Kullanımı

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Potter, S. J., DeFalco, T. Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis. J. Vis. Exp. (104), e53262, doi:10.3791/53262 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Intrauterin organogenezi incelenmesi rahim içinde gelişmesi embriyolar nedeniyle reaktif erişilememesi plasenta memelilerde teknik olarak oldukça zor bir süreçtir. Yeni geliştirilen ex vivo dik damlacık kültür yöntemi rahimde yapılan çalışmalara cazip bir alternatif sunuyor. Ex vivo damlacık kültürü incelemek ve çeşitli engelleme ve aktive bileşiklerin kullanımı ile hücresel etkileşimleri ve çeşitli sinyal yolları işlemek için yeteneği sağlar; buna ek olarak, belirli bir organların gelişimi üzerindeki çeşitli farmakolojik reaktifler etkileri in utero sistemik ilaç verilmesi, istenmeyen yan etkiler olmadan incelenebilir. Vitro sistemler diğer karşılaştırıldığında, damlacık kültürü, memeli hücre çizgilerinde üretilemeyen, üç boyutlu morfogenez ve hücre-hücre etkileşimini incelemek için yeteneği, izin verir, ancak, aynı zamanda daha az r gerektirir sadeceex vivo ve in vitro diğerinden daha protokollerde eagents. Bu yazıda yöntemin etkinliğini göstermek için tüm organ immünofloresan ardından uygun fare fetal organı diseksiyonu ve dik damlacık kültürü teknikleri, göstermektedir. Ex vivo damlacık kültürü yöntemi benzer in vivo olarak gözlenen ve in vivo modellerde embriyon ölümlerine nedeniyle, aksi takdirde zor çalışma süreçleri incelemek için kullanılabilir ne organ mimarisi oluşumunu sağlar. Bir örnek uygulama sistemi olarak, bir küçük moleküllü inhibitör testiküler morfojenezinde damarlanma rolünü araştırmak için kullanılacaktır. Her organ yoğun olması protokole herhangi bir organ spesifik değişiklikler belirlemek için okudu gerekir, ancak bu ex vivo damlacık kültür yöntemi, akciğer ve potansiyel diğerleri gibi diğer fetal organ sistemlerinde, yükseltilebiliyor. Bu organ kültür sisteminde fetal organlar ile deney esneklik sağlar ve obtaine sonuçlarıd araştırmacılar fetal gelişim içgörüler elde etmenize yardımcı olacaktır, bu tekniği kullanarak.

Introduction

Insanlarda in vivo olarak organ yenilenmesi çok sınırlıdır; Bu nedenle, doku mühendisliği, doku ve bir ev sahibi tarafından bağışlanan bireysel hücrelerden organ gelişimi, organ değişimi için cazip bir potansiyel tedavi haline geliyor. Bu tedavi stratejisi başarılı olması için, ancak, faktörler ve organ morfolojilerinden katılan hücresel etkileşimleri iyice incelenmesi gerekir ve iyi anladım. Geleneksel yaklaşımlara belirli organların gelişimini incelemek için yetersizlik nedeniyle, araştırmacılar, alternatif bütün embriyo veya tüm organ kültürlerinde döndü. Kalaskar ve ark., 1 o ex vivo kültür yöntemleri organogenezisin çalışmaları için uygun bir alternatif düşündüren, utero geliştirme için (kültürlü embriyoların% 58'inde) o ex vivo tüm embriyogenez kültür karşılaştırılabilir sonuçlar verir göstermiştir.

Bir bireyselleştirilmiş organ kültürü sistemi gibi bu ex vivo drofarmakolojik reaktifler veya antikorların ilavesi ile, belirli bir sinyal yolu ya da hücresel etkileşimler manipülasyonu izin verirken plet kültür sistemi, sistemik etkileri tüm organ analizi bağımsız sağlar. Geleneksel olarak, fetal organ gelişimine çalışma maternal teslim farmakolojik reaktifler yanı sıra, transgenik fare ve boşaltma teknolojileri ile sınırlı olmuştur. Ancak, in vivo bu teknikleri ve tedavileri kapsayan teknik sorunlar vardır; En endişeleri genellikle embriyonik öldürücülüğü sonuçları eş zamanlı olarak çeşitli organları etkileyen etkileri etrafında döner. Fetal gelişimi manipüle çalışmaların ilave endişe farmakolojik tür reaktifler plasental bariyeri geçmek eğer (örneğin, ilacın anne metabolizma o embriyoyu ulaşmadan önce) ve intrauterin embriyonik gelişimi üzerindeki ilaçların anne etkisidir.

Tüm organ kültürü tekniği tarifBurada bütün fetal gonadlar ex vivo dik damlacık kültürleri inkübe edildiği ilk Maatouk ve ark., 2 tarafından tarif edilen protokol uyarlanmıştır. Fetal gonadlar kültürlenmesi önemli bir avantajı, küçük molekül inhibitörleri ile kolaylıkla difüzyon ile bütün bir organ erişebilir olmasıdır. . DeFalco ve arkadaşları, küçük-molekül inhibitörleri ile bağlantılı olarak, bu ex vivo damlacık kültür yöntemi kullanılarak süreçler ve gonad gelişimi sırasında meydana gelen 3 etkileşimleri sinyal incelemek için kullanılabilir olduğunu göstermiştir; bu işlemler nedeniyle teknik zorlukları in vivo incelenmesi zor olacağını (örneğin, plasenta ya da genetik ya da farmakolojik yaklaşımlar kullanarak birden fazla organı etkileyen ölümcül yoluyla ilaçların geçişi).

Damlacık kültürü sadece utero deneme belirli yönleri üzerinde bir gelişmedir, ama aynı zamanda in vitro ve ex vi üzerinde bir gelişmedirvo sistemleri de. Bunlar, çok çeşitli hücre tiplerini eksikliği, organ mimarisinin oluşmasına izin kritik hücre dışı matris (ECM) bileşenleri yoksundur ve sinyal basamaklarının gölgeleri göstermemesi için morfonogenezi çalışma hücre çizgilerinin kullanımı son derece zordur. Doku mühendisliği ECM taklit iskeleleri oluştururken önemli iyileştirmeler yapılmış olmasına rağmen, sinyaller organogenezis sırasında her hücre türüne göre gerekli olan ilgili bilgi eksikliği zorlu in vitro organ sistemini oluşturmak için yapar. Diğer ex vivo sistemler daha önce, filtreler 6 ve diğer iskele matrisleri 7,8 organogenezi incelemek için kurulan ya da daha spesifik olarak morfogenez ve agar 4 fetal organların canlı görüntüleme için çok başarılı olmuştur, 5 transwells oylandı. Damlacık kültür sisteminin avantajı, o kadar az reaktifleri, kullanma olanağı sağlayarak morfogenez çalışma olanak sağlamasıdırFTEN pahalı, ama aynı zamanda büyüme ve sinyal yetenekleri 9 için önemli olan, organ yüzey gerilimi vererek.

Fare, ilk testis morfogenezisi embriyonik (E) arasında yer alan E11.5 E13.5 ve aşamaları; Bu aşamalar cinsiyete özgü farklılaşma etkileyen faktörleri incelemek için en uygun zaman penceresini içermektedir. Testis oluşumu sırasında meydana gelen önemli işlemler arasında testis kord mimarisinin üretimi ve testis özgü damar ağı oluşumu bulunmaktadır. Bu ex vivo tüm organ damlacık kültür sistemi kullanmak, bir erkek spesifik vaskülarizasyon değiştirebilir ve küçük bir molekül inhibitörü kullanmak suretiyle testis morfogenetiğine inhibe edebilir engelleyen, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) için reseptör etkinliği; VEGF-aracılı vasküler yeniden modellenme Testis gelişiminin 10-12 için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, başarılı bir diğer organlara uygulanabilir ve belirli bir zaman hedefleyebilirgelişme pencereler. Tüm montaj organı görüntüleme hayati yapıların görselleştirme yanı sıra çeşitli inhibitörlerinin uygulanmasından kaynaklanan yapısal ve hücresel değişiklikler sağlar. Önemli olarak, bu sistem, bir araştırmacı, in vivo hedefli gen stratejileri maternal ilaç uygulama ya da sistemik olarak bozulması potansiyel karıştırıcı etkilerini atlayabilir avantajlıdır. Böylece, bütün bu organın ex vivo damlacık kültürü sistemi önemli ölçüde fetal gelişim sırasında belirli organları içinde özellikle meydana gelen etkileşimleri ve sinyalizasyon anlama yeteneğini geliştirmek olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmalarda kullanılan tüm fareler Charles River Laboratories den temin edilen CD-1 fareler. Önceki kültürü deneyleri, aynı zamanda, C57BL / 6J (veriler gösterilmemiştir) gibi başka suşlar üzerinde gerçekleştirilmiştir, ancak herhangi bir suşu kullanılabilir. Hamile yetişkin kadın yaklaşık 2-3 aylık ve servikal dislokasyon ve embriyo çıkarılması öncesinde ikili torakotomi ardından CO 2 inhalasyon yoluyla ötenazi edildi. Fareler NIH esaslara uygun olarak muhafaza edildi ve deneysel protokoller Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık

  1. % 70 etanol çözeltisi hazırlayın. (Nemlendirilmiş odaları yapmak için ve / seyreltilmesi çözüm yapmak için) Otoklav deiyonize su. % 70 etanol ile aşağı püskürtülerek diseksiyon araçları (forseps, makas ve 27 G iğne şırınga) sterilize edin.
  2. HazırlamakMl 1 M MgCl2 CaCl2, 3,75 1 M PO 4, 6.75 mi, kalsiyum ve magnezyum (80 g NaCl, 2 g KCI, 14.4 g 2 Na HPO 4, 2.4 g KH 2 içeren 10X fosfat tamponlu tuz (PBS) ). 1 L steril otoklava su içinde çözülür ve daha sonra filtre kağıdı ile filtre karıştırın. 1X PBS yapmak için, su ile 10 kat seyreltilir.
  3. Isı 30 dakika boyunca 55 ° C 'de cenin sığır serumu (FBS) inaktive ve filtre, bir 0.22 mikron bir şırınga filtresi ile sterilize edin.
  4. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) 'den oluşan, (tam bir DMEM, cDMEM adlandırılır) 38 mi 1X komple kültür ortamı hazırlayın,% 10 penisilin-streptomisin stokunun ısı ile inaktive edilmiş FBS ile 1/100 seyreltme filtre edilmiştir. Bu genellikle taze kullanılabilir, ama 1 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  5. 5 mg / ml'lik bir stok konsantrasyonu için DMSO içinde VEGFR Tirosin kinaz önleyici II (TK II) sulandırın ve bir çalışma çözeltisinin yapılması için cDMEM ile stok seyreltin. Nihai conBu çalışma için sentrasyonu cDMEM içinde 1,875 ng / ml 'dir. Şirketin tavsiyelerine göre, stok çözeltileri -20 ° C'de en fazla 6 ay süreyle stabildir. Çalışma çözümleri gibi taze yapmak ve aynı gün kullanın.
    Not: çalışma çözeltisi içinde, bu, ilacın konsantrasyonunun (bu damlacık iki kat seyreltilmiş olacaktır çünkü) arzu edilen son konsantrasyona göre iki kat daha yüksek olması gerekir. Aynı zamanda, "kontrol" tedavi için DMSO aynı hacimde içeren cDMEM aynı hacimde hazırlar.
  6. Damıtılmış su ayrı ayrı kuyruk sindirim reaktifler (50 mM NaOH ve 1 M Tris-HCI [pH 8.0]) hazırlayın.
  7. XY PCR primerleri, bir 25 uM stok olun (XY ileri 5'-TGA TGG AGC TTT CTT TGA G-3 've 5'-in XY Arka CCG CCA CTG AAT TCT TTG G-3') birlikte nükleaz içermeyen su içinde.
  8. 50X TAE tamponu (242 g Trizma Baz, 57.1 ml buzlu asetik asit Hazırlama, 100 mi 0,5 M EDTA, pH 8.5 ve ek su, 1 L final hacim). 1X TAE çalıştırma tamponu hazırlayın (20 mi 50X TAE 1 L toplam hacim, su ile sulandırılmış).
  9. Kaynar kadar mikrodalga% 2.5 agaroz çözeltisi (0.625 gr agaroz, 0.5 ml 50X TAE tamponu, 24.5 ml su) ısı agaroz çözüm oluşturmak için, daha sonra soğumaya bırakın yaklaşık 55-65 ° C (dokunabilmek) kadar. Soğuduktan sonra,% 1 etidyum bromür çözeltisi 2 ul ve jel dökün.
    DİKKAT! Etidyum bromür mutajen ve teratojen olduğu; nitril eldiven ve uygun güvenlik protokolü taşıma kullanın. Seçenek olarak ise, diğer potansiyel olarak daha az toksik jel çözme maddeleri ya da boyalar kullanılabilir.
  10. Imüno (% 0.1 Triton X-100,% 10 fetal sığır serumu [FBS] ve% 3 sığır serum albümini [BSA] PBS) Bloklama çözeltisi hazırlayın.
  11. Immünofloresans için yıkama Solüsyonu (% 0.1 Triton X-100 PBS ile,% 1 FBS ve% 3 BSA) hazırlayın.
  12. Imüno (% 0.1 Triton X-100 ile PBS) PBTx hazırlayın.
  13. Cu kuluçka odaları hazırlayınlture. Su otoklavlanmış 35 ml büyük (100 mm çapında) petri kaplarına doldurulur. Diseksiyon ve kültürler yapılacaktır yere yakın yerleştirin.

Mus musculus kaynaklı Fetal TESTİSLERİN 2. izolasyonu

  1. Her sabah vajinal fişler için dişi fare kontrol edin. Vajinal fişi tespit edildiği gün öğle E0.5 olarak kabul edilir. Onaylı hayvan protokolleri ile uyumlu bir şekilde, E11.5 hamile kadın fare Euthanize.
  2. % 70 etanol ile fare karın aşağı Sprey.
  3. Ince makas kullanarak bir V-şekilli kesi ile karın deri ve periton açın ve iç organları maruz doku kapağı geri çekin.
  4. Uterin horn iki ucunda yumurtalık bulun. Makas kullanarak, annenin vücudundan embriyoları içeren rahim ayırmak için yumurtalığın ve bağ dokusu kesilir.
  5. Yavaşça, plasenta karşı tarafında kesme sarısı kesesi teşhir ederek rahim duvarına açın. Pu dikkatli olun değilncture yolk kesesi zarar veya kaybetme embriyolar önlemek için.
  6. Embriyo içeren sarısı keseler çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum ile PBS içeren bir çanak içine yerleştirmek için plasenta yakınındaki kesin. Kalsiyum ve magnezyum iyonlarının varlığı desteği hücre adhezyon molekülleri mimari dokusu korumak ve diseksiyon araçları yapışmasını doku önlemeye yardımcı olacaktır.
  7. Forseps ile dikkatlice embriyo dışarı kayabileceği bir delik oluşturmak için sarısı kesesi batırılarak embriyo sarısı kesesi ve amniyon çıkarın. Embriyo yumurta sarısının dışında sonra, göbek kordonu kesti.
  8. Bu noktadan sonra, steril doku kültürü kaputu bulunan bir mikroskop kullanılır. Embriyonun kafasını çıkartın ve boyun her iki tarafında forseps ile kısma atın.
  9. Kuyruk çıkarın ve embriyo cinsiyeti belirlemek için XY PCR analizi için yeni mikrosantrifüj tüpe koyun.
    Not: Hasattan sonra en kısa sürede kültür gonadlar optimal iken, aynı zamanda pos olduğunusible kuyruk DNA'sının çıkarın ve her bir embriyonun cinsiyeti bilinir ve sadece arzu edilen cinsiyet kültürlenmiş olması gerekmektedir, böylece, kültür önceden XX / XY genotipleme gerçekleştirmek için. Genotipleme yapılmaktadır birlikte kültür için hazır olana kadar 4 ° C de veya buz üzerinde (bunlar izlenebilir ve böylece), embriyolar ayrıldı tutulabilir. Bir ihtar utero veya kültür koşulları dışında bu dönem potansiyel kültür sırasında kültüre ya da sonraki gelişimi için canlılığı etkileyebilir olmasıdır.
  10. (Genelde zayıf elinde tuttuğu forseps) forseps bir çift embriyo koltukaltı iğneleyerek kültür çanak alt karşı yatar pozisyonda embriyo sabitleyin. Tüm diseksiyon sürecinde hala embriyo tutmak için yerinde bu forseps koruyun.
  11. Forseps diğer çifti, cilt kaplayan karın kaldırmak ve yavaşça vücut duvarı geri maruz karaciğer, bağırsak, ve diğer organları çıkarın.
  12. Gonadlar dorsal aort iki tarafında arka vücut duvarında bulunan gibi,Vücudun orta hat boyunca uzanan büyük bir kan damarı, kapalı forseps ile ürogenital sırtı altına kepçe ve forseps açılması ve yukarı kaldırarak ürogenital sırtı çıkarın. Gonadlar gevşek duvara iliştirilmiş gibi, bu bağlantıları çıkarmadan çok hızlı yukarı çekin ya da gonadlar organlara zarar, streç olabilir dikkatli olun.
  13. Medyaya doku acclimate bir çanak cDMEM içine ürogenital sırtı taşıyın.
  14. 27 G iğneler kullanarak ürogenital sırtın geri kalanından gonad-mezonefron kompleksi ayırın. Optimal ayrılması izin bastırarak kesti ve doğru dokuyu yönlendirmek için diğer kullanılacak bir iğne kullanın. Keskin iğneler dokuya sopa plastik kırıkları yaratacak şekilde, çanak alt karşı testere hareketi kullanmaktan kaçının. Tamamen gonad bağlı mesonephrosun tutmak için emin olun.

Küçük moleküllü inhibitör ile gonadın 3. Kültürleme

  1. Iki adet 20 mikron ayarlayın15 ul her l pipetler. Diğer pipet ilaçla tedavi cDMEM yalnızca kullanılacak ise, gonadlar ve kontrol cDMEM eklenmesi transferi için temiz, steril jilet kullanarak bariyer pipet uçları kapalı bir yaklaşık 1-2 mm kesti.
  2. Kolayca kesme ucu kullanılarak pipetlenebilir böylece pipet onların uzun eksen paralel gonadlar hizaya. Pipet içine yapışmasını gonadlar dikkatli olun.
  3. Bir kontrol damlacık olarak yan ve ilaç içeren damlacık gibi diğer etiketleyin. Sadece iki damlacıkları 35 mm çanak kapağı üzerinde sığabilir. Kapaklarındaki etiketler kuyruk doku içeren mikrosantrifüj tüpler üzerindeki etiketleri uygun olduğundan emin olun.
  4. Küçük (35 mm) kültür çanak kapağı bir damlacık içine tek bir gonad içeren cDMEM Pipet 15 ul (dipleri nemlendirilmiş petri odasına sığacak kadar uzun olduğu gibi, sadece kapaklar kullanın). Çanak her iki yanı üzerinde iki ayrı gonad ihtiva eden damlacıkları yerleştirin, iyi ayrılmış from Birbirinizi. Gonadlar damlacıklar devredilmiştir emin olmak için mikroskop altında kontrol edin.
  5. Kontrol olarak belirlenmiş damlacık için, 30 ul toplam hacim bir damlacık yapmak için (adım 1.5) yapılan DMSO içeren cDMEM ek bir 15 ul ekle. Ilaç temas olmayacak sadece "kontrol" pipet kullanın.
  6. Diğer damlacık (ilaçla tedavi örnek) için, 30 ul toplam hacmi olan bir damlacık yapmak için TKİ-II içeren cDMEM 15 ul ekleyin. Ilaçla işleme tabi tutulmuş numuneler için tasarlanmış tek pipet kullanın.
  7. Onlar çapı yaklaşık 15-18 mm ve gonad kabaca ortasında yer alır kadar pipet kullanarak, genişleyen dairesel desen damlacıklar yayılır. Onun yan yatıyor ve gonad ve mezonefron kolayca ayırt böylece gonad Orient. İki lobu düz koymak, böylece akciğer Orient.
    1. Damlacık çapı biraz farklı olabilir, ancak gonadlar uçuşan değildir sağlamakg ve yüzey gerilimi ile yerinde tutulur. Damlacıklar birbirleri veya kapağın yan dokunmayın emin olun. Yüzey gerilimi olmadan, organlar, organ ve böylece morfolojisi bozan, kültür sırasında kapağın üzerine büyür ve dümdüz olacak.
  8. Dikkatle dik büyük (100 mm) nemlendirici çanak su yüzeyi üzerine damlacıklar içeren kültür çanağı kapağı yerleştirin. Kapağın altındaki altında sıkışıp hiçbir kabarcıkları vardır emin olun ve su yüzeyinde düz yalan. Kapağı ters ve herhangi bir su damlacıkları bulunan kapağın üst dokunmasına izin vermemek için dikkatli olmayın.
  9. Küçük, nemlendirilmiş odasına oluşturmak için, hemen gonad kültürleri içine daha büyük nemlendirici çanak kapak ile kapatın. Medya herhangi buharlaşmasını en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk hareket ederler. Daha küçük tabak serbestçe hareket etmek o ve daha büyük çanak kapak arasında oda olduğundan emin olun; Aksi takdirde, yoğuşma mühür ve b yapabilirdokuya kilidi hava değişimi.
  10. Iki küçük kapaklar odasına yerleştirilir hemen sonra, inkübatör içine odasına yerleştirin. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde 48 saat boyunca damla kültürleri inkübe edin.

Embriyolar Seks Belirleme 4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu

  1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp dibine embriyonik kuyrukları ekleyin.
  2. Her tüpe 50 mM NaOH 200 ul ekle.
  3. 15 dakika boyunca ya da doku tamamen eriyene kadar 95 ° C'de yerleştirin.
  4. Hafif ve kısaca 50 1M Tris-HCI ul ve vorteks ekleyin.
  5. 0.5 ul 25 uM Primer çözelti, 2.5 ul 10X Taq tamponu, 0.5 ul 10 mM dNTP (nükleotit), 19,3 ul nuclease-: 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, örneklerin toplam sayısı her hacim çarpılarak taze PCR ana karışımı yapmak serbest su, 0.2 ul DNA Taq polimerazı. İyice karıştır.
  6. 23 EklePCR master karışımı ul sindirilmiş kuyrukları 3 ul lizatı içeren tüpler PCR için.
  7. Flick tüpler daha sonra tüpün dibine örnekleri getirmek için kısa bir sıkma gerçekleştirin, bunları karıştırın.
  8. XY (Kısa) PCR programı (Tablo 1) çalıştırın.
  9. 1X TAE tamponu içinde% 2.5 agaroz jeli içinde merdiveni (5x boyayla) örnekleri yerleştirin.
  10. XX ve XY bantları çözülebilir kadar agaroz jel elektroforezi çalıştırın.
  11. Görüntü UV ışığı ve yakalama görüntüsü ile jel.
  12. Y kromozomu özgü bantlar vs özgü X-kromozomu-(X kromozomu = 331 baz çifti [bp] ve XY = 302 bp) analiz 13; XY (erkek) numuneleri, 331 iki bant ve 302 bp olacak XX ise (kadın) numuneler tek 331 bp bandı olarak görünecektir.

5. Tüm Dağı Organ İmmünofloresan

1.gün:

  1. Bir kesme ucu ile 1000 ul pipet kullanılarak kültürden gonadlar çıkarın. Eğer arzu edilirse, bunlar olabilirortam ve reaktifleri yıkamak için bir PBS tabağına yerleştirilir. 0.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde PBS içine yerleştirin. Daha küçük tüp boyutu reaktifleri korumak ve daha kolay tüp numune takip etmek için yapacaktır.
    1. Potansiyel ilaç kirlenmesini önlemek için ayrı ayrı tüplerde, kontrol ve tedavi örnekleri yanı sıra, XX ve XY örnekleri tutmak ve pipetler ayrı setleri ile kültürden bunları kaldırmak için emin olun.
  2. PBS ile iki kez gonadlar yıkayın. Bu noktada andan itibaren, bu protokol kalsiyum ve magnezyum eksik 1X PBS kullanabilirsiniz. Onları yıkamak için, gonadlar (yerçekimi) tarafından tüpün dibine çöker ve daha sonra yukarıda sıvı kaldırmak için izin verir. Onlara çok yakın pipetleme gonadlar kaybetmek değil dikkatli olun.
  3. Tüpten mümkün olduğunca PBS çıkarın. PBS,% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden içinde% 4 paraformaldehit 250 ul ekleyin ve bir rocker 4 ° C 'de O / N inkübe edin. Seçenek olarak ise, bu tespit bir rocker 4 ° C 'de 2 saat süre ile yapılabilir. DİKKAT! ParaforFormaldehit işlerken bu nedenle güvenlik protokolünü takip toksik bir maddedir.

2. Gün:

  1. Oda sıcaklığında 250 ul PBTx iki kez gonadlar durulayın.
  2. Bir rocker oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 250 ul PBTx ile gonadlar 3 kez yıkayın.
  3. Bir rocker oda sıcaklığında çözüm Engelleme 250 ul gonadlar en az 1 saat engelleyin.
  4. Çözüm Engelleme içinde seyreltilmiş 250 ul primer antikor bir rocker 4 ° C 'de gonadlar O / N Leke.

3. Gün:

  1. 250 ul Yıkama Çözüm kez gonadlar durulayın.
  2. Bir rocker oda sıcaklığında 10 dakika her biri için gonadlar 250 ul Yıkama Çözeltisi ile 3 kere yıkayın.
  3. Gonadlar bir rocker RT'de Çözüm Engelleme 250 ul 1 saat engelleyin.
  4. Işıktan, ışıltılı ikincil antikorlar korumak için alüminyum folyo ile mikrosantrifüj tüpü örtün.
  5. Ar üzerinde oda sıcaklığında gonadlar 2-4 saat bekletinOcker Alternatif olarak Hoechst 33342. ihtiva eden bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmiş 250 ul ikincil antikor, rocker 4 ° C 'de, ikincil antikor ve Hoechst 33342 inkübasyon O / N gerçekleştirin.
  6. 250 ul PBTx iki kez gonadlar durulayın.
  7. Bir rocker oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 250 ul PBTx içinde gonad 3 kere yıkayın.
  8. Bir kesme pipet kullanarak, en az bir sıvı, bir lam üzerine gonadlar aktarın. Pipet yardımıyla fazla sıvıyı çıkarın, ancak doku kurumasına değil emin olun.
  9. Forseps ile istenilen şekilde gonadlar yönlendirmek ve hızlı bir şekilde slayt gonadlar monte etmek montaj medya bir damla ekleyin. Montaj medya mantolar tamamen bütün numuneler emin olunuz; o örnekleri kurumasına izin kaçınmak için kritik öneme sahiptir.
  10. Uygun büyüklükte kullanılması lamelleri (sayı 1.5 tarzı) yavaşça örnekleri kapsayacak. Lamel tüm yüzeyine temas montaj medya yayılmasını edelim. Gerekirse, çok hafifçe böylece lamel köşelerinde basınhiçbir büyük hava kabarcıkları vardır.
  11. Montaj medya buharlaşmasını azaltmak için kenarlarda açık oje ile slaytlar mühür. Mağaza 4 ° C'de karanlıkta slaytlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ex vivo damlacık kültürü kimse, böyle bir gonad olarak bütün organların, işlemek için hücresel etkileşimleri ve dinamiklerini incelemek için. 1, bir E11.5 gonadal damlacık kültürü nasıl hazırlanacağını adım adım moda gösteriyor Şekil verir. Kültür protokolünde ilk adımlar anne fare (Şekil 1A ve 1B) gelen embriyo içeren rahim başlangıçtaki kaldırılmasını içerir. Anneden rahim çıkarılmasından sonra rahim duvarına kesilir ve embriyoların daha da diseksiyon (Şekil 1C-E) PBS içine yolk kesesi serbest bırakılmaktadır. Iç organ çıkarılmasından sonra ürogenital sırtı embriyo (Şekil 1F) arka gövde duvarı boyunca açık bir biçimde görülebilir (Şekil 1G), izole edilir. Gonad-mezonefron kompleksi, daha sonra uzak ürogenital sırtı (Şekil 1H) disseke edilir ve küçük moleküllü inhibitör (Şekil 1i ile damlacık kültürün içine yerleştirilirSol: tedavi için "T") ve küçük moleküllü inhibitörü (Şekil 1I olmadan, sağ: kontrolü için "C"). Damlacıkları içeren küçük yemekler 48 saat boyunca CO2 yapma vardiya nemli bir bölmede (Şekil 1J) içine alınır ve inkübe 37 ° C de ve% 5 edilir.

48 saatlik inkübasyondan sonra kültürlenmiş organlar, PBS ile yıkandı, çıkarıldı ve kültür ve ilaç tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için bir bütün montaj immünofloresan protokolüne tabi tutulurlar gen ekspresyonu için analiz, alternatif olarak, bunlar RNA ekstraksiyonu için işlenebilir. Normal şartlarda (37 ° C ve% 5 CO 2) 48 saat boyunca altında kültüre hemen temiz diseksiyonu sonrası kültür ortamına aktarıldı ve fetal tüm gonad-mezonefron kompleksler (E11.5 ve yaşlı), yüksek hayatta kalma oranına sahip (ama onlar ) gerektiğinde daha uzun süre için potansiyel olarak kültürlenebilir. Aydınlık mikroskop altında E11.5 gonad Karşılaştırmalarkültür 24 ya da 48 saat (Şekil 2) gonad şeklinde dramatik bir değişim ve kontrol XY gonad şerit benzeri kord yapılarının görünümünü ortaya sonra karşı ilk inkübasyon de y. Bu nedenle, 48 saat süre ile kültür edildikten sonra, geliştirme utero gonadlarda E13.5 (Şekil 2) ile karşılaştırılabilir. Ayrıca, E11.5 fetal akciğer büyür ve görüntüler normalde gelişiminde bu faz (Şekil 2) sırasında meydana geldiğini dallanma artmıştır. Nedeniyle kültür koşulları utero ortamda (Tartışma) büyüme akrabası için optimal olmayan gerçeğine in utero, büyük olasılıkla karşılaştırıldığında kültür süreci genellikle küçük organlarda sonuçlanır.

Utero yedirilerek organlarda, ex vivo kültürlenmiş organlar içindeki doku mimarisi göstermek için ve uygun temsilciler hizmet verebilir 48 saat kültürden elde edilen organ boyutu (bundan F bağlı olmakla birlikteigures 3 ve 4). Organ mimarisi ve morfojenezi, örneğin testis Sertoli hücreleri ve akciğer dallanması hücreleri, akciğer epitel hücreleri için E-kadherin, PECAM1 germ hücreleri ve damar için ve klivaj için SOX9 Kaspaz 3 için olduğu gibi özellikle kritik bir organ, hücre tipi etiket belirteçleri kullanıldı, karakterize etmek için Apoptotik hücreler, (Şekil 3 ve 4). SOX9, bir transkripsiyon faktörünü kodlayan fetal organı proliferasyon, farklılaşma ve hücre dışı matris oluşumu önemli bir rol oynar. Bu nedenle, her iki organlarda, SOX9 akciğerler 17 içindeki testis kordların 14-16 ve dallanma yapılar içinde yer alan Sertoli hücreleri etiketler ortak bir mimari işaretleyici olarak kullanılmaktadır.

Etkili bir utero morfolojilerinden özellikle yeniden de gonad kültürleri. Fare gonad embriyonik (E) aşama E10.0 belirtilen ve XY (erkek) ve XX (fem başlangıçta morfolojik aynıdır olduğunuale) embriyolar. E10.5 fetal testis 19 E11.5 E13.5 ve arasında hızla ortaya dahil olmak üzere önemli moleküler ve morfolojik değişikliklere sürücüler de XY gen Sry (Y kromozomunun Sex belirleyen bölgenin) ifadesi başlangıç ​​Gonadlar: şartname Sertoli hücreleri, testisin destekleyici hücre soyu; Sertoli ve germ hücrelerinin oluşan ve yetişkin seminifer tübüllerde fetal öncüleri vardır testis kordonlar, oluşumu; ve büyük damar remodeling. Erkek özgü vasküler remodeling, komşu mezonefros bir vasküler pleksus salınan endotel hücreleri bir testis özgü arteriyel sistem 4,20 oluşturmak için gonad içine göç ederler. Immunofluorescent E11.5 testisler (Şekil 3) göre utero testislerde E13.5 iyi gelişmiş testis kord yapıları ve damarsal ortaya analizleri. Şekil 3 gösterisinde görüntü olarak, damlacık kültürü sistemi testis farklılaşması EV yeniden oluşturabilirsinizveliler ex vivo, bu organın boyunca şekillendirme tubule benzeri kordonlar ve damar sistemine şekillendirme XY gonadlarda SOX9 pozitif Sertoli hücreleri görselleştirmek için mümkün olduğu. 2 gün (Şekil 4) boyunca SOX9 / E-kaderin çift pozitif epitel şube artan dallanma akciğerlerde, 48 saatlik kültür sonuçlarına göre. Aynı kültür koşullarında akciğerlerde apoptotik hücrelerin bir miktar artış (Şekil 3 ve 4) gonad kültür koşullarına özellikle uygun olduğunu düşündüren varken Ayrıca, kontrol kültürlenmiş ve utero gonad apoptoz benzer seviyelerde bkz.

Küçük-molekül inhibitörleri hücresel lokalizasyonunu, proliferasyon ve hücre döngüsü durumunu, hem de organın mimarisi ve çeşitli sinyal kaskadı etkileyerek, organ gelişimini incelemek için kullanılabilir. Ex vivo Tüm organ damlacık yöntemi araştırmacı fe kolayca farmakolojik reaktifler yönetmek için izin verirKültür ortamı, çok küçük bir hacim içinde tal organlar. Testis farklılaşması ve morfolojilerinden üzerinde damarlanma ve vasküler yeniden etkisini incelemek için, küçük moleküllü inhibitör TKI II, VEGF reseptörlerinin aktivitesini bloke ederek testis damar gelişimi 3 bozan bir reaktif kullanılan; Fetal testis mimarisi oluşumu, vasküler endotel büyüme faktörü A (VEGFA) 11,12 vasıtasıyla hareket eden bir damar bağımlı bir şekilde meydana gelir. Testisin vaskülarizasyon embriyo virilizasyon sürücüler testosteron ihracat için kritik olsa da, aynı zamanda testis kord morfolojilerinden önemli bir sürücü: Bir önceki çalışma göstermiştir ki VEGFA sinyal, Sertoli hücrelerinde ya da öncesinde E11.5 bloke edildiğinde interstisyel hücreleri çevreleyen ve hiçbir kordon yapıları 3,12 oluşturan dışarı bölümlemek başarısız. Burada gösterilen sonuçlar, fetal testiste vasküler yeniden bozulması damlacık kültür sisteminde etkili olduğunu göstermek ve subsequen(yani, anormal testis kord oluşumu) testis morfojenezinde t kusurları (Şekil 3) görüntülenebilir. Bu PECAM1, endotel hücreleri için bir marker, mikrop hücrelerinden (Şekil 3) ile ifade edilir dikkat edilmelidir; Bu germ hücre boyama tedavi gonadlar vasküler lekeleme olmaması teknik nedenlerden dolayı olmadığını gösterir ve aynı zamanda, üreme hücreleri gibi diğer hücre tipleri, ilaç tedavisi ile etkilenmediğini göstermektedir bir iç kontrol edilmesidir. En ilk testis morfogenezisi E11.5 E13.5 ve arasında yer alır göz önüne alındığında, bu aşamalar özellikle gonad VEGF rolü ve damar biçimlenme cinsiyete özgü farklılaşma etkileyen faktörleri belirlemek için en uygun pencere vardır.

E11.5 E13.5 ve arasında akciğer gelişimi sırasında TKİ II kullanımı damar küçük moleküllü engellenmesi başka bir organ (Şekil 4) çoğaltılamaz edilebileceğini göstermektedir. Bu sonuç, t etkinliğini göstermektedirO ex vivo fetal organı damlacık kültür model sistemi ve organları içinde sinyal yolları değiştirmek için küçük molekül inhibitörleri kullanma becerisi. Bu protokolün kolaylığı, esneklik ve etkinlik göz önüne alındığında, damlacık kültür in vivo olarak ele alınamaz Organ gelişimi ile ilgili deneysel sorular için uygun bir alternatif sunuyor.

figür 1
In vitro Tüm organ damlacık kültür protokolünde 1. Adımlar Şekil. Açılan periton boşluğuna gebe fare Ötenazi (A). Kapalı embriyolar ile (B) Uterus korna. (C) açıkta embriyo içeren yumurta sarısının açılan rahim duvarına Close-up görünümü. (D) Tek embriyo (e) eklenmiştir yolk kesesi (y) içinde kapalı plasenta (p) için. (E) Embriyo f ayrıldı rom plasenta ve yolk kesesi. (F) viseral organlar çıkarılır ve ürogenital sırtı (siyah özetlenen ürogenital sırtı içinde gonadlar). (G) maruz ürogenital sırtın izole anlatim (gonad-mezonefron kompleksleri siyah özetlenen) ile Dissected embriyo. Asterisk G ve H. (siyah kesikli çizgi ile gösterilen diseksiyon) ürogenital sırttan gonad mezonefron kompleksi (H) ayırma dorsal aort göstermektedir. g, gonad; m, mezonefron. (I) 'in 35-mm kültür kabı kapağı içindeki damlacık kültürlerinin kunnak. Siyah oklar damlacıklar içinde gonadlar işaret. T, muamele edilmiş; C kontrol. (J) açık nemlendirilmiş odasına yerleştirilen iki damlacık kültür çanak kapakları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ig2.jpg "/>
Ex vivo Şekil 2. Gelişme utero organlarında göre kültür organları damlacık ve aydınlık görüntüler. E11.5 in-utero- geliştirilen organlar (gonadlar ve akciğerler) (birinci sütun); 24 saat (ikinci sütun) ve 48 saat damlacık kontrol kültürü (üçüncü sütun) sonra E11.5 organları; TKİ II VEGFR inhibitörü (dördüncü sütun) ile 48 saat süre ile kültüre E11.5 organlar; ve E13.5 in-utero- organları (beşinci sütun) geliştirdi. Gonadlar mezonefros (opak yapısı) Yukarıdaki gonad (açık yapısı) ile yönlendirilmiştir. E11.5 gonadlar bipotential ve (erkek) XY ve XX (kadın) örneklerinde morfolojik aynı görünür. Ölçek çubuğu, 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

"Src =" / files / ftp_upload / 53262 / 53262fig3.jpg "/>
Şekil 3. ex vivo damlacık kültür testisler in-utero- geliştirilen meslektaşları doku mimarisi ve hücre ölümü karşılaştırılabilir bir Immunofluorescent görüntüleri. Intrauterin E11.5 fetal testis (ilk sütun) yedirilerek; Kontrol E11.5 testis kontrolü ex vivo damlacık kültürü (ikinci sütun) 48 saat sonra; E11.5 testis TKİ II VEBFR inhibitörü (üçüncü sütun) ile ex vivo olarak damlacık kültürünün 48 saat sonra; ve in-utero- E13.5 (dördüncü sütun) testis geliştirdi. Kesik çizgiler (gonad üstünde odaklı) gonad-mezonefron sınır gösterir. SOX9 Sertoli hücrelerinin bir belirtecidir ve testis kord mimarisi görselleştirmek için kullanılır; PECAM1 mikrop ve vasküler endotel hücreleri (ve bu nedenle, tedavi edilen gonadlarda PECAM1 boyama kalan hemen hemen tamamen germ hücreleri) olarak ifade edilir; ve klivajed Kaspaz 3 apoptotik hücrelerin bir belirtecidir. Sergilenen TKİ-II-kültürlenmiş gonadlar damar ve anormal testis kord morfojenezi kesintiye ise kültürlenmiş kontrol gonadlar, in-utero- geliştirilmiş meslektaşları benzer testis kord oluşumu, testis spesifik vaskülarizasyon (Şekil boyunca oklar) ve apoptozis nisbetle seviyeleri göstermiştir. Damarlar normalde mevcut ancak tedavi numunelerde tespit edilmemiştir nerede Parantez gonad yüzey alanını gösterir. Arrowheads TKİ-II-tedavi testislerde vasküler hücre kümeleri ölüyor işaret. Ölçek çubuğu, 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Diğer fetal organlar (akciğer) damlacıklar ex vivo kültüre karşılaştırılabilir > In- utero- geliştirilen organlar Immunofluorescent görüntüleri. E11.5 uterus içinde yedirilerek akciğerler (birinci sütun); E11.5 akciğer kontrolü 48 saat ex vivo damlacık kültürü (ikinci sütun) sonra; E11.5 akciğer TKİ II VEBFR inhibitörü (üçüncü sütun) ile ex vivo olarak damlacık kültürünün 48 saat sonra; ve in-utero- E13.5 (dördüncü sütun) akciğerleri geliştirdi. Hücrelerin dallanma SOX9 etiketler; E-kaderin işaretleri tübüler yapılar epitel; PECAM1 vasküler endoteli etiketler; ve Caspase 3 işaretleri apoptotik hücreler ayrılır. ex vivo kültürlenmiş kontrol organlarda-utero- gelişmiş organ göre kültürlenmiş organlar içindeki bir mimari ve SOX9, E-kaderin ekspresyonunu ve PECAM1 gösterir, ancak hücre ölümüne değişen miktarlarda. (PECAM1 boyama ile ortaya çıktığı gibi) TKİ II ile muamele üzerine, vasküler gelişim önemli ölçüde akciğerlerdeki azaltılır. Ölçek çubuğu, 100 mikron.target = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Step Isı Zaman Döngü sayısı
Başlangıç 94 ° C 2 dakika 1 döngü
Denatüre 94 ° C 15 sn 35 döngü
Tavlama 57 ° C 30 sn
Uzama 72 ° C 30 sn
Son 72 ° C 5 dakika 1 döngü

Tablo 1: XY PCR Analiz Programı embriyo XX / XY genotiplemesi için kullanılan "XY (Kısa)" PCR programı için Döngü parametresi..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışma fetal gelişimi eğitimi için birçok potansiyel uygulamalar vardır bir ex vivo tüm organ damlacık yöntemi gösterir. Bu teknik sayesinde embriyo ve potansiyel embriyonik letalitesinin erişilememesi biyolojik in vivo kullanarak incelemek için zor sorulara yaklaşımları ele araştırmacı birden organlar için kullanılan ve izin verir edilebilir. Bu kültür yöntemi memeli hücre çizgileri gibi yaklaşımlar nitro Diğer üzerinde ek avantajları vardır: bütün organların nedenle uterus içinde mevcut olduğu kritik arası ilişki muhafaza kullanılabilir; Kültür hacminin büyümesine, dolayısıyla az ya da pahalı farmasötik reaktifler çok az miktarda kullanılarak, (~ 30 ul) çok küçüktür.

Damlacık kültür protokolünün Kritik yönleri şunlardır: organ a) Temiz bir diseksiyon. Temiz diseksiyon doku mimarisi muhafaza edilmesini sağlar ve maruz kesme veya hasarlı sur sayısını en aza indirirKültür çanak yüzeye çekilebilir ve kültürü bozabilir yüzleri; b) Organ büyüme ve morfonogenezi izin vermek için damlacık içindeki organın düzgün bir şekilde ayarlanmasını; Damlacık kurumaz da yüzey gerilimi ile yerinde organı korur ama bu o kadar c), damlacık uygun büyüklükte yapım; d) org için doğru damlacık hacmini kullanarak. Damlacık hacmi deneysel olarak tespit ve organ boyutuna göre olmalıdır. Ancak, 30 ul makul bir başlangıç ​​noktası olmalıdır. e) ilgi biyolojik soru adresi bir gelişme aşamasını ilgili seçimi; f) damlacık içinde dokulara zarar verebilir kirlenmesini önlemek amacıyla, steril bir kültür ortamı sağlamak.

Bu yazıda esas olarak (ilk cinsel farklılaşma sırasında yani) E11.5-E13.5 gonad odaklanır, ama aynı zamanda bu protokol diğer organlara uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Diğer organlar için bu protokolün Potansiyel değişiklikler şunlardır: a) Gelişme belirli bir organ ve / veya sahne için damlacık hacmini değiştirerek. Bu kültür yöntemi gonad seyahati fetal aşamaları için geçerli olmakla birlikte, daha büyük bir birim daha sonra organları fetal aşamaları için ayarlanmalıdır. Basit bir difüzyon besinler veya reaktifler daha sonraki aşamalarında çok etkili bir şekilde büyük bir dokulara nüfuz izin verilmekte olduğu fetal aşamaları büyük organları için kullanılabilecek bir sınırı, büyük olasılıkla bulunmaktadır. Bu nedenle, deneme için mümkün olan en erken aşamada fetal organlar için bu kültürü kullanmak tavsiye edilir. b) kültür ortamına eksojen büyüme faktörleri, hormonlar, ya da diğer faktörlerin de eklenmesiyle. Belli organ, normal morfonogenezi geçmesi için belirli bir protein veya hormon gerektirebilir; Bu nedenle bu protokol kültür ortamına bu reaktiflerin eklenmesi ile modifiye edilebilir. c) kültür içinde süreyi ayarlanması. Başlangıç ​​testis gelişimi az 24 saat oluşabilir, diğer organlar kültür içinde daha uzun zaman dönemleri gerektirebilir. Damlacıkları halindeSteril muhafaza, doku kültürü içinde en fazla 4 ya da 5 gün için uygun olabilir. Kültür (fazla 48 saat), uzun süre için, amonyak kaldırmak için ya da diğer meskûn atık damlacık bir dizi hacmini kaldırarak ve değiştirerek damlacıklar (ilişkili reaktif) ile günlük medya yenilemek için gerekli olabilir yanürünlerinin Taze medya ile aynı hacim; tedavi edilen damlacıkların taze ortam başlangıç ​​tedavisi olarak, ilaç / reaktif aynı konsantrasyonu içermelidir. d) ortam ve / veya ilgili reaktiflerin kompozisyonunu değiştirerek. Bazı doku istenen etkiyi ortaya çıkarmak için, belirli bir farmasötik reajanın veya daha az gerektirebilir. Bu / blok, istenen yolu aktive ama kültür organlarda belirgin hücre ölümünü teşvik olmaz optimum konsantrasyonu bulmak için (bölünmüş Kaspaz 3 boyama yoluyla) konsantrasyonlarının seri seyreltme ve değerlendirme hücre ölümünü denemek için tavsiye edilir. iç kontrollerin e) kullanılması. Böyle gonad olarak organlar çift gelir bu yana, tek gonad hizmet edebilirtaraf muamele gonad için ideal bir iç kontrol olarak. Böyle çiftler halinde gelmiyor karaciğer gibi diğer organları; kullanılan fare soyu nadirdir ve örnekler sınırlı ise, bu devre, organı incelemek ve kontrol ve muamele edilmiş numuneler için her yarım kullanmak mümkündür. Bire bir organın tarafı dikkate almak gerekir bu yüzden, hatta organları, çiftler halinde gelenler, (örneğin akciğer, her tarafı için lob farklı sayı olarak) asimetri gösterebilir akılda tutmak gerekir kontrol için kullanılıyor ve Tedavi örnekleri.

Damlacık kültürleri potansiyel utero gelişiminde neredeyse tüm yönleriyle yeniden ederken, bu tekniğin bazı sınırlamalar vardır. Bir genel damlacık kültürleri ve ex vivo kültür teknikleri, utero geliştirme 1,5 'de görece tutarlı bir şekilde daha yavaş büyüme oranları neden olduğunu; bu durum, örneğin, kültür ortamı gerekli büyüme faktörlerinin düşük konsantrasyonlarda gibi faktörlere, bir dizi muhtemeldir (ve bunlarındokuya bağlantısı) ve sınırlı neovaskülarizasyon ex vivo oluşur. Organ boyutu ek olarak, eksplant doğru yönlendirilmiş ya da damlacık boyutu yanlış değilse, doku morfolojisi yassılaştırılmış veya bir agar yatak tarafından sağlanan bir destek yapısının bir eksikliği ile bozulabilir bir endişe vardır diğer protokoller de. Ancak, bu sorun protokolü parametrelerinin optimizasyonu ile önlenebilir. Bir diğer potansiyel sınırlayıcı faktör medya ve reaktifler tüm organı boyunca yayılabilir ne kadar iyi olduğunu; Bu kültür dokuları kan damarları varken yok, kan akışının olmaması, bu damarlar ex vivo üzerinden herhangi bir besin perfüzyon ve oksijen, bunun yerine, bir difüzyon faktör haline gelir. Bu sınırlama, hangi ex vivo spermatogenez içinde eksplant çevresinin ancak doku merkez çoğu kısmı (yani, medyadan uzak) degenera iyi sürekli olduğunu, doğum sonrası testis kültürlerinde özellikle belirgindirtes 21-23. Bu gözlemler, göz önüne alındığında, tüm organ boyutu kültürü veya büyük boyutlu eksplant protokolleri için genel bir sınırlayıcı faktör olduğu görülmektedir. Ancak, bu tür fetal akciğer ve fetal gonad de novo testis kord oluşumunda morfolojilerinden dallanma gibi genel morfojenetik programlar, halen damlacık kültürlerde görülür. Bu nedenle, bu temel işlemler de bu teknik kullanılarak incelenebilir.

Bütün bu organı protokol önce Maatouk ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir. Coveney vd önceki agar temelli bir kültür yöntemi uyarlanmış 2. 4 kültür organları ex vivo yoluyla damlacıklar yerine agar kuyu yarar en kullanmasıdır Bu şekilde reaktifleri koruyucu en az 10 kat düşük kültür hacmi; buna ek olarak, damlacık yöntem zaman kazandırır ve olmak reaktifler de verimi ile ilgili herhangi bir endişeleri atlar reaktifi ihtiva eden ortam, agar kuyu ön kuluçka içermezagar boyunca dokuya livered. Agar-bazlı yöntemler genel olarak doku daha sadık üç-boyutlu yapısını muhafaza düşünülmektedir birlikte, eksplant kültür koşullarının optimizasyonu (yukarıya bakınız) düzgün bir şekilde ayarlanmasını damla kültürlenmiş organların normal morfolojisini sağlayacaktır.

Bu sonuçlar, in-utero- gelişmiş organ ile karşılaştırılabilir bu ex vivo kültürlenmiş damlacık fetal gonadlar sergiler büyüme ve morfojenezi göstermektedir. Bu kültür tekniği gonad ile kısıtlı değildir, aynı zamanda, akciğer ve diğer fetal organlara uygulanabilir. Bu ex vivo organı damlacık yöntemi tüm organ sinyalizasyon ve organ-spesifik hücre etkileşimleri çalışmaları için yararlı olacaktır, kültür ve ilaç tedavisinden sonra görüntü tüm organ yeteneği kısmen yardımcı oldu. Morfolojilerinden üzerinde damarlanma etkisini araştırmak için bir küçük moleküllü inhibitörü kullanılan Burada anlatılan çalışmada, fakat ticari ava bir bollukilable farmakolojik reaktifler sinyal iletim yolakları ve biyolojik süreçlerin bir çok çalışma bulunmaktadır. Bu nedenle, birçok potansiyel gelecek araştırmacı gelişimsel biyoloji ilginç ve önemli soruları soruşturma sağlayacak bu damlacık kültür yöntemi için kullandığı vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) Fisherbrand 12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps GeneMate T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L Gilson FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
Fine Scissors FST 91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes Denville C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes Denville C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles BD PrecisionGlide 309623
10 ml syringe BD 305559
0.2 μM PES syringe filter VWR 28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm Whatman 1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish Falcon/Corning 353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) VWR 25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator Eppendorf CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet Nuare NU-425-400
Mini-centrifuge  Fisher Scientific 05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL GeneMate R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel Eppendorf 950040015
SMZ445 stereomicroscope Nikon SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software Alpha Innotech Corporation Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol Fisher BP2818-500
Triton X-100 Fisher BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 Fisher S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S671-3
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water Life Technologies AM9938 
XY PCR Primer  IDT N/A
Glacial Acetic Acid Fisher A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher BP2482-1
1% Ethidium bromide solution Fisher BP1302-10 Toxic
Agarose GeneMate E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 367176-2.5KG
Trizma Base Sigma T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions Thermo Scientific R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer Denville CB-4050-3
Paraformaldehyde Fisher O4042-500 Toxic
FluorMount-G Southern Biotech 0100-01
Hydrogen Chloride (HCl) Fisher A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation Bioexpress 0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered Fisher 03-600-511 Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered Sigma D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem EMD Millipore 676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody Millipore AB5535 Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody BD Pharmingen 553370 Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Cell Signaling 9661S Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) Life Technologies 13-1900 Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate Invitrogen (Molecular Probes) H1399 Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-165-153 Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-605-153 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A31572 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21206 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21208 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Life Technologies A31573 Use at dilution: 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
  2. Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
  3. DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
  4. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
  5. Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
  6. Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
  7. Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  10. Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
  11. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
  12. Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
  13. Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
  14. Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
  15. Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
  16. Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
  17. Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
  18. Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
  19. Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
  20. Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
  21. Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
  22. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
  23. Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics