la contamination possible de nos préparations par d'autres types de cellules neurales. Immunomarquage des filaments intermédiaires neuronaux (NFM) (Hornung et al, 1999) a révélé la présence de quelques fibres restantes attachées aux navires, indiquant une co-purification éventuelle de quelques terminaux neuronaux (figure 4A-B). La microglie, marqué par Iba1 (figure 4C-D) et les oligodendrocytes, marqué par Olig2 (figure 4E-F) ont été détectés dans des récipients non isolés. Ainsi, les neurones, les oligodendrocytes et la microglie sont co-purifiés avec les vaisseaux cérébraux.

Ensemble, ces résultats indiquent que le protocole décrit permet la purification de fragments des vaisseaux du cerveau structurellement conservées, sur laquelle les membranes astrocytes périvasculaires restent attachés.

Figure 1
Figure 1. Résumé Schéma du protocole de purification du navire du cerveau. Les principales étapes sont présentées. Ce croquis indique les trois fractions éventuelles des navires qui peuvent être obtenus en fonction de la fi filtres utilisés (20 ou 100 um-mesh). S1: microvaisseaux et grands navires, S2: grands navires et S3:. Microvaisseaux S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Les navires isolés conservent la plupart de Leur In Situ Structure. Projections d'image confocale de navires de cerveau de souris isolé immunocolorées. (A) lame basale immunomarquées pour Agrin (rouge). (B) cellules endothéliales jonctions serrées immunomarquées pour Zonula occludens (ZO-1 ) (rouge). (C) péricytes immunomarquées pour NG2 (rouge). (D) des cellules musculaires lisses immunomarquées Muscle actine (SMA) (rouge). Les noyaux sont colorés avec Hoechst (bleu).pg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. astrocyte Endfeet membranes restent attachés aux navires purifiées. Projections d'image confocale. (A) l'image d'une section du cerveau montrant un navire corticale immunocolorées pour endothéliale Pecam (blanc), les astrocytes GFAP (en rouge) et la connexine 43 (Cx43) (vert ). (B, C) ​​GFAP immunomarquage (vert) à la surface d'un capillaire isolé marqué par isolectine b4 (blanc) (B) ou d'un grand navire étiqueté pour Muscle actine (SMA) (rouge) (C). (C) est un Re-print avec la permission de 20 (D, E) Cx43 immunomarquage (vert) à la surface d'un capillaire isolé marqué par isolectine b4 (blanc) (D) ou d'un grand navire étiqueté pour Muscle actine (SMA) (rouge) (F, G) Aquaporin 4 (AQP4) immunomarquage (vert) à la surface d'un capillaire isolé marqué par isolectine b4 (blanc) (F) ou d'un grand navire étiqueté pour Muscle actine (SMA) (rouge) (G). Les noyaux sont colorés avec Hoechst (bleu). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:.. Neurones, microglie et les oligodendrocytes ne sont pas co-purifiés avec vaisseaux cérébraux projections image confocale (A, B) Neurofilament (NFM) immunocoloration sur une tranche de 20 um d'épaisseur de l'hippocampe (rouge) (A) et les vaisseaux cérébraux purifiés ( B). (C, B) microglial Iba1 immunocoloration sur une tranche corticale 20 um d'épaisseur (red) (C) et les vaisseaux cérébraux purifiés (D). (E, F) Oligodendrocyte Olig2 immunologique sur un 20 um d'épaisseur tranche corticale (rouge) (E) et les vaisseaux cérébraux purifiés (F). Les noyaux sont colorés par Hoechst (blanc ), l'endothélium par Isolectine b4 (IB4) (vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La barrière hémato-encéphalique régule le passage de substances physiologiques dans et hors du système nerveux central et le protège contre des substances potentiellement nocives présentes dans le sang. Elle intervient dans plusieurs pathologies du système nerveux central, incluant les maladies neurodégénératives 2 et 28 tumeurs du cerveau. Le très faible perméabilité de la BHE entrave également le passage d'agents thérapeutiques ciblant les cellules neuronales et le développement de méthodes qui ont l'intention d'ouvrir de manière réversible le BBB sans conséquences néfastes pour le cerveau est un domaine de recherche très actif 3. Beaucoup d'efforts ont été faits pour développer des modèles précieux et de techniques permettant enquêtes cellulaires, moléculaires et pharmacologiques de la BHE, et en particulier, les protocoles pour isoler vaisseaux du cerveau de rongeur. Premières tentatives simplement recueillies microvaisseaux de tissu cérébral dissocié mécaniquement par variables mailles des pores de taille se défaire de contaminer les cellules du parenchyme cérébral 13, 29, 30, 31. Centrifugation en gradient de densité a été introduit plus tard associé à une filtration de vaisseaux cérébraux sur des mailles de nylon ou de billes de verre colonnes 32, 33, 15. Dans ces procédures, perle de verre par rapport à la filtration de filet de nylon est apparu pour améliorer les rendements et de haute contre centrifugation à faible vitesse, la pureté des microvaisseaux, bien centrifugation à grande vitesse induit également contrainte de cisaillement qui affecte l'expression du gène 15, 32. Une étape supplémentaire de digestion enzymatique a été également introduit dans certains protocoles après l'étape de dissociation 34 dans le but de détacher les neurones et les astrocytes adhérentes pour augmenter la pureté des microvaisseaux 35. Cependant, une pré-digestion excessive pourrait aussi perturber l'intégrité micro-capillaire 36, 37. Plus récemment, des immuno-capture microdissection laser (LCM immuno-) Il a été démontré pour permettre l'extraction des bateaux ou encore des populations de cellules distinctes dans vessels, pour examiner les changements dans l'expression des gènes BBB, bien que la quantité de matériau obtenu par cette technique est très limitée 23.

Ici, nous présentons une procédure pour une isolation mécanique des vaisseaux du cerveau initialement élaboré par Yousif et al 14. Il offre la possibilité d'obtenir des vaisseaux cérébraux purs, et de les séparer en fonction de leur diamètre. Ce protocole n'a pas la prétention de permettre la purification de l'ensemble du compartiment vasculaire cérébral, et on n'a pas comparer son efficacité avec les protocoles publiés précédents. Toutefois, l'absence de gradient, des colonnes spécifiques et les étapes de centrifugation à grande vitesse rend la procédure générale très simple et peu coûteux. Surtout, nous vous recommandons fortement de retirer le plexus choroïde, comme décrit par 38 avant homogénéisation du cerveau, comme nous l'avons vécu comme une source possible de contamination. Autres recommandations importantes sont: 1) l'utilisation de «faible liaison" mater plastiqueial (en particulier les embouts de pipette) puisque les navires adhère naturellement aux plastiques non traités. Omettre ce point se traduirait par la perte de la plupart des navires; 2) l'équilibrage soigneux des filtres de nylon avant la filtration (étape 5.2); 3) la remise en suspension du culot dans un tampon autant que possible avant la filtration afin d'améliorer la pureté de l'échantillon; 3) Si nécessaire, les cellules sanguines et des protéines piégées dans des récipients purifiés peuvent être éliminés par lavage par perfusion intracardiaque avec du PBS avant la dissection du cerveau; 4) Le rendement des navires purifiée pourrait être améliorée en répétant la séparation de la myéline dans dextrane deux ou trois fois (étape 4.2) 39,40. Pour immunocoloration, nous recommandons vivement de: 1) pour effectuer un marquage nucléaire afin de distinguer les navires de contaminer les poils et poussières pour lesquels des anticorps ont une grande affinité non spécifique; 2) pour éviter la collecte de récipients par centrifugation avant chaque changement de milieu comme il peut en résulter la formation d'une balle de matériau inextricable.

Purification de vaisseaux cérébraux intacts présentent de grands avantages à étudier les caractéristiques moléculaires du Bureau. Bien que endothéliales et péricytes gènes et les voies spécifiques ou enrichies ont été identifiés par des études transcriptomiques et protéomiques sur des types cellulaires individuels 18,19, il est bien connu que les techniques de dissociation et le tri de cellules conduisent à la perte de la polarité cellulaire et morphologie ainsi que l'interconnexion entre types de cellules, qui ont une incidence fortement leurs profils moléculaires. Dans ce contexte, en gardant l'ensemble du compartiment vasculaire intact tel que décrit ici, à l'exception des astrocytes, peut représenter un grand avantage. En outre, par rapport au tri de cellules, purification des vaisseaux cérébraux ne nécessite pas l'utilisation de souches de souris transgéniques rapporteur ou procédures spécifiques sur la base d'immunocoloration-longues. Un autre avantage de l'utilisation des vaisseaux cérébraux est la possibilité d'adapter le protocole de purification pour d'autres espèces comme déjà montré pour murine14, Bovine13 ainsi que chez les humains 41,42. Enfin, un autre développement de la présente technique serait la culture in vitro de fragments vaisseaux du cerveau. Co-culture de vaisseaux purifiés avec les neurones d'astrocytes primaires et les cellules microgliales pourrait aider à rassembler l'unité neurovasculaire d'une manière précise que complexes en 3 dimensions des systèmes de culture multicellulaires où les cellules sont d'abord isolées et purifiées avant d'être réassemblé 43. Ainsi purification des vaisseaux cérébraux intacts pourrait être d'une grande aide pour le développement de tout type d'essais in vitro pour étudier le Bureau.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Labex MemoLife et par l'ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en plaques)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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