Purificazione delle navi cervello di topo

Neuroscience

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Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

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Abstract

Nel cervello, la maggior parte del sistema vascolare costituito da una barriera selettiva, la barriera emato-encefalica (BBB) ​​che regola lo scambio di molecole e cellule immunitarie tra il cervello e il sangue. Inoltre, la grande richiesta metabolica neuronale richiede un regolamento momento per momento del flusso sanguigno. In particolare, le anomalie di questi regolamenti sono le caratteristiche distintive eziologici della maggior parte delle patologie cerebrali; compresi glioblastoma, ictus, edema, epilessia, malattie degenerative (es: la malattia di Parkinson, il morbo di Alzheimer), tumori cerebrali, così come le condizioni infiammatorie come la sclerosi multipla, la meningite e sepsi indotta disfunzioni cerebrali. Pertanto, la comprensione degli eventi di segnalazione che modulano la fisiologia cerebrale è una sfida importante. Molto comprensione delle proprietà cellulari e molecolari dei vari tipi di cellule che compongono il sistema cerebrovascolare può essere acquisita da coltura primaria o separazione delle cellule dal tessuto cerebrale di recente dissociato. Però,proprietà come polarità cellulare, morfologia e rapporti intercellulari non sono mantenuti in tali preparazioni. Il protocollo che descriviamo qui è concepito per purificare frammenti dei vasi cerebrali, mantenendo l'integrità strutturale. Abbiamo dimostrato che i vasi isolati costituiti da cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette che sono circondati da una lamina basale continuo. Periciti, cellule muscolari lisce e le membrane astrociti endfeet perivascolari rimangono attaccati allo strato endoteliale. Infine, si descrive come eseguire gli esperimenti di immunoistochimica sui vasi cerebrali purificate.

Introduction

Il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale (CNS) richiede un ambiente extracellulare altamente regolato, e le sue richieste metaboliche sono enormi rispetto ad altri organi 1. Il CNS è anche estremamente sensibile a una vasta gamma di prodotti chimici, generalmente innocui agli organi periferici, ma ad esso, neurotossico. Per un corretto funzionamento, la maggior parte del 'vascolare CNS costituisce una barriera endoteliale; la barriera emato-encefalica (BBB), che controlla il flusso di molecole e ioni così come il passaggio di cellule immunitarie tra il sangue e il cervello, mantenendo quindi una corretta omeostasi 2, ma anche limitando l'ingresso di farmaci terapeutici, trattamenti ostacolano pertanto di disturbi neurologici 3. A livello cellulare, il BBB è sostenuta principalmente da ampi giunzioni strette tra le cellule endoteliali, espressione polarizzata dei trasportatori di efflusso e un tasso molto basso transcitosi 4. Proprietà e funzioni del BBB sono per lo più indotte da NEcellule ighboring 4. In particolare, periciti svolgono un ruolo importante nel indurre e mantenere la BBB 5,6. Essendo le cellule contrattili, periciti regolano anche il flusso di sangue 7 come le cellule della muscolatura liscia che circondano i grandi vasi. Infine, astrociti, le principali cellule gliali del cervello, inviano grandi processi denominati endfeet intorno la maggior parte del sistema vascolare cerebrale 8 e modulare l'integrità BBB e quiescenza immunitario 9, il trasferimento di metaboliti di neuroni 10, e indurre l'accoppiamento stretto tra l'attività neuronale e il flusso di sangue 11,12.

La possibilità di studiare le proprietà molecolari e cellulari del sistema cerebrovascolare è fondamentale per caratterizzare meglio il suo contributo alla fisiologia del cervello e fisiopatologia. Per affrontare questo problema, sono state sviluppate strategie per isolare il sistema cerebrovascolare del cervello, che consentono per la preparazione di frammenti dei vasi cerebrali intatti. Cerebral nave purification è stata inizialmente descritta utilizzando cervelli bovini 13 e migliorato e adattato ad altre specie, in particolare roditori 14. In questo ultimo studio, l'uso di filtri di varie dimensioni è stato introdotto per separare vasi cerebrali in per frazioni arricchite in vasi di diametri diversi. È interessante notare che, in tali preparati, le cellule endoteliali mantenuto le loro proprietà metaboliche 15, funzionalità trasportatore 16 e 17 di polarizzazione. Qui, descriviamo in dettaglio questo protocollo e inoltre dimostrare che le navi isolate mantengono la maggior parte di loro in strutture in situ. Le cellule endoteliali restano legati da giunzioni strette e circondate da una lamina basale continuo. Periciti e cellule muscolari lisce rimangono attaccati allo strato endoteliale, così come membrane astrociti perivascolari. Tuttavia, astrociti, cellule microgliali, neuroni e oligodendrociti sono eliminati. Infine, si descrive una procedura per eseguire immunocolorazione sui vasi cerebrali isolate. Fino ad ora la maggior parte degli studi molecolari e cellulari riguardanti il sistema cerebrovascolare sono stati eseguiti su cellule dei vasi cerebrali purificate dissociati da cellule di smistamento utilizzando cellulari specifici ceppi di topi giornalista o procedure basate immunocolorazione-18,19. Sebbene queste tecniche consente l'isolamento delle popolazioni cellulari quasi puro cerebrovascolari, cellule isolate perdono completamente la loro morfologia e in situ interazioni, che a sua volta, influisce notevolmente le loro proprietà molecolari e cellulari. Il protocollo qui descritto, consentendo l'isolamento di interi frammenti cerebrovascolari senza necessità di anticorpi specifici o macchie di topi transgenici, offre una buona alternativa come la struttura complessiva di isolati vasi cerebrali è conservato, quindi, diminuendo ripercussioni sulla loro proprietà molecolari. Isolato imbarcazioni potrebbero quindi essere utilizzati per studiare l'attività dei geni, la sintesi proteica e la regolamentazione a BBB come recentemente descritto 20,21 22,23 il presente protocollo è poco costoso, facile da eseguire e rapidamente adattabile a qualsiasi laboratorio.

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Protocol

1. Soluzioni e materiali

  1. Preparare le soluzioni di isolamento dei vasi: B1, aggiungere 1,5 ml di HEPES 1M a 150 ml di HBSS; B2, aggiungere 3,6 g di destrano al 20 ml di B1; B3, aggiungere 1 g di BSA a 100 ml di B1.
  2. Modificare il portafiltro tagliando il fondo al largo della parte superiore avvitamento.
  3. Preparare le soluzioni di immunoistochimica: soluzione di fissaggio, 4% paraformaldeide in PBS pH 7,4; Permeabilization / soluzione bloccante, diluire siero di capra al 5% e Triton X100 al 0,25% in PBS pH 7,4.
    Nota: Fixation dipende dal tipo di anticorpi primari utilizzati.

2. Dissection

Nota: le condizioni sterili non sono richieste, a meno che le navi sono utilizzati per scopi di colture cellulari.

  1. Preparare un bicchiere da 150 ml con 20 ml di B1. Continuate a ghiaccio e coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell'aria.
  2. Profondamente anestetizzare il mouse sotto una cappa con un piccolo asciugamano di carta imbevuto di 1 ml di isoflurano puro che viene aggiunto into la gabbia. L'anestesia è verificata da una mancanza di reazione ad una presa punta. Uccidere il mouse dislocazione cervicale.
    NOTA: Questi passaggi sono realizzate nel rispetto della normativa nazionale e istituzionale.
  3. Opzionale: eseguire perfusione intracardiaca con 20 ml di PBS 1x per eliminare il contenuto del sangue 24.
  4. Sezione la pelle con un bisturi dal collo al naso e tirarlo via. Rimuovere tutti i peli contaminanti con PBS 1x.
  5. Per aprire il cranio, prima inserire forbici anteriormente al bulbo olfattivo, e aprire le forbici per rompere il cranio in due parti.
  6. Rimuovere con attenzione il cervello con una spatola cerebrale. Sezionare plessi corioidei dei ventricoli laterali come sarebbero contaminare il sangue di preparazione nave 38.
    NOTA: Opzionale: La preparazione finale conterrà vasi parenchimali e le meningi. Se non si desidera, le meningi possono essere staccata seguendo la procedura descritta da 38.
  7. Transfer cervello nel becher contenente soluzione B1 su ghiaccio. Fino a 8 cervelli possono essere trattati insieme.

3. tessuto cerebrale omogeneizzazione

  1. Utilizzando due bisturi, manualmente e vigorosamente battere il cervello nella soluzione B1 ottenere successivamente pezzetti di circa 2 mm.
  2. Omogeneizzare preparato, con un Dounce omogeneizzatore automatizzata, l'esecuzione di 20 colpi a 400 rpm. Assicurarsi che il tubo di vetro è mantenuto in ghiaccio e che la parte superiore del douncer è in soluzione quando si spostano su e giù, in modo da impedire la formazione di sacche d'aria. Se diversi campioni sono preparati, lavare il douncer con acqua ionizzata tra ogni omogeneizzazione.

4. Vessel Purificazione

  1. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo di plastica da 50 ml e procedere alla centrifugazione a 2.000 g per 10 min a 4 ° C. Un grande interfaccia bianca (principalmente mielina) formerà sulla parte superiore del serbatoio pellet (rosso se è stata eseguita alcuna perfusione).
  2. Scartare il surnatante. Il pellet nave e l'interfaccia bianco rimarrà attaccato insieme. Aggiungere 20 ml di soluzione B2 ghiacciata e agitare il tubo manualmente e vigorosamente per 1 min.
  3. Procedere alla seconda centrifugazione a 4.400 g per 15 minuti a 4 ° C. La mielina ora formare uno strato bianco densa alla superficie del supernatante.
  4. Staccare accuratamente lo strato mielina dalle pareti del tubo tenendo il tubo e ruotare lentamente per permettere il surnatante di passare lungo le pareti. Eliminare mielina con il surnatante. Il pellet contenente i vasi rimane attaccato al fondo della provetta.
  5. Tamponare la parete interna del tubo con carta assorbente avvolto intorno ad un pipetta da 5 ml e rimuovere tutti i residui di liquido, evitare di toccare il pellet recipiente. Tenere il tubo capovolto su una carta assorbente per drenare eventuali residui di liquido.
  6. Sospendere il pellet in 1 ml di soluzione B3 ghiacciata pipettando su e giù con punte basso vincolante, keeping la provetta in ghiaccio, quindi aggiungere altri 5 ml di soluzione B3. Assicurarsi che le navi sono disperse, per quanto possibile e non formano aggregati.

5. Filtrazione

  1. Preparare un becher su ghiaccio con 30 ml di soluzione B3 ghiacciata. Coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell'aria.
  2. Collocare un filtro da 20 micron a maglia su un portafiltro modificato sulla sommità di un pallone becker ed equilibrare applicando 10 ml di soluzione B3 ghiacciata.
  3. Versate la preparazione nave sul filtro e sciacquare i vasi con 40 ml di soluzione B3 ghiacciata.
  4. Recuperare il filtro con pinze pulite e immergere immediatamente nel bicchiere contenente la soluzione B3. Staccare i vasi dal filtro scuotendolo delicatamente.
  5. Versare il contenuto becher in un tubo di plastica da 50 ml e centrifugare a 2000 g per 5 minuti a 4 ° C.
  6. Nota: in alternativa, la sospensione dei vasi cerebrali 'dal punto 4.6 può essere filtrata su un filtro a maglie micron 100.In questo caso, più grandi vasi sono preferenzialmente trattenuta dal filtro mentre il flow-through contiene microvasi (principalmente capillari), che vengono poi filtrati su un filtro 20 micron a maglie come sopra.
  7. Risospendere il pellet di microvasi in 1 ml di soluzione B3 ghiacciata e trasferirlo pipettando in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Centrifugare a 2.000 g per 5 minuti a 4 ° C.

6. Fissazione, permeabilizzazione e blocco

  1. Vasi di trasferimento pipettando nella 0,2 ml provette PCR contenenti PBS usando una bassa punta vincolante 1,0 ml. Fare attenzione a non toccare i vasi in quanto potrebbero aderire alla parte esterna della punta. Eseguire le seguenti operazioni al microscopio binoculare.
  2. Per ciascuno dei seguenti cambiamenti medi, lasciare i tubi in ghiaccio fino vasi hanno raggiunto il fondo, e pipettare la maggior parte dei liquidi con puntali gel-caricamento lunghi e cosa.
  3. Eliminare la maggior parte PBS e aggiungere 200 ml di soluzione di fissativo.Sospendere i vasi agitando delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  4. Pipettare la soluzione fissativo e sostituirlo con 200 ml di PBS 1x (primo lavaggio), incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e ripetere l'operazione 3 volte. Ogni volta, verificare che le navi sono affondate correttamente al fondo delle provette e pipetta su PBS 1x, assicurando le navi non sono toccati.
  5. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire PBS 1x dal / soluzione di bloccaggio permeabilizzazione e incubare 1 ora a temperatura ambiente, risospendere i vasi agitando delicatamente di tanto in tanto.

7. Immunostaining

  1. Sostituire la / soluzione di bloccaggio permeabilizzazione con il mix di anticorpi primari (vedi riferimenti degli anticorpi utilizzati qui e diluizioni nella tabella modello Materials) diluito in / soluzione di blocco permeabilizzazione, e incubare a 4 ° CO / N.
  2. Dopo 3 lavaggi in PBS a temperatura ambiente, incubare le navi con il mix di anticorpi secondari diluito in PBS per 2 orea RT.
  3. Nota: si consiglia vivamente di eseguire una colorazione nucleare con Hoechst (1: 2.000) o DAPI (1: 2.000), al fine di distinguere le navi di possibile contaminazione peli o polveri sotto il microscopio.
  4. Dopo 3 lavaggi in PBS, risospendere le navi in ​​50 ml di PBS.

8. Montaggio e di osservazione

  1. Preparare una punta con un capillare di vetro siliconato: tagliare una punta di pipetta P200 con un bisturi e regolare il capillare all'interno. Il volume approssimativo del capillare è di 40 microlitri.
  2. Trasferire le navi ad un vetrino utilizzando il capillare di vetro siliconato e rimuovere con attenzione il liquido con un pezzo di carta assorbente.
  3. Applicare una sola goccia di soluzione di montaggio sulle navi e in possesso di un vetrino a 45 ° permettendo al calo di diffusione lungo il bordo dello slip. Lasciate andare la vetrino e lasciare medio di diffondersi lentamente. Lasciare asciugare O / N a RT con protezione dalla luce. Le navi possono essere osservati sotto un flmicroscopio confocale ent.

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Representative Results

Qui, descriviamo un protocollo che consente l'isolamento meccanico dei vasi cerebrali 14. La figura 1 riassume le fasi principali di questa tecnica. L'architettura dei vasi cerebrali è complesso e comprende vari tipi di cellule, cioè, cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette e circondati da periciti, cellule muscolari lisce e processi piede astrociti 9. Così, dopo l'isolamento dei vasi cerebrali, abbiamo voluto caratterizzare la struttura dei vasi purificati mediante immunocolorazione come descritto nella seconda parte del nostro protocollo. Agrin, un componente della lamina basale dell'endotelio è continuo e omogeneo etichettato in superficie endoteliale (Figura 2A). Zona occludere-1 (ZO-1), uno dei componenti di giunzioni strette endoteliali stato immunostained senza discontinuità apparente, suggerendo che le giunzioni strette endoteliali sono state conservate (Figura 2B). La copertura pericyte endoteliale, etichettacato da NG2, apparso quasi continua, come descritto in precedenza 25 (Figura 2C). Infine, etichettatura actina muscolo liscio ha rivelato la presenza di uno strato di cellule muscolari lisce fitta in corrispondenza delle superfici di grandi vasi purificati (Figura 2D). Questi risultati hanno dimostrato che il complesso in situ struttura del vaso cerebrale è stata conservata in frammenti isolati vaso.

Gli astrociti sono stati indicati per inviare grandi processi o 'endfeet' alla superficie dei vasi, guaina quasi completamente il sistema cerebrovascolare 8. La loro stretta interazione con i vasi e il loro ruolo nel mantenimento e regolare varie funzioni cerebrovascolari, li designati come una parte cruciale del gruppo neurovascolare 9. Abbiamo analizzato ulteriormente la copertura vascolare astrociti dei vasi cerebrali isolate. Immunolabelling del filamento intermedio astrociti GFAP, presente normalmente in tutto il astrociti (figura 3A), was solo parzialmente presenti su navi purificati mostrano alcune fibre corte sulla superficie endoteliale (Figura 3B-C). Al contrario, Connexin 43, una proteina giunzione gap altamente arricchito in perivascolari membrane astrogliali 26, era altamente rilevato alla superficie dei recipienti purificati grandi (Figura 3D) e capillari (Figura 3E). Allo stesso modo, immunolabelling di Aquaporin-4 (AQP4), un membro della famiglia canale d'acqua notevolmente espresso a livello delle membrane astrociti di fronte alle imbarcazioni 27, 26, delineando le pareti dei vasi isolati (Figura 3F-G). Anche se astrociti non sono state co-purificate con le navi, le loro membrane endfeet perivascolari rimasti attaccati durante la procedura meccanica di isolamento vaso cerebrale.

Infine, abbiamo esaminato la possibile contaminazione della nostra preparazione da parte di altri tipi di cellule neurali. Immunolabelling di filamenti intermedi neuronali (NFM) (Hornung et al, 1999) ha rivelato la presenza di poche fibre rimanenti allegate ai vasi, indicando una possibile co-purificazione di alcuni terminali neuronali (Figura 4A-B). Microglia, etichettati da Iba1 (Figura 4C-D) e gli oligodendrociti, etichettati da Olig2 (Figura 4E-F), non sono stati rilevati nei vasi isolati. Così, i neuroni, microglia e oligodendrociti non erano co-purificate con i vasi del cervello.

Insieme, questi risultati indicano che il protocollo descritto consente la purificazione di frammenti dei vasi cerebrali strutturalmente conservati, su cui membrane astrociti perivascolari rimangono attaccati.

Figura 1
Figura 1. Schema Sintesi della Purificazione protocollo cervello vaso. I passi principali sono presentati. Questo disegno indica tre possibili frazioni vaso ottenibili seconda del fi ltri utilizzati (20 o 100 micron-mesh). S1: microvasi e grandi vasi, S2: grandi vasi e S3:. Microvasi Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Isolati recipienti mantenere la maggior parte di loro in situ struttura. Proiezioni di immagini confocale di vasi del cervello di topo isolato immunostained. (A) lamina basale immunolabelled per Agrin (rosso). (B) delle cellule endoteliali giunzioni strette immunolabelled per zonula occludere (ZO-1 ) (rosso). (C) periciti immunolabelled per NG2 (rosso). (D) cellule muscolari lisce immunolabelled per muscolo liscio actina (SMA) (rosso). I nuclei sono colorati con Hoechst (blu).pg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. astrociti Endfeet Membrane rimangono attaccati alla Vessels purificata. Proiezioni di immagini confocale. (A) Immagine di una sezione che mostra un vaso cerebrale corticale immunostained per endoteliale PECAM (bianco), astrociti GFAP (rosso) e connessina 43 (Cx43) (verde ). (B, C) ​​GFAP immunolabelling (verde) sulla superficie di un capillare isolato etichettati da isolectin b4 (bianco) (B), o di un grande vaso etichettato per Actina muscolo liscio (SMA) (rosso) (C). (C) è un Re-stampa con l'autorizzazione da 20 (D, E) Cx43 immunolabelling (verde) sulla superficie di un capillare isolato etichettati da isolectin b4 (bianco) (D) o di un grande vaso etichettato per muscolo liscio actina (SMA) (rosso) (F, G) Aquaporin 4 (AQP4) immunolabelling (verde) sulla superficie di un capillare isolato etichettati da isolectin b4 (bianco) (F) o di un grande vaso etichettato per muscolo liscio actina (SMA) (red) (G). I nuclei sono colorati con Hoechst (blu). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:.. Neuroni, microglia e oligodendrociti sono non co-purificate con vasi del cervello proiezioni di immagini confocale (A, B) Neurofilament (NFM) immunocolorazione su una fetta di 20 micron di spessore ippocampale (rosso) (A) e dei vasi cerebrali purificate ( B). (C, B) microglia Iba1 immunostaining su 20 micron di spessore fetta corticale (rndr) (C) e dei vasi cerebrali purificate (D). (E, F) Oligodendrocyte Olig2 immunostaining su 20 micron di spessore fetta corticale (rosso) (E) e dei vasi cerebrali purificate (F). I nuclei sono macchiati da Hoechst (bianco ), endotelio da Isolectine b4 (IB4) (verde). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La barriera ematoencefalica regola il passaggio di sostanze fisiologiche dentro e fuori del sistema nervoso centrale e lo protegge da sostanze potenzialmente nocivi presenti nel sangue. E 'coinvolto in diverse patologie del sistema nervoso centrale, tra cui le malattie neurodegenerative 2 e tumori cerebrali 28. La bassissima permeabilità della BBB ostacola anche il passaggio di agenti terapeutici mirati cellule neurali e lo sviluppo di metodi che intendono aprire reversibilmente BBB senza conseguenze deleterie per il cervello è un campo di ricerca molto attiva 3. Sono stati fatti molti sforzi per sviluppare modelli preziosi e tecniche che permettono indagini cellulari, molecolari e farmacologici del BBB, in particolare, i protocolli per isolare i vasi dal cervello dei roditori. I primi tentativi microvasi da tessuto cerebrale dissociato meccanicamente utilizzando maglie pori di dimensioni variabili per scartare contaminare cellule parenchimali cervello 13 raccolti semplicemente, 29, 30, 31. Gradiente di densità centrifugazione è stato successivamente introdotto associata alla filtrazione dei vasi cerebrali in mesh di nylon o in perle di vetro colonne 32, 33, 15. In queste procedure, perle di vetro contro filtrazione rete di nylon apparve a migliorare la resa e alta rispetto a centrifugazione a bassa velocità, microvasi purezza, anche se la centrifugazione ad alta velocità induce anche sforzo di taglio che colpisce l'espressione genica 15, 32. È stato introdotto anche un ulteriore fase di digestione enzimatica in alcuni protocolli dopo la fase di dissociazione 34 allo scopo di separare i neuroni e astrociti aderenti aumentare microvasi purezza 35. Tuttavia, un eccessivo pre-digestione potrebbe anche compromettere l'integrità microcapillari 36, 37. Più recentemente, immuno-cattura microdissezione laser (LCM immuno-) ha dimostrato di consentire il recupero di navi o anche di distinte popolazioni cellulari in vessels, per esaminare i cambiamenti nell'espressione genica BBB, sebbene la quantità di materiale ottenuto con questa tecnica è molto limitata 23.

Qui vi presentiamo una procedura per un isolamento meccanico di vasi del cervello inizialmente elaborata da Yousif et al 14. Offre la possibilità di ottenere vasi cerebrali puri, e per separarli in base al loro diametro. Questo protocollo non pretende di permettere la purificazione di tutto il compartimento vascolare del cervello, e non abbiamo fatto confrontare la sua efficacia con i protocolli pubblicati precedenti. Tuttavia, l'assenza di gradiente, colonne specifiche e le fasi di centrifugazione ad alta velocità rende la procedura generale molto semplice e poco costoso. È importante sottolineare che, si consiglia vivamente di rimuovere le plesso coroideo come descritto da 38 prima di omogeneizzazione del cervello, come abbiamo sperimentato come una possibile fonte di contaminazione. Altre raccomandazioni importanti sono: 1) l'uso di "basso legame" mater plasticaIAL (in particolare le punte delle pipette) poiché le navi aderiscono naturalmente alle materie plastiche non trattate. Tralasciando questo punto comporterebbe la perdita della maggior parte dei vasi; 2) l'attenta equilibrazione di filtri di nylon prima della filtrazione (passo 5.2); 3) risospensione del pellet in quanto buffer come possibile prima filtrazione per migliorare la purezza del campione; 3) Se necessario, le cellule del sangue e proteine ​​intrappolati nei vasi purificati possono essere lavati da intracardiaca perfusione con PBS prima dissezione del cervello; 4) La resa di navi purificati potrebbe essere migliorata ripetendo la separazione dalla mielina in destrano due o tre volte (passo 4.2) 39,40. Per immunostaining, si consiglia vivamente di: 1) per eseguire una etichettatura nucleare al fine di distinguere i vasi di contaminare peli e polveri per i quali gli anticorpi hanno grande affinità non specifico; 2) per evitare di raccogliere i vasi per centrifugazione prima di ogni variazione media in quanto può portare alla formazione di una palla inestricabile di materiale.

Purificazione dei vasi cerebrali intatte presentare grandi vantaggi per studiare le caratteristiche molecolari di BBB. Sebbene geni e vie endoteliali e periciti specifici o arricchiti sono stati identificati da studi trascrittomica e proteomica su tipi cellulari individuali 18,19, è ben noto che le tecniche di dissociazione e la separazione delle cellule portano alla perdita della polarità e la morfologia cellulare e interconnessione tra tipi di cellule, che influenzano fortemente i loro profili molecolari. In questo contesto, mantenendo l'intero compartimento vascolare intatto come descritto qui, con l'eccezione degli astrociti, potrebbe rappresentare un grande vantaggio. Inoltre, rispetto alla separazione delle cellule, la purificazione dei vasi cerebrali non richiede l'uso di specifici ceppi di topi transgenici giornalista o procedure basate immunocolorazione-lunghi. Un altro vantaggio per l'uso di vasi cerebrali è la possibilità di adattare il protocollo di purificazione ad altre specie come già indicato per murine14, Bovine13 nonché nell'uomo 41,42. Infine, un ulteriore sviluppo della tecnica attuale sarebbe la coltura in vitro di vasi cerebrali frammenti. Co-cultura dei vasi purificati con neuroni astrociti primarie e cellule della microglia potrebbe aiutare a ricomporre l'unità neurovascolare in modo accurato di complessi 3-dimensionale sistemi di coltura pluricellulari dove le cellule vengono prima isolati e purificati prima di essere rimontato 43. Così la purificazione dei vasi cerebrali intatti potrebbe essere di grande aiuto per lo sviluppo di qualsiasi tipo di test in vitro per studiare la BBB.

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Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal LABEX MemoLife e dal ARSEP (Fondazione per l'aide à la recherche sur la sclérose en placche)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77, (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468, (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508, (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58, (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7, (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14, (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468, (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10, (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185, (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276, ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166, (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192, (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5, (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34, (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35, (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9, (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14, (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23, (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25, (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17, (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44, (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21, (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207, (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17, (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24, (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94, (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70, (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

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