С помощью

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Potter, S. J., DeFalco, T. Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis. J. Vis. Exp. (104), e53262, doi:10.3791/53262 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Исследуя органогенез в утробе матери является технически сложным процессом, в плацентарных млекопитающих из-за недоступности реагентов для эмбрионов, которые развиваются в матке. Недавно разработанная экс естественных условиях в вертикальном положении метод капель культура обеспечивает привлекательную альтернативу исследований, проведенных в период внутриутробного развития. Экс естественных капель культура дает возможность исследовать и управлять клеточных взаимодействий и различные сигнальные пути с применением различного блокирования и активирующих соединений; Кроме того, влияние различных фармакологических реагентов на разработке конкретных органов могут быть изучены без нежелательных побочных эффектов системного доставки лекарств в матке. По сравнению с другими системами в пробирке, капли культура не только позволяет способности к обучению трехмерного морфогенеза и межклеточных взаимодействий, которые не могут быть воспроизведены в линии клеток млекопитающих, но и требует существенно меньше Reagents чем другие экс естественных условиях и в пробирке протоколов. Эта статья демонстрирует правильное мыши плода рассечение органов и вертикально методы капли культуры, а затем весь орган иммунофлюоресценции, чтобы продемонстрировать эффективность метода. Экс естественных способ культивирования капель позволяет формировать архитектуры органа сопоставимы к тому, что наблюдается в естественных условиях и могут быть использованы для изучения в противном случае трудно-исследования процессов в связи с эмбриональной летальности в моделях в естественных условиях. В модельной системе приложений, ингибитор малые молекулы будут использованы для исследования роли васкуляризации в яичек формообразования. Это экс естественных способ культивирования капелек с возможностью расширения до других органов и систем плода, таких как легких и потенциально других, хотя каждый орган должен быть широко изучены, чтобы определить, какие специфические для органа модификации протокола. Эта система органом культура обеспечивает гибкость в экспериментирования с органами плода, и результаты obtained используя этот метод поможет исследователям получить представление развития плода.

Introduction

Регенерации органов в естественных условиях в организме человека очень ограничены; Поэтому, тканевая инженерия, развитие тканей и органов из отдельных клеток, пожертвованных хозяина, становится привлекательной потенциал терапии замены органов. Правда, для этого терапевтическая стратегия, чтобы быть успешным, факторы и клеточные взаимодействия участвующих в морфогенезе органа должны быть тщательно изучены и хорошо изучены. Из-за неспособности изучения развития отдельных органов с традиционными подходами, исследователи обратились к альтернативным всей эмбриона или целых культур органов. Kalaskar др. 1 показали, что экс естественных условиях вся эмбриогенез культура дает сопоставимые результаты (в 58% культивируемых эмбрионов) в развитии внутриутробной, предполагая, что экс естественных условиях методы культура реальной альтернативой для органогенеза исследований.

Индивидуальный система органной культуры, такие, как этот бывший естественных УЦИплет система культуры, позволяет весь анализ орган, независимо от системных эффектов, в то время как позволяет манипулировать конкретного сигнального пути или клеточных взаимодействий с помощью того фармакологических реагентов или антител. Традиционно, изучение развития плода органа была ограничена трансгенных мышей и нокаут технологий, в дополнение к фармакологических реагентов, поставляемых материнской. Тем не менее, существуют технические вопросы, связанные с эти методы и процедуры в естественных условиях; большинство проблем вращаются вокруг эффектов воздействия на различные органы одновременно, что часто приводит к эмбриональной летальности. Дополнительной проблемой исследований манипулирования на развитие плода фармакологически является материнский эффект препаратов на эмбриональное развитие в утробе матери (например, материнской метаболизма препарата прежде чем он достигнет эмбриона), и если такие реагенты могут проходить через плацентарный барьер.

Описан метод целая культура органЗдесь был адаптирован из протокола, впервые описанным Maatouk и др. 2, в котором целые гонады эмбриона инкубируют в бывших естественных вертикальных культур капель. Одним из важных преимуществ культивирования эмбриональные половые железы, что ингибиторы низкомолекулярные легко получить доступ к весь орган по простой диффузии. . Дефолко др показали, что использование этого исключая виво капель способ культивирования в сочетании с ингибиторами низкомолекулярных может быть использован для изучения процессов и взаимодействий, происходящих во время развития гонад 3 сигнализации; эти процессы будет трудно рассмотреть в естественных условиях из-за технических проблем (например, прохождение препаратов через плаценту или летальности влияет несколько органов, используя генетические или фармакологические подходы).

Капелька культура является не только улучшение в некоторых аспектах более внутриутробно экспериментов, но и является улучшением по сравнению в пробирке и экс VIСистемы VO, а также. Использование клеточных линий для изучения морфогенеза крайне сложно, потому что они не имеют разнообразные типы клеток, отсутствие критических внеклеточного матрикса (ЕСМ) компоненты, которые позволяют формирования архитектуры органа и могут проявлять артефакты в сигнальных каскадов. Хотя тканевая инженерия добилась значительных улучшений в создании каркасов, имитирующих ECM, отсутствие знаний в отношении которых сигналы требуются каждого типа клеток во время органогенеза делает его сложным, чтобы построить систему органов в пробирке. Другие бывшие естественных систем были установлены ранее для изучения органогенеза, или, более конкретно формообразования, и были очень успешными для живой визуализации органов плода в агар 4, 5 transwells, фильтры 6, и другие эшафот матрицы 7,8. Преимущество системы капель культуры является то, что она позволяет изучение морфогенеза, предоставляя возможность использовать меньше реагентов, которые оften дорого, но и придания поверхности органом напряжение, что очень важно для роста и сигнализации возможностей 9.

В мыши, начальная яичко морфогенез происходит между эмбриональной (E) E11.5 этапы и E13.5; Эти этапы включают в себя оптимальное окно времени для изучения факторов, которые влияют на сексуальную конкретных дифференциации. Среди важных процессов, происходящих во время формирования семенников то поколение архитектуры семенников мозга и формирование семенников конкретных сосудистой сети. Используя этот исключая виво целого органа системы капель культуры, человек способен изменять мужской конкретных васкуляризации и ингибируют семенников морфогенез посредством использования ингибитора низкомолекулярных, что блокирует активность рецепторов для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF); VEGF-опосредованной сосудистой реконструкции имеет решающее значение для развития яичек 10-12. Этот метод может успешно применяться к другим органам и может предназначаться определенное времяОкна развития. Всего монтажа изображений орган позволяет визуализировать жизненно важных структур, а также структурные и клеточные изменения, вытекающие из администрации различных ингибиторов. Важно отметить, что эта система имеет преимущество в том, что исследователь может обойти потенциальные вмешивающиеся эффекты от материнской введения препарата или системного нарушения во время естественных условиях в целевых стратегий генов. Таким образом, вся эта органом экс естественных условиях система культуры капель может значительно улучшить способность понимать взаимодействие и сигнализацию, которые происходят именно в рамках конкретных органов во время развития плода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все мыши, используемые в этих исследованиях были CD-1 мышей, полученные от Charles River Laboratories. Предыдущие эксперименты культуры были также выполнены на других штаммов, таких как C57BL / 6J (данные не показаны), но любой штамм может быть использован. Беременные женщины были взрослые примерно 2-3 месяцев и были умерщвлены с помощью CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков и двустороннего торакотомии до удаления эмбриона. Мышей содержали в соответствии с руководящими принципами NIH, и экспериментальные протоколы были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животное Hospital Medical Center Цинциннати Детская с.

1. Подготовка инструментов, средств массовой информации, культуры и блюда

  1. Подготовка 70% -ным раствором этанола. Автоклав деионизированная вода (для принятия увлажненных камерах и делает / разжижающие растворы). Стерилизовать рассечение инструментов (щипцы, ножницы и игла 27 G шприцы) путем распыления вниз с 70% этанола.
  2. Подготовить10X забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), содержащий кальций и магний (80 г NaCl, 2 г KCl, 14,4 г Na 2 HPO 4, 2,4 г КН 2 РО 4, 6,75 мл 1 М CaCl 2, 3,75 мл 1 М MgCl 2 ). Движение, чтобы растворить в 1 л стерильной автоклавного водой, а затем отфильтровать через фильтровальную бумагу. Развести в 10 раз водой, чтобы сделать 1X PBS.
  3. Тепло инактивации фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 55 ° С в течение 30 мин и фильтруют стерилизовать с помощью шприца 0,22 мкм фильтр.
  4. Подготовьте 38 мл 1X полной культуральной среде (DMEM, называется полным, cDMEM), состоящий из Игла в модификации Дульбекко (DMEM), 10% фильтруется тепла инактивированной ФБС и 1/100 разбавление пенициллина стрептомицин складе. Это обычно следует использовать свежие, но можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
  5. Восстановить VEGFR тирозинкиназы II (ИТК II) в ДМСО при концентрации фондовой 5 мг / мл, и разбавляют акции с cDMEM сделать рабочий раствор. Окончательный концентрация для данного исследования является 1,875 мкг / мл в cDMEM. В соответствии с рекомендациями компании, растворы стабильны в течение до 6 месяцев при температуре -20 ° С. Что касается рабочих растворов, чтобы свежим и использовать в тот же день.
    Примечание: Концентрация этого препарата в рабочем растворе должно быть в два раза выше, чем желаемой конечной концентрации (так как она будет в два раза разбавл в капле). В то же время, подготовить такой же объем, содержащий cDMEM такой же объем ДМСО для «контрольной» лечения.
  6. Подготовьте хвост пищеварения реагенты (50 мм NaOH и 1 М Трис-HCl, рН 8,0 []) отдельно в дистиллированной воде.
  7. Выполнить 25 мкм запас праймеров ПЦР XY (XY вперед 5'-TGA AGC TTT TGG СТТ TGA G-3 'и XY обратного 5'-CCG ААТ КТГ CCA TCT TTG G-3') вместе в нуклеазы без воды.
  8. Подготовка 50X TAE буфер (242 г Trizma Base, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,5, и добавить воды до 1 л Fiнал объем). Подготовка 1X TAE буфер Запуск (20 мл 50X ТАЕ разбавляют водой до 1 л объема).
  9. Для создания 2,5% раствора агарозы (0,625 г агарозы, 0,5 мл 50X буфера ТАЕ, 24,5 мл воды), раствор агарозы тепла в микроволновой печи до кипения, затем дать остыть до 55-65 о ° С (в состоянии коснуться). После того, как здорово, добавьте 2 мкл 1% раствора этидийбромидом, и залить гель.
    ВНИМАНИЕ! Этидия бромид является мутагенным и тератогенным; пожалуйста, используйте нитриловые перчатки и надлежащую протокол безопасности при обращении. Кроме того, другие потенциально токсичные гель менее решении агенты или красители могут быть использованы.
  10. Готовят раствор (Блокирование PBS с 0,1% Triton X-100, 10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], и 3% бычьего сывороточного альбумина [BSA]) для иммунофлуоресценции.
  11. Готовят промывочный раствор (PBS с 0,1% Triton X-100, 1% FBS, и 3% BSA) для иммунофлуоресценции.
  12. Подготовьте PBTx (PBS с 0,1% Triton X-100) для иммунофлуоресценции.
  13. Подготовка инкубаторе для Culture. Заполните большой (диаметром 100 мм) чашки Петри с 35 мл воды в автоклаве. Поместите рядом, где будет выполняться рассечение и культуры.

2. Выделение плода семенников от Mus Musculus

  1. Проверьте каждое утро женский мышь для вагинальных пробок. Полдень в день, при которой влагалищный плагин обнаруживается считается E0.5. Эвтаназии беременной женщины мыши в E11.5, в соответствии с утвержденными протоколами животных.
  2. Спрей вниз мыши живота с 70% этанола.
  3. Откройте кожу живота и брюшину с V-образный разрез, используя тонких ножниц и отступить лоскут ткани, чтобы выставить внутренние органы.
  4. Найдите яичники на обоих концах рога матки. Используя ножницы, вырезать на яичнике и соединительной ткани, чтобы отделить матку, содержащий эмбрионов из тела матери.
  5. Откройте стенки матки, осторожно резки сторону, противоположную плаценты, подвергая желток мешочки. Будьте осторожны, чтобы не пуncture желточный мешок, чтобы не повредить или потерять эмбрионов.
  6. Вырезать вблизи плаценты, чтобы удалить эмбрион, содержащий желток мешочки и поместить их в чашку, содержащую PBS с кальцием и магнием. Наличие ионов кальция и магния поможет молекулы адгезии клеток поддержка для поддержания архитектуру ткани и предотвратить ткань от прилипания к рассечение инструментов.
  7. Пинцетом, удалить желточный мешок и амнион из эмбриона, осторожно прокалывания желточный мешок, чтобы создать отверстие, в котором эмбрион может выскользнуть. После того, как эмбрион находится вне желточного мешка, перерезать пуповину.
  8. С этого момента, используйте микроскоп, расположенный в стерильной капот культуры ткани. Снимите головку эмбриона и выбросить, зажимая пинцетом по обе стороны шеи.
  9. Удалить хвост и поместите в новую пробирку микроцентрифужных для анализа ПЦР XY, чтобы определить пол эмбриона.
    Примечание: В то время как оптимальным является культура половых желез как можно скорее после сбора урожая, это также позможные удалить хвост ДНК и выполнять XX / XY генотипирование до культуры, так что пол каждого эмбриона известно и только желаемого пола должна быть культивированы. В то время как генотипирование делается, эмбрионы могут быть поддерживаются отделенными (так, чтобы они не могут быть отслежены) при 4 ° С или на льду до момента культуры. Одно предостережение в том, что в этот период за пределами внутриутробному или условия культивирования могут потенциально повлиять на жизнеспособность культуры или последующего развития в культуре.
  10. Закрепите эмбриона в положении лежа на спине с нижней части культуры блюдо, закрепив подмышки эмбриона с одной парой щипцов (обычно щипцов, занимаемые в слабой рукой). Поддерживать эти щипцы на месте провести эмбрион еще в течение всего процесса вскрытия.
  11. С другой парой щипцов, удалить кожу живота покрытия и аккуратно удалить печень, кишечник и другие органы, чтобы выставить обратно стенку тела.
  12. В гонады будут расположены на задней стенке корпуса по обе стороны от дорсальной аорты,большой кровеносный сосуд, вдоль средней линии тела, совок под мочеполовой хребта с закрытыми щипцами и удалить хребет мочеполовой открыв щипцы и подняв. Как гонады будет свободно крепится к стене, будьте осторожны, чтобы не тянуть слишком быстро, не снимая эти соединения или половые железы может растянуться, вызывая повреждение органов.
  13. Перемещение мочеполовой хребет в cDMEM в блюдо, чтобы акклиматизироваться ткани СМИ.
  14. Отделите комплекс гонад-мезонефрос от остальной части мочеполовой хребта с использованием 27 г иглы. Используйте одну иглу, чтобы сократить нажав вниз, и использовать другой, чтобы направлять ткань правильно для оптимального разделения. Избегайте использования распиловки движение против блюдо снизу, а острые иглы создаст осколки пластика, который может прилипнуть к ткани. Убедитесь, что держать мезонефрос полностью, прикрепленные к гонад.

3. Культивирование гонад с ингибитором малые молекулы

  1. Установите два 20 Мл пипетки до 15 мкл каждый. Вырезать около 1-2 мм от одной из подсказок барьер пипетки с использованием чистой, стерилизованное лезвие для передачи половых желез и добавление управления cDMEM, в то время как другой пипетки будет использоваться исключительно для наркотиков лечение cDMEM.
  2. Выстроить гонады с их длинной оси, параллельной пипетки таким образом, они могут быть легко пипеткой с помощью иглы отсечки. Будьте осторожны, половых желез, торчащие внутрь наконечника пипетки.
  3. Этикетка одну сторону в качестве контроля капли, а другой в качестве лекарственного средства, содержащего капли. Только два капельки могут поместиться на 35 мм блюдо крышкой в. Убедитесь, что метки на крышках соответствовать надписи на хвост тканей, содержащих микропробирок.
  4. Пипеток 15 мкл cDMEM, содержащие один гонаду в капле в крышке небольшой (35 мм) культуры блюдо (используйте только крышки, днища, как слишком высок, чтобы вписываться в увлажненной чашку Петри камеры). Поместите два отдельных гонад, содержащих капли по обе стороны от тарелки, хорошо разделены FRом друг друга. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что половые железы были переданы капель.
  5. Чтобы капли, назначенного в качестве контроля, добавить дополнительный 15 мкл, содержащие cDMEM ДМСО (сделанный на стадии 1.5), чтобы капли 30 мкл общего объема в. Используйте только "контроль" пипетки, что не будет с нами препарат.
  6. Для другой капли (образец наркотиков лечение), добавить 15 мкл ТКИ-II, содержащей cDMEM сделать капельку с 30 мкл общего объема. Используйте только пипетки предназначенный для образцов наркотиков лечение.
  7. Использование пипетки, раскинувшийся капли в расширяющейся круговой схеме до тех пор, пока около 15-18 мм в диаметре и гонад находится примерно в середине. Ориентируйте гонады так, что она лежит на боку и гонад и мезонефрос легко различимы. Расположите легкие, так что две доли лежать.
    1. Хотя капли диаметром могут незначительно отличаться, убедитесь, что половые железы не floatinг и удерживаются на месте силами поверхностного натяжения. Убедитесь, что капли не должны касаться друг друга или часть крышки. Без поверхностного натяжения, органы будет расти на крышке во время культивирования и придавить, искажая, таким образом морфологию органов.
  8. Осторожно установить крышку чашки для культивирования, содержащей капельки в вертикальном положении на поверхности воды в больших (100 мм) Увлажнитель блюдо. Гарантировать, что нет никаких пузырей, захваченные под нижней части крышки, и что он лежит плоско на поверхности воды. Не инвертировать крышку и быть осторожными, чтобы не допускайте попадания воды коснуться верхней крышке, где капли находятся.
  9. Чтобы создать небольшой, влажной камере, сразу накрыть крышкой большего увлажнения блюдо вложить гонады культуры. Закон как можно быстрее, чтобы свести к минимуму любые испарение сред. Убедитесь, что меньше, блюдо имеет номер между ним и крышкой большего блюдо свободно передвигаться; в противном случае, конденсат может сделать печать и бзамок обмен воздуха в ткани.
  10. После того, как два маленьких крышки помещают в камеру, немедленно поместите камеру в инкубаторе. Инкубируйте капель культур в течение 48 ч в увлажненной CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.

4. полимеразной цепной реакции для определения пола эмбрионов

  1. Добавить эмбриональных хвосты нижней части 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  2. Добавить в каждую пробирку 200 мкл 50 мМ NaOH.
  3. Поместите при 95 ° С в течение 15 мин или до ткань полностью не растворится.
  4. Добавить 50 мкл 1М Трис-HCl и вихрь слегка и ненадолго.
  5. В 1,5 мл микроцентрифужных трубки, чтобы свежий Master Mix ПЦР путем умножения каждого объема на общее число проб: 0,5 мкл 25 мкМ праймера раствора, 2,5 мкл 10х буфера Taq, 0,5 мкл 10 мМ дНТФ (нуклеотиды), 19,3 мкл nuclease- свободной воды, 0,2 мкл ДНК-полимеразы Taq. Хорошо перемешать.
  6. Добавить 23мкл ПЦР мастер смеси для ПЦР пробирки, содержащие 3 мкл лизата переваренных хвостами.
  7. Flick трубки смешать их, а затем выполнить кратковременный отжим довести образцы в нижней части трубы.
  8. Запустите программу XY (Short) ПЦР (Таблица 1).
  9. Загрузка образцов (с 5-кратным красителя) и лестницы в 2,5% агарозном геле в ТАЕ буфере 1X.
  10. Запустите электрофореза в агарозном геле, пока XX и XY полосы не могут быть решены.
  11. Изображение гель с УФ-света и захвата изображения.
  12. Анализ Х-хромосому-специфический против Y хромосом конкретных групп (Х-хромосома = 331 пар оснований [BP] и XY = 302 б.п.) 13; (Мужчины) образцы XY будет иметь две полосы 331 и 302 б.п., в то время как XX (женщины) образцы появятся в виде одной полосы 331 б.п..

5. Всего Иммунофлуоресценции Гора Орган

1 день:

  1. Удалить половые железы от культуры с помощью пипетки 1000 мкл с наконечником отсечки. При желании они могут бытьпомещают в чашку из ФБР, чтобы смыть сред и реактивов. Поместите в PBS в 0,5 мл микроцентрифужных трубки. Чем меньше размер трубка сохранить реагенты и сделать его легче отслеживать образцов в трубке.
    1. Будьте уверены, чтобы сохранить контроль и обработанные образцы, а также образцы XX и XY, в отдельные пробирки и удалить их из культуры с отдельными наборами пипеток, чтобы избежать возможного загрязнения наркотиков.
  2. Вымойте половые железы в два раза с PBS. С этой точки зрения, этот протокол можно использовать 1X PBS хватает кальция и магния. Для мытья их, позволяют гонады опускаться до нижней части трубки (по тяжести), а затем удалить жидкость выше. Будьте осторожны, не теряют гонады с помощью пипетки к ним слишком близко.
  3. Удалить столько PBS, насколько это возможно из трубки. Добавить 250 мкл 4% параформальдегида в PBS, содержащем 0,1% Triton X-100, и пусть инкубировать O / N при 4 ° С на качалке. Кроме того, эта фиксация может быть сделано в течение 2 ч при 4 ° С на качалке. ВНИМАНИЕ! Paraformaldehyde является токсичным веществом, поэтому следуйте протокол безопасности при обращении.

День 2:

  1. Промыть половые железы в два раза в 250 мкл PBTx при комнатной температуре.
  2. Вымойте половых желез 3 раза 250 мкл PBTx в течение 10 мин при комнатной температуре каждого на качалку.
  3. Блок гонады по крайней мере, 1 час в 250 мкл блокирующего раствора при КТ на качалке.
  4. Пятно гонады O / N при 4 ° С на качалке в 250 мкл первичного антитела, разведенного в блокирующем растворе.

День 3:

  1. Промыть половые железы в два раза в 250 мкл промывочного раствора.
  2. Вымойте половых желез 3 раза 250 мкл промывочного раствора в течение 10 мин каждый при комнатной температуре на качалке.
  3. Блок гонад 1 час в 250 мкл блокирующий раствор при КТ на качалке.
  4. Накройте микроцентрифужную трубку с алюминиевой фольгой для защиты флуоресцентные вторичные антитела от света.
  5. Выдержите половых желез 2-4 ч при комнатной температуре на АРOcker в 250 мкл вторичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе, содержащем Hoechst 33342. В качестве альтернативы, выполнение вторичного антитела и Hoechst 33342 инкубации o / n при 4 ° С на качалке.
  6. Промыть половые железы в два раза в 250 мкл PBTx.
  7. Вымойте половых желез 3 раза в 250 мкл PBTx в течение 10 мин при комнатной температуре каждого на качалку.
  8. Использование пипетки отсечки, передать половые железы на слайде с минимальным жидкости. Удалите излишки жидкости с пипетки, но убедитесь, что ткань не высыхают.
  9. Расположите половые железы в нужный лад щипцами и быстро добавить каплю монтажных СМИ монтировать гонады на слайде. Убедитесь, что монтажные СМИ пальто все образцы полностью; важно, чтобы не позволить образцы высохнуть.
  10. Используйте покровные (количество 1,5 стиль) соответствующего размера, чтобы мягко охватывать образцы. Пусть монтажный СМИ распространили связаться всю поверхность покровного. При необходимости очень легко нажать на углах, так что покровноенет крупные пузырьки воздуха.
  11. Печать слайдов с четким лака для ногтей по краям, чтобы уменьшить испарение монтажной СМИ. Магазин слайды в темноте при 4 ° С.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экс естественных капель культура позволяет манипулировать целые органы, такие, как гонады, изучать клеточные взаимодействия и динамики. Рисунок 1 демонстрирует в поэтапно, как приготовить E11.5 половые железы капель культуру. Первые шаги в протоколе культуры включают в себя начальное удаление эмбриона, содержащего матки от матери мыши (рис 1А и 1В). После удаления матки от матери, матки стены вырезать и эмбрионы освобожден от желтка в PBS для дальнейшего вскрытия (рис 1С-E). После удаления внутренних органов, мочеполовой гребень хорошо видна вдоль задней стенки корпуса эмбриона (рис 1F) и изолирован (рис 1G). Комплекс гонад-мезонефрос затем рассекали от урогенитального гребня (рис 1H), и помещают в капель культуры с ингибитором малые молекулы (рис 1I,слева: "Т" для лечение) и без ингибитора низкомолекулярных (рис 1I, справа: "С" для контроля). Небольшие блюда, содержащие капельки заключены в самодельных влажной камере (рис 1J) и инкубировали при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 48 часов.

После 48-часового инкубирования культивируемые органы удаляются, промывают PBS, и подвергают всей горе иммунофлюоресценции протокола оценки эффективности культуры и лечения наркомании; Кроме того, они могут быть обработаны для экстракции РНК для экспрессии гена анализа. Эмбриональные целые гонад-мезонефрос комплексы (E11.5 и старше) имеют высокую выживаемость при передаче на культуральной среде сразу же после вскрытия чистой и культивировали при нормальных условиях (37 ° С и 5% СО 2) в течение 48 ч (но они могут потенциально культивировали в течение более, если это необходимо). Сравнение E11.5 половых желез под светлого microscopу при первоначальном инкубации против после 24 или 48 ч культуры выявить резкое изменение формы гонад и появление полосы-структур мозга в управление XY гонад (рис 2). Таким образом, после культивирования в течение 48 ч, в разработке находится сравнима с E13.5 внутриутробно гонад (рисунок 2). Кроме того, E11.5 легких плода растет и отображает увеличилось ветвления, что обычно происходит во время этой фазы в развитии (рис 2). Процесс культура как правило, приводит в небольших органов по сравнению с внутриутробно, скорее всего, из-за того, что условия культуры не как оптимальным для роста по отношению к окружающей среде в утробе (см Обсуждение).

Хотя размер органов в результате 48 ч культуры отличается от внутриутробному -developed органов, исключая виво культивированный органы показывают аналогичную архитектуру ткани и может служить в качестве разумных суррогаты (Figures 3 и 4). Чтобы охарактеризовать архитектуру органов и морфогенез, маркеры, которые специально маркировать важные типы органом клеток были использованы, например, SOX9 для семенников клеток Сертоли и легких ветвления клеток, Е-кадгерин для легких эпителиальных клеток, PECAM1 для зародышевых клеток и сосудистой и расщепленные каспазы 3 для апоптотических клеток (фиг.3 и 4). Sox9, кодирующие фактор транскрипции, играет важную роль в пролиферации плода органа, дифференциации и образованию внеклеточного матрикса. Таким образом, в обоих органах, SOX9 используется в качестве общего архитектурного маркера, что метки клетки Сертоли, расположенные в семенниках шнуров 14-16 и ветвления структур в легких 17.

Гонад культуры, в частности воссоздать в маточно морфогенеза эффективно. Гонады мыши указано в эмбриональном (E) E10.0 стадии и первоначально морфологически идентичны в XY (мужской) и XX (FEMALE) эмбрионы. Выражение Sry (секс, определяющей области Y хромосомы) гена в XY гонадах, начиная с E10.5 диски крупных молекулярных и морфологических изменений, которые происходят быстро между E11.5 и E13.5 в плода яичка 19, в том числе: спецификацию клетки Сертоли, поддерживающий клеточных клонов яичка; формирование семенников шнуры, которые состоят из Сертоли и половые клетки и фетальные предшественников в взрослых семенных канальцев; и основным ремоделирование сосудов. В мужской конкретных сосудистого ремоделирования, эндотелиальные клетки выпустили из сосудистого сплетения в соседних мезонефроса мигрируют в гонады, чтобы сформировать яичка конкретных артериальной системы 4,20. Иммунофлуоресцентное анализирует выявить хорошо развитые структуры мозга яичка и сосудистую в E13.5 внутриутробному яичек по отношению к E11.5 яичек (рисунок 3). Как изображений в 3 показывают, система капля культура может воссоздать яичка дифференциации эвЭнты исключая виво, как можно визуализировать Sox9-положительных клеток в Сертоли XY гонад, образующих в канальцев, как шнуров и сосудистой образующих по всему органа. Что касается легких, 48-ч результатам культуры в повышенной разветвления SOX9 / Е-кадгерина дважды положительных эпителиальных отраслей на протяжении 2 дней (рисунок 4). Кроме того, мы видим, подобные уровни апоптоза в управлении культурной и внутриутробно половых желез, в то время как есть некоторое увеличение апоптоза клеток в легких в тех же условиях культивирования (рис 3 и 4), предполагая, что гонады особенно подходит для условий культивирования.

Ингибиторы малые молекулы могут быть использованы для изучения развития органов путем воздействия клеточную локализацию, пролиферацию, и статус клеточного цикла, а также архитектуру органов и различные сигнальные каскады. Экс естественных весь метод органом капель позволяет исследователю управлять фармакологические реагенты легко FeTal органы в очень небольшом объеме культуральной среды. Для изучения влияния васкуляризации и ремоделирования сосудов яичка на дифференциации и морфогенеза, мы использовали небольшой молекулы ингибитора TKI II, реагент, который разрушает яичка развитие сосудов 3, блокируя активность VEGF-рецепторов; формирование плода семенников архитектуры происходит таким образом, сосудисто-зависимой, действующий через сосудистый эндотелиальный фактор роста А (Vegfa) 11,12. В то время как васкуляризация яичка имеет решающее значение для экспорта тестостерона, что приводит вирилизации эмбриона, он также является основным фактором яичко мозга формообразования: предыдущая работа показала, что, когда сигнализация VEGFA блокируется во время или до E11.5, клетки Сертоли не разделять из окружающих интерстициальные клетки и не шнур структуры не образуют 3,12. Результаты, показанные здесь, демонстрируют, что нарушение ремоделирования сосудов в эмбриональной яичка является эффективным в системе культуры капель, а subsequenт дефекты яичек формообразования (т.е., ненормальные формирования семенников шнур) могут быть визуализированы (рисунок 3). Следует отметить, что PECAM1, маркера эндотелиальных клеток, также экспрессируется зародышевых клеток (фиг.3); Этот окрашивание зародышевых клеток является внутренний контроль, который показывает, что отсутствие окрашивания в сосудистой обработанной гонад не по техническим причинам, а также демонстрирует, что другие типы клеток, такие как половые клетки не зависит от лекарственной терапии. Учитывая, что большинство первоначальный яичко морфогенез происходит между E11.5 и E13.5, эти этапы являются оптимальным окно для определения факторов, которые влияют на сексуальную конкретных дифференциации, в частности, роль VEGF и сосудистого ремоделирования в гонадах.

Использование ИТК II во время развития легких между E11.5 и E13.5 показывает, что ингибирование малые молекулы сосудистой могут быть воспроизведены в другом органе (рисунок 4). Эти результаты показывают, эффективность тон экс естественных плода орган капель модель системы культуры и умение использовать ингибиторы низкомолекулярные изменить сигнальных путей в органах. Учитывая легкость, гибкость, и эффективность этого протокола, капля культура обеспечивает подходящую альтернативу для экспериментальных вопросов, касающихся развития органов, которые не могут быть решены в естественных условиях.

фигура 1
Рисунок 1. Шаги в пробирке протокола капли культуры в целом органов. (А) эвтаназии беременности мыши с открытой брюшной полости. (Б) рога матки с эмбрионами закрытых. (С) Крупным планом открытого стенки матки с открытыми эмбриона, содержащих желтка. (D) одного эмбриона (е) прилагается плаценты (р), заключенной внутри желтка (у). (Е) Эмбрион разделены F ROM плаценты и желточный мешок. (F), расчлененных эмбрион внутренние органы удалены и мочеполовой хребет подвергается (половые железы в течение урогенитального гребня, изложенной в черный). (G) Крупным планом изолированные урогенитального гребня (гонад-мезонефрос комплексы выделены черным). Звездочка обозначает спинной аорты в G и H. (Н) Разделение гонад-мезонефрос комплекса из урогенитального гребня (рассечение, изображенной черным пунктиром). г, гонад; м, мезонефрос. (I), указан план капель культур в 35-мм блюдо культуры крышкой. Черные стрелки указывают на гонады в пределах капелек. Т, лечение; С, контроль. (J) Два капель культуры блюдо крышки размещенные в открытом влажной камере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

ig2.jpg "/>
Рисунок 2. Разработка экс естественных капель, культивируемые органы относительно внутриутробному органов светлого изображения:. E11.5 в-utero- разработана органов (половых желез и легких) (первая колонка); E11.5 органы после 24 часов (вторая колонка) и 48 ч культуры управления капли (третья колонка); E11.5 органы культивированные в течение 48 ч с ингибитором ИТК II VEGFR (четвертый столбец); и E13.5 в-utero- разработан органы (пятая колонна). Половые ориентированы гонад (четкая структура) над мезонефроса (непрозрачной структурой). E11.5 гонады bipotential и появляются морфологически идентичны (женщин) образцов XY (мужчина) и XX. Масштаб бар, 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

"SRC =" / файлы / ftp_upload / 53262 / 53262fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Экс естественных капель культура яички сопоставимы в архитектуре ткани и гибели клеток в-utero- развитых коллегами иммунофлуоресцентных изображения:. E11.5 в утробе плода яички -developed (первая колонка); контроль E11.5 яички после 48 часов контроля экс естественных капель культура (вторая колонка); E11.5 яички после 48 часов экс естественных капель культуры с ИТК II VEGFR ингибитора (третья колонка); и E13.5 в-utero- разработаны яички (четвертый столбец). Пунктирные линии показывают, гонад-мезонефрос границу (гонад ориентирована на вершине). SOX9 является маркером клеток Сертоли и используется для визуализации архитектуры семенников шнура; PECAM1 выражается в зародыше и сосудистых эндотелиальных клеток (поэтому, оставаясь окрашивание PECAM1 в обработанных гонад почти исключительно зародышевые клетки); и cleavред каспазы 3 является маркером апоптоза клеток. Искусственный гонады управления показал, похоже формирование семенников шнур, яичко конкретных васкуляризации (стрелки по всей фигуры), и уровни апоптоза по сравнению с в-utero- развитых коллегами, в то время как ИТК-II культивировали гонады выставлены нарушается сосудистую и аномальные морфогенез яичко шнур. Кронштейны указывают поверхности домен гонады, где сосудистая обычно присутствует, но не обнаружен в обработанных образцах. Наконечники указывают на умирают сгустки клеток сосудов в ИТК-II-обработанных семенников. Масштаб бар, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Другие органы плода (легких) культивируют экс естественных условиях в каплях сопоставимы с > Не- utero- разработанные органы иммунофлуоресцентных изображения: E11.5. Внутриутробно -developed легкие (первая колонка); E11.5 легких через 48 ч контроля экс естественных капли культуры (вторая колонка); E11.5 легких через 48 ч экс естественных капель культуры с ИТК II VEGFR ингибитора (третья колонка); и E13.5 в-utero- разработаны легкие (четвертый столбец). Sox9 этикетки ветвящиеся клетки; E-кадгерин знаки эпителия трубчатых структур; PECAM1 этикетки эндотелий; и расщепляется каспазы 3 балла апоптотических клеток. Экс естественных управления культивированный органы показывают аналогичную архитектуру и экспрессию SOX9, E-кадгерина, и PECAM1 в культивируемых органах по сравнению с в-utero- разработаны органов, но различные количества гибели клеток. При обработке ИТК II, развитие сосудов значительно снижена в легких (как показали окрашивания PECAM1). Масштаб бар, 100 мкм.цель = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Шаг Температура Время Количество циклов
Начало 94 ° С 2 мин 1 цикл
Денатурирующий 94 ° С 15 сек 35 циклов
Отжиг 57 ° С 30 сек
Удлинение 72 ° С 30 сек
Конец 72 ° С 5 мин 1 цикл

Таблица 1: XY Программа Анализ ПЦР параметров цикла для "XY (Short)" программы, используемой для ПЦР ХХ / ХУ генотипирования эмбрионов..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это исследование показывает, экс естественных весь орган метод капель, который имеет много потенциальных приложений для изучения развития плода. Этот метод может быть использован для нескольких органов, и позволяет исследователю решать биологические вопросы, которые трудно изучить с помощью естественных подходов в из-за недоступности эмбрионов и потенциальной эмбриональной летальности. Этот метод культура имеет дополнительные преимущества над другими в пробирке подходов, таких как клеточные линии млекопитающих: целые органы могут быть использованы, поэтому поддержание критических межклеточных взаимодействий, которые присутствуют в утробе; и объем культура очень мала (~ 30 мкл), таким образом, с использованием очень малых количеств редких или дорогих фармацевтических реагентов.

Критические аспекты протокола капли культуры включают в себя: а) чистый рассечение органа. Чистый рассечение позволяет архитектура ткани для сохранения и сводит к минимуму количество выставленной обрезанные или поврежденные сюрлица, которые могут быть привлечены к поверхности культуры блюдо и, возможно, нарушают культуру; б) правильной ориентации органа в капле, с тем чтобы рост органа и морфогенез; в) принятие капли соответствующего размера, так что капля сохраняет орган в месте поверхностного натяжения, но также не высыхает; г) с использованием правильного объема капелек органа. Объем капли должны быть определены эмпирически, и в зависимости от размера органа. Тем не менее, 30 мкл должно быть разумное отправной точкой. д) выбор соответствующего этапа развития для решения биологической вопрос интересов; и е) поддержание стерильной среды культуры, чтобы избежать загрязнения, которые могут повредить ткань в капле.

Эта статья в основном ориентирована на E11.5-E13.5 гонад (т.е. во время начальной половой дифференциацией), но также показывает, что этот протокол может быть применен к другим органам. Потенциальные модификации этого протокола для других органов включают в себя:) Изменения объема капли для конкретного органа и / или стадии развития. Этот метод культура применяется для всех эмбриональных стадиях для гонад, но объем должен быть настроен для более поздних эмбриональных стадиях крупных органов. Существует вероятность предел, к которому плода этапы могут быть использованы для больших органов, при условии, что простой диффузии не позволит питательных веществ или реагентов проникать большие ткани очень эффективно на более поздних этапах. Поэтому рекомендуется использовать эту культуру для органов плода на ранней стадии для эксперимента. б) добавление экзогенных факторов роста, гормоны или другие факторы культуральной среде. Некоторые органы могут потребовать данного белка или гормона происходит нормальное морфогенез; Таким образом, этот протокол может быть модифицирован добавлением таких реагентов к культуральной среде. в) регулировки длины времени в культуре. В то время как начальное развитие семенников может произойти в качестве лишь 24 часов, другие органы могут потребовать более длительных периодов времени в культуре. Если каплихранятся стерильный, ткань может быть поддается до 4 или даже 5 дней в культуре. Для более длительных периодов культуры (более 48 ч), чтобы удалить аммиак или другие встроенные сливной побочные продукты, может быть необходимо ежедневно обновлять носитель (с соответствующими реагентами) в капельках путем удаления заданного объема капли и замены, что такой же объем свежей информации; Для обработанных капель, питательными средами, должна содержать ту же концентрацию лекарственного / реагента, как при начальной обработке. г) изменения состава сред и / или связанных реагентов. Некоторые ткани могут потребовать больше или меньше данного фармацевтического реагента, чтобы вызвать желаемый эффект. Рекомендуется попробовать серийное разведение концентрации и оценкой гибель клеток (через скола каспазы 3 окрашивания), чтобы найти оптимальную концентрацию, которая будет блокировать / активировать нужный путь, но не вызывать значительную гибель клеток в культуре органов. е) использование внутреннего контроля. Так органы, такие как гонады приходят парами, один гонад может служитьв качестве идеального внутреннего контроля в противоположной обработанной гонад. Другие органы, такие как печень не приходят в парах; если штамм мыши использовали редко и образцы ограничен, можно рассекать орган пополам и каждую половину используют для контрольных и обработанных образцов. Следует иметь в виду, что органы, даже те, которые входят в пар, может показать асимметрию (например, различного количества долей для каждой стороны легких), так что надо принять к сведению, с какой стороны органа используется для управления и Образцы лечения.

В то время как капли культуры могут потенциально воссоздать практически все аспекты в развитии внутриутробной, есть некоторые ограничения этого метода. Одним из них является, что капли культур и Экс Vivo методы культуры в целом, в результате последовательно более медленными темпами роста относительных в развитии внутриутробной 1,5; это, вероятно, из-за целого ряда факторов, таких как низкие концентрации необходимых факторов роста в культуральной среде (и ихДоступ к ткани) и ограниченное образование новых сосудов, которое происходит исключая виво. В дополнение к размеру органа, существует опасение, что, если эксплантов не правильной ориентации или капелек неправильный размер, ткани морфологии может стать плоский или искаженное с отсутствием опорной конструкции, которая обеспечивается агаровой кровати В других протоколах. Тем не менее, эта проблема можно избежать с оптимизации параметров протокола. Еще одна потенциальная ограничивающим фактором является, насколько хорошо СМИ и реагенты могут диффундировать по всей органа; в то время как эти культивированные ткани имеют кровеносные сосуды, нет перфузии питательных веществ и кислорода через эти сосуды бывших естественных из-за отсутствия кровотока, так что вместо диффузии становится фактором. Это ограничение особенно очевидно в постнатальном культур семенников, в котором экс виво сперматогенеза хорошо поддерживается на периферии эксплантов но центр-самый части ткани (т.е. дальше всего от носителя) degeneraTES 21-23. Учитывая эти замечания, представляется, что размер общего ограничивающим фактором для всей органной культуре или крупногабаритных эксплантов протоколов. Тем не менее, общие морфогенетические программы, такие как морфогенеза ветвления в легких плода и Ново формирования де яичко мозга в плода гонады, по-прежнему происходят в капельных культур. Таким образом, эти процессы еще основные могут быть изучены с помощью этой техники.

Этот протокол целого органа была впервые описана Maatouk др. 2, которые адаптировали его от предыдущего метода на основе агара культуру Ковени др. 4 Преимущество капель культивирования органы экс виво через нежели в чашках с скважин в том, что он использует в мере в 10 раз объем уменьшенный культуры, таким образом, сохраняя реагентов; Кроме того, способ капель не включает предварительно инкубации агар скважин в реагента средах, что позволяет экономить время и обходит любые опасения по поводу эффективности реагентов составляет депоставляемых в ткани через агар. В то время как агар-методы, основанные на, как правило, думал, чтобы сохранить более точно трехмерную архитектуру ткани, правильной ориентации эксплантата и оптимизации условий культивирования (см выше) обеспечит нормальную морфологию капель культивировали органов.

Эти результаты показывают, что экс виво капель культивированные фетальные гонад рост выставлять и морфогенез, сравнимую с в-utero- развитых органов. Эта методика культура не ограничивается гонад, но также могут быть применены к другим органам плода, таких как легкие. Это экс естественных орган метод капли будут полезны для изучения всей сигнализации органов и органов конкретных клеточных взаимодействий, помог частично способности к изображению целых органов после лечения культуры и наркотиков. Исследование описано здесь используется ингибитор малые молекулы, чтобы исследовать влияние васкуляризации на морфогенез, но множество коммерчески Аваilable фармакологические реагенты готов изучить множество сигнальных путей и биологических процессов. Таким образом, есть много потенциальных будущих использует для этого метода капли культуры, что позволит исследователям зондировать интересные и важные вопросы в биологии развития.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) Fisherbrand 12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps GeneMate T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L Gilson FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
Fine Scissors FST 91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes Denville C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes Denville C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles BD PrecisionGlide 309623
10 ml syringe BD 305559
0.2 μM PES syringe filter VWR 28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm Whatman 1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish Falcon/Corning 353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) VWR 25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator Eppendorf CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet Nuare NU-425-400
Mini-centrifuge  Fisher Scientific 05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL GeneMate R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel Eppendorf 950040015
SMZ445 stereomicroscope Nikon SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software Alpha Innotech Corporation Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol Fisher BP2818-500
Triton X-100 Fisher BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 Fisher S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S671-3
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water Life Technologies AM9938 
XY PCR Primer  IDT N/A
Glacial Acetic Acid Fisher A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher BP2482-1
1% Ethidium bromide solution Fisher BP1302-10 Toxic
Agarose GeneMate E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 367176-2.5KG
Trizma Base Sigma T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions Thermo Scientific R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer Denville CB-4050-3
Paraformaldehyde Fisher O4042-500 Toxic
FluorMount-G Southern Biotech 0100-01
Hydrogen Chloride (HCl) Fisher A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation Bioexpress 0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered Fisher 03-600-511 Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered Sigma D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem EMD Millipore 676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody Millipore AB5535 Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody BD Pharmingen 553370 Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Cell Signaling 9661S Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) Life Technologies 13-1900 Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate Invitrogen (Molecular Probes) H1399 Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-165-153 Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-605-153 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A31572 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21206 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21208 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Life Technologies A31573 Use at dilution: 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
  2. Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
  3. DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
  4. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
  5. Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
  6. Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
  7. Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  10. Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
  11. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
  12. Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
  13. Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
  14. Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
  15. Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
  16. Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
  17. Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
  18. Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
  19. Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
  20. Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
  21. Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
  22. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
  23. Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics