Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lazar, I. M., Deng, J., Smith, N. Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor. J. Vis. Exp. (110), e53564, doi:10.3791/53564 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De overgrote meerderheid van massaspectrometrie (MS) -gebaseerde eiwitanalyse werkwijzen omvatten een enzymatische digestie stap voorafgaand aan detectie, typisch met trypsine. Deze stap is noodzakelijk voor het genereren van kleine moleculaire gewicht peptides, doorgaans MW <3000-4000 Da, dat binnen het effectieve scanbereik van massaspectrometrie instrumenten vallen. Gebruikelijke protocollen betrekking O / N enzymatische digestie op 37 ° C. Recente ontwikkelingen hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende strategieën, gewoonlijk met het gebruik van een microreactor met geïmmobiliseerde enzymen of een reeks aanvullende fysische processen die de tijd die voor proteolytische digestie reduceren tot een paar minuten (bijvoorbeeld magnetron of high- druk). In dit werk beschrijven we een eenvoudige en rendabele benadering die in elk laboratorium kan worden toegepast voor het bereiken van snelle enzymatische vertering van een proteïne. Het eiwit (of eiwit mengsel) wordt geadsorbeerd op C18-gebonden omgekeerde fase performance vloeistofchromatografie (HPLC) silicadeeltjes voorgeladen in een capillaire kolom en trypsine in waterige buffer wordt toegediend gedurende de deeltjes gedurende korte tijd. Om on-line MS detectie mogelijk te maken, worden de tryptische peptiden geëlueerd met een oplosmiddel systeem met een verhoogd gehalte aan organisch materiaal direct in het MS ionenbron. Deze aanpak vermijdt het gebruik van dure geïmmobiliseerde enzymdeeltjes en vereist niet geen steun voor voltooiing van het proces. Eiwitvertering en volledige monsteranalyse kan worden uitgevoerd in minder dan 3 min ~ en ~ 30 min, respectievelijk.

Introduction

De identificatie en karakterisering van gezuiverde eiwitten wordt vaak bereikt door MS technieken. Het eiwit wordt geknipt met een enzym en de peptiden worden verder geanalyseerd door MS via een eenvoudige infusie experimentele opstelling. Proteolytische digestie noodzakelijk voor het genereren van kleine peptidefragmenten die in de nuttige massabereik meeste MS analyzers vallen, en die gemakkelijk worden gefragmenteerd door lage botsenergie fragmentatie te aminozuursequentie informatie te genereren. Voor geïsoleerde eiwitten of eiwitmengsels eenvoudig, er geen verdere behoefte voor chromatografische scheiding van peptiden voorafgaand aan MS detectie. Een mengsel van 25-50 peptiden kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd door het inbrengen van het monster met een spuitpomp direct in het MS ionenbron.

De massaspectrometer kan de analyse uit te voeren en bevestig de sequentie van een eiwit binnen een kort tijdsbestek. Met moderne data-acquisitie methoden, kan dit proces worden bereikt wedurende enkele minuten of zelfs seconden. De beperkende factor bij het voltooien van het hele proces op een korte tijdschaal is de proteolytische vertering stap. Dit wordt typisch uitgevoerd gedurende enkele uren (of O / N) in oplossing bij 37 ° C met behulp van substraat: enzym verhoudingen van (50-100): 1. De enzymatische digestie tijd om minuten of seconden, geïmmobiliseerd enzym microreactoren Gewoonlijk verminderen, in de vorm van microfluïdische reactoren of commercieel verkrijgbaar cartridges, zijn beschreven. 1-6, wordt het enzym geïmmobiliseerd door covalente, niet-covalente / fysische adsorptie, complex formatie of inkapseling, 3,6 verhoogde de efficiëntie van het enzymatisch proces wordt mogelijk gemaakt door het grote oppervlak-tot-volume en enzym tot substraat verhouding. Bijkomende voordelen van geïmmobiliseerde reactoren onder verminderde autolyse en interferentie van het enzym in MS analyse verbeterde enzymstabiliteit en herbruikbaarheid. Een verscheidenheid van benaderingen, zoals glas of polymere microgefabriceerde inrichtingen zijn beschreven,gebruik enzymen geïmmobiliseerd op magnetische beads met antilichaam-antigen interacties 7,8 ingevangen in goud nanodeeltjes netwerken, 9 ingekapseld in titania-alumina sol-gels 10 en nanozeolites, 11 of gevangen met Ni-NTA en His-Tag complexvorming. 6 Alternatief , open buisvormige capillairen met geïmmobiliseerde enzymen zijn ontwikkeld en. 12 Bovendien verbeterde proteolytische splitsing werd aangetoond met gecontroleerde microgolfbestraling 13 of drukondersteunde of drukwisselingen technologie (PCT) om het reactietijden 30-120 min. 14

Ondanks de vele voordelen van geïmmobiliseerde enzym reactoren, de kosten voor commerciële cartridges is hoog, de beschikbaarheid van microfluïdische inrichtingen voor routinegebruik beperkt en het gebruik van microgolf of PCT technieken leidt tot behoefte aan extra apparatuur. Het doel van dit werk was om een ​​methode te ontwikkelen die circumvents deze nadelen en die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd in elk laboratorium onderzoekers machtigen met een eenvoudige en doeltreffende benadering voor het uitvoeren van enzymatische splitsing van eiwitten ter voorbereiding MS analyse binnen minuten. De benadering is gebaseerd op het gebruik van hydrofobe, C18-deeltjes die vooraf geïnstalleerd op een capillair of microfluïdische apparaat en de adsorptie van het eiwit (ten) van belang op deze deeltjes, gevolgd door enzymatische digestie tijdens de infusie van het enzym via gepakt bed en veroverde eiwit (s). In deze benadering wordt het substraat geïmmobiliseerd door niet-covalente interacties, en het enzym wordt toegediend via geïmmobiliseerde eiwit. De proteolytische digestie efficiëntie verhoogd met het grote deeltjesoppervlak gebieden die het eiwit enzymatische verwerking, verminderde afstanden en diffusie tijden en naar het oppervlak van de deeltjes bloot te leggen, verbeterde massaoverdracht, geen covalente binding die de activiteit van het enzym beïnvloeden, vermogen om snel evaluate combinaties van verschillende enzymen, disposability en multiplexing als het proces wordt uitgevoerd in een microfluïdische formaat. Deze aanpak wordt gedemonstreerd met behulp van een mengsel van standaard eiwitten en trypsine-de meest gebruikte enzym proteolytische digestie voorafgaand aan ESI-MS detectie. De massaspectrometer gebruikt voor detectie in deze studie was een lineair trap quadrupole (LTQ) instrument.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van de capillaire Microreactor

  1. Snijd de 100 urn inwendige diameter (ID) x 360 urn buitendiameter (OD) capillair met een lengte van 7-8 cm, en 20 urn x 90 urn ID OD capillaire 3-5 cm met de glazen capillair hakmes; controleren onder de microscoop dat beide capillaire uiteinden een schone, rechte snede, zonder uitstekende bramen.
  2. Plaats de 20 um ID x 90 micrometer OD capillair in een einde van de 100 um ID x 360 urn OD capillair, een lengte van ~ 6 mm; in geval van nood, acht deze operatie onder een microscoop.
  3. Breng een kleine druppel lijm E6000 rond de kruising van de 90 micrometer OD / 100 um ID capillairen met het uiteinde van een wattenstaafje en laat de lijm cure O / N bij kamertemperatuur.
  4. Snijd de ingevoegde 20 um ID x 90 urn OD capillair met een lengte van ~ 10-15 mm; dit zal de electrospray ionisatie emitter zijn.
  5. Pre-snijd de 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK en 1/16 "OD PTFE tubing in stukken van 4-5 cm lang; zullen de hulzen die in capillaire bonden voor het verschaffen van een lekvrije verbinding.
  6. Sluit het andere uiteinde van de 100 um ID x 360 micrometer OD capillair een PEEK-unie; Gebruik een 1/32 "PEEK huls voor het verschaffen van een lekvrije verbinding.
  7. Invoegen / draai een stuk van ~ 5 cm lang 1/16 "PTFE slang in de andere kant van de unie.
  8. Weeg ~ 4 mg C18 (5 pm) deeltjes in een vooraf schoongemaakte / gedroogde 2 ml glazen flesje; Voeg 0,5 ml isopropanol, sluit de flacon en de verspreiding van de slurry in de ultrasonicator bad.
  9. Terugtrekken met een 250 ul spuit ongeveer 200 ul slurry, steek de naald in de 1/16 "PTFE-buis van de PEEK unie, en afzien langzaam de slurry in de 100 um ID x 360 micrometer OD capillaire; observeren onder de microscoop als capillair gevuld met deeltjes tot een lengte van 2-3 mm verpakking bedraagt, zal de microreactor (figuur 1) de 20 μ.m ID capillaire houdt de deeltjes in de microreactor door een Keystone effect. 15
  10. Spoel de microreactor met ~ 50 pi oplossing van H2O / CH3CN 50:50 v / v, en daarna met ~ 50 pi oplossing van H2O / CH3CN 98: 2 v / v.

2. Voorbereiding van de Sample Solutions

Opmerking: Bewerkingen die gepaard gaan hanteren van organische oplosmiddelen en zuren en oplossing voorbereiding moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. Draag een veiligheidsbril, handschoenen en beschermende kleding.

  1. Spoelen met CH3OH en drogen enkele glazen flacons (4 ml) en polypropyleen buizen (15 ml).
  2. Bereid 10 ml van een oplossing van H2O / CH3CN (98: 2 v / v) in een 15 ml polypropyleen buis door mengen van 9,8 ml H2O met 200 pl CH3CN; meng door sonicatie.
  3. Bereid 10 ml van een oplossing van H2O / CH3CN (50:50 v / v) in een 15 ml polypropyleen buis door 5 ml H 2 </ sub> O met 5 ml CH3CN; meng door sonicatie.
  4. Bereid 4 ml van een aangezuurde waterige oplossing (/ v TFA 0,01% v) door toevoeging van 4 pl TFA (10%) aan 4 ml H2O / CH3CN (98: 2 v / v) in een 4 ml glazen flesje; meng door sonicatie.
  5. Bereid 4 ml van een aangezuurde organische oplossing (/ v TFA 0,01% v) door toevoeging van 4 pl TFA (10%) aan 4 ml H2O / CH3CN (50:50 v / v) in een 4 ml glazen flesje; meng door sonicatie.
  6. Weeg 16 mg NH 4 HCO 3 een analytische microbalans in een 4 ml glazen flesje; Voeg 4 ml H2O / CH3CN: oplossing (98 2 v / v) en dispergeren door sonicatie; Dit resulteert in een 50 mM oplossing van NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) in waterige buffer.
  7. Weeg 5 mg van een standaard eiwit (bijvoorbeeld runderserumalbumine, hemoglobine α / β, cytochroom C, koolzuuranhydrase, α-2-HS-glycoproteine, etc.) met een analytische microbalans in een 4 ml glazen flesje; voeg 4 ml DI water en verspreiden door sonicatie; Dit resulteert meestal in een high-level uM concentratie oplossing.
  8. Bereid 1 ml eiwitoplossing (1-2 uM) door verdunning van het hoge niveau uM concentratie oplossing met een geschikt volume NH 4 HCO 3 (50 mM) waterige buffer; meng door sonicatie.
  9. Bereid de trypsine-oplossing (5 uM) door oplossen van 20 g sequencing-grade trypsine in 170 gl NH 4 HCO 3 (50 mM) waterige buffer; verspreiden door sonicatie.

3. Experimentele Setup

Noot: De LTQ-MS systeem is uitgerust met een aangepaste ESI bron die een zelfgebouwde XYZ-fase die maakt koppeling van de massaspectrometer verschillende voorbeeldinvoer benaderingen omvat.

  1. Koppel de capillaire microreactor van het PEEK Unie en aan te sluiten op de PEEK-stuk.
  2. Plaats een ~ 2 cm lang Pt draad in de zijarm van de PEEK-stuk; Gebruik een 1/32 "PEEK sleeve voor het verstrekken van eenlekvrije verbinding en voor de isolatie van de draad Pt.
  3. Sluit een 50 um ID x 360 micrometer OD (~ 0,5 m lang) sample overdracht capillair naar de andere kant van de PEEK-stuk; Gebruik een 1/32 "PEEK huls voor het verschaffen van een lekvrije verbinding.
  4. Zet de PEEK-stuk van de XYZ-podium en de positie van de ESI emitter ~ 2 mm afstand van de massaspectrometer inlaat capillair.
  5. Sluit de Pt draad aan op de ESI voedingsbron van de massaspectrometer.
  6. Sluit het andere uiteinde van de monsteroverdrachtsstrook capillair aan de roestvrij stalen eenheid; Gebruik een 1/16 "PEEK huls voor het verschaffen van een lekvrije verbinding.
  7. Sluit een 4-5 cm lange 1/16 "PTFE slang aan het andere uiteinde van de roestvrijstalen eenheid en plaats de 250 ul spuitnaald in de PTFE-buis, zet de pomp en stellen de stroomsnelheid op de gewenste waarde (bijvoorbeeld 2 pl / min).
  8. Input tandem MS data-acquisitie parameters in het softwarepakket dat de MS instrument een bestuurtd opslaan als een methode bestand klaar de opstelling voor het uitvoeren van de analyse; voor de LTQ-MS-systeem, gebruikt u de volgende gegevens afhankelijke analyse parameters: dynamische uitsluiting ingeschakeld voor 180 sec met uitsluiting massa breedte ± 1,5 m / z; een MS scan gevolgd door een zoom en MS 2 scans op de top 5 meest intense pieken, zoom scan breedte ± 5 m / z; botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) parameters ingesteld op isolatie breedte 3 m / z, genormaliseerd botsingsenergie 35%, activering Q 0,25, en activering tijd 30 ms.

4. microfluïdische Setup

  1. Bereid een microfluïdische apparaat uit glas of polymere substraten, 16-18 de indeling van de inrichting wordt in figuur 2A, bestaande uit een microreactor (1) (0,13 mm breedte x 2 mm lengte x 50 pm diep) is verbonden met een inlaat (2 ), uitlaat (3) en een zijpoort (4); de onderling verbonden kanalen voor fluïde manipulaties zijn ~110 micrometer breed en ~ 50 micrometer diep; een meerkanaals structuur (5), bestaande uit ~ 1,5-2 urn diep x 10 micrometer x 100 micrometer breed lange microkanalen geplaatst 25 urn uit elkaar, zal fungeren als een filter voor het vasthouden van de deeltjes in de microreactor.
  2. Inschakelen fluïdum leverende verbindingen met de chip door lijmen gespecialiseerde aan op de inlaatpoorten, of door het ontwerpen van een polymeer stand het beslag past voor vloeistofafgifte (figuur 2B). 16
  3. Maak een suspensie van deeltjes C18 (5 pm) zoals beschreven in stap 1.8; leveren de slurry aan de microreactor met een spuit met 1/16 "PTFE slang verbonden met de chip zijpoort (4), sluit de poort na deeltjesbelading met epoxylijm en genezing van 1 uur in een oven bij 90 ° C 16.
  4. Plaats een capillair (20 um ID x 90 micrometer OD x 10 mm lengte) in de uitlaatpoort, afdichting met E6000 lijm, en genees O / N; dit zal de ESI zender geworden (
  5. Sluit een 50 um ID x 360 micrometer OD (~ 0,5 m lang) sample overdracht capillair aan de chip inlaatpoort (2); Sluit het andere uiteinde van de capillair een 250 ul en de naald pomp zoals beschreven in 3,6-3,7.
  6. Plaats een lichtgewicht PEEK-stuk-connector op het monster overdracht lijn vlak voor de inlaat (2) en plaats een Pt draad op de zijarm van het stuk, zoals beschreven in 3.2; Dit zal de ESI elektrode.
  7. Beveilig de microfluïdische apparaat op de XYZ podium met de ESI emitter geplaatst ~ 2 mm afstand van de massaspectrometer inlaat capillaire; bereiden MS als beschreven onder 3.8.

5. Sample laden, proteolytische digestie en Elution voor MS Analysis

Opmerking: Alle oplossing / monsteroverdrachtsstrook stappen worden uitgevoerd met behulp van een spuitpomp en moeten een paar extra minuten in beslag, ter compensatie van de dode volumes verbonden aan de transportlijnen en naar de microreactor; de nodige tijd hangt af van de stroomsnelheden betrokken.

  1. Spoel de microreactor en voor te bereiden voor analyse door infusie van een waterige oplossing van NH 4 HCO 3 (50 mM) in H2O / CH3CN (98: / v 2 v) en 2 pl / min gedurende 5 min; Gebruik een 250 ul injectiespuit.
  2. Laad het eiwitmonster (1 uM) aan de microreactor door het inbrengen van de monsteroplossing in 2 pl / min gedurende 5 min; Gebruik een 250 ul injectiespuit.
  3. Infuseren de trypsine-oplossing (5 uM) via geadsorbeerde eiwit op de microreactor bij 2 pl / min gedurende 1-3 min.
  4. Quench de proteolytische vertering door spoelen van de microreactor met een aangezuurde waterige oplossing van TFA (0,01% v / v) in H2O / CH3CN (98: 2 v / v) en 2 pl / min gedurende 5 min; Gebruik een 250 ul injectiespuit.
  5. Start elueren van het eiwit verteren van de microreactor door het inbrengen van een aangezuurde organische oplossing van TFA (0,01%v / v) in H2O / CH3CN (50:50 v / v) en 300 nl / min.
  6. Schakel de MS data-acquisitie-proces en de ESI spanning (~ 2000 V); verwerven MS-gegevens met behulp van de data-acquisitie parameters verschaft in stap 3.8; let op de elutie van de tryptische peptiden.

6. Data Processing

  1. Verwerk de tandem MS-gegevens met een zoekmachine verenigbaar is met de rauwe MS dataformaat.
    1. Verwerk de LTQ-MS Raw-bestanden met behulp van een organisme specifieke minimaal redundant eiwit databank; uploaden van de ruwe data in de zoekmachine, stelt de toleranties massa ouder en fragment ion tot en met 2 en 1 Da respectievelijk, en gebruik alleen volledig tryptische fragmenten met maximaal twee gemiste splitsingen voor de zoektocht; laten geen posttranslationele modificaties; Stel de hoge en middelhoge vertrouwen valse discovery tarieven (FDR) tot 1% en 3%, respectievelijk, en houden geen rekening met posttranslationele modificaties.
  2. Filter de gegevens alleen met veel vertrouwen te selecterenpeptide past bij de eiwitten in de databank; evalueren van de eiwit- en peptide-level resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een representatief resultaat van een proteolytische digestie proces gelijktijdig uitgevoerd op een mengsel van eiwitten, met de hierboven beschreven microreactoren (figuren 1 of 2), is opgenomen in tabel 1. De tabel omvat de unieke peptidesequenties die een bepaald eiwit te identificeren, het kruis correlatie score (Xcorr) (dat wil zeggen, een score die de kwaliteit van de experimentele-to-theoretische match voor de overeenkomstige tandem massaspectrum karakteriseert), het aantal gemiste splitsingen, het peptide laadtoestand (z), en de massa / lading ( m / z) van de geprotoneerde peptiden. Op het eiwitgehalte, de tabel geeft de UniProt eiwit ID, de beschrijving (naam) van het eiwit, het eiwit score en het eiwit dekking. Alle eiwitten werden geïdentificeerd door meerdere peptiden, na proteolytische digestie uitgevoerd gedurende 90 sec.

De tijd die nodig is voor deelutie van peptiden was afhankelijk van de lengte van de capillaire overdracht dat de aangezuurde organische oplossing met 300 nl / min, een stroomsnelheid geschikt nano-ESI optimale werking opgeleverd. In capillair mengen van de waterige en organische oplossingen aangezuurd resulteerde in de eerste elutie van enkele peptiden, maar de overgrote meerderheid elueerde als een enkele minuten alleen in de organische oplossing. Een massaspectrum weergeven van de co-elutie van verscheidene peptiden representatief voor de vijf eiwitten, gegenereerd met capillaire microreactor, wordt in figuur 3.

Tabel 1. Lijst van tryptische peptiden gegenereerd door proteolytische digestie van vijf eiwitten met de capillaire microreactor en O / N digestie protocollen. Alleen unieke sequenties, met de hoogste Xcorr, worden getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur 1
Figuur 1. Capillaire microreactor. (A) Experimentele opstelling voor de vervaardiging van de microreactor. (B) capillaire microreactor gepositioneerd in de MS-ion bron. De microreactor wordt handmatig geladen met C18-gebonden silicadeeltjes en geplaatst op een XYZ-stadium dat een goede positionering vergemakkelijkt in de ESI-MS bron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. microfluïdische microreactor. (A) Schematische weergave van de microfluïdische reactor. (B) microfluïdische reactor bevestigd in een PEEK stand. De microfluïdische reactor eennd overdracht lijnen worden vervaardigd in een glazen substraat dat in een zelfgemaakt polymeer PEEK kan worden vastgezet staan ​​voor verdere positionering in de MS bron met de XYZ podium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Massa spectrum omvat tryptische peptiden gegenereerd op basis van het eiwit mengsel onderworpen aan proteolyse in de microreactor. De meest intense tryptische peptide-ionen worden geëtiketteerd met de volgorde van de aminozuren en de bijbehorende eiwit identifier. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De in dit werk beschreven microreactor biedt een eenvoudig te implementeren experimentele opstelling voor het uitvoeren van enzymatische vertering van eiwitten MS analyse en identificatie in minder dan 30 minuten mogelijk. De duidelijke voordelen van dit systeem, in vergelijking met conventionele methoden, onder meer eenvoud, snelheid, laag reagensverbruik en lage kosten. In het bijzonder is er geen dure geïmmobiliseerd trypsine kralen en patronen. De bereiding van de capillaire microreactor is eenvoudig (figuur 1A), en kan worden bereikt binnen minuten van homogene goederen, gewoonlijk in een laboratorium chromatografie. Terwijl de omgekeerde fase C18 deeltjes kunnen worden gespoeld met hoog organisch oplosmiddelgehalte (CH3CN of CH3 OH) volledige verwijdering van de geadsorbeerde eiwitten of peptiden en de microreactor kan worden hergebruikt, de gemakkelijke en kosteneffectieve fabricageproces nodigt voor de productie van wegwerp-eenheden voor eenmalig gebruik APPLICties. De capillaire microreactor kan in een zelfgebouwde ESI bron worden gemonteerd, zoals getoond in figuur 1B, of kan in een standaard commerciële ionenbron ingevoegd. Terwijl het deeltjesbed voor monster opname en vertering hoeft niet langer zijn dan ~ 1-2 mm, voldoende om voldoende materiaal te vangen voor een optimale detectie door MS, kan de lengte van het capillair zich aanpassen aan de grootte van een bepaalde past ionenbron.

Voor laboratoria die mogelijkheden om microfluïdische inrichtingen te fabriceren zijn, wordt een eenvoudig ontwerp (figuur 2A), die in een stand kan worden vastgezet voor het vergemakkelijken van het koppelen aan MS detectie (figuur 2B) ontvangen. De afmetingen van de microreactor en overdrachtskanalen kan worden aangepast aan de vereisten van een bepaalde toepassing, en het apparaat kan worden ontwikkeld tot een of multiplex formaat. Voor de meeste commerciële massaspectrometers echter de ionenbron zou wijzigingen moeten th toee plaatsing van de inrichting in de bron. De fotomasker tekening voor chip fabricage werd uitgevoerd met AutoCAD-software en het fotomasker werden voorbereid door HTA fotomasker. Het vervaardigen van de microchips werd uitgevoerd volgens eerder beschreven protocollen: 17,18 uitlijning van het substraat met het fotomasker, blootstelling aan UV-licht (360 nm), verwijdering van de bestraalde fotoresist en de onderliggende chroomlaag, nat chemisch etsen van kanalen met buffer oxide etch verwijdering van de resterende chroomlaag, boren van toegangsopeningen, reiniging, hydrolyse van de microchip oppervlak (NH 4 OH + H 2 O 2), en thermisch binden van het substraat om de afdekplaat door geleidelijke verhitting tot 550 ° C. Zowel substraat en afdekplaat werden geëtst, een voor diepe geulen voor monster hanteren (~ 20-50 pm), en de andere voor ondiepe micro-channel filterelementen (1,5-2 micrometer diep). 16

De resultaten die met de hierboven beschreven microreactor zijn vergelijkbaar met de resultaten uit O / N, 19 conventionele digestie protocollen resultaten substraat gebruikt: enzym verhoudingen van (50-100): 1, gevolgd door een peptide infusie experiment met MS-detectie (300 nl / min, peptiden opgelost in H 2 O / CH3CN (/ v 50:50 v) aangezuurd met CH3COOH, 0,1% v / v). Zowel microreactor conventionele protocollen kon de identificatie van eiwitten door meerdere unieke peptiden (Tabel 1). Typisch, een iets groter aantal unieke peptiden per proteïne waarneembaar waren met de microreactor dan bij de conventionele opstelling. Dit was een gevolg van onvolledige enzymatische splitsing op bepaalde sites. Een paar extra minuten van proteolytische vertering verminderd of geëlimineerd dit resultaat. Ook sommige enzymatische peptiden gegenereerd met microreactor verschilden van die welke gegenereerd in oplossing, vanwege het feit dat de eiwitten geadsorbeerd aan de deeltjes C18 verschillende plaatsen werden blootgesteld aan het enzym than in homogene oplossingen. 20 De Xcorr scores tonen echter dat de kwaliteit van de tandem massaspectra gegenereerd met microreactor was van hoge kwaliteit en er voldoende eiwitsequentie dekking (11-75%) haalbaar ondubbelzinnige eiwitidentificaties .

De techniek, zoals beschreven, wordt beperkt tot de analyse van vrij eenvoudige eiwitmengsels die het genereren van de meeste ~ 25-50 peptiden die kunnen worden geanalyseerd door eenvoudige experimenten infusie en vereisen geen vloeistofchromatografische scheiding voorafgaand aan MS analyse. Cruciaal voor het succes is het gebruik van vers ontdooid en voorbereid trypsine oplossingen niet verlagen of verliezen de activiteit van het proteolytisch enzym aan de operationele pH van de microreactor (dwz pH ~ 8). Bovendien moet een evenwicht worden gevonden tussen de optimale stroomsnelheden van electrospray ionisatie (150-300 nl / min) en het maximale debiet dat kan worden getolereerd door de experimentele opstelling en waarmeefast peptide elutie uit de microreactor (2-3 pl / min). Hoger dan optimale ESI debieten resulteren in gevoeligheid verliezen en slechte detectielimieten. Dientengevolge moet de lengte van de overgang capillairen zo kort mogelijk worden gehouden om de tijd die voor de elutie van peptiden uit de microreactor verminderen bij benutting ≤300 nl / min. Alle componenten werden gebruikt voor de experimentele opstelling kan worden vervangen door onderdelen van andere fabrikanten die soortgelijke functies uitvoeren. Als de maatvoering van deze componenten verschillen (lengte, diameter, volume), de optimalisering eluent stroomsnelheden, monsterconcentratie, tijd voor het uitvoeren van bepaalde stappen en de ESI spanning kan noodzakelijk zijn om vergelijkbare resultaten te verkrijgen.

Een uniek voordeel mogelijk gemaakt door de microfluïdische opstelling is de mogelijkheid om verder omvatten over de chip een pompsysteem, bijvoorbeeld een elektro-stroom aangedreven pomp, 21,22 voor het inschakelen van de stand-aleen bediening van het platform en de integratie van een extra scheidingsstap. De mogelijkheid om on-chip scheidingen van peptiden gegenereerd door middel van proteolytische digestie uitgevoerd zal resulteren in een verbeterde detectielimieten, en de analyse van complexe mengsels van eiwitten cellulaire extracten vergemakkelijken. Dit zal verder kan de integratie van de techniek werkstromen die gebruik microfabricated platforms en snel MS detectie voor biomedische toepassingen. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ion trap ESI-MS Thermo Electron LTQ The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage Newport Multiple parts The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope Edmund optics G81-278 The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler VWR 46600-204 The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson VWR 33995-540 The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22 Harvard Apparatus 552222 The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system EMD Millipore ZD5311595  The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) VWR 53513-410 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl) VWR 53513-406 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl) VWR 53513-402 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP100375 This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) Polymicro Technologies TSP020090 This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP050375 This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver Supelco 23740-U This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue Eclectic Products E6000 Craft This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue Epo-Tek 353NDT This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm) Agilent Technologies Zorbax 300SB-C18 These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl) Hamilton 81130-1725RN The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) Valco ZRU1.5FPK This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”) Valco ZU1XC The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) Valco MT.5XCPK The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight) Valco C-NTXFPK This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm) VWR 66260-126 The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD) Valco TTF115-10FT The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union 
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) Upchurch Scientific 1565 The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) Valco TPK.515-25 The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter Valco JR-797 This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml) Agilent  HP-5183-2069 The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry 
Amber vial (4 ml) VWR 66011-948 The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml) Fisher 12-565-286D The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml) VWR 24710-463 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml) VWR 24710-441 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl) VWR 83007-386 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl) VWR 53503-781 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl) VWR 53511-681 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates Nanofilm B270 white crown, 3” x 3” These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”) Upchurch P203X This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly Upchurch N-122H This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards Sigma Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade Fisher A955
Methanol, HPLC grade Fisher A452
Isopropanol, HPLC grade Sigma 650447
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
Ammonium bicarbonate Aldrich A6141
Trypsin, sequencing grade Promega V5111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  2. Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86, (3), 325-334 (2011).
  3. Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390, (1), 227-229 (2008).
  4. Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4, (6), 588-597 (2004).
  5. Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3, (1), 11-18 (2003).
  6. Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7, (16), 6041-6059 (2011).
  7. Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, 1071-1074 (2009).
  8. Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30, (12), 2129-2133 (2009).
  9. Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6, (8), 1428-1436 (2007).
  10. Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3, (6), 1201-1209 (2004).
  11. Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80, (7), 2457-2463 (2008).
  12. Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3, (3511), 1-7 (2013).
  13. Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11, (11), 2676-2687 (2002).
  14. Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438, (1), 67-72 (2013).
  15. Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
  16. Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13, (11), 2055-2065 (2013).
  17. Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64, (17), 1926-1932 (1992).
  18. Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66, (7), 1107-1113 (1994).
  19. Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
  20. Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
  21. Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78, (15), 5513-5524 (2006).
  22. Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74, (24), 6259-6268 (2002).
  23. Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71, (13), 2578-2581 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics