باستخدام

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Potter, S. J., DeFalco, T. Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis. J. Vis. Exp. (104), e53262, doi:10.3791/53262 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التحقيق توالد في الرحم هي عملية صعبة من الناحية التقنية في الثدييات المشيمية نظرا لعدم إمكانية الوصول إلى الكواشف إلى الأجنة التي تتطور داخل الرحم. يوفر خارج الحي تستقيم طريقة الثقافة قطرة وضعت حديثا بديلا جذابا لالدراسات التي أجريت في الرحم. تقدم الثقافة فيفو السابقين قطرة القدرة على دراسة ومعالجة التفاعلات الخلوية ومسارات الإشارات المختلفة من خلال استخدام مختلف الحجب ومركبات تفعيل. بالإضافة إلى ذلك، فإن آثار مختلف الكواشف الدوائية على تطوير أجهزة معينة يمكن دراستها من دون آثار جانبية غير مرغوب فيها من إيصال الدواء النظامية في الرحم. بالمقارنة مع غيرها من نظم المختبر، وثقافة قطرة يسمح ليس فقط من أجل القدرة على دراسة ثلاثي الأبعاد التشكل وخلية خلية التفاعلات، التي لا يمكن استنساخها في خطوط خلايا الثدييات، ولكن يتطلب أيضا أقل بكثير صeagents من الآخر خارج الحي والبروتوكولات المختبر. توضح هذه الورقة السليم الماوس الجنين تشريح الجهاز وتقنيات زراعة قطرة تستقيم، تليها كله المناعي الجهاز لإثبات فعالية هذه الطريقة. فيفو السابقين قطرة طريقة ثقافة يسمح بتشكيل بنية الجهاز قابلة للمقارنة إلى ما لوحظ في الجسم الحي، ويمكن استخدامها لدراسة عمليات خلاف ذلك يصعب الدراسة بسبب الفتك الجنينية في النماذج في الجسم الحي. كنظام تطبيق النموذج، سيتم استخدام مثبط جزيء صغير للتحقيق في دور الأوعية الدموية في التشكل الخصية. هذا خارج الحي قطرة طريقة ثقافة غير قابلة للتوسيع إلى أجهزة الجسم الجنين أخرى، مثل الرئة وربما غيرها، على الرغم من أن كل جهاز يجب أن يكون على نطاق واسع درس لتحديد أي تعديلات الجهاز محددة لبروتوكول. ويوفر هذا النظام الثقافة الجهاز المرونة في التجريب مع أجهزة الجنين، والنتائج obtaineد باستخدام هذه التقنية ستساعد الباحثين اكتساب نظرة ثاقبة نمو الجنين.

Introduction

تجديد جهاز في الجسم الحي في البشر محدود للغاية؛ لذلك، هندسة الأنسجة، وتطوير الأنسجة والأعضاء من الخلايا الفردية التي تبرعت بها مجموعة، أصبح علاجا جذابا المحتملين لاستبدال الجهاز. ومع ذلك، لهذه الاستراتيجية العلاجية لتكون ناجحة، والعوامل والتفاعلات الخلوية العاملة في التشكل من الجهاز يجب دراستها بدقة وفهمها جيدا. نظرا لعدم القدرة على دراسة تطوير أجهزة معينة مع الأساليب التقليدية، تحولت الباحثون إلى الجنين كله بديل أو الثقافات الجهاز كله. Kalaskar وآخرون. 1 أظهرت أن ثقافة مرحلة التطور الجنيني كلها خارج الحي تعطي نتائج مماثلة (في 58٪ من الأجنة مثقف) لفي التنمية الرحم، مما يشير إلى أن وسائل الثقافة فيفو السابقين هي بديل ممكن للدراسات توالد.

نظام الجهاز ثقافة فردية، مثل هذا خارج الحي دروPLET نظام الثقافة، ويسمح لتحليل الجهاز كله مستقلة عن التأثيرات الجهازية، مع السماح التلاعب في مسار الإشارات معين أو التفاعلات الخلوية عن طريق إضافة الكواشف الدوائية أو الأجسام المضادة. تقليديا، ودراسة تطوير الجهاز الجنين قد اقتصر على التقنيات المعدلة وراثيا والماوس خروج المغلوب، بالإضافة إلى الكواشف الدوائية تسليمها للأمهات. ومع ذلك، هناك مسائل فنية تشمل هذه التقنيات والعلاجات في الجسم الحي. معظم المخاوف تدور حول آثار التأثير على مختلف الأجهزة في وقت واحد والذي غالبا ما يؤدي إلى الفتك الجنينية. مصدر قلق إضافي من الدراسات التلاعب نمو الجنين هو دواء تأثير الأمهات من المخدرات على التطور الجنيني داخل الرحم (على سبيل المثال، والتمثيل الغذائي الأمهات من الدواء قبل أن تصل إلى الجنين) وإذا كانت هذه الكواشف يمكن أن تمر من خلال حاجز المشيمة.

تقنية ثقافة الجهاز كلها وصفتهنا تم تكييفها من بروتوكول وصف لأول مرة من قبل معتوق وآخرون. والتي يتم تحضين الغدد التناسلية الجنينية كلها في خارج الحي الثقافات قطرة تستقيم. واحدة ميزة كبيرة لزراعة الغدد التناسلية الجنينية هي أن مثبطات جزيء صغير يمكن الوصول بسهولة الجهاز كله عن طريق الانتشار البسيط. وقد أظهرت DeFalco آخرون أن استخدام هذا فيفو السابقين قطرة طريقة الثقافة بالتزامن مع مثبطات جزيء صغير يمكن أن تستخدم لدراسة العمليات والتفاعلات التي تحدث أثناء نمو الغدد التناسلية 3 إشارات؛ أن هذه العمليات سيكون من الصعب دراسة في الجسم الحي بسبب التحديات التقنية (على سبيل المثال، مرور المخدرات عبر المشيمة أو الفتك يصيب أعضاء متعددة باستخدام النهج وراثية أو الدوائية).

ثقافة الحبرية ليست فقط تحسنا في بعض الجوانب أكثر في الرحم التجريب، ولكن أيضا أن ذلك يعد تحسنا خلال في المختبر، وبحكم السادسنظم فو كذلك. استخدام خطوط الخلايا لدراسة التشكل من الصعب للغاية لأنها تفتقر إلى أنواع الخلايا المتنوعة، تفتقر إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) العناصر الأساسية التي تسمح تشكيل بنية الجهاز، ويمكن أن تظهر التحف في الإشارة شلالات. على الرغم من أن هندسة الأنسجة وإجراء تحسينات كبيرة في خلق السقالات محاكاة ECM، والافتقار إلى المعرفة فيما يتعلق وهي مطلوبة إشارات من قبل كل نوع من الخلايا خلال توالد يجعل صعوبة في بناء نظام جهاز في المختبر. وقد أنظمة أخرى خارج الحي أنشئت سابقا لدراسة توالد، أو بشكل أكثر تحديدا التشكل، وكانت ناجحة جدا للتصوير المباشر لأجهزة الجنين في أجار transwells 5، 6 مرشحات، ومصفوفات سقالة أخرى 7،8. الاستفادة من نظام الثقافة الحبرية هو أنه يتيح دراسة التشكل من خلال توفير القدرة على الاستفادة من أقل الكواشف، والتي هي سften تكلفة، ولكن أيضا إعطاء التوتر السطحي الجهاز، وهو أمر مهم للنمو ويشير قدرات 9.

في الماوس، التشكل الخصية الأولي يحدث بين الجنينية (E) مراحل E11.5 وE13.5. وتشمل هذه المراحل نافذة الوقت الأمثل لدراسة العوامل التي تؤثر على التفرقة بين جنس معين. ومن بين العمليات الحيوية التي تحدث أثناء تشكيل الخصية هي الجيل العمارة الحبل الخصية وتشكيل شبكة الأوعية الدموية الخصية محددة. استخدام هذا الجهاز خارج الحي كله نظام الثقافة الحبرية، واحد قادر على تغيير الأوعية الدموية الخاص بالذكور وتمنع الخصية التشكل من خلال استخدام مثبط جزيء صغير الذي يمنع نشاط مستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)؛ بوساطة VEGF إعادة الأوعية الدموية هو أمر حاسم لتنمية الخصية 10-12. يمكن أن تطبق بنجاح هذه التقنية إلى الأجهزة الأخرى، ويمكن أن تستهدف وقت محددنوافذ التنمية. جبل لالجامع التصوير جهاز يسمح التصور من الهياكل الحيوية فضلا عن التغييرات الهيكلية والخلوية الناتجة عن إدارة مثبطات المختلفة. الأهم من ذلك، هذا النظام هو مفيد في هذا الباحث يمكن تجاوز آثار الخلط المحتملة من الدواء الأمهات أو التعطيل المنهجي في الجسم الحي خلال استراتيجيات الجينات المستهدفة. وهكذا، هذا الجهاز كله خارج الحي النظام الثقافة قطرات يمكن أن تحسن بشكل كبير من القدرة على فهم التفاعلات والإشارات التي تحدث بشكل خاص ضمن أجهزة خاصة أثناء التطور الجنيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسات CD-1 الفئران التي تم الحصول عليها من مختبرات نهر تشارلز. كما تم إجراء تجارب زراعة السابقة على السلالات الأخرى، مثل C57BL / 6J (لا تظهر البيانات)، ولكن يمكن استخدام أي سلالة. وكانت الإناث البالغات الحوامل حوالي 2-3 أشهر من العمر والموت الرحيم كانت عبر CO 2 الاستنشاق تليها خلع عنق الرحم وبضع الصدر الثنائي قبل إزالة الجنين. تم إيواء الفئران فقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة، وتمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي مركز سينسيناتي للأطفال الطبية مستشفى.

1. إعداد الآلات، الثقافة وسائل الإعلام، وأطباق

  1. إعداد محلول الإيثانول 70٪. الماء منزوع الأيونات الأوتوكلاف (لصنع الدوائر ترطيب وجعل / حلول تمييع). تعقيم أدوات تشريح (ملقط، مقص، و 27 G الحقن إبرة) عن طريق الرش أسفل مع الايثانول 70٪.
  2. إعداد10X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (80 جم كلوريد الصوديوم، 2 ز بوكل، 14.4 ز نا 2 هبو 2.4 غرام KH 2 PO 6.75 مل من 1 M CaCl 3.75 مل من 1 M MgCl 2 ). يحرك المزيج حتى يذوب في 1 لتر ماء معقم وتعقيمها ثم تصفية مع ورق الترشيح. تمييع 10 أضعاف مع الماء لجعل 1X PBS.
  3. حرارة تعطيل مصل بقري جنيني (FBS) عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتصفية تعقيم مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون.
  4. إعداد 38 مل 1X مستنبت كاملة (تسمى DMEM كاملة، cDMEM)، ويتألف من Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM)، و 10٪ تصفيتها FBS الحرارة المعطل و1/100 التخفيف من الأسهم للبنسلين الستربتومايسين. هذا عادة ما ينبغي أن تستخدم طازجة، ولكن يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر.
  5. إعادة تشكيل VEGFR كيناز التيروزين II (TKI II) في DMSO لتركيز الأسهم من 5 ملغ / مل، وتمييع الأسهم مع cDMEM لجعل حل العاملة. يخدع النهائيوحدانية التركيز لهذه الدراسة هو 1.875 ميكروغرام / مل في cDMEM. وفقا لتوصيات الشركة، حلول الأسهم مستقرة لمدة تصل إلى 6 أشهر في -20 ° C. أما بالنسبة للحلول العمل، وجعل جديدة واستخدامها في نفس اليوم.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز هذا الدواء في حل العاملة شقين أعلى من تركيز النهائي المطلوب (لأنها سوف تضعف شقين في الحبرية). في نفس الوقت، وإعداد نفس الحجم من cDMEM تحتوي على نفس الحجم من DMSO لعلاج "السيطرة".
  6. إعداد الكواشف ذيل الهضم (50 ملي هيدروكسيد الصوديوم و 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك [درجة الحموضة 8.0]) بشكل منفصل في الماء المقطر.
  7. جعل 25 ميكرومتر الأسهم من الاشعال XY PCR (XY إلى الأمام 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 "و XY عكس 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3 ') معا في nuclease خالية من المياه.
  8. إعداد 50X TAE العازلة (242 غرام Trizma قاعدة، 57.1 مل الجليدية حمض الخليك، 100 مل 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8.5، وإضافة الماء إلى 1 L فايحجم نال). إعداد 1X TAE العازلة تشغيل (المخفف 20 مل 50X TAE بالماء ل1 L الحجم الكلي).
  9. لإيجاد حل 2.5٪ الاغاروز (0.625 ز الاغاروز، 0.5 مل 50X TAE العازلة، 24.5 مل من الماء)، والحل الاغاروز الحرارة في الميكروويف حتى الغليان، ثم السماح لتبرد حتى حوالي 55-65 ° C (قادرة على لمس). مرة واحدة باردة، إضافة 2 ميكرولتر من 1٪ محلول بروميد إيثيديوم، وتصب جل.
    الحذر! بروميد إيثيديوم هو المغير ومشوه. يرجى استخدام قفازات النتريل وبروتوكول السلامة المناسبة عند التعامل مع. بدلا من ذلك، وغيرها من هلام حل كلاء يحتمل أن تكون أقل سمية أو الأصباغ يمكن استخدامها.
  10. إعداد عرقلة الحل (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100، و 10٪ مصل بقري جنيني [FBS]، و 3٪ ألبومين المصل البقري [BSA]) لمدة المناعي.
  11. إعداد غسل الحل (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100، 1٪ FBS، و 3٪ BSA) لالمناعي.
  12. إعداد PBTx (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100) لالمناعي.
  13. إعداد غرف الحضانة الإعlture. ملء كبيرة الاطباق (100 مم) بتري مع 35 مل تعقيمها الماء. مكان قرب حيث سيتم إجراء تشريح والثقافات.

2. عزل الجنين الخصية من المصحف العضلة

  1. تحقق الماوس الإناث المقابس المهبلية كل صباح. يعتبر ظهر اليوم الذي تم الكشف عن المكونات المهبلية E0.5. الموت ببطء الماوس الإناث الحوامل في E11.5، بطريقة تتفق مع بروتوكولات الحيوانية المعتمدة.
  2. رش أسفل البطن الماوس مع 70٪ من الإيثانول.
  3. فتح الجلد أو الغشاء البريتوني في البطن مع شق على شكل حرف V باستخدام مقص غرامة وسحب رفرف من الأنسجة لفضح الأجهزة الداخلية.
  4. تحديد المبايض عند كلا الطرفين من قرن الرحم. باستخدام مقص، وقطع في المبيض والنسيج الضام لفصل الرحم التي تحتوي على أجنة من جسم الأم.
  5. فتح جدار الرحم عن طريق خفض بلطف الجانب المقابل من المشيمة، وفضح كيس المح. يجب الحرص على عدم بوncture الكيس المحي لتجنب الأجنة تلف أو فقدان.
  6. قطع بالقرب من المشيمة لإزالة كيس المح التي تحتوي على جنين ووضعها في صحن يحتوي PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. فإن وجود أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم يساعد جزيئات الالتصاق خلية دعم للحفاظ على بنية الأنسجة ويمنع النسيج من الالتصاق على أدوات تشريح.
  7. بالملقط، قم بإزالة الكيس المحي والسلى من الجنين عن طريق ثقب بعناية الكيس المحي لخلق ثقب فيها الجنين يمكن أن تنزلق. وبمجرد أن الجنين هو خارج الكيس المحي، وقطع الحبل السري.
  8. من هذه النقطة إلى الأمام، واستخدام المجهر الموجود في غطاء نسيج الثقافة العقيمة. إزالة رأس الجنين وتجاهل من قبل معسر مع ملقط على جانبي الرقبة.
  9. إزالة الذيل ومكان في أنبوب microcentrifuge جديد لتحليل XY PCR لتحديد جنس الجنين.
    ملاحظة: في حين أنه هو الأمثل لالغدد التناسلية الثقافة في أقرب وقت ممكن بعد الحصاد، بل هو أيضا نقاط البيعsible لإزالة DNA الذيل وأداء XX / XY التنميط الجيني قبل الثقافة، بحيث يعرف جنس الجنين كل وفقط من الجنس المطلوب يجب أن يكون مثقف. في حين يجري القيام به في التنميط الجيني والأجنة يمكن أن تظل فصل (بحيث يمكن تتبع) في 4 درجات مئوية أو على الجليد لتصبح جاهزة للثقافة. واحد التحذير هو أن هذه الفترة خارج الرحم أو في الثقافة الظروف قد يؤثر على قابلية للثقافة أو تطور لاحق خلال الثقافة.
  10. تأمين الجنين في موقف ضعيف ضد قاع الطبق الثقافة التي تعلق الإبطين الجنين مع زوج واحد من ملقط (عادة الملقط الذي عقد في اليد ضعيفة). الحفاظ على هذه ملقط في المكان المناسب لعقد الجنين لا يزال أثناء عملية تشريح كامل.
  11. مع زوج آخر من الملقط، وإزالة الجلد الذي يغطي البطن وإزالة بلطف الكبد، والأمعاء، وغيرها من الأجهزة للكشف عن الجدار الخلفي الجسم.
  12. كما سيتم تقع الغدد التناسلية على جدار الجسم الخلفي على جانبي الأبهر الظهري،أحد الأوعية الدموية الكبيرة على طول خط الوسط من الجسم، مغرفة تحت التلال البولي التناسلي مع ملقط المغلقة وإزالة التلال البولي التناسلي عن طريق فتح ملقط ورافعين. كما سيتم إرفاق الغدد التناسلية فضفاضة للجدار، يجب الحرص على عدم سحب ما يصل بسرعة كبيرة دون إزالة هذه الاتصالات أو الغدد التناسلية تمتد، مما تسبب في أضرار لأجهزة.
  13. نقل ريدج البولي التناسلي في cDMEM في طبق للتأقلم الأنسجة إلى وسائل الإعلام.
  14. فصل مجمع الغدد التناسلية-mesonephros عن بقية التلال البولي التناسلي باستخدام الإبر 27 G. استخدام إبرة واحدة لقطع طريق الضغط على أسفل، واستخدام البعض لتوجيه الأنسجة بشكل صحيح للسماح للفصل الأمثل. تجنب استخدام حركة النشر ضد قاع الطبق، والإبر الحادة سيخلق شظايا من البلاستيك التي يمكن التمسك الأنسجة. تأكد للحفاظ على mesonephros تعلق تماما على الغدد التناسلية.

3. التثقيف من مناسل مع المانع الصغيرة جزيء

  1. تعيين اثنين 20 μماصات لتر إلى 15 ميكرولتر لكل منهما. قطع حوالي 1-2 ملم مرة واحدة من النصائح حاجز ماصة باستخدام نظيفة، معقمة شفرة حلاقة لنقل الغدد التناسلية وإضافة للسيطرة cDMEM، في حين سيتم استخدام ماصة أخرى فقط لcDMEM المعالجة المخدرات.
  2. يصطف مع الغدد التناسلية الطويل محور مواز لطرف ماصة بحيث يمكن بسهولة أن pipetted باستخدام غيض قطع. كن حذرا من الغدد التناسلية الالتصاق إلى الداخل من طرف ماصة.
  3. تسمية جانب واحد كما الحبرية التحكم والبعض كما الحبرية التي تحتوي على المخدرات. اثنين فقط قطرات يمكن أن يصلح على 35 مم طبق الغطاء. تأكد من أن العلامات على الجفن تطابق العلامات على أنابيب microcentrifuge تحتوي ذيل الأنسجة.
  4. ماصة 15 ميكرولتر من cDMEM تحتوي على الغدد التناسلية واحد إلى قطرة في غطاء من (35 ملم) صحن الثقافة صغيرة (فقط استخدام الأغطية، وقيعان طويل القامة جدا لاحتوائه داخل غرفة طبق بتري مرطب). وضع اثنين من قطرات تحتوي على الغدد التناسلية منفصلة على جانبي الطبق، الاب فصل جيداOM بعضها البعض. الاختيار تحت المجهر للتأكد من أن الغدد التناسلية تم نقلها إلى قطرات.
  5. لالحبرية اعتبرت بمثابة السيطرة، إضافة 15 ميكرولتر إضافية من cDMEM تحتوي على DMSO (صنع في الخطوة 1.5) لجعل قطيرة مع إجمالي حجم 30 ميكرولتر. استخدم فقط "السيطرة" ماصة التي لن الاتصال المخدرات.
  6. لالحبرية أخرى (عينة المعالجة المخدرات)، إضافة 15 ميكرولتر من TKI-II-تحتوي على cDMEM لجعل قطيرة مع إجمالي حجم 30 ميكرولتر. استخدم فقط ماصة المخصصة للعينات المعالجة المخدرات.
  7. باستخدام ماصة، وانتشرت قطرات في نمط دائري توسيع حتى ما يقرب من 15-18 ملم في القطر وتقع الغدد التناسلية تقريبا في الوسط. توجيه الغدد التناسلية بحيث انها تقع على جانبها والغدد التناسلية وmesonephros يمكن تمييزها بسهولة. توجيه الرئة بحيث فصين اثنين وضع شقة.
    1. على الرغم من أن قطر القطيرات قد تختلف قليلا، وضمان أن الغدد التناسلية ليست floatinتقام ز وضعتها التوتر السطحي. تأكد من أن قطرات لا تلمس بعضها البعض، أو على جانب الغطاء. دون التوتر السطحي، فإن أجهزة تنمو على الغطاء خلال الثقافة وتتسطح، وبالتالي تشويه مورفولوجيا الجهاز.
  8. وضع بعناية غطاء صحن الثقافة التي تحتوي على قطرات تستقيم على سطح الماء في كبير (100 ملم) طبق المرطب. ضمان عدم وجود فقاعات محاصرين تحت الجزء السفلي من غطاء وأنها الاستلقاء على سطح الماء. لا عكس الغطاء ويجب الحرص على عدم ترك أي ماء تلمس الجزء العلوي من الغطاء حيث تقع قطرات.
  9. لخلق، غرفة ترطيب صغيرة، تغطية مباشرة مع غطاء الطبق المرطب أكبر لإحاطة الثقافات الغدد التناسلية. العمل في أسرع وقت ممكن للحد من أي تبخر سائل الإعلام. تأكد من أن طبق أصغر لديه غرفة بينه وبين غطاء الطبق أكبر على التحرك بحرية. خلاف ذلك، والتكثيف قد جعل ختم وبتبادل الهواء القفل إلى الأنسجة.
  10. مرة واحدة يتم وضع اثنين من الأغطية صغيرة في الغرفة، وضع على الفور غرفة في الحاضنة. احتضان الثقافات قطرة لمدة 48 ساعة في ترطيب CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.

4. البلمرة المتسلسل لتحديد جنس الأجنة

  1. إضافة ذيول الجنينية إلى أسفل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  2. إضافة إلى كل أنبوب 200 ميكرولتر من 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم.
  3. ضع في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو حتى يذوب الأنسجة تماما.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من 1M تريس، حمض الهيدروكلوريك ودوامة برفق لفترة وجيزة.
  5. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وجعل مزيج الرئيسي PCR الطازجة بضرب كل وحدة تخزين على العدد الكلي للعينات: 0.5 ميكرولتر 25 ميكرومتر حل التمهيدي، 2.5 ميكرولتر 10X طق العازلة، 0.5 ميكرولتر 10 ملي dNTPs (النيوكليوتيدات)، 19.3 ميكرولتر nuclease- المياه مجانا، 0.2 ميكرولتر الحمض النووي بوليميريز طق. تخلط جيدا.
  6. إضافة 23ميكرولتر من PCR مزيج الرئيسي لPCR أنابيب تحتوي على 3 ميكرولتر المحللة من ذيول هضمها.
  7. أنابيب نفض الغبار إلى مزجها، ثم نفذ تدور قصيرة لجلب العينات إلى أسفل الأنبوب.
  8. تشغيل XY (شورت) PCR برنامج (الجدول 1).
  9. تحميل العينات (مع 5X صبغ) وسلم في هلام الاغاروز 2.5٪ في المخزن 1X TAE.
  10. تشغيل الكهربائي للهلام الاغاروز حتى يمكن حلها XX XY والعصابات.
  11. صورة هلام مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية والتقاط الصور.
  12. تحليل كروموسوم X-محددة مقابل العصابات كروموسوم معين Y (كروموسوم X = 331 أزواج قاعدة [بي بي] وXY = 302 بي بي) 13؛ سوف XY (الذكور) عينات يكون شريطين من 331 و 302 نقطة أساس، في حين XX سوف تظهر عينات (للإناث) باعتبارها واحدة الفرقة 331 سنة مضت.

5. الجامع جبل الجهاز المناعي

اليوم 1:

  1. إزالة الغدد التناسلية من الثقافة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع طرف قطع. إذا رغبت في ذلك، فإنها قد تكونتوضع في طبق من برنامج تلفزيوني ليغسل وسائل الإعلام والكواشف. ضع في برنامج تلفزيوني في أنبوب 0.5 مل microcentrifuge ل. فإن حجم أنبوب أصغر الحفاظ على الكواشف وجعلها أسهل لمتابعة العينات في الأنبوب.
    1. تأكدي من الحفاظ على السيطرة والعينات المعالجة، وكذلك عينات XX XY و، في أنابيب منفصلة وإزالتها من الثقافة مع مجموعات منفصلة من الماصات لتجنب التلوث المخدرات المحتملين.
  2. غسل الغدد التناسلية مرتين مع برنامج تلفزيوني. من هذه النقطة، يمكن استخدام هذا البروتوكول 1X PBS تفتقر إلى الكالسيوم والمغنيسيوم. لغسلها، والسماح للالغدد التناسلية لتنزل الى قاع الأنبوب (عن طريق الجاذبية) ومن ثم إزالة السائل أعلاه. يجب الحرص على عدم فقدان الغدد التناسلية من قبل pipetting قريبة جدا لهم.
  3. إزالة PBS أكبر قدر ممكن من الأنبوب. إضافة 250 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X-100، والسماح احتضان O / N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز. بدلا من ذلك، يمكن أن يتم هذا التثبيت لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز. الحذر! Paraformaldehyde هو عبارة عن مادة سامة، لذلك اتبع بروتوكول السلامة عند التعامل مع.

يوم 2:

  1. شطف الغدد التناسلية مرتين في 250 ميكرولتر PBTx في RT.
  2. غسل الغدد التناسلية 3 مرات مع 250 ميكرولتر PBTx لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT على الكرسي الهزاز.
  3. منع الغدد التناسلية لا يقل عن 1 ساعة في 250 ميكرولتر عرقلة الحل في RT على الكرسي الهزاز.
  4. وصمة عار على الغدد التناسلية O / N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز في 250 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل.

يوم 3:

  1. شطف الغدد التناسلية مرتين في 250 ميكرولتر الحل الغسل.
  2. غسل الغدد التناسلية 3 مرات مع 250 ميكرولتر غسل الحل لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT على الكرسي الهزاز.
  3. منع الغدد التناسلية 1 ساعة في 250 ميكرولتر عرقلة الحل في RT على الكرسي الهزاز.
  4. تغطية أنبوب microcentrifuge مع رقائق الألومنيوم لحماية الأجسام المضادة الثانوية فلوري من الضوء.
  5. احتضان الغدد التناسلية 4/2 ساعة على RT على عocker في 250 الضد الثانوية ميكرولتر المخفف في عرقلة الحل تحتوي على هويشت 33342. بدلا من ذلك، نفذ الضد الثانوية وهويشت 33342 حضانة O / N عند 4 درجات مئوية على الروك.
  6. شطف الغدد التناسلية مرتين في 250 ميكرولتر PBTx.
  7. غسل الغدد التناسلية 3 مرات في 250 ميكرولتر PBTx لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT على الكرسي الهزاز.
  8. باستخدام قطع ماصة، ونقل الغدد التناسلية على شريحة مع الحد الأدنى من السائل. إزالة السائل الزائد مع ماصة، ولكن تأكد من أن الأنسجة لا تجف.
  9. توجيه الغدد التناسلية بطريقة المطلوب بالملقط، وبسرعة إضافة قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة لتركيب الغدد التناسلية على الشريحة. تأكد من أن المعاطف وسائل الإعلام تصاعد جميع العينات تماما. فمن الأهمية بمكان تجنب ترك عينات تجف.
  10. استخدام coverslips (رقم 1.5 نمط) ذات حجم مناسب لتغطية بلطف العينات. السماح تصاعد انتشار وسائل الإعلام في الاتصال كامل سطح ساترة. إذا لزم الأمر، اضغط برفق جدا على زوايا ساترة بحيثلا توجد فقاعات الهواء الكبيرة.
  11. ختم الشرائح مع طلاء الأظافر واضحة حول حواف للحد من تبخر من وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. متجر شنت الشرائح في الظلام في 4 درجات مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الثقافة فيفو السابقين قطرة واحدة تسمح للتلاعب الأجهزة كلها، مثل الغدد التناسلية، لدراسة التفاعلات الخلوية وديناميكية الشكل 1 يوضح في خطوة حكيمة الأزياء كيفية تحضير ثقافة E11.5 الغدد التناسلية الحبرية. وتشمل الخطوات الأولى في البروتوكول ثقافة إزالة الأولية للرحم التي تحتوي على الجنين من الماوس الأم (1A الشكل و1B). بعد إزالة الرحم من الأم، وقطع جدار الرحم وتتحرر الأجنة من الكيس المحي في برنامج تلفزيوني لمزيد من تشريح (الشكل 1C-E). بعد نزع الأعضاء الحشوية، ريدج البولي التناسلي واضحة للعيان على طول الجدار الخلفي للجسم الجنين (الشكل 1F) ومعزول (الشكل 1G). ثم يتم تشريح مجمع الغدد التناسلية-mesonephros بعيدا عن حافة البولي التناسلي (الشكل 1H)، ويتم وضعها في الثقافة قطيرة مع جزيء صغير المانع (الشكل 1I،اليسار: "T" للتعامل) وبدون جزيء صغير المانع (الشكل 1I، والحق: "C" للسيطرة). أرفقت الأطباق الصغيرة التي تحتوي على قطرات في جعل التحول غرفة ترطيب (الشكل 1J) وحضنت عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة.

بعد 48 ساعة حضانة تتم إزالة الأجهزة مثقف، وغسلها مع برنامج تلفزيوني، ويتعرضون لجبل بأكمله بروتوكول المناعي لتقييم فعالية الثقافة والعلاج من تعاطي المخدرات. بدلا من ذلك، فإنها يمكن معالجتها لاستخراج الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير الجيني. الجنين كلها الغدد التناسلية-mesonephros المجمعات (E11.5 وكبار السن) لديها معدل البقاء على قيد الحياة عالية عند تحويلها إلى وسائط الثقافة على الفور بعد تشريح نظيفة والمثقف في ظل الظروف العادية (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 48 ساعة (ولكن ما في وسعها يحتمل أن يكون مثقف لفترة أطول إذا لزم الأمر). مقارنات الغدد التناسلية E11.5 تحت brightfield microscopy في الحضانة الأولية مقابل بعد 24 أو 48 ساعة من ثقافة تكشف عن تغيير جذري في شكل الغدد التناسلية وظهور هياكل الحبل مثل شريط في الغدد التناسلية تحكم XY (الشكل 2). ولذلك، بعد زراعة لمدة 48 ساعة، والتنمية هي مماثلة لتلك التي E13.5 في الغدد التناسلية الرحم (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، E11.5 رئة الجنين ينمو وزيادة يعرض المتفرعة التي تحدث عادة خلال هذه المرحلة في التنمية (الشكل 2). النتائج العملية الثقافة عموما في الأجهزة الأصغر حجما مقارنة في الرحم، وعلى الأرجح بسبب حقيقة أن الظروف الثقافة ليست كما المثلى للنمو بالنسبة للفي الرحم البيئة (انظر مناقشة).

على الرغم من أن حجم أجهزة الناتجة عن ثقافة 48 ساعة يختلف من داخل الرحم -developed الأجهزة، تظهر خارج الجسم الحي أجهزة مثقف العمارة الأنسجة مماثلة، ويمكن أن تستخدم بدائل معقولة (Figures 3 و 4). لتوصيف بنية الجهاز والتشكل، وعلامات هذا الوصف على وجه التحديد أنواع الخلايا الجهاز الحرجة استخدمت مثل SOX9 لخلايا الخصية سيرتولي وخلايا الرئة المتفرعة، كادهيرين E للخلايا الظهارية الرئة، PECAM1 للخلايا الجرثومية والأوعية الدموية، والمشقوق كاسباس 3 ل الخلايا أفكارك (أرقام 3 و 4). Sox9، ترميز عامل النسخ، ويلعب دورا هاما في انتشار الجنين الجهاز، والتمايز، وتشكيل مصفوفة خارج الخلية. لذلك، في كلا الجهازين، وتستخدم SOX9 كعلامة المعمارية المشتركة التي تصف خلايا سيرتولي تقع داخل الحبال الخصية 14-16 والهياكل المتفرعة داخل الرئتين 17.

ثقافات الغدد التناسلية في إعادة معينة في الرحم التشكل على نحو فعال. يتم تحديد الغدد التناسلية الماوس في الجنينية (E) مرحلة E10.0 وغير متطابقة في البداية شكليا في XY (الذكور) وXX (فيممزر) الأجنة. التعبير عن (منطقة جنس تحديد من كروموسوم Y) جمهورية يوغوسلافيا الجينات في XY الغدد التناسلية بدأت في E10.5 يدفع التغيرات الجزيئية والمورفولوجية الرئيسية التي تحدث بسرعة بين E11.5 وE13.5 في الخصية الجنينية 19، بما في ذلك: مواصفات خلايا سيرتولي، والنسب خلية دعم من الخصية. تشكيل الحبال الخصية، والتي تتألف من خلايا سيرتولي والجرثومية وهي السلائف الجنين إلى الأنابيب المنوية الكبار. وإعادة الأوعية الدموية الرئيسية. في بالذكور إعادة الأوعية الدموية، والخلايا البطانية صدر من الضفيرة الوعائية في mesonephros المجاورة تهاجر إلى الغدد التناسلية لتشكيل نظام الشرايين 4،20 الخصية محددة. تحليل مناعي الكشف عن هياكل الحبل الخصية متطورة والأوعية الدموية في E13.5 في الخصيتين الرحم قريبة E11.5 الخصيتين (الشكل 3). كما صور في الشكل 3 العرض، يمكن للنظام الثقافة قطرة إعادة إنشاء الخصية التمايز EVالوالدان خارج الجسم، كما أنه من الممكن أن تصور خلايا سيرتولي-SOX9 إيجابية في الغدد التناسلية XY تشكيل في الحبال تشبه أنبوب صغير والأوعية الدموية في جميع أنحاء تشكيل الجهاز. وفيما يتعلق الرئتين، ونتائج ثقافة 48 ساعة في زيادة المتفرعة من SOX9 / كادهيرين E فروع الظهارية انقر نقرا مزدوجا إيجابية على مدار أيام 2 (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، ونحن نرى مستويات مماثلة من موت الخلايا المبرمج في السيطرة مثقف والغدد التناسلية الرحم، في حين أن هناك بعض الزيادة في الخلايا أفكارك في الرئتين في ظل الظروف الثقافة نفسها (أرقام 3 و 4)، مما يدل على أن الغدد التناسلية غير قابلة خاص لظروف التربية.

مثبطات جزيء صغير يمكن استخدامها لدراسة تطوير الجهاز عن طريق التأثير في توطين الخلوية، والانتشار، ووضع دورة الخلية، وكذلك بنية الجهاز ومختلف الاجهزة الإشارة. كامل طريقة فيفو السابقين قطرة الجهاز يسمح للباحث لإدارة المواد الكيميائية الدوائية بسهولة إلى الحديدأجهزة التل في حجم صغير جدا من وسائل الإعلام الثقافة. لدراسة آثار الأوعية الدموية وإعادة الأوعية الدموية على التمايز الخصية والتشكل، استخدمنا الصغيرة جزيء المانع TKI II، كاشف أن يعطل الخصية تطوير الأوعية الدموية 3 عن طريق منع نشاط مستقبلات VEGF؛ تشكيل بنية الخصية الجنينية يحدث بطريقة تعتمد على الأوعية الدموية، من خلال عامل نمو بطانة الأوعية الدموية A (VEGFA) 11،12. بينما الأوعية الدموية في الخصية هو أمر حاسم لتصدير التستوستيرون الذي يدفع ترجيل من الجنين، كما أنها المحرك الرئيسي للالتشكل الحبل الخصية: أظهرت الأعمال السابقة أنه عندما يتم حظر VEGFA الإشارات عند أو قبل E11.5، وخلايا سيرتولي فشل لتقسيم الخروج من الخلايا المحيطة الخلالي وليس الهياكل الحبل تشكل 3،12. وتوضح النتائج المعروضة هنا أن تعطل إعادة الأوعية الدموية في الخصية الجنينية فعال في نظام الثقافة الحبرية، وsubsequenعيوب تي في التشكل الخصية (أي غير طبيعي تشكيل الحبل الخصية) يمكن تصور (الشكل 3). وتجدر الإشارة إلى أن PECAM1، وهي علامة للحصول على الخلايا البطانية، وأعرب أيضا عن طريق الخلايا الجرثومية (الشكل 3). هذا تلطيخ الخلية الجرثومية هو الرقابة الداخلية التي تظهر أن عدم تلطيخ الأوعية الدموية في الغدد التناسلية معاملة لا يعود لأسباب فنية، ويدل أيضا على أن أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الجرثومية لا تتأثر العلاج من تعاطي المخدرات. وبالنظر إلى أن معظم التشكل الخصية الأولي يحدث بين E11.5 وE13.5، وهذه المراحل هي النافذة الأمثل لتحديد العوامل التي تؤثر على التفرقة بين جنس معين، ولا سيما دور VEGF وإعادة الأوعية الدموية في الغدد التناسلية.

استخدام TKI الثاني خلال تطوير الرئة بين E11.5 وE13.5 تبين أن جزيء صغير تثبيط الأوعية الدموية يمكن أن تتكرر في جهاز آخر (الشكل 4). هذه النتيجة تظهر فعالية رانه خارج الحي قطرة الجهاز نظام نموذجي ثقافة الجنين والقدرة على استخدام مثبطات جزيء صغير لتغيير مسارات الإشارات داخل الأجهزة. ونظرا لسهولة ومرونة وفعالية هذا البروتوكول، توفر ثقافة قطرة بديل مناسب لطرح الأسئلة التجريبية بشأن تطوير الجهاز التي لا يمكن معالجتها في الجسم الحي.

الشكل 1
الشكل 1. خطوات في المختبر الجهاز كله بروتوكول ثقافة الحبرية. (A) الموت الرحيم الماوس حاملا فتح التجويف البريتوني. (B) الرحم قرن مع الأجنة المغلقة. (C) عن قرب نظرا لفتح جدار الرحم مع تعرضا المحتوية على الجنين الكيس المحي. (D) وجنين واحد (ه) ويرد إلى المشيمة (ع) المغلقة داخل الكيس المحي (ص). (E) الأجنة فصل و المشيمة مدمج والكيس المحي. (F) الجنين مشرح مع الأجهزة الحشوية إزالتها والتلال البولي التناسلي يتعرض (الغدد التناسلية داخل التلال البولي التناسلي المبينة باللون الأسود). (G) عن قرب من عزلة من التلال البولي التناسلي (مجمعات للmesonephros الغدد التناسلية المبينة باللون الأسود). النجمة يدل الأبهر الظهري في G وH. (H) فصل الغدد التناسلية-mesonephros مجمع من التلال البولي التناسلي (تشريح يصور خط متقطع الأسود). ز، الغدد التناسلية. م، mesonephros. (I) إنشاء الثقافات قطرة في غضون 35 ملم صحن الثقافة الغطاء. وتشير السهام السوداء إلى الغدد التناسلية داخل قطرات. T، وتعامل. C، السيطرة. (J) اثنين من قطرات الأغطية طبق ثقافة وضعت داخل غرفة ترطيب المفتوحة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ig2.jpg "/>
الشكل 2. تطوير المجراة سابقا قطيرة أجهزة مثقف قريبة في أجهزة الرحم الصور Brightfield من: E11.5 في utero- وضعت أجهزة (الغدد التناسلية والرئتين) (العمود الأول)؛ أجهزة E11.5 بعد 24 ساعة (العمود الثاني) و 48 ساعة ثقافة السيطرة الحبرية (العمود الثالث)؛ أجهزة E11.5 مثقف لمدة 48 ساعة مع TKI II VEGFR المانع (العمود الرابع)؛ وE13.5 وضعت في utero- أجهزة (طابور خامس). موجهة الغدد التناسلية مع الغدد التناسلية (هيكل واضح) فوق mesonephros (هيكل مبهمة). الغدد التناسلية E11.5 هي ثنائي المكنة وتظهر متطابقة شكليا في XY (الذكور) وXX عينات (للإناث). شريط النطاق، 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53262 / 53262fig3.jpg "/>
الشكل 3. خارج الحي الخصيتين الثقافة قطرة قابلة للمقارنة في مجال العمارة الأنسجة وموت الخلايا لنظرائهم نموا في utero- الصور مناعي من: E11.5 في الرحم -developed الخصيتين الجنين (العمود الأول)؛ الخصيتين السيطرة E11.5 بعد 48 ساعة من سيطرة الجسم الحي ثقافة الحبرية (العمود الثاني) السابقين. E11.5 الخصيتين بعد 48 ساعة من خارج الحي ثقافة قطيرة مع TKI II VEGFR المانع (العمود الثالث)؛ وE13.5 في utero- وضع الخصيتين (العمود الرابع). الخطوط المتقطعة تشير الحدود الغدد التناسلية-mesonephros (موجه الغدد التناسلية في الأعلى). SOX9 هو علامة من خلايا سيرتولي ويستخدم لتصور العمارة الحبل الخصية. وأعرب عن PECAM1 في الجرثومية وخلايا بطانة الأوعية الدموية (وبالتالي، تبقى PECAM1 تلطيخ في الغدد التناسلية المعالجة هو الخلايا الجرثومية حصرا تقريبا)؛ وcleavإد كاسباس 3 هو علامة من الخلايا أفكارك. وأظهرت الغدد التناسلية السيطرة مثقف تشكيل الحبل الخصية مماثل، الأوعية الدموية الخصية محددة (الأسهم في جميع أنحاء الشكل)، ومستويات الخلايا نسبة إلى نظيراتها المتقدمة في utero-، في حين تعطل الغدد التناسلية TKI-II-مثقف تعرض الأوعية الدموية وغير طبيعي التشكل الحبل الخصية. بين قوسين تشير مجال سطح المناسل حيث الأوعية الدموية موجودة بشكل طبيعي ولكن لم يتم الكشف في عينات المعالجة. وتشير السهام إلى الموت كتل الخلايا الوعائية في الخصيتين TKI-II المعاملة. شريط النطاق، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. أجهزة الجنين أخرى (الرئة) مثقف خارج الحي في قطرات قابلة للمقارنة ل > IN-utero- الأجهزة المتقدمة الصور مناعي من: E11.5 في الرحم الرئتين -developed (العمود الأول)؛ E11.5 الرئتين بعد 48 ساعة من سيطرة فيفو السابقين الثقافة الحبرية (العمود الثاني)؛ E11.5 الرئتين بعد 48 ساعة من خارج الحي ثقافة قطيرة مع TKI II VEGFR المانع (العمود الثالث)؛ وE13.5 في utero- تطوير الرئتين (العمود الرابع). التسميات SOX9 المتفرعة الخلايا. علامات كادهيرين E الظهارية الهياكل الأنبوبية. PECAM1 تسميات بطانة الأوعية الدموية. والمشقوق كاسباس 3 علامات الخلايا أفكارك، وتظهر خارج الحي مراقبة أجهزة مثقف بنية مماثلة والتعبير عن SOX9، كادهيرين E، وPECAM1 في أجهزة مثقف مقارنة في utero- وضعت الأجهزة، ولكن كميات من موت الخلايا متفاوتة. على العلاج مع TKI II، يتم تقليل تطوير الأوعية الدموية بشكل كبير في الرئتين (كما يتضح من PECAM1 تلطيخ). شريط النطاق، 100 ميكرون.الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خطوة درجة الحرارة وقت عدد دورات
بدء 94 درجة مئوية 2 دقيقة 1 دورة
تغيير طبيعة 94 درجة مئوية 15 ثانية 35 دورات
الصلب 57 ° C 30 ثانية
استطالة 72 درجة مئوية 30 ثانية
النهاية 72 درجة مئوية 5 دقيقة 1 دورة

الجدول 1: XY برنامج تحليل PCR المعلمات دورة ل "XY (شورت)" برنامج PCR تستخدم لXX / XY التنميط الجيني للأجنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح هذه الدراسة المجراة سابقا كله الجهاز طريقة قطرة يحتوي على العديد من التطبيقات المحتملة لدراسة التطور الجنيني. هذه التقنية يمكن استخدامها لأجهزة متعددة، ويسمح الباحث لمعالجة المسائل الحيوية التي يصعب دراسة استخدام في الجسم الحي النهج بسبب عدم إمكانية الوصول إلى الأجنة والفتك الجنينية المحتملة. هذه الطريقة ثقافة له فوائد إضافية على الآخر في المختبر النهج مثل خطوط الخلايا الثديية: الأجهزة كلها يمكن استخدامها، وبالتالي الحفاظ على التفاعلات بين الخلايا الحرجة التي تكون موجودة في الرحم. وحجم الثقافة صغير جدا (~ 30 ميكرولتر)، وبالتالي استخدام كميات صغيرة جدا من المواد الكيميائية الدوائية النادرة أو باهظة الثمن.

الجوانب الحاسمة للبروتوكول ثقافة الحبرية ما يلي: أ) تشريح نظيفة من الجهاز. تشريح نظيفة يسمح بنية الأنسجة إلى الإبقاء على ويقلل من عدد من قطع يتعرض أو سور التالفةوجوه، والتي قد تنجذب إلى سطح الطبق الثقافة وقد تعكر صفو الثقافة؛ ب) التوجه السليم للجهاز داخل الحبرية، من أجل السماح للنمو الجهاز والتشكل. ج) اتخاذ الحبرية الحجم المناسب، بحيث تحتفظ الحبرية الجهاز في مكان من التوتر السطحي ولكن أيضا لا تجف. د) باستخدام حجم القطيرات الصحيح للجهاز. ينبغي تحديد حجم القطيرات تجريبيا وفقا لحجم الجهاز. ومع ذلك، يجب أن يكون 30 ميكرولتر نقطة انطلاق معقولة. ه) اختيار مرحلة ذات الصلة من التنمية لمعالجة هذه المسألة البيولوجية المصالح؛ و) الحفاظ على البيئة ثقافة عقيمة، لتجنب التلوث التي يمكن أن تتلف الأنسجة داخل الحبرية.

ويركز هذا البحث أساسا على الغدد التناسلية E11.5-E13.5 (أي خلال التمايز الجنسي الأولي)، ولكنه يظهر أيضا أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على الأجهزة الأخرى. التعديلات المحتملة لهذا البروتوكول عن الأجهزة الأخرى وتشمل: أ) تغيير حجم القطيرات لعضو معين و / أو مرحلة من مراحل التنمية. هذه الطريقة الثقافة ينطبق على جميع مراحل الجنين لالغدد التناسلية، ولكن ينبغي تعديل حجم لمراحل الجنين في وقت لاحق من الأجهزة الأكبر حجما. ومن المرجح هناك حد لمراحل الجنين التي يمكن استخدامها لأجهزة أكبر، بالنظر إلى أن الانتشار البسيط لن تسمح المغذيات أو الكواشف لاختراق الأنسجة كبيرة جدا بشكل فعال في مراحل لاحقة. ولذلك فمن المستحسن استخدام هذه الثقافة لأجهزة الجنين في أقرب وقت ممكن للتجربة. ب) مضيفا عوامل خارجية النمو والهرمونات، أو عوامل أخرى إلى وسائل الإعلام الثقافة. قد تتطلب بعض الأجهزة بروتين معين أو هرمون الخضوع التشكل الطبيعي. لذلك، هذا البروتوكول يمكن تعديلها بإضافة هذه الكواشف إلى وسائل الإعلام الثقافة. ج) تعديل طول الوقت في الثقافة. في حين يمكن أن يحدث تطور الخصية الأولية في اقل من 24 ساعة، قد تتطلب أجهزة أخرى فترات أطول من الزمن في الثقافة. إذا كانت قطراتيتم الاحتفاظ عقيمة، قد تكون أنسجة قابلة للما يصل إلى 4 أو حتى 5 أيام في الثقافة. لفترات أطول من ثقافة (أكثر من 48 ساعة)، لإزالة الأمونيا أو غيرها من النفايات المبنية تركات قد يكون من الضروري لتحديث وسائل الإعلام يوميا (مع الكواشف المرتبطة بها) في قطرات عن طريق إزالة حجم مجموعة من الحبرية والاستعاضة عن ذلك نفس الحجم مع وسائل الإعلام العذبة؛ لقطرات المعالجة، ويجب أن تحتوي وسائل الإعلام الجديدة على نفس التركيز من المخدرات / الكاشف كما في العلاج الأولي. د) تغيير التركيب من وسائل الإعلام و / أو الكواشف المرتبطة بها. قد تتطلب بعض الأنسجة أكثر أو أقل من كاشف الأدوية تعطى للحصول على التأثير المطلوب. فمن المستحسن لمحاولة التخفيف المتسلسل للتركيز وتقييم موت الخلايا (عبر المشقوق كاسباس 3 تلطيخ) للعثور على تركيز الأمثل التي من شأنها عرقلة / تفعيل المسار المطلوب ولكن ليس لحث على موت الخلايا كبيرا في أجهزة المستزرعة. ه) استخدام الضوابط الداخلية. منذ أجهزة مثل الغدد التناسلية تأتي في أزواج، ويمكن الغدد التناسلية واحد يخدمباعتبارها الرقابة الداخلية مثالية للتعامل الغدد التناسلية المقابل. الأجهزة الأخرى مثل الكبد لا تأتي في أزواج. إذا كانت سلالة الماوس المستخدم هو نادر وعينات محدودة، فمن الممكن لتشريح الجهاز في النصف واستخدام كل شوط لمراقبة وعينات المعالجة. يجب على المرء أن نضع في اعتبارنا أن الأجهزة، حتى تلك التي تأتي في أزواج، قد تظهر التباين (مثل عدد مختلف من فصوص لكل جانب من الرئة)، لذلك يجب على المرء أن يحيط علما أي جانب من الجهاز يتم استخدامه للسيطرة و عينات العلاج.

بينما الثقافات قطرة يحتمل أن إعادة إنشاء تقريبا جميع جوانب التنمية في الرحم، وهناك بعض القيود على هذه التقنية. واحد هو أن الثقافات قطرة، وبحكم تقنيات زراعة الجسم الحي بشكل عام، يؤدي إلى تباطؤ معدلات النمو باستمرار قريبة في التنمية الرحم 1،5. هذا هو الأرجح بسبب عدد من العوامل، مثل تركيزات أقل من عوامل النمو المطلوب في وسائل الإعلام ثقافة (وعلىالوصول إلى الأنسجة) واتساع الأوعية الدموية المحدود الذي يحدث خارج الحي. بالإضافة إلى حجم الجهاز، هناك قلق، وإذا لم يتم توجيه يزدرع بشكل صحيح أو الحبرية هو حجم غير صحيح، قد تصبح التشكل الأنسجة بالارض أو مشوهة مع عدم وجود هيكل الدعم التي توفرها سرير أجار في البروتوكولات الأخرى. ومع ذلك، يمكن تجنب هذه المشكلة مع تعظيم الاستفادة من المعلمات البروتوكول. العوامل التي تحد محتمل آخر هو مدى وسائل الإعلام والكواشف يمكن منتشر في جميع أنحاء الجهاز بأكمله؛ في حين أن هذه الأنسجة مثقف لها الأوعية الدموية، ليس هناك نضح من المواد المغذية والأكسجين من خلال هذه السفن خارج الجسم الحي بسبب نقص تدفق الدم، وذلك بدلا يصبح نشر عاملا. هذا القيد هو واضح خصوصا في الثقافات الخصية بعد الولادة، والتي فيفو السابقين الحيوانات المنوية غير مستدامة جيدا في محيط النباتى ولكن الجزء الوسط معظم الأنسجة (أي أبعد من وسائل الإعلام) degeneraقسم التدريب والامتحانات 21-23. ونظرا لهذه الملاحظات، يبدو أن حجم عاملا مقيدا العام للثقافة الجهاز كله أو بروتوكولات يزدرع كبيرة الحجم. ومع ذلك، برامج تخلقية العامة، مثل المتفرعة التشكل في رئة الجنين وتكوين الحبل الخصية نوفو دي في الغدد التناسلية الجنين، لا تزال تحدث في الثقافات الحبرية. لذلك، لا تزال هذه العمليات الأساسية دراستها باستخدام هذه التقنية.

وقد وصفت هذا البروتوكول الجهاز كله أول من معتوق وآخرون. الذي تكييفها من مقرها أجار طريقة الثقافة السابق بنسبة Coveney وآخرون. 4 الاستفادة من زراعة الأعضاء خارج الحي عبر قطرات بدلا من الآبار أجار هو أنه يستخدم في وبلغ حجم التداول الأقل 10 أضعاف الحد من ثقافة، وبالتالي الحفاظ على الكواشف. بالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة قطرات لا ينطوي قبل تفرخ-الآبار أجار في التي تحتوي على كاشف وسائل الإعلام، مما يوفر الوقت ويتجاوز أية مخاوف حول كفاءة الكواشف كونها ديlivered إلى الأنسجة عن طريق أجار. في حين يعتقد عموما الأساليب القائمة على أجار للحفاظ على أكثر بأمانة الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد من الأنسجة، والتوجه السليم للالنباتى وتعظيم الاستفادة من الظروف والثقافة (انظر أعلاه) ضمان التشكل الطبيعي للأجهزة قطرة مثقف.

هذه النتائج تثبت أن فيفو السابقين قطرة مثقف الغدد التناسلية الجنينية نمو المعرض والتشكل مماثلة لتلك التي من الأجهزة المتقدمة في utero-. لا يقتصر هذا الأسلوب الثقافة إلى الغدد التناسلية، ولكن أيضا يمكن تطبيقها على أجهزة الجنين أخرى مثل الرئة. وهذا خارج الحي الجهاز طريقة قطرة تكون مفيدة لدراسات كلها إشارات الجهاز والجهاز محددة التفاعلات الخلوية، مدعوما جزئيا القدرة على صورة أجهزة كاملة بعد ثقافة والعلاج من تعاطي المخدرات. الدراسة الموصوفة هنا يستخدم مثبط جزيء صغير للتحقيق في تأثير الأوعية الدموية على التشكل، ولكن عدد كبير من افا تجارياالكواشف الدوائية ilable متاحة لدراسة العديد من مسارات إشارات والعمليات البيولوجية. ولذلك، هناك العديد من الاستخدامات المحتملة في المستقبل لهذا الأسلوب الثقافة الحبرية التي من شأنها أن تسمح للباحثين للتحقيق الأسئلة المثيرة للاهتمام وهامة في البيولوجيا التطورية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) Fisherbrand 12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps GeneMate T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L Gilson FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
Fine Scissors FST 91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes Denville C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes Denville C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles BD PrecisionGlide 309623
10 ml syringe BD 305559
0.2 μM PES syringe filter VWR 28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm Whatman 1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish Falcon/Corning 353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) VWR 25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator Eppendorf CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet Nuare NU-425-400
Mini-centrifuge  Fisher Scientific 05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL GeneMate R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel Eppendorf 950040015
SMZ445 stereomicroscope Nikon SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software Alpha Innotech Corporation Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol Fisher BP2818-500
Triton X-100 Fisher BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 Fisher S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S671-3
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water Life Technologies AM9938 
XY PCR Primer  IDT N/A
Glacial Acetic Acid Fisher A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher BP2482-1
1% Ethidium bromide solution Fisher BP1302-10 Toxic
Agarose GeneMate E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 367176-2.5KG
Trizma Base Sigma T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions Thermo Scientific R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer Denville CB-4050-3
Paraformaldehyde Fisher O4042-500 Toxic
FluorMount-G Southern Biotech 0100-01
Hydrogen Chloride (HCl) Fisher A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation Bioexpress 0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered Fisher 03-600-511 Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered Sigma D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem EMD Millipore 676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody Millipore AB5535 Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody BD Pharmingen 553370 Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Cell Signaling 9661S Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) Life Technologies 13-1900 Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate Invitrogen (Molecular Probes) H1399 Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-165-153 Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-605-153 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A31572 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21206 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21208 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Life Technologies A31573 Use at dilution: 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
  2. Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
  3. DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
  4. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
  5. Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
  6. Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
  7. Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  10. Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
  11. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
  12. Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
  13. Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
  14. Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
  15. Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
  16. Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
  17. Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
  18. Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
  19. Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
  20. Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
  21. Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
  22. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
  23. Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics