Rening av Mouse Brain Fartyg

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I hjärnan är de flesta av det vaskulära systemet består av en selektiv barriär, blod-hjärnbarriären (BBB), som reglerar utbytet av molekyler och immunceller mellan hjärnan och blodet. Dessutom kräver den stora neuronala metaboliska efterfrågan ett ögonblick till ögonblick reglering av blodflödet. Noterbart är, avvikelser i dessa föreskrifter är etiologiska kännetecken flesta hjärn sjukdomar; inklusive glioblastom, stroke, ödem, epilepsi, degenerativa sjukdomar (ex: Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom), hjärntumörer, liksom inflammatoriska tillstånd såsom multipel skleros, hjärnhinneinflammation och sepsis inducerad hjärn dysfunktioner. Således, förstå de signaleringshändelser som modulerar cerebrovaskulär fysiologi är en stor utmaning. Mycket insikt i de cellulära och molekylära egenskaper hos de olika celltyper som utgör det cerebrovaskulära systemet kan fås från primär kultur eller cellsortering från nyligen dissocierade hjärnvävnad. Dock,egenskaper såsom cellpolaritet, morfologi och inter relationer inte upprätthålls i sådana preparat. Protokollet som vi beskriver här är utformad för att rena hjärnfartygsfragment, samtidigt som strukturell integritet. Vi visar att isolerade kärl består av endotelceller förseglats av tight junctions som är omgivna av en kontinuerlig basal lamina. Pericyter, glatta muskelceller samt perivaskulära astrocyternas endfeet membran sitter kvar endotelskiktet. Slutligen beskriver vi hur du utför immunfärgning experiment på renade hjärn fartyg.

Introduction

Korrekt funktion av det centrala nervsystemet (CNS) kräver en starkt reglerad extracellulär miljö, och dess metaboliska krav är stora jämfört med andra organ 1. CNS är också extremt känsliga för ett brett spektrum av kemikalier, i allmänhet ofarliga för perifera organ, men att det, neurotoxiskt. För att säkerställa korrekt funktion, de flesta av CNS "kärl bildar en endotel barriär; blod-hjärnbarriären (BBB), som styr flödet av molekyler och joner samt passage av immunceller mellan blodet och hjärnan, och därigenom bibehålla korrekt homeostas 2, men även att begränsa inträdet av terapeutiska läkemedel, på så sätt hämmar behandlingar av neurologiska störningar 3. På cellnivå är BBB främst stöds av omfattande täta förbindelser mellan endotelceller, polariserade uttryck av utflödes transportörer och en mycket låg transcytos hastighet 4. Egenskaper och funktioner hos BBB är mestadels induceras av neighboring celler 4. Särskilt pericyter spela en viktig roll vid inducering och bibehållande av BBB-5,6. Att kontraktila celler, pericyter reglerar också blodflödet 7 som gör glatta muskelceller som omger stora fartyg. Slutligen, astrocyter, de stora gliaceller i hjärnan, skicka stora processer heter endfeet runt större delen av hjärnan kärl 8 och modulera BBB integritet och immun quiescence 9, överföring av metaboliter neuroner 10, och förmå den täta kopplingen mellan neuronal aktivitet och blodflödet 11,12.

Möjligheten att studera de molekylära och cellulära egenskaper hos cerebrovaskulära systemet är avgörande för att karakterisera bättre dess bidrag till hjärnan fysiologi och patofysiologi. För att ta itu med denna fråga, har strategier för att isolera hjärnans cerebrovaskulär system utvecklats, som gör det möjligt för framställning av intakta hjärnfartygsfragment. Cerebral kärl purification ursprungligen beskrivas med nötkreatur hjärnor 13 och förbättras och anpassas till andra arter, i synnerhet gnagare 14. I denna sista studie användning av filter av varierande storlek införts för att separera hjärnan fartyg till fraktioner anrikade på fartyg av olika diametrar. Intressant i sådana preparat, endotelceller hållit sina metaboliska egenskaper 15, transportör funktionalitet 16 och polarisering 17. Här beskriver vi i detalj detta protokoll och ytterligare visar att isolerade fartyg behålla de flesta av deras in situ strukturer. Endotelceller förblir förenade genom tight junctions och omgiven av en kontinuerlig basal lamina. Pericyter och glatta muskelceller sitter kvar endotelskiktet, liksom perivaskulära astrocyternas membran. Emellertid är astrocyter mikrogliaceller, nervceller och oligodendrocyter elimineras. Slutligen beskriver vi ett förfarande för att utföra immunfärgning på isolerade hjärn fartyg. Hittills har de flesta av de molekylära och cellulära studier beträffande cerebrovaskulära systemet har utförts på renade hjärnkärlceller dissocierade genom cellsortering med hjälp av cellspecifika reporter musstammar eller immunfärgning baserade förfaranden 18,19. Även om dessa tekniker möjliggör för isolering av nästan rena cerebrovaskulära cellpopulationer, isolerade celler förlorar helt deras in situ-morfologi och interaktioner, vilket i sin tur, påverkar i hög grad deras molekylära och cellulära egenskaper. Protokollet som beskrivs här, vilket möjliggör isolering av hela cerebrovaskulära fragment utan behov av specifika antikroppar eller transgena mus fläckar, erbjuder ett bra alternativ eftersom den övergripande strukturen av isolerade cerebrala kärl är konserverad på så sätt, vilket minskar återverkningar på deras molekylära egenskaper. Isolerade fartyg kan sedan användas för att studera geners aktivitet, proteinsyntesen och reglering på BBB som nyligen beskrivits 20,21 22,23 det nuvarande protokollet är billigt, lätt att utföra och snabbt anpassas för att alla laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lösningar och material

  1. Bered isolering fartygslösningar: B1, tillsätt 1,5 ml HEPES 1M till 150 ml HBSS; B2, tillsätt 3,6 g dextran till 20 ml B1; B3, tillsätt 1 g BSA till 100 ml B1.
  2. Ändra filterhållaren genom att skära botten av den övre skruvdelen.
  3. Förbered immunfärgning lösningar: fixeringslösning, 4% paraformaldehyd i PBS pH 7,4; Permeabilisering / blockeringslösning, utspädd getserum till 5% och Triton X100 till 0,25% i PBS, pH 7,4.
    Anmärkning: Fixering beror på typen av primära antikroppar användes.

2. Dissektion

Obs: Sterila betingelser krävs inte, om inte fartyg används för cellkulturändamål.

  1. Förbered en 150 ml bägare med 20 ml av B1. Håll på is och täck med parafilm för att undvika luftföroreningarna.
  2. Djupt söva musen under huven med en liten pappershandduk indränkt i 1 ml ren Isofluran som läggs into buren. Anestesi verifieras genom en brist på reaktion på en tå nypa. Döda musen genom halsdislokation.
    OBS! Dessa steg utförs i enlighet med nationella och institutionella regler.
  3. Tillval: Utför intrakardiell perfusion med 20 ml PBS 1x för att eliminera innehållet blod 24.
  4. Avsnitt huden med en skalpell från halsen till näsan och dra bort. Ta bort alla förorenande hårstrån med PBS 1x.
  5. För att öppna skallen, först sätta en sax anteriorly till luktbulben, och öppna sax för att spräcka skallen i två delar.
  6. Försiktigt bort hjärnan med hjälp av en hjärna spatel. Dissekera ut choroid plexus från de laterala ventriklama som de skulle förorena blodkärls framställning 38.
    OBS: Tillval: Den slutliga beredningen innehåller parenkyma och mening fartyg. Om inte önskas kan meninger skalas av att följa det förfarande som beskrivs av 38.
  7. Transfer hjärnan i bägaren innehållande B1 lösningen på is. Upp till 8 hjärnor kan behandlas tillsammans.

3. hjärnvävnad Homogenisering

  1. Med hjälp av två skalpeller, manuellt och kraftfullt slå hjärnan i B1 lösningen därefter få små bitar av ca 2 mm.
  2. Homogenisera beredningen med en automatiserad Dounce homogenisator, utför 20 slag vid 400 rpm. Se till att glasröret hålls i is och att den övre delen av douncer är i lösning vid förflyttning uppåt och nedåt, för att förhindra att det bildas luftfickor. Om flera prover bereds, tvätta douncer med joniserat vatten mellan varje homogenisering.

4. Fartygs Rening

  1. Överför homogenatet i en 50 ml plaströret och vidare till centrifugering vid 2000 g under 10 min vid 4 ° C. En stor vit gränssnitt (mestadels myelin) kommer att ligga på toppen av kärlet pelleten (rött om ingen perfusionen utfördes).
  2. Kasta bort supernatanten. Fartyget pellet och den vita gränssnittet kommer sitta kvar tillsammans. Tillsätt 20 ml iskall B2 lösning och skaka röret manuellt och kraftigt under en minut.
  3. Gå vidare till den andra centrifugering vid 4400 g under 15 min vid 4 ° C. Myelin kommer nu att bilda en tät vit skikt vid ytan av den överstående vätskan.
  4. Försiktigt loss myelinskiktet från rörväggarna genom att hålla röret och långsamt roterande den så att supernatanten passera längs väggarna. Kassera myelin med supernatanten. Pelleten innehållande kärlen förblir fäst vid botten av röret.
  5. Blot innervägg av röret med ett absorberande papper som sätts runt en 5 ml plastpipett och ta bort alla kvarvarande vätskor, undvik att röra fartyget pelleten. Håll röret upp och ner på ett absorberande papper för att dränera eventuellt kvarvarande vätska.
  6. Suspendera pelleten i 1 ml iskall B3 lösning genom pipettering upp och ned med låg bindnings spetsar, keeping röret på is, tillsätt sedan ytterligare 5 ml B3 lösning. Se till att fartyg sprids så mycket som möjligt och inte bilda aggregat.

5. Filtrering

  1. Förbered en bägare på is med 30 ml iskall B3 lösning. Täck med parafilm för att undvika luftföroreningarna.
  2. Placera en 20 um mesh filter på ett modifierat filterhållare på toppen av en becker kolv och jämvikt genom att tillämpa 10 ml iskall B3 lösning.
  3. Häll fartyget preparatet på filtret och skölj fartygen med 40 ml iskall B3 lösning.
  4. Återställa filtret med rena pincett och omedelbart doppa den i bägaren innehållande B3 lösningen. Lossa fartyg från filtret genom att skaka det försiktigt.
  5. Häll innehållet bägaren i en 50 ml plaströr och centrifugera vid 2000 g under 5 min vid 4 ° C.
  6. Obs: Alternativt kan filtreras hjärn fartygens avstängning från steg 4,6 till 100 um mesh filter.I detta fall är större fartyg företrädesvis kvar på filtret medan genomströmning innehåller mikrokärl (främst kapillärerna), som sedan filtreras på ett 20 um-nätfilter som ovan.
  7. Återsuspendera pelleten av mikrokärl i 1 ml iskall B3 lösning och överföra den genom att pipettera den i en 1,5 ml Eppendorf-rör. Centrifugera vid 2000 g under 5 min vid 4 ° C.

6. Fixering, Permeabilization och Blockering

  1. Överför fartyg från pipett till 0,2 ml PCR-rör innehållande PBS med hjälp av en 1,0 ml låg bindnings spets. Var noga med att inte röra fartygen eftersom de kan ansluta sig till den yttre delen av spetsen. Utföra alla följande stegen under ett binokulärt mikroskop.
  2. För vardera av följande medium ändras, lämnar rören på is tills kärlen har nått botten, och pipettera de flesta av vätskorna med användning av långa och sak-gel-lastning pipettspetsar.
  3. Avlägsna det mesta av PBS och tillsätt 200 ul av fixeringslösning.Suspendera fartyg genom att skaka försiktigt och inkubera i 20 minuter vid RT.
  4. Pipett ut fixeringslösning och ersätta det med 200 pl 1x PBS (första tvätten), inkubera i 5 minuter vid RT och upprepa detta steg 3 gånger. Varje gång, kontrollera att fartyg korrekt har sjunkit till botten av rören och pipetten ut 1x PBS, säkerställa kärlen inte berört.
  5. Efter den sista tvätten, ersätta 1x PBS genom permeabilization / blockeringslösning och inkubera 1 timme vid RT, återsuspendering kärlen genom att skaka försiktigt från tid till annan.

7. Immunfärgning

  1. Byt permeabilization / blockeringslösning med blandningen av primära antikroppar (se referenser av antikropparna som används här och utspädningar i materialmallen tabellen) utspädda i permeabilization / blockeringslösning och inkubera vid 4 ° CO / N.
  2. Efter 3 tvättar i PBS vid RT, inkubera fartyg med blandningen av sekundära antikroppar utspädda i PBS under 2 timmarvid RT.
  3. Obs: Vi rekommenderar starkt att utföra nukleär färgning med Hoechst (1: 2000) eller DAPI (1: 2000) för att skilja fartyg från möjliga kontaminerande hår eller damm under mikroskop.
  4. Efter 3 tvättar i PBS, resuspendera fartyg i 50 | il PBS.

8. Montering och miljöövervakning

  1. Förbered en spets med en silikon glaskapillär: skär en P200 pipettspets med hjälp av en skalpell och justera kapillär inuti. Den ungefärliga volymen av kapillären är 40 fil.
  2. Överför fartyg till ett objektglas med hjälp av silikon glaskapillär och försiktigt bort vätskan med en bit absorberande papper.
  3. Applicera en enda droppe monteringsmedium på fartygen och håll en täck på 45º låta droppen sprida sig längs kanten av halka. Släpp av täck och låt medium för att sprida långsamt. Låt det torka O / N vid RT med skydd mot ljus. Fartyg kan observeras under en fluorescerent konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör mekanisk isolering av hjärnan fartyg 14. Figur 1 sammanfattar de viktigaste stegen i denna teknik. Arkitekturen i hjärnkärlen är komplex och omfattar flera celltyper, det vill säga, endotelceller förseglats av tight junctions och omgivna av pericyter, glatta muskelceller, och astrocyter fot processer 9. Sålunda efter isolering av hjärnkärlen, syftar vi att karaktärisera strukturen hos renade kärl genom immunfärgning som beskrivits i den andra delen av våra protokoll. Agrin, en komponent i den endoteliala basala lamina kontinuerligt och homogent märkt vid endotelytan (Figur 2A). Zona occludens-1 (ZO-1), en av komponenterna i endoteliala tight junctions ades immunfärgades med någon uppenbar diskontinuitet, vilket antyder att endotelceller tight junctions bevarades (Figur 2B). Den pericyte endothelial täckning, etiketted av NG2, verkade nästan kontinuerligt som tidigare beskrivits 25 (figur 2C). Slutligen avslöjade glattmuskelaktin märkning närvaro av en tät glatt muskelcellskikt på ytorna av stora renade kärl (figur 2D). Dessa resultat visade att den totala in situ hjärnans kärlstrukturen konserverad i de isolerade kärl fragmenten.

Astrocyter har visat att skicka stora processer, eller "endfeet" till ytan av fartygen, mantlar nästan helt och hållet cerebrovaskulära systemet 8. Deras snäva samverkan med fartyg och deras roll för att upprätthålla och reglera olika cerebrovaskulära funktioner, betecknade dem som en viktig del av neurovaskulära enheten 9. Vi analyserade vidare astrocyternas vaskulära täckningen av isolerade hjärn fartyg. Inmärkning av astrocytisk intermediärt filament GFAP, närvarande normalt i hela astrocyt (figur 3A), waendast delvis närvarande på renade fartyg visar några korta fibrer på endotelytan (Figur 3B-C) s. Däremot Connexin 43, ett gap junction-protein i hög grad anrikade på perivaskulära astrogliala membran 26, var mycket detekteras vid ytan av renade stora kärl (figur 3D) och kapillärer (figur 3E). På samma sätt, inmärkning av Aquaporin-4 (Aqp4), en medlem av vattenkanalen familjen kraftigt uttryckt i nivå med astrocyternas membranen riktade kärlen 27, 26, beskriver väggar isolerade fartyg (Figur 3F-G). Även astrocyter inte samar renas med fartyg, förblev deras perivaskulära endfeet membran fäst vid den mekaniska förfarandet av hjärnans kärl isolering.

Slutligen har vi granskat en eventuell förorening av våra förberedelser av andra nervcelltyper. Inmärkning av neuronala intermediära filament (NFM) (Hornung et al, 1999) avslöjade närvaron av få kvarvarande fibrer knutna till fartygen, vilket tyder på en möjlig samrening av några neuronala terminaler (Figur 4A-B). Mikroglia märkt av Iba1 (figur 4C-D) och oligodendrocyter, märkt av Olig2 (Figur 4E-F) inte registreras i isolerade kärl. Sålunda neuroner, mikroglia och oligodendrocyter inte var co-renades med hjärnkärlen.

Tillsammans indikerar dessa resultat att den beskrivna protokoll möjliggör rening av strukturellt bevarade hjärnkärl fragment, på vilken perivaskulära astrocytiska membran sitter kvar.

Figur 1
Figur 1. Sammanfattning Scheme of Brain Vessel reningsprotokollet. De viktigaste stegen presenteras. Denna skiss visar de tre möjliga fartygs fraktioner som kan erhållas beroende på fi lter används (20 eller 100 | j, m mesh). S1: mikrokärl och stora fartyg, S2: stora fartyg och S3:. Mikrokärl klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Enstaka fartyg behålla de flesta av deras In Situ struktur. Confocal bild projektioner av immun isolerade mus hjärnan fartyg. (A) Basal lamina immunolabelled för Agrin (röd). (B) endotelceller tight junctions immunolabelled för zonula occludens (ZO-1 ) (röd). (C) Pericyter immunolabelled för NG2 (röd). (D) Glatta muskelceller immunolabelled för glattmuskelaktin (SMA) (röd). Kärnor färgades med Hoechst (blå).pg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. astrocyt Endfeet membran sitter kvar på renade fartyg. Konfokala bildprojektioner. (A) Bild av en hjärna snitt som visar en kortikal kärl immunostained för endotel PECAM (vit), astrocytisk GFAP (röd) och Connexin 43 (Cx43) (grön ). (B, C) ​​GFAP inmärkning (grön) vid ytan av en isolerad kapillär märkt genom isolectin b4 (vit) (B) eller av ett stort kärl märkt glattmuskelaktin (SMA) (röd) (C). (C) är en Re-print med tillstånd från 20 (D, E) Cx43 inmärkning (grön) vid ytan av en isolerad kapillär märkt av isolectin b4 (vit) (D) eller av ett stort kärl märkt glattmuskelaktin (SMA) (röd) (F, G) Aquaporin 4 (Aqp4) inmärkning (grön) vid ytan av en isolerad kapillär märkt genom isolectin b4 (vit) (F) eller av ett stort kärl märkt glattmuskelaktin (SMA) (röd) (G). Kärnor färgas med Hoechst (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4:.. Nervceller, mikroglia och Oligodendrocyter är inte samar renas med Brain Fartyg Confocal bild projektioner (A, B) neurofilament (NFM) immunfärgning på en 20 pm tjock hippocampus slice (röd) (A) och renade hjärn fartyg ( B). (C, B) mikrogliaceller Iba1 immunfärgning på en 20 | im tjock kortikal skiva (red) (C) och renade hjärnkärlen (D). (E, F) Oligodendrocyte Olig2 immunfärgning på en 20 | im tjock kortikal skiva (röd) (E) och renade hjärnkärlen (F). Kärnor färgades med Hoechst (vit ), endotel av Isolectine b4 (IB4) (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Blod-hjärnbarriären reglerar passage av fysiologiska ämnen i och ut ur CNS och skyddar den mot potentiellt skadliga ämnen som finns i blodet. Det är involverad i flera CNS-patologier, inklusive neurodegenerativa sjukdomar 2 och hjärntumörer 28. Den extremt låga permeabilitet BBB hämmar också passagen av läkemedel inriktade på neurala celler och utveckling av metoder för avsikt att reversibelt öppna BBB utan skadliga konsekvenser för hjärnan är ett mycket aktivt forskningsområde 3. Många försök har gjorts för att utveckla värdefulla modeller och tekniker som gör det möjligt cellulära, molekylära och farmakologiska undersökningar av BBB, och särskilt protokoll för att isolera fartyg från gnagare hjärnan. Första försök samlas helt enkelt mikrokärl från dissocierades mekaniskt hjärnvävnaden med hjälp av variabla por stora maskor som kassera förorenande hjärnan parenkymceller 13, 29, 30, 31. Densitetsgradientcentrifugering infördes senare associerade till filtrering av hjärnkärlen på nylon maskor eller på glaspärlor kolonner 32, 33, 15. I dessa förfaranden, glaspärla kontra nylon mesh filtrering verkade förbättra avkastningen och hög-kontra låghastighetscentrifugering, microvessel renhet, även om höghastighetscentrifugering inducerar också skjuvspänning som påverkar genuttrycket 15, 32. Ett ytterligare steg av enzymatisk digerering infördes också i en del protokoll efter dissociationssteget 34 i syfte att lösgöra vidhäftande neuroner och astrocyter för att öka mikrokärls renhet 35. Däremot kan en alltför stor pre-uppslutning också störa mikrokapillär integritet 36, 37. På senare tid har immun laser capture microdissection (immun LCM) visat att möjliggöra hämtning av fartyg eller till och med distinkta cellpopulationer i vessels, för att undersöka förändringar i BBB-genuttryck, även om mängden av material som erhållits genom denna teknik är mycket begränsad 23.

Här presenterar vi ett förfarande för en mekanisk isolering av hjärnan fartyg som ursprungligen utarbetats av Yousif et al 14. Det ger möjlighet att få rena hjärn fartyg och att separera dem i enlighet med deras diameter. Detta protokoll inte låtsas att tillåta reningen av hela hjärnan vaskulära utrymmet, och vi inte jämföra dess effektivitet med de tidigare publicerade protokoll. Men frånvaron av lutning, specifika kolumner och höghastighetscentrifugeringssteg gör det övergripande förfarandet mycket enkelt och billigt. Viktigt, rekommenderar vi starkt att ta bort choroid plexus som beskrivits av 38 före homogenisering av hjärnan, som vi upplevde det som en möjlig källa till kontaminering. Andra viktiga rekommendationer är: 1) användningen av "låg bindning" plast materIAL (särskilt pipettspetsar) eftersom fartyg fastnar naturligtvis obehandlade plaster. Utelämna denna punkt skulle resultera i förlust av de flesta fartyg; 2) den noggranna ekvilibrering av nylonfilter före filtrering (steg 5,2); 3) Den återsuspension av pelleten i så mycket buffert som möjligt innan filtrering för att förbättra renheten hos provet; 3) Vid behov kan blodkroppar och proteiner fångade i renade fartyg tvättas genom intrakardiell perfusion med PBS före hjärnan dissektion; 4) Utbytet av fartyg renade skulle kunna förbättras genom att upprepa separation från myelin i dextran två eller tre gånger (steg 4,2) 39,40. För immunfärgning, rekommenderar vi starkt: 1) för att utföra en nukleär märkning för att skilja fartyg förorenar hårstrån och damm för vilka antikroppar har stor ospecifik affinitet; 2) för att undvika uppsamling av kärlen genom centrifugering före varje mediumbyte eftersom det kan resultera i bildandet av en oupplöslig boll av materialet.

Rening av intakta hjärnan fartyg presenterar stora fördelar att studera de molekylära egenskaper BBB. Även om specifika eller berikade endotelceller och pericyte gener och vägar har identifierats av transcriptomic och proteomik studier på enskilda celltyperna 18,19, är det väl känt att dissociation och cellsortering tekniker leder till förlust av cellens polaritet och morfologi samt sammankoppling mellan celltyper, som starkt påverkar deras molekylära profiler. I detta sammanhang, att hålla hela den vaskulära utrymmet intakt såsom beskrivits här, med undantag av astrocyter, kan utgöra en stor fördel. Dessutom, jämfört med cellsortering, rening av hjärn fartyg inte kräver användning av specifika transgena reporter musstammar eller långa immunfärgning baserade förfaranden. En annan fördel med att använda hjärnan fartyg är möjligheten att anpassa reningsprotokollet till andra arter som redan visats för murine14, Bovine13 liksom hos människor 41,42. Slutligen skulle en vidareutveckling av den nuvarande tekniken vara kultur av hjärn fartyg fragment in vitro. Co-kultur av renade fartyg med primära astrocyter nervceller och mikrogliaceller kan bidra till att återmontera neurovaskulära enheten på ett korrekt sätt än komplicerade 3-dimensionella flercelliga odlingssystem där celler först isoleras och renas innan det ihop 43. rening av intakta hjärnan fartyg kan vara till stor hjälp för utveckling av alla typer av analyser in vitro för att studera BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Labex MemoLife och av ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose sv plack)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77, (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468, (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508, (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58, (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7, (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14, (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468, (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10, (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185, (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276, ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166, (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192, (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5, (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34, (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35, (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9, (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14, (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23, (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25, (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17, (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44, (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21, (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207, (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17, (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24, (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94, (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70, (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics