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Developmental Biology

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Potter, S. J., DeFalco, T. Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis. J. Vis. Exp. (104), e53262, doi:10.3791/53262 (2015).

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Abstract

गर्भाशय में जीवोत्पत्ति की जांच कर गर्भाशय के भीतर विकसित भ्रूण कि वजह से अभिकर्मकों की पहुंच को अपरा स्तनधारियों में एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है। एक नव विकसित पूर्व vivo ईमानदार छोटी बूंद संस्कृति विधि गर्भाशय में प्रदर्शन के अध्ययन के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रदान करता है। पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति की जांच करने और विभिन्न अवरुद्ध और सक्रिय करने के यौगिकों के उपयोग के माध्यम से बातचीत सेलुलर और विविध संकेत दे रास्ते में हेरफेर करने की क्षमता प्रदान करता है; इसके अतिरिक्त, विशिष्ट अंगों के विकास पर विभिन्न औषधीय अभिकर्मकों के प्रभाव गर्भाशय में प्रणालीगत दवा वितरण की अवांछित दुष्प्रभावों के बिना अध्ययन किया जा सकता है। इन विट्रो प्रणालियों में अन्य की तुलना में, छोटी बूंद संस्कृति स्तनधारी सेल लाइनों में reproduced नहीं किया जा सकता है, जो तीन आयामी morphogenesis और सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने की क्षमता है, के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी काफी कम आर की आवश्यकता ही नहीं हैपूर्व vivo अन्य की तुलना में और इन विट्रो प्रोटोकॉल में eagents। इस पत्र विधि के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए पूरे अंग immunofluorescence द्वारा पीछा उचित माउस भ्रूण अंग विच्छेदन और ईमानदार छोटी बूंद संस्कृति तकनीक, यह दर्शाता है। पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति विधि तुलनीय विवो में मनाया जाता है और इन विवो मॉडल में भ्रूण मारक के कारण अन्यथा मुश्किल-अध्ययन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, उन्हें करने के लिए अंग वास्तुकला के गठन की अनुमति देता है। एक मॉडल के आवेदन प्रणाली के रूप में, एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला वृषण morphogenesis में vascularization की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग किया जाएगा। प्रत्येक अंग बड़े पैमाने पर होना प्रोटोकॉल के लिए किसी भी अंग विशेष संशोधनों का निर्धारण करने के लिए अध्ययन करना चाहिए, हालांकि यह पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति विधि, जैसे फेफड़ों और संभवतः दूसरों के रूप में अन्य भ्रूण अंग प्रणालियों, करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस अंग संस्कृति प्रणाली भ्रूण अंगों के साथ प्रयोग में लचीलापन प्रदान करता है, और obtaine परिणामडी शोधकर्ताओं भ्रूण के विकास में अंतर्दृष्टि पाने में मदद मिलेगी इस तकनीक का उपयोग।

Introduction

मानव में विवो में अंग उत्थान बहुत सीमित है; इसलिए, ऊतक इंजीनियरिंग, ऊतकों और एक मेजबान के द्वारा दान में व्यक्ति की कोशिकाओं से अंगों के विकास, अंग प्रतिस्थापन के लिए एक आकर्षक संभावित चिकित्सा होता जा रहा है। इस चिकित्सकीय रणनीति सफल होने के लिए हालांकि, कारकों और अंग के morphogenesis में शामिल सेलुलर बातचीत अच्छी तरह से अध्ययन किया जाना चाहिए और अच्छी तरह से समझ में आया। पारंपरिक तरीकों के साथ विशिष्ट अंगों के विकास का अध्ययन करने में असमर्थता के कारण, शोधकर्ताओं वैकल्पिक पूरे भ्रूण या पूरे अंग संस्कृतियों के लिए खड़ा हो गया है। Kalaskar एट अल। 1 कि पूर्व vivo संस्कृति तरीकों जीवोत्पत्ति के अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य विकल्प हैं, सुझाव गर्भाशय विकास में करने के लिए (सुसंस्कृत भ्रूण के 58% में) है कि पूर्व vivo पूरे भ्रूण संस्कृति तुलनीय परिणाम पैदावार से पता चला है।

एक व्यक्तिगत अंग संस्कृति प्रणाली, इस तरह के रूप में इस पूर्व vivo Droऔषधीय अभिकर्मकों या एंटीबॉडी के अलावा के माध्यम से एक विशिष्ट संकेतन मार्ग या सेलुलर बातचीत के हेरफेर अनुमति है, जबकि plet संस्कृति प्रणाली, प्रणालीगत प्रभाव के पूरे अंग विश्लेषण स्वतंत्र के लिए अनुमति देता है। परंपरागत रूप से, भ्रूण अंग विकास के अध्ययन माता के रूप में वितरित औषधीय अभिकर्मकों के अलावा, ट्रांसजेनिक और पीटकर माउस प्रौद्योगिकियों तक ही सीमित कर दिया गया है। हालांकि, विवो में इन तकनीकों और उपचार से जुड़े तकनीकी मुद्दे हैं; सबसे चिंताओं अक्सर भ्रूण मारक में जो परिणाम एक साथ विभिन्न अंगों को प्रभावित करने के प्रभाव के आसपास घूमता है। भ्रूण के विकास में हेर-फेर के अध्ययन का एक अतिरिक्त चिंता औषधीय ऐसे अभिकर्मकों अपरा बाधा के माध्यम से पारित कर सकते हैं (जैसे, दवा की मातृ चयापचय यह भ्रूण तक पहुंचने से पहले) और गर्भाशय में भ्रूण के विकास पर दवाओं के मातृ प्रभाव है।

पूरे अंग संस्कृति तकनीक का वर्णनयहाँ पूरे भ्रूण जननग्रन्थि पूर्व vivo ईमानदार छोटी बूंद संस्कृतियों में incubated रहे हैं, जिसमें पहले Maatouk एट अल। 2 द्वारा वर्णित एक प्रोटोकॉल, से लिया गया था। भ्रूण जननग्रन्थि संवर्धन में से एक महत्वपूर्ण लाभ छोटे अणु अवरोधकों को आसानी से सरल प्रसार द्वारा पूरे अंग का उपयोग कर सकते हैं। DeFalco एट अल छोटे अणु inhibitors के साथ संयोजन के रूप में इस पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति विधि का उपयोग प्रक्रियाओं और जननद विकास 3 के दौरान होने वाली बातचीत के संकेत अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पता चला है; इन प्रक्रियाओं की वजह से तकनीकी चुनौतियों के लिए विवो में जांच करने के लिए मुश्किल होगा (जैसे, नाल या आनुवंशिक या औषधीय दृष्टिकोण का उपयोग कर कई अंगों को प्रभावित करने की मारक के माध्यम से दवाओं के पारित होने)।

छोटी बूंद संस्कृति न केवल गर्भाशय प्रयोग में कुछ पहलुओं ओवर में एक सुधार है, लेकिन यह भी इन विट्रो और पूर्व छठी पर एक सुधार हैवो सिस्टम के रूप में अच्छी तरह से। वे विविध प्रकार की कोशिकाओं की कमी अंग वास्तुकला के गठन की अनुमति है कि महत्वपूर्ण बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों की कमी है, और cascades संकेत में कलाकृतियों का प्रदर्शन कर सकते हैं क्योंकि morphogenesis अध्ययन करने के लिए सेल लाइनों का उपयोग बेहद मुश्किल है। ऊतक इंजीनियरिंग ईसीएम अनुकरण मचानों बनाने में महत्वपूर्ण सुधार किए गया है, संकेतों जीवोत्पत्ति के दौरान प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए आवश्यक हैं, जो करने के संबंध में ज्ञान की कमी के कारण यह चुनौतीपूर्ण विट्रो में एक अंग प्रणाली का निर्माण करने के लिए बनाता है। अन्य पूर्व vivo सिस्टम पहले से, फिल्टर 6, और अन्य पाड़ मेट्रिसेस 7.8 जीवोत्पत्ति अध्ययन करने के लिए स्थापित किया है, या अधिक विशेष Morphogenesis, और अगर 4 में भ्रूण अंगों के रहते इमेजिंग के लिए बहुत सफल रहे हैं, 5 transwells कर दिया गया है। छोटी बूंद संस्कृति प्रणाली का लाभ यह है ओ रहे हैं जो कम अभिकर्मकों, उपयोग करने की क्षमता प्रदान करके morphogenesis के अध्ययन की अनुमति देता हैften महंगा है, लेकिन यह भी विकास और संकेत क्षमताओं 9 के लिए महत्वपूर्ण है, जो अंग सतह तनाव, दे रही है।

माउस में, प्रारंभिक वृषण morphogenesis भ्रूण (ई) के बीच होता है E11.5 और E13.5 चरणों; इन चरणों में सेक्स-विशिष्ट भेदभाव को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच के लिए इष्टतम समय खिड़की शामिल। वृषण गठन के दौरान होती है कि महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के अलावा वृषण कॉर्ड वास्तुकला की पीढ़ी और एक वृषण-विशिष्ट संवहनी नेटवर्क के गठन कर रहे हैं। इस पूर्व vivo पूरे अंग छोटी बूंद संस्कृति प्रणाली का उपयोग, एक पुरुष-विशिष्ट vascularization में परिवर्तन और एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला के उपयोग के माध्यम से वृषण morphogenesis को बाधित करने में सक्षम है कि ब्लॉक संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) के लिए रिसेप्टर्स की गतिविधि; वीईजीएफ़ की मध्यस्थता संवहनी remodeling वृषण विकास 10-12 के लिए महत्वपूर्ण है। इस तकनीक को सफलतापूर्वक अन्य अंगों के लिए लागू किया जा सकता है और विशिष्ट समय लक्षित कर सकते हैंविकास की खिड़कियां। साबुत माउंट अंग इमेजिंग महत्वपूर्ण संरचनाओं के दृश्य के साथ ही विभिन्न अवरोधकों के प्रशासन से उत्पन्न संरचनात्मक और सेलुलर परिवर्तन की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रणाली के शोधकर्ता इन विवो लक्षित जीन रणनीतियों के दौरान मातृ औषधि प्रशासन या प्रणालीगत व्यवधान से संभावित confounding प्रभाव बायपास कर सकते हैं कि में फायदेमंद है। इस प्रकार, इस पूरे अंग पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति प्रणाली काफी भ्रूण के विकास के दौरान विशेष अंगों के भीतर विशेष रूप से पाए जाते हैं, जो बातचीत और संकेतन को समझने की क्षमता में सुधार कर सकते हैं।

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Protocol

इन अध्ययनों में इस्तेमाल सभी चूहों चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं से प्राप्त सीडी-1 चूहों थे। पिछला संस्कृति प्रयोगों में भी इस तरह C57BL / 6J (नहीं दिखाया डेटा) के रूप में अन्य उपभेदों, पर प्रदर्शन किया गया है, लेकिन किसी भी तनाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। गर्भवती वयस्क महिलाओं लगभग 2-3 महीने पुराने थे और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और भ्रूण को हटाने के लिए पहले द्विपक्षीय थोरैकोटॉमी द्वारा पीछा सीओ 2 साँस लेना के माध्यम से euthanized थे। चूहे एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुसार रखे जाते थे, और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल के मेडिकल सेंटर के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

उपकरण, संस्कृति, मीडिया, और व्यंजनों की 1. तैयारी

  1. एक 70% इथेनॉल समाधान तैयार है। (Humidified कक्षों बनाने के लिए और / गिराए समाधान बनाने के लिए) आटोक्लेव विआयनीकृत पानी। 70% इथेनॉल के साथ नीचे छिड़काव द्वारा विच्छेदन उपकरण (संदंश, कैंची, और 27 जी सुई सीरिंज) जीवाणुरहित।
  2. तैयार करनामिलीलीटर की 1 एम 2 MgCl 2 CaCl, 3.75 1 एम के पीओ 4, 6.75 मिलीग्राम कैल्शियम और मैग्नीशियम (80 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 2 जी KCl, 14.4 छ 2 ना 4 HPO, 2.4 जी 2 के.एच. युक्त 10X फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) )। 1 एल बाँझ autoclaved पानी में भंग करने और उसके बाद फिल्टर पेपर के साथ फिल्टर करने के लिए हलचल। 1X पीबीएस बनाने के लिए पानी के साथ 10 गुना पतला।
  3. हीट 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) निष्क्रिय और फिल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ बाँझ।
  4. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) से मिलकर, (पूरा DMEM, cDMEM कहा जाता है) 38 मिलीलीटर 1X पूरी संस्कृति के माध्यम तैयार, 10% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन शेयर की गर्मी निष्क्रिय FBS और 1/100 कमजोर पड़ने फ़िल्टर किया। यह आमतौर पर नए सिरे से इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  5. 5 मिलीग्राम / एमएल के एक शेयर की एकाग्रता के लिए DMSO में VEGFR tyrosine kinase अवरोध द्वितीय (TKI द्वितीय) Reconstitute, और एक काम समाधान बनाने के लिए cDMEM के साथ शेयर पतला। अंतिम चोरइस अध्ययन के लिए centration cDMEM में 1.875 ग्राम / एमएल है। कंपनी की सिफारिशों के अनुसार, शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 6 महीने के लिए स्थिर रहे हैं। काम कर समाधान के लिए के रूप में, नए सिरे से बनाने और उसी दिन का उपयोग करें।
    नोट: काम समाधान में इस दवा की एकाग्रता (यह छोटी बूंद में दो गुना पतला हो जाएगा के बाद से) वांछित अंतिम एकाग्रता से अधिक दो गुना होना चाहिए। एक ही समय में, "नियंत्रण" उपचार के लिए DMSO के एक ही मात्रा युक्त cDMEM का एक ही मात्रा तैयार करते हैं।
  6. आसुत जल में अलग से पूंछ पाचन अभिकर्मकों (50 मिमी NaOH और 1 एम Tris एचसीएल [पीएच 8.0]) तैयार करें।
  7. XY पीसीआर प्राइमरों के एक 25 माइक्रोन के शेयर बनाओ (XY फॉरवर्ड 5'-टीजीए एजीसी TTT TGG सीटीटी टीजीए जी -3 'और XY रिवर्स 5'-CCG CTG सीसीए AAT TCT टीटीजी जी -3') एक साथ nuclease मुक्त पानी में।
  8. 50X TAE बफर (242 ग्राम Trizma बेस, 57.1 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड तैयार, 100 मिलीलीटर 0.5 एम EDTA, पीएच 8.5, और जोड़ने के पानी के लिए 1 एल फाईएनएएल मात्रा)। 1x TAE रनिंग बफर तैयार (20 मिलीलीटर 50X TAE 1 एल कुल मात्रा के पानी से पतला)।
  9. उबलते जब तक माइक्रोवेव में एक 2.5% agarose समाधान (0.625 जी agarose, 0.5 मिलीलीटर 50X TAE बफर, 24.5 मिलीलीटर पानी), गर्मी agarose समाधान बनाने के लिए, तो शांत करते हैं के बारे में 55-65 डिग्री सेल्सियस (स्पर्श करने में सक्षम) तक। एक बार शांत, 1% ethidium ब्रोमाइड समाधान के 2 μl जोड़ने के लिए, और जेल डालना।
    चेतावनी! Ethidium ब्रोमाइड एक उत्परिवर्तजन और अपरूपजनन है; nitrile दस्ताने और उचित सुरक्षा प्रोटोकॉल से निपटने जब इस्तेमाल करें। वैकल्पिक रूप से, अन्य संभावित कम विषाक्त जेल के समाधान के एजेंट या रंगों का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  10. Immunofluorescence के लिए (0.1% ट्राइटन X-100, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], और 3% गोजातीय सीरम albumin [बीएसए] के साथ पीबीएस) अवरुद्ध समाधान तैयार करें।
  11. Immunofluorescence के लिए धोने के समाधान (0.1% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस, 1% FBS, और 3% बीएसए) तैयार करें।
  12. Immunofluorescence के लिए (0.1% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस) PBTx तैयार करें।
  13. घन के लिए ऊष्मायन कक्षों तैयारlture। पानी autoclaved 35 मिलीलीटर के साथ बड़े (100 मिमी व्यास) पेट्री डिश भरें। विच्छेदन और संस्कृतियों का प्रदर्शन किया जाएगा, जहां के पास रखें।

मस मस्कुलस से भ्रूण वृषण की 2. अलगाव

  1. हर सुबह योनि प्लग के लिए महिला माउस की जाँच करें। योनि प्लग का पता चला है, जिस पर दिन दोपहर E0.5 माना जाता है। मंजूरी दे दी पशु प्रोटोकॉल के साथ सुसंगत तरीके में, E11.5 पर गर्भवती महिला माउस euthanize।
  2. 70% इथेनॉल के साथ माउस पेट के नीचे का छिड़काव करें।
  3. ठीक कैंची का उपयोग कर एक वी के आकार का चीरा के साथ पेट की त्वचा और पेरिटोनियम खोलें और आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए ऊतक के फ्लैप वापस खींच।
  4. गर्भाशय सींग के दोनों सिरों पर अंडाशय का पता लगा। कैंची का प्रयोग, मां के शरीर से भ्रूण युक्त गर्भाशय को अलग करने के अंडाशय और संयोजी ऊतक में कटौती।
  5. धीरे, अपरा विपरीत पक्ष काटने की जर्दी थैलियों को उजागर करके गर्भाशय की दीवार खोलें। पु के लिए सावधान नहीं रहोncture जर्दी थैली हानिकारक या खोने भ्रूण से बचने के लिए।
  6. भ्रूण युक्त जर्दी थैलियों को हटाने और कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पीबीएस युक्त एक डिश में उन्हें जगह अपरा के पास कट। कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों की मौजूदगी समर्थन कोशिका आसंजन अणुओं ऊतक वास्तुकला को बनाए रखने और विच्छेदन उपकरण के लिए चिपके से ऊतक को रोकने में मदद मिलेगी।
  7. संदंश के साथ, ध्यान से भ्रूण बाहर स्लाइड कर सकते हैं, जिसमें एक छेद बनाने के लिए जर्दी थैली puncturing द्वारा भ्रूण से जर्दी थैली और भ्रूणावरण हटा दें। भ्रूण जर्दी थैली के बाहर हो जाने के बाद, गर्भनाल काट दिया।
  8. इस बिंदु से आगे, एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में स्थित एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। भ्रूण के सिर को हटाने और गर्दन के दोनों तरफ संदंश के साथ बन्द रखो द्वारा त्यागें।
  9. पूंछ निकालें और भ्रूण के लिंग का निर्धारण करने के लिए XY पीसीआर विश्लेषण के लिए नए microcentrifuge ट्यूब में जगह है।
    नोट: यह फसल के बाद जितनी जल्दी हो सके संस्कृति जननग्रन्थि इष्टतम है, वहीं यह भी पीओएस हैअसंभव पूंछ डीएनए को हटा दें और प्रत्येक भ्रूण के लिंग में जाना जाता है और केवल वांछित सेक्स सुसंस्कृत होने की जरूरत है, ताकि संस्कृति के लिए पहले XX / XY जीनोटाइपिंग प्रदर्शन करने के लिए। जीनोटाइपिंग किया जा रहा है, जबकि संस्कृति के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ पर (वे पता लगाया जा सकता है, ताकि), भ्रूण अलग रखा जा सकता है। एक चेतावनी गर्भाशय या संस्कृति की स्थिति में बाहर इस अवधि के संभावित संस्कृति के दौरान संस्कृति या बाद के विकास के लिए व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है।
  10. (आम तौर पर कमजोर हाथ में आयोजित संदंश) संदंश की एक जोड़ी के साथ भ्रूण की कांख लगाए द्वारा संस्कृति डिश के नीचे के खिलाफ एक लापरवाह स्थिति में भ्रूण सुरक्षित। पूरे विच्छेदन की प्रक्रिया के दौरान अभी भी भ्रूण धारण करने के लिए जगह में इन संदंश बनाए रखें।
  11. संदंश के अन्य जोड़ी के साथ, त्वचा को कवर पेट को हटाने और धीरे शरीर दीवार वापस बेनकाब करने के लिए लीवर, आंतों, और अन्य अंगों को हटा दें।
  12. जननग्रन्थि पृष्ठीय महाधमनी के दोनों तरफ वापस शरीर दीवार पर स्थित हो जाएगा के रूप में,शरीर के midline के साथ चल रहे एक बड़े रक्त वाहिका, बंद संदंश के साथ मूत्रजननांगी रिज के नीचे स्कूप और संदंश खोलने और ऊपर उठाने के द्वारा मूत्रजननांगी रिज को हटा दें। जननग्रन्थि शिथिल दीवार से जुड़ी होगी के रूप में, इन कनेक्शनों को हटाने के बिना भी तेजी से ऊपर खींचने के लिए या जननग्रन्थि अंगों को नुकसान हो सकता है, खिंचाव कर सकते हैं नहीं सावधान रहना होगा।
  13. मीडिया के लिए ऊतक acclimate करने के लिए एक थाली में cDMEM में मूत्रजननांगी रिज ले जाएँ।
  14. 27 जी सुइयों का उपयोग मूत्रजननांगी रिज के बाकी हिस्सों से जननद-mesonephros जटिल अलग करें। इष्टतम जुदाई अनुमति देने के लिए नीचे दबाने से काटा, और सही ढंग से ऊतक मार्गदर्शन करने के लिए अन्य का उपयोग करने के लिए एक सुई का प्रयोग करें। तेज सुइयों के ऊतकों को छड़ी कर सकते हैं कि प्लास्टिक के shards पैदा करेगा, के रूप में पकवान नीचे के खिलाफ एक काटने का कार्य गति के प्रयोग से बचें। पूरी तरह से जननद से जुड़ी mesonephros रखने के लिए सुनिश्चित करें।

एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला के साथ जननद 3. संवर्धन

  1. दो 20 μ सेट15 μl प्रत्येक के लिए एल pipettes। अन्य पिपेट दवा इलाज cDMEM के लिए पूरी तरह इस्तेमाल किया जाएगा, जबकि जननग्रन्थि और नियंत्रण cDMEM के अलावा के हस्तांतरण के लिए एक साफ, निष्फल रेजर ब्लेड का उपयोग बाधा पिपेट सुझावों में से एक बंद के बारे में 1-2 मिमी कट।
  2. वे आसानी से कट-ऑफ टिप का उपयोग pipetted जा सकता है तो पिपेट टिप करने के लिए उनके लंबे धुरी के समानांतर के साथ जननग्रन्थि अप लाइन। विंदुक टिप के अंदर करने के लिए चिपके हुए जननग्रन्थि से सावधान रहें।
  3. एक नियंत्रण छोटी बूंद के रूप में पक्ष और दवा युक्त छोटी बूंद के रूप में अन्य लेबल। केवल दो बूंदों एक 35 मिमी पकवान ढक्कन पर फिट कर सकते हैं। पलकों पर लेबल पूंछ-ऊतक युक्त microcentrifuge ट्यूब पर लेबल है कि मैच के लिए सुनिश्चित करें।
  4. एक छोटी सी (35 मिमी) संस्कृति डिश के ढक्कन में एक छोटी बूंद में एक भी जननद युक्त cDMEM पिपेट 15 μl (नीचे से एक humidified पेट्री डिश कक्ष के भीतर फिट करने के लिए भी लंबे हैं, के रूप में केवल पलकों का उपयोग करें)। पकवान के दोनों तरफ दो अलग-अलग जननद युक्त बूंदों की जगह, अच्छी तरह से अलग मंगलवारओम एक दूसरे के। जननग्रन्थि बूंदों को हस्तांतरित कर दिया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें।
  5. नियंत्रण के रूप में नामित छोटी बूंद के लिए, एक 30 μl की कुल मात्रा के साथ एक छोटी बूंद बनाने के लिए (1.5 कदम में किए गए) DMSO युक्त cDMEM की एक अतिरिक्त 15 μl जोड़ें। दवा से संपर्क नहीं होगा कि केवल "नियंत्रण" पिपेट का प्रयोग करें।
  6. अन्य छोटी बूंद (दवा इलाज नमूना) के लिए, एक 30 μl की कुल मात्रा के साथ एक छोटी बूंद बनाने के लिए TKI-द्वितीय युक्त cDMEM के 15 μl जोड़ें। दवा-इलाज के नमूने के लिए नामित केवल पिपेट का प्रयोग करें।
  7. वे व्यास में लगभग 15-18 मिमी और जननद मोटे तौर पर मध्य में स्थित है, जब तक पिपेट का उपयोग करना, एक विस्तार परिपत्र पैटर्न में बूंदों बाहर फैल गया। वह अपने पक्ष पर स्थित है और जननद और mesonephros आसानी से अलग पहचाना जाता है, ताकि जननद पूरबी। दो पालियों फ्लैट करना इतना है कि फेफड़ों के पूरबी।
    1. छोटी बूंद व्यास से थोड़ा भिन्न हो सकता है, जननग्रन्थि floatin नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करेंजी और सतह तनाव द्वारा जगह में आयोजित की जाती हैं। बूंदों एक दूसरे को या ढक्कन के पक्ष स्पर्श नहीं है कि सुनिश्चित करें। सतह तनाव के बिना, अंगों इस प्रकार अंग आकृति विज्ञान विकृत संस्कृति के दौरान ढक्कन पर आगे बढ़ने और समतल करना होगा।
  8. ध्यान से ईमानदार बड़े (100 मिमी) humidifier डिश में पानी की सतह पर बूंदों से युक्त संस्कृति डिश ढक्कन रखें। ढक्कन के नीचे के नीचे फंस कोई बुलबुले हैं सुनिश्चित करें और यह पानी की सतह पर फ्लैट झूठ बोल रहा है। ढक्कन पलटना और किसी भी पानी की बूंदों स्थित हैं जहां ढक्कन के ऊपर छूने के लिए नहीं जाने के लिए सावधान रहना मत करो।
  9. एक छोटी सी, humidified कक्ष बनाने के लिए, तुरंत जननद संस्कृतियों लगा देना बड़ा humidifier डिश के ढक्कन के साथ कवर। मीडिया के किसी भी वाष्पीकरण को कम करने के रूप में जल्दी संभव के रूप में काम करते हैं। छोटे पकवान स्वतंत्र रूप से चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए यह और भी बड़ा डिश के ढक्कन बीच कमरा है कि सुनिश्चित करना; अन्यथा, संक्षेपण एक मुहर और ख कर सकते हैंऊतकों को ताला हवा विनिमय।
  10. दो छोटे पलकों कक्ष में रखा जाता है एक बार, तुरंत इनक्यूबेटर में चैम्बर जगह है। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए छोटी बूंद संस्कृतियों सेते हैं।

भ्रूण के लिंग का पता लगाने के लिए 4. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

  1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के नीचे भ्रूण पूंछ जोड़ें।
  2. प्रत्येक ट्यूब 50 मिमी NaOH के 200 μl जोड़ें।
  3. 15 मिनट के लिए या ऊतक पूरी तरह भंग है जब तक 95 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. हल्के से और संक्षेप में 50 1M Tris एचसीएल के μl और भंवर जोड़ें।
  5. 0.5 μl 25 माइक्रोन प्राइमर समाधान, 2.5 μl 10X Taq बफर, 0.5 μl 10 मिमी dNTPs (न्यूक्लियोटाइड), 19.3 μl nuclease-: एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, नमूने की कुल संख्या से प्रत्येक मात्रा से गुणा करके एक ताजा पीसीआर मास्टर मिश्रण बनाना नि: शुल्क पानी, 0.2 μl डीएनए Taq पोलीमरेज़। अच्छी तरह से मलाएं।
  6. 23 जोड़ेपीसीआर मास्टर मिश्रण के μl पचा पूंछ के 3 μl lysate युक्त ट्यूबों पीसीआर।
  7. झाड़ ट्यूबों तो ट्यूब के नीचे करने के लिए नमूने लाने के लिए एक छोटी स्पिन करते हैं, उन्हें मिश्रण करने के लिए।
  8. XY (लघु) पीसीआर कार्यक्रम (तालिका 1) चलाएँ।
  9. 1x TAE बफर में 2.5% agarose जेल में और सीढ़ी (5x डाई के साथ) के नमूने लोड।
  10. XX और XY बैंड का समाधान किया जा सकता है जब तक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन चलाएँ।
  11. छवि पराबैंगनी प्रकाश और कब्जा छवि के साथ जेल।
  12. वाई गुणसूत्र-विशिष्ट बैंड बनाम विशिष्ट एक्स गुणसूत्र (एक्स गुणसूत्र = 331 आधार जोड़े [बीपी] और XY = 302 बीपी) का विश्लेषण 13; XY (पुरुष) के नमूने, 331 के दो बैंड और 302 बीपी होगा XX जबकि (महिला) नमूने एक 331 बीपी बैंड के रूप में दिखाई देंगे।

5. पूरा पर्वत अंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस

दिन 1:

  1. एक कट ऑफ टिप के साथ एक 1000 μl पिपेट का उपयोग संस्कृति से जननग्रन्थि निकालें। अगर वांछित, वे हो सकता हैमीडिया और अभिकर्मकों को धोने के लिए पीबीएस की एक डिश में रखा। एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पीबीएस में रखें। छोटे ट्यूब आकार अभिकर्मकों के संरक्षण और इसे आसान ट्यूब में नमूने का ट्रैक रखने के लिए कर देगा।
    1. संभावित दवा संक्रमण से बचने के लिए अलग नलियों में, नियंत्रण और इलाज के नमूने, साथ ही XX और XY नमूने रखने और pipettes के अलग सेट के साथ संस्कृति से उन्हें हटाने के लिए सुनिश्चित करें।
  2. पीबीएस के साथ दो बार जननग्रन्थि धो लें। इस बात पर से, इस प्रोटोकॉल कैल्शियम और मैग्नीशियम की कमी 1X पीबीएस उपयोग कर सकते हैं। उन्हें धोने के लिए, जननग्रन्थि (गंभीरता से) ट्यूब के नीचे डूब और फिर ऊपर तरल निकालने के लिए अनुमति देते हैं। उन्हें भी बंद pipetting द्वारा जननग्रन्थि खोना नहीं सावधान रहना होगा।
  3. ट्यूब से जितना संभव हो उतना पीबीएस निकालें। पीबीएस 0.1% ट्राइटन X-100 युक्त में 4% paraformaldehyde के 250 μl जोड़ें, और एक घुमाव पर 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, इस निर्धारण एक घुमाव पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए किया जा सकता है। चेतावनी! Paraformaldehyde निपटने जब इतनी सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करें, एक जहरीले पदार्थ है।

दूसरा दिन:

  1. आरटी पर 250 μl PBTx में दो बार जननग्रन्थि कुल्ला।
  2. एक घुमाव पर आरटी पर 10 मिनट प्रत्येक के लिए 250 μl PBTx साथ जननग्रन्थि 3 बार धोएं।
  3. एक घुमाव पर आरटी पर अवरुद्ध समाधान 250 μl में जननग्रन्थि कम से कम 1 घंटा ब्लॉक।
  4. समाधान को रोकने में पतला 250 μl प्राथमिक एंटीबॉडी में एक घुमाव पर 4 डिग्री सेल्सियस पर जननग्रन्थि हे / एन दाग।

तीसरा दिन:

  1. 250 μl धोने के समाधान में दो बार जननग्रन्थि कुल्ला।
  2. एक घुमाव पर आरटी पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक जननग्रन्थि 250 μl धोने के समाधान के साथ 3 बार धोएं।
  3. जननग्रन्थि एक घुमाव पर आरटी पर अवरुद्ध समाधान 250 μl में 1 घंटे के ब्लॉक।
  4. प्रकाश से फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ microcentrifuge ट्यूब कवर।
  5. एआर पर आरटी पर जननग्रन्थि 2-4 घंटा सेतेocker वैकल्पिक Hoechst 33342. युक्त समाधान को रोकने में पतला 250 μl माध्यमिक एंटीबॉडी में, घुमाव पर 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यमिक एंटीबॉडी और Hoechst 33342 ऊष्मायन हे / एन प्रदर्शन करते हैं।
  6. 250 μl PBTx में दो बार जननग्रन्थि कुल्ला।
  7. एक घुमाव पर आरटी पर 10 मिनट प्रत्येक के लिए 250 μl PBTx में जननग्रन्थि 3 बार धोएं।
  8. एक कट ऑफ पिपेट टिप का उपयोग करना, कम से कम तरल के साथ एक स्लाइड पर जननग्रन्थि हस्तांतरण। विंदुक के साथ अतिरिक्त तरल निकालें, लेकिन ऊतक बाहर सूखा नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  9. संदंश के साथ वांछित फैशन में जननग्रन्थि ओरिएंट, और जल्दी स्लाइड पर जननग्रन्थि माउंट करने के लिए बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ें। बढ़ते मीडिया कोट पूरी तरह से सभी नमूनों सुनिश्चित करें; यह नमूने बाहर सूखी दे बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  10. उचित आकार का उपयोग coverslips (संख्या 1.5 शैली) धीरे नमूनों को कवर करने के लिए। Coverslip की पूरी सतह से संपर्क करने के लिए बढ़ते मीडिया प्रसार करते हैं। यदि आवश्यक हो, बहुत हल्के ढंग से इतना है कि coverslip के कोनों पर प्रेसकोई बड़े हवाई बुलबुले हैं।
  11. बढ़ते मीडिया के वाष्पीकरण को कम करने के किनारों के आसपास स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ स्लाइड सील। स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्लाइड्स मुहिम शुरू की।

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Representative Results

पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति एक है, ऐसे जननद के रूप में पूरे अंगों, हेरफेर करने के लिए बातचीत सेलुलर और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए। एक एक E11.5 जननांगों छोटी बूंद संस्कृति तैयार करने के लिए एक कदम वार फैशन में दर्शाता चित्रा की अनुमति देता है। संस्कृति प्रोटोकॉल में पहला कदम मां माउस (चित्रा 1 ए और 1 बी) से भ्रूण युक्त गर्भाशय के प्रारंभिक हटाने शामिल हैं। मां से गर्भाशय को हटाने के बाद, गर्भाशय की दीवार काट रहा है और भ्रूण आगे विच्छेदन (चित्रा 1 सी-ई) के लिए पीबीएस में जर्दी थैली से मुक्त कर रहे हैं। आंत अंगों को हटाने के बाद, मूत्रजननांगी रिज भ्रूण (चित्रा 1F) के पीछे शरीर दीवार के साथ स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और (चित्रा 1G) अलग है। जननद-mesonephros जटिल है, तो दूर मूत्रजननांगी रिज (चित्रा 1H) से विच्छेदित है, और छोटे अणु अवरोध करनेवाला (चित्रा 1 मैं के साथ छोटी बूंद संस्कृति में रखा गया हैवाम: इलाज किया के लिए "टी") और छोटे अणु अवरोध करनेवाला (चित्रा 1 मैं बिना, सही: नियंत्रण के लिए "सी")। बूंदों से युक्त छोटे बर्तन 48 घंटे के लिए सीओ 2 एक अस्थायी humidified कक्ष (चित्रा 1J) में संलग्न है और incubated 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% कर रहे हैं।

48 घंटे की ऊष्मायन के बाद सुसंस्कृत अंगों पीबीएस के साथ धोया, हटा रहे हैं, और संस्कृति और नशीली दवाओं के उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के अधीन हैं; जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए वैकल्पिक रूप से, वे आरएनए निकासी के लिए कार्रवाई की जा सकती। सामान्य परिस्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) 48 घंटे के लिए के तहत सुसंस्कृत तुरंत एक साफ विच्छेदन के बाद संस्कृति मीडिया को हस्तांतरित और जब भ्रूण पूरे जननद-mesonephros परिसरों (E11.5 और पुराने) एक उच्च जीवित रहने की दर है (लेकिन वे कर सकते हैं ) यदि आवश्यक हो तो लंबे समय तक के लिए संभावित संवर्धित किया। Brightfield microscop तहत E11.5 जननग्रन्थि की तुलनासंस्कृति के 24 या 48 घंटा (चित्रा 2) जननद आकार में एक नाटकीय परिवर्तन और नियंत्रण XY जननद में धारी-तरह की हड्डी संरचनाओं की उपस्थिति का पता चलता है के बाद बनाम प्रारंभिक ऊष्मायन में वाई। इसलिए, 48 घंटे के लिए संवर्धन के बाद, विकास गर्भाशय जननग्रन्थि में E13.5 (चित्रा 2) के बराबर है। इसके अतिरिक्त, E11.5 भ्रूण फेफड़ों बढ़ता है और प्रदर्शित करता है सामान्य रूप से विकास में इस चरण (चित्रा 2) के दौरान होता है कि शाखाओं में वृद्धि हुई है। कारण संस्कृति की स्थिति utero में पर्यावरण (चर्चा देखें) के लिए विकास के रिश्तेदार के लिए के रूप में इष्टतम नहीं कर रहे हैं कि इस तथ्य के गर्भाशय में, सबसे अधिक संभावना की तुलना में संस्कृति की प्रक्रिया आम तौर पर छोटे अंगों में यह परिणाम है।

गर्भाशय विकसित किया अंगों में, पूर्व vivo सुसंस्कृत अंगों समान ऊतक वास्तुकला दिखाने के लिए और के रूप में उचित किराए की कोख की सेवा कर सकते हैं की 48 घंटा संस्कृति से उत्पन्न अंगों का आकार (उस से एफ अलग हैigures 3 और 4)। अंग वास्तुकला और morphogenesis, ऐसे वृषण Sertoli कोशिकाओं और फेफड़ों शाखाओं में सेल, फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं के लिए ई cadherin, PECAM1 जनन कोशिकाओं और वाहिका के लिए, और cleaved के लिए SOX9 कस्पासे 3 के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण अंग सेल प्रकार लेबल कि मार्कर का उपयोग किया गया, चिह्नित करने के लिए apoptotic कोशिकाओं (आंकड़े 3 और 4)। Sox9, एक प्रतिलेखन कारक एन्कोडिंग, भ्रूण अंग प्रसार, भेदभाव, और बाह्य मैट्रिक्स के गठन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसलिए, दोनों अंगों में, SOX9 फेफड़ों 17 भीतर वृषण डोरियों 14-16 और शाखाओं में बंटी संरचनाओं के भीतर स्थित Sertoli कोशिकाओं लेबल है कि एक आम वास्तु मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है।

प्रभावी रूप से गर्भाशय morphogenesis में विशेष बहलाना में जननद संस्कृतियों। माउस जननद भ्रूण (ई) चरण E10.0 पर निर्दिष्ट और XY (पुरुष) और XX (FEM में शुरू में आकृति विज्ञान के समान हैशराब) भ्रूण। E10.5, भ्रूण वृषण 19 में E11.5 और E13.5 के बीच तेजी से घटित सहित कि प्रमुख आणविक और morphological परिवर्तन ड्राइव पर XY में जीन Sry (वाई गुणसूत्र के लिंग का पता लगाने क्षेत्र) की अभिव्यक्ति शुरू करने जननग्रन्थि: के विनिर्देश Sertoli कोशिकाओं, वृषण का समर्थन सेल वंश; Sertoli और जनन कोशिकाओं के शामिल है और वयस्क वीर्योत्पादक नलिकाओं को भ्रूण व्यापारियों रहे हैं जो कर रहे हैं वृषण तार, का गठन; और प्रमुख संवहनी remodeling। पुरुष-विशिष्ट संवहनी remodeling में, पड़ोसी mesonephros में एक नाड़ी जाल से रिहा endothelial कोशिकाओं एक वृषण-विशिष्ट धमनी सिस्टम 4,20 के लिए फार्म का जननद में विस्थापित। Immunofluorescent E11.5 वृषण (चित्रा 3) के सापेक्ष गर्भाशय वृषण में E13.5 में अच्छी तरह से विकसित वृषण कॉर्ड संरचनाओं और वाहिका को प्रकट विश्लेषण करती है। चित्रा 3 शो में छवियों के रूप में, छोटी बूंद संस्कृति प्रणाली वृषण भेदभाव EV विश्राम कर सकते हैंदस्तावेजों पूर्व vivo, यह अंग भर के गठन छोटी नली की तरह डोरियों और वाहिका में बनाने से XY जननग्रन्थि में SOX9 पॉजिटिव Sertoli कोशिकाओं कल्पना करने के लिए संभव है। 2 दिन (चित्रा 4) के पाठ्यक्रम पर SOX9 / ई cadherin डबल सकारात्मक उपकला शाखाओं की वृद्धि की शाखाओं में फेफड़े, 48 घंटे की संस्कृति के परिणाम के संबंध में। एक ही संस्कृति की स्थिति में फेफड़ों में apoptotic कोशिकाओं में कुछ वृद्धि (आंकड़े 3 और 4) जननद संस्कृति की स्थिति के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी है, सुझाव है कि वहाँ है, जबकि इसके अलावा, हम नियंत्रण सुसंस्कृत में और गर्भाशय जननग्रन्थि में apoptosis के समान स्तर को देखते हैं।

छोटे अणु अवरोधकों सेलुलर स्थानीयकरण, प्रसार, और सेल चक्र स्थिति, साथ ही अंग वास्तुकला और विभिन्न cascades संकेत को प्रभावित करने से अंग विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पूर्व vivo पूरे अंग छोटी बूंद विधि शोधकर्ता फे के लिए आसानी से औषधीय अभिकर्मकों प्रशासन के लिए अनुमति देता हैसंस्कृति मीडिया के एक बहुत छोटी मात्रा में ताल अंगों। वृषण भेदभाव और morphogenesis पर vascularization और नाड़ी remodeling के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम छोटे अणु अवरोध करनेवाला TKI द्वितीय, वीईजीएफ़ रिसेप्टर्स की गतिविधि को अवरुद्ध करके वृषण संवहनी विकास 3 बाधित कि एक अभिकर्मक इस्तेमाल किया; भ्रूण वृषण वास्तुकला के गठन संवहनी endothelial वृद्धि कारक एक (VEGFA) 11,12 के माध्यम से अभिनय, एक नाड़ी पर निर्भर तरीके से होता है। वृषण के vascularization भ्रूण की virilization कि ड्राइव टेस्टोस्टेरोन के निर्यात के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी वृषण की हड्डी morphogenesis के एक प्रमुख ड्राइवर है: पिछले काम से पता चला है कि VEGFA संकेतन, Sertoli कोशिकाओं पर या पूर्व E11.5 को अवरुद्ध है जब मध्य कोशिकाओं के आसपास और कोई कॉर्ड संरचनाओं 3,12 फार्म से बाहर विभाजन करने के लिए असफल। यहाँ दिखाए गए परिणामों भ्रूण वृषण में संवहनी remodeling के विघटन छोटी बूंद संस्कृति प्रणाली में प्रभावी है कि प्रदर्शन, और subsequen(यानी, असामान्य वृषण की हड्डी गठन) वृषण morphogenesis में टी दोष (चित्रा 3) देखे जा सकते हैं। यह PECAM1, endothelial कोशिकाओं के लिए एक मार्कर, यह भी जनन कोशिकाओं (चित्रा 3) द्वारा व्यक्त की है कि ध्यान दिया जाना चाहिए; इस रोगाणु सेल धुंधला इलाज किया जननग्रन्थि में संवहनी धुंधला की कमी तकनीकी कारणों की वजह से नहीं है कि पता चलता है, और भी इस तरह के रोगाणु कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं नशीली दवाओं के उपचार से प्रभावित नहीं हैं कि यह दर्शाता है कि एक आंतरिक नियंत्रण है। सबसे प्रारंभिक वृषण morphogenesis E11.5 और E13.5 के बीच होता है कि यह देखते हुए, इन चरणों में विशेष रूप से, जननद में वीईजीएफ़ की भूमिका और संवहनी remodeling के सेक्स-विशिष्ट भेदभाव को प्रभावित करने वाले कारकों का निर्धारण करने के लिए इष्टतम खिड़की हैं।

E11.5 और E13.5 के बीच फेफड़ों के विकास के दौरान TKI द्वितीय के उपयोग वाहिका के छोटे अणु अवरोध अन्य अंग (चित्रा 4) में reproduced किया जा सकता है दिखाता है। ये परिणाम टी की प्रभावकारिता से पता चलता हैवह पूर्व vivo भ्रूण अंग छोटी बूंद संस्कृति मॉडल प्रणाली और अंगों के भीतर रास्ते संकेतन को बदलने के लिए छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग करने की क्षमता। इस प्रोटोकॉल में आसानी, लचीलापन, और प्रभावकारिता को देखते हुए, छोटी बूंद संस्कृति विवो में संबोधित नहीं किया जा सकता कि अंग विकास के बारे में प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए एक उपयुक्त विकल्प प्रदान करता है।

चित्र 1
इन विट्रो पूरे अंग छोटी बूंद संस्कृति प्रोटोकॉल में 1. कदम चित्रा। खोला पेरिटोनियल गुहा के साथ गर्भवती माउस euthanized (ए)। संलग्न भ्रूण के साथ (बी) गर्भाशय सींग। (सी) उजागर भ्रूण युक्त जर्दी थैली के साथ खोला गर्भाशय की दीवार के ऊपर बंद दृश्य। (डी) एक एकल भ्रूण (ई) से जुड़ा हुआ है जर्दी थैली (वाई) के भीतर संलग्न नाल (पी) के लिए। (ई) भ्रूण च अलग ROM नाल और जर्दी थैली। (एफ) आंत अंगों हटा दिया है और मूत्रजननांगी रिज (काले रंग में उल्लिखित मूत्रजननांगी रिज के भीतर जननग्रन्थि)। (G) उजागर मूत्रजननांगी रिज की पृथक के ऊपर बंद (जननद-mesonephros परिसरों काले रंग में उल्लिखित) के साथ विच्छेदित भ्रूण। तारांकन जी और एच (काले धराशायी लाइन द्वारा दर्शाया विच्छेदन) मूत्रजननांगी रिज से जननद-mesonephros परिसर के (एच) जुदाई में पृष्ठीय महाधमनी अर्थ। जी, जननद; मीटर, mesonephros। (मैं) 35 मिमी संस्कृति डिश ढक्कन के भीतर छोटी बूंद संस्कृतियों का सेट-अप। काला तीर बूंदों के भीतर जननग्रन्थि को इंगित। टी इलाज; सी, नियंत्रण। (जे) के लिए एक खुला humidified कक्ष के भीतर रखा दो छोटी बूंद संस्कृति डिश पलकों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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पूर्व vivo चित्रा 2. विकास गर्भाशय अंगों में के सापेक्ष सुसंस्कृत अंगों छोटी बूंद के brightfield छवियों:। E11.5 में utero- विकसित अंगों (जननग्रन्थि और फेफड़ों) (प्रथम स्तंभ); 24 घंटा (दूसरा स्तंभ) और 48 घंटा छोटी बूंद नियंत्रण संस्कृति (तीसरे स्तंभ) के बाद E11.5 अंगों; TKI द्वितीय VEGFR अवरोध करनेवाला (चौथा स्तंभ) के साथ 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत E11.5 अंगों; और E13.5 में utero- अंगों (पांचवें स्तंभ) विकसित की है। जननग्रन्थि mesonephros (अपारदर्शी संरचना) ऊपर जननद (स्पष्ट संरचना) के साथ उन्मुख होते हैं। E11.5 जननग्रन्थि bipotential कर रहे हैं और (पुरुष) XY और XX (महिला) के नमूनों में आकृति विज्ञान के समान दिखाई देते हैं। स्केल बार, 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3. पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति वृषण में utero- विकसित समकक्षों के ऊतक वास्तुकला और कोशिका मृत्यु में तुलना कर रहे हैं की Immunofluorescent छवियों:। में गर्भाशय E11.5 भ्रूण वृषण (प्रथम स्तंभ) विकसित किया; नियंत्रण E11.5 वृषण नियंत्रण पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति (दूसरा स्तंभ) के 48 घंटे के बाद; E11.5 वृषण TKI द्वितीय VEGFR अवरोध करनेवाला (तीसरे स्तंभ) के साथ पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति के 48 घंटे के बाद; और में utero- E13.5 (चौथा स्तंभ) वृषण विकसित की है। धराशायी लाइनों (जननद शीर्ष पर उन्मुख है) जननद-mesonephros सीमा से संकेत मिलता है। SOX9 Sertoli कोशिकाओं के एक मार्कर है और वृषण कॉर्ड वास्तुकला कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है; PECAM1 रोगाणु और संवहनी endothelial कोशिकाओं (इसलिए, इलाज जननग्रन्थि में PECAM1 धुंधला शेष लगभग विशेष रूप से रोगाणु कोशिकाओं है) में व्यक्त किया जाता है; और cleavएड कस्पासे 3 apoptotic कोशिकाओं की एक मार्कर है। प्रदर्शित TKI-द्वितीय सुसंस्कृत जननग्रन्थि वाहिका और असामान्य वृषण की हड्डी morphogenesis बाधित जबकि संवर्धित नियंत्रण जननग्रन्थि, इन-utero- विकसित समकक्षों के समान वृषण की हड्डी गठन, वृषण-विशिष्ट vascularization (आंकड़ा भर तीर), और apoptosis रिश्तेदार के स्तर से पता चला। वाहिका सामान्य रूप से मौजूद है, लेकिन इलाज के नमूने में पता नहीं है, जहां कोष्ठक जननद की सतह डोमेन संकेत मिलता है। तीर TKI-द्वितीय का इलाज वृषण में संवहनी सेल झुरमुटों मरने के लिए इशारा करते हैं। स्केल बार, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. अन्य भ्रूण अंगों (फेफड़ों) बूंदों में पूर्व vivo सुसंस्कृत करने के लिए तुलना कर रहे हैं > आय utero- विकसित अंगों की Immunofluorescent छवियों:। E11.5 में गर्भाशय विकसित किया फेफड़ों (प्रथम स्तंभ); E11.5 फेफड़ों नियंत्रण से 48 घंटा पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति (दूसरा स्तंभ) के बाद; E11.5 फेफड़ों TKI द्वितीय VEGFR अवरोध करनेवाला (तीसरे स्तंभ) के साथ पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति के 48 घंटे के बाद; और में utero- E13.5 (चौथा स्तंभ) फेफड़ों का विकास किया। कोशिकाओं शाखाओं में बंटी SOX9 लेबल; ई cadherin निशान ट्यूबलर संरचना उपकला; PECAM1 संवहनी अन्तःचूचुक लेबल; और कस्पासे 3 अंक apoptotic कोशिकाओं cleaved। पूर्व vivo नियंत्रण सुसंस्कृत अंगों में utero- विकसित अंगों की तुलना में सुसंस्कृत अंगों में इसी तरह की वास्तुकला और SOX9, ई cadherin की अभिव्यक्ति है, और PECAM1 दिखा, लेकिन कोशिका मृत्यु की मात्रा बदलती। (PECAM1 धुंधला द्वारा पता चला है के रूप में) TKI द्वितीय के साथ इलाज करने पर, संवहनी विकास काफी फेफड़ों में कम हो जाता है। स्केल बार, 100 माइक्रोन।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चरण तापमान समय चक्रों की संख्या
शुरू 94 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट एक चक्र
अप्राकृतिकरण 94 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड 35 चक्र
एनीलिंग 57 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
बढ़ाव 72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
समाप्त 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट एक चक्र

तालिका 1: XY पीसीआर विश्लेषण कार्यक्रम भ्रूण की XX / XY जीनोटाइपिंग के लिए प्रयोग किया जाता है "XY (लघु)" पीसीआर कार्यक्रम के लिए साइकिल मापदंडों।।

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Discussion

इस अध्ययन में भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए कई संभावित अनुप्रयोगों है कि एक पूर्व vivo पूरे अंग छोटी बूंद विधि दर्शाता है। इस तकनीक की वजह से भ्रूण और संभावित भ्रूण मारक के पहुंच के लिए जैविक विवो में उपयोग करते हुए जांच करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि सवालों के दृष्टिकोण को संबोधित करने के शोधकर्ता कई अंगों के लिए इस्तेमाल किया, और अनुमति देता जा सकता है। यह संस्कृति विधि स्तनधारी सेल लाइनों के रूप में इस तरह के दृष्टिकोण इन विट्रो में एक दूसरे के ऊपर अतिरिक्त लाभ है: पूरे अंगों इसलिए गर्भाशय में मौजूद हैं कि महत्वपूर्ण कहनेवाला बातचीत को बनाए रखने का इस्तेमाल किया जा सकता है; और संस्कृति मात्रा इस प्रकार दुर्लभ या महंगी दवा अभिकर्मकों की बहुत थोड़ी मात्रा का उपयोग करते हुए, (~ 30 μl) बहुत ही छोटा है।

छोटी बूंद संस्कृति प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं में शामिल हैं: अंग की एक) साफ विच्छेदन। साफ विच्छेदन ऊतक वास्तुकला बनाए रखा करने की अनुमति देता है और सामने कट या क्षतिग्रस्त सुर की संख्या को कम करता हैसंस्कृति डिश की सतह के लिए आकर्षित किया जा सकता है और संस्कृति को परेशान कर सकता है, जो चेहरों; ख) अंग विकास और morphogenesis अनुमति देने के लिए छोटी बूंद के भीतर अंग की उचित उन्मुखीकरण; छोटी बूंद बाहर सूखा नहीं है भी सतह तनाव द्वारा जगह में अंग को बनाए रखता है, लेकिन इतना है कि ग), छोटी बूंद उचित आकार बनाने; घ) अंग के लिए सही छोटी बूंद मात्रा का उपयोग करते हुए। छोटी बूंद मात्रा अनुभव से निर्धारित और अंग के आकार के अनुसार किया जाना चाहिए। हालांकि, 30 μl एक उचित प्रारंभिक बिंदु होना चाहिए। ई) ब्याज की जैविक सवाल का पता करने के लिए विकास का एक प्रासंगिक चरण चुनने; और एफ) छोटी बूंद के भीतर ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है, जो संक्रमण से बचने के लिए, एक बाँझ संस्कृति के माहौल को बनाए रखने।

इस पत्र में मुख्य रूप से (प्रारंभिक यौन भेदभाव के दौरान यानी,) E11.5-E13.5 जननद पर केंद्रित है, लेकिन यह भी इस प्रोटोकॉल के अन्य अंगों पर लागू किया जा सकता है दिखाता है। अन्य अंगों के लिए इस प्रोटोकॉल के संभावित संशोधनों में शामिल हैं: एक) के विकास का एक विशेष अंग है और / या मंच के लिए छोटी बूंद मात्रा में फेरबदल। यह संस्कृति विधि जननद के लिए सभी भ्रूण चरणों के लिए लागू है, लेकिन मात्रा बड़ा अंगों के बाद भ्रूण चरणों के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। सरल प्रसार पोषक तत्वों या अभिकर्मकों बाद के चरणों में बहुत प्रभावी ढंग से बड़े ऊतकों घुसना करने के लिए अनुमति नहीं दी जाएगी यह देखते हुए कि भ्रूण चरणों बड़ा अंगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो की एक सीमा होती है, की संभावना नहीं है। इसलिए यह प्रयोग के लिए संभव प्रारंभिक चरण में भ्रूण अंगों के लिए इस संस्कृति का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। ख) संस्कृति मीडिया को बहिर्जात वृद्धि कारकों, हार्मोन, या अन्य कारकों को जोड़ने। कुछ अंगों सामान्य morphogenesis गुजरना करने के लिए एक दिया प्रोटीन या हार्मोन की आवश्यकता हो सकती है; इसलिए, इस प्रोटोकॉल संस्कृति मीडिया के लिए इस तरह के अभिकर्मकों के अलावा द्वारा संशोधित किया जा सकता है। ग) संस्कृति में समय की लंबाई का समायोजन। प्रारंभिक वृषण विकास के रूप में छोटा रूप में 24 घंटे में हो सकता है, जबकि अन्य अंगों संस्कृति में समय की लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती है। बूंदों हैंबाँझ रखा जाता है, टिशू कल्चर में अप करने के लिए 4 या 5 दिनों के लिए उत्तरदायी हो सकता है। संस्कृति (अधिक से अधिक 48 घंटा) की लंबी अवधि के लिए, अमोनिया हटाने के लिए या अन्य बिल्ट-अप अपशिष्ट छोटी बूंद का एक सेट मात्रा को हटाने और उस जगह से बूंदों में (एसोसिएटेड अभिकर्मकों के साथ) यह दैनिक मीडिया ताज़ा करने के लिए आवश्यक हो सकता है उपोत्पाद ताजा मीडिया के साथ ही मात्रा; इलाज किया बूंदों के लिए, ताजा मीडिया प्रारंभिक उपचार के रूप में दवा / अभिकर्मक का एक ही एकाग्रता को शामिल करना चाहिए। घ) मीडिया और / या संबद्ध अभिकर्मकों की संरचना में फेरबदल। कुछ ऊतकों एक वांछित प्रभाव को प्रकाश में लाना एक दिया दवा अभिकर्मक के अधिक या कम आवश्यकता हो सकती है। यह / ब्लॉक वांछित मार्ग को सक्रिय लेकिन सुसंस्कृत अंगों में महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु को उत्पन्न नहीं होगा कि एक इष्टतम एकाग्रता लगाने के लिए (cleaved कस्पासे 3 धुंधला के माध्यम से) एक सांद्रता के धारावाहिक कमजोर पड़ने और आकलन कोशिका मृत्यु की कोशिश करने के लिए सिफारिश की है। आंतरिक नियंत्रण की ई) का प्रयोग करें। ऐसे जननद के रूप में अंगों जोड़े में आते हैं, एक जननद सेवा कर सकते हैंcontralateral इलाज किया जननद के लिए एक आदर्श आंतरिक नियंत्रण के रूप में। ऐसे जोड़े में नहीं आते हैं जिगर के रूप में अन्य अंगों; इस्तेमाल किया माउस तनाव दुर्लभ है और नमूने सीमित हैं, तो यह छमाही में अंग काटना और नियंत्रण और इलाज के नमूने के लिए प्रत्येक आधे का उपयोग करने के लिए संभव है। एक के बाद एक अंग के पक्ष को ध्यान में रखना चाहिए ताकि, यहां तक ​​कि अंगों, जोड़ों में आया है कि उन (जैसे फेफड़ों के प्रत्येक पक्ष के लिए पालियों के विभिन्न संख्या के रूप में) विषमता दिखा सकता है कि दिमाग में रखना चाहिए नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है और उपचार के नमूने हैं।

छोटी बूंद संस्कृतियों संभावित गर्भाशय विकास में के लगभग सभी पहलुओं विश्राम कर सकते हैं, वहीं इस तकनीक के लिए कुछ सीमाएं हैं। एक सामान्य में छोटी बूंद संस्कृतियों, और पूर्व vivo संस्कृति तकनीक, गर्भाशय विकास 1,5 में के सापेक्ष लगातार धीमी विकास दर का परिणाम है कि है; इस वजह से इस तरह की संस्कृति मीडिया में अपेक्षित वृद्धि कारकों की कम सांद्रता जैसे कारकों की एक संख्या होने की संभावना है (और उनकेऊतक के लिए उपयोग) और सीमित neovascularization पूर्व vivo होता है। अंग के आकार के अलावा, explant ठीक से उन्मुख या छोटी बूंद आकार गलत है नहीं है, ऊतक आकृति विज्ञान चपटा या एक अगर बिस्तर द्वारा प्रदान की जाती है कि एक समर्थन संरचना की कमी के साथ विकृत हो सकता है कि एक चिंता का विषय है अन्य प्रोटोकॉल में। हालांकि, इस समस्या प्रोटोकॉल मानकों के अनुकूलन के साथ से बचा जा सकता है। एक अन्य संभावित सीमित कारक मीडिया और अभिकर्मकों पूरे अंग भर में फैलाना कर सकते हैं कि कैसे अच्छी तरह से है; इन सुसंस्कृत ऊतकों रक्त वाहिकाओं है, जबकि वहाँ की वजह से रक्त प्रवाह की कमी के कारण इन जहाजों पूर्व vivo के माध्यम से कोई पोषक तत्वों का छिड़काव और ऑक्सीजन है, इसलिए बजाय प्रसार एक कारक बन जाता है। यह सीमा है, जो पूर्व vivo शुक्राणुजनन में explant के परिधि लेकिन ऊतक के केंद्र सबसे भाग (यानी, मीडिया से दूर) degenera में अच्छी तरह से निरंतर है, प्रसव के बाद वृषण संस्कृतियों में विशेष रूप से स्पष्ट हैटीईएस 21-23। उन टिप्पणियों को देखते हुए यह आकार पूरे अंग संस्कृति या बड़े आकार explant प्रोटोकॉल के लिए एक सामान्य सीमित कारक है कि प्रतीत होता है। हालांकि, इस तरह भ्रूण फेफड़ों और भ्रूण जननद में नए सिरे से वृषण की हड्डी के गठन में morphogenesis शाखाओं के रूप में सामान्य मॉर्फ़ोजेनेटिक कार्यक्रमों, अभी भी छोटी बूंद संस्कृतियों में होते हैं। इसलिए, इन बुनियादी प्रक्रियाओं अभी भी इस तकनीक का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है।

इस पूरे अंग प्रोटोकॉल पहले Maatouk एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। Coveney एट अल द्वारा पिछले आगर-आधारित संस्कृति विधि से यह अनुकूलित हैं, जो 2,। 4 संवर्धन अंगों पूर्व vivo के माध्यम से बूंदों के बजाय अगर कुओं में लाभ यह है कि कम से उपयोग करता है इस प्रकार अभिकर्मकों संरक्षण कम से कम 10 गुना कम हो संस्कृति मात्रा; इसके अतिरिक्त, छोटी बूंद पद्धति समय की बचत होती है और किया जा रहा अभिकर्मकों डी की क्षमता के बारे में कोई चिंता नजरअंदाज जो अभिकर्मक युक्त मीडिया में अगर कुओं पूर्व incubating को शामिल नहीं करताअगर माध्यम से ऊतक को जोशीला। आगर-आधारित विधियों आम तौर पर ऊतक का अधिक ईमानदारी तीन आयामी वास्तुकला की रक्षा करने के लिए लगा रहे हैं, वहीं explant और संस्कृति की स्थिति के अनुकूलन (ऊपर देखें) की उचित उन्मुखीकरण छोटी बूंद-सुसंस्कृत अंगों के सामान्य आकृति विज्ञान सुनिश्चित करेगा।

इन परिणामों में utero- विकसित अंगों के बराबर है कि पूर्व vivo छोटी बूंद सुसंस्कृत भ्रूण जननग्रन्थि प्रदर्शनी विकास और morphogenesis प्रदर्शित करता है। यह संस्कृति तकनीक जननद तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी जैसे फेफड़ों के रूप में अन्य भ्रूण अंगों के लिए लागू किया जा सकता है। यह पूर्व vivo अंग छोटी बूंद विधि पूरे अंग संकेतन और अंग विशेष सेलुलर बातचीत के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा, संस्कृति और नशीली दवाओं के उपचार के बाद छवि पूरे अंगों करने की क्षमता के हिस्से में मदद की। morphogenesis पर vascularization के प्रभाव की जांच के लिए एक छोटा सा अणु अवरोध करनेवाला उपयोग किया यहाँ वर्णित अध्ययन है, लेकिन व्यावसायिक रूप से शुक्रिया के ढेर सारेilable औषधीय अभिकर्मकों संकेत दे रास्ते और जैविक प्रक्रियाओं की एक भीड़ का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध है। इसलिए, कई संभावित भविष्य के शोधकर्ताओं के विकास जीव विज्ञान में रोचक और महत्वपूर्ण सवाल की जांच करने की अनुमति देगा कि इस छोटी बूंद संस्कृति विधि के लिए उपयोग हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) Fisherbrand 12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps GeneMate T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L Gilson FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
Fine Scissors FST 91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes Denville C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes Denville C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles BD PrecisionGlide 309623
10 ml syringe BD 305559
0.2 μM PES syringe filter VWR 28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm Whatman 1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish Falcon/Corning 353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) VWR 25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator Eppendorf CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet Nuare NU-425-400
Mini-centrifuge  Fisher Scientific 05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL GeneMate R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel Eppendorf 950040015
SMZ445 stereomicroscope Nikon SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software Alpha Innotech Corporation Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol Fisher BP2818-500
Triton X-100 Fisher BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 Fisher S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S671-3
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water Life Technologies AM9938 
XY PCR Primer  IDT N/A
Glacial Acetic Acid Fisher A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher BP2482-1
1% Ethidium bromide solution Fisher BP1302-10 Toxic
Agarose GeneMate E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 367176-2.5KG
Trizma Base Sigma T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions Thermo Scientific R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer Denville CB-4050-3
Paraformaldehyde Fisher O4042-500 Toxic
FluorMount-G Southern Biotech 0100-01
Hydrogen Chloride (HCl) Fisher A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation Bioexpress 0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered Fisher 03-600-511 Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered Sigma D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem EMD Millipore 676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody Millipore AB5535 Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody BD Pharmingen 553370 Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Cell Signaling 9661S Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) Life Technologies 13-1900 Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate Invitrogen (Molecular Probes) H1399 Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-165-153 Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-605-153 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A31572 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21206 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21208 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Life Technologies A31573 Use at dilution: 1:500

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References

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