Fast Processing Enzymatic des protéines pour MS de détection avec un microréacteur Flow-through

Bioengineering

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Lazar, I. M., Deng, J., Smith, N. Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor. J. Vis. Exp. (110), e53564, doi:10.3791/53564 (2016).

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Abstract

La grande majorité de la spectrométrie de masse (MS) à base de méthodes d'analyse de protéines impliquent une étape de digestion enzymatique avant la détection, généralement avec de la trypsine. Cette étape est nécessaire pour la génération de peptides de poids moléculaire, généralement PM <3000-4000 Da, qui se situent dans la plage de balayage effective de la spectrométrie de masse de l'instrumentation. protocoles classiques impliquent O / N digestion enzymatique à 37 ° C. Des progrès récents ont permis le développement d'une variété de stratégies, impliquant habituellement l'utilisation d'un microréacteur avec des enzymes immobilisées ou d'une série de processus physiques complémentaires qui permettent de réduire le temps nécessaire à la digestion protéolytique , à quelques minutes (par exemple, micro - onde ou de haute activité pression). Dans ce travail, nous décrivons une approche simple et rentable qui peut être mis en œuvre dans un laboratoire pour réaliser une digestion enzymatique rapide d'une protéine. Le (ou mélange de protéines) de la protéine est adsorbé sur C18 lié en phase inverse à haute perfORMANCE chromatographie liquide (HPLC) des particules de silice pré-chargés dans une colonne capillaire, et de la trypsine dans un tampon aqueux est imprégné sur les particules pendant un court laps de temps. Pour activer la détection en ligne MS, les peptides tryptiques sont élues avec un système solvant avec un contenu organique augmenté directement dans la source MS ion. Cette approche évite l'utilisation de particules d'enzymes immobilisées à prix élevé et ne nécessite pas d'aide pour compléter le processus. la digestion des protéines et analyse complète de l'échantillon peut être accompli en moins de 3 min et ~ ~ 30 min, respectivement.

Introduction

L'identification et la caractérisation des protéines purifiées sont fréquemment obtenus en utilisant des techniques de SM. La protéine est digérée par une enzyme et les peptides sont en outre analysés par SM en utilisant un dispositif expérimental de perfusion simple. la digestion protéolytique est nécessaire pour produire des petits fragments peptidiques qui se situent dans la plage de masse utile de la plupart des analyseurs de sclérose en plaques, et qui peut être facilement fragmenté par une faible énergie dissociation induite par collision pour générer des informations de séquence d'acides aminés. Pour les protéines isolées ou mélanges de protéines simples, il n'y a plus besoin d'une séparation chromatographique des peptides avant la détection MS. Un mélange de 25-50 peptides peut être facilement analysé en insufflant de l'échantillon avec une pompe à seringue directement dans la source d'ions SP.

Le spectromètre de masse peut effectuer l'analyse et confirmer la séquence d'une protéine dans un laps de temps court. Avec les méthodes d'acquisition de données modernes, ce processus peut être accompli wurant quelques minutes, voire quelques secondes. Le facteur limitant dans la réalisation de l'ensemble du processus sur une échelle de temps courte est l'étape de digestion protéolytique. En règle générale, ceci est réalisé en quelques heures (ou O / N), en solution, à 37 ° C, en utilisant un substrat: ratios de (50-100) de l'enzyme: 1. Pour réduire le temps de digestion enzymatique minutes ou secondes, microréacteurs d'enzymes immobilisées, sous la forme de réacteurs microfluidiques ou des cartouches disponibles dans le commerce, ont été décrits. 1-6 Typiquement, l'enzyme est immobilisée par liaison covalente, non covalente / adsorption physique, complexe la formation ou l' encapsulation, 3,6- l'efficacité accrue du processus enzymatique étant activé par la grande surface-volume et de rapports enzyme-substrat. Des avantages supplémentaires de réacteurs immobilisés comprennent autolyse et l'interférence réduite de l'enzyme dans l'analyse MS, une stabilité améliorée et la réutilisabilité enzyme. Une variété d'approches, en utilisant du verre ou des dispositifs micro-usinés polymères ont été décrits,en utilisant des enzymes immobilisées sur des perles magnétiques par des interactions anticorps-antigène, 7,8 piégées dans des réseaux de nanoparticules d' or, 9 encapsulées dans du dioxyde de titane-alumine sol-gels 10 et nanozeolites, 11 ou capturés par Ni-NTA ou His-Tag formation du complexe. 6 Alternativement , capillaires ouvert tubulaires avec des enzymes immobilisées ont été développés, aussi bien. 12 par ailleurs, le renforcement de clivage protéolytique a été démontrée en utilisant micro - ondes irradiation contrôlée 13 ou de la technologie de vélo assisté à la pression ou à la pression (PCT) pour réduire les temps de réaction à 30-120 min. 14

Malgré les multiples avantages de réacteurs enzymatiques immobilisés, les coûts des cartouches commerciales est élevé, la disponibilité des dispositifs microfluidiques pour une utilisation de routine est limitée, et l'utilisation des technologies de micro-ondes ou PCT résultats dans le besoin pour l'instrumentation supplémentaire. Le but de ce travail était de développer une méthode qui circumveNTS ces inconvénients, et qui peuvent être facilement mises en œuvre dans tous les laboratoires de permettre aux chercheurs avec une approche simple et efficace pour effectuer un clivage enzymatique de protéines en préparation pour l'analyse MS en quelques minutes. L'approche repose sur l'utilisation de C18 particules hydrophobes qui sont pré-chargés dans un tube capillaire ou d'un dispositif microfluidique, et l'adsorption de la protéine (s) d'intérêt sur ces particules, suivie par une digestion enzymatique pendant la perfusion de l'enzyme au cours de la lit garni et de protéines (s) capturé. Dans cette approche, le substrat est immobilisé par des interactions non covalentes, et l'enzyme est perfusé sur la protéine immobilisée. L'efficacité protéolytique de digestion est augmentée par les grandes surfaces des particules qui exposent la protéine pour le traitement enzymatique, des distances et des temps de diffusion vers et à partir de la surface de particules réduite, améliore le transfert de masse, aucune liaison covalente qui peut affecter l'activité de l'enzyme, l'aptitude rapidement évaluate combinaisons de différentes enzymes, et le multiplexage jetabilité si le procédé est exécuté dans un format microfluidique. Cette approche est démontrée par l'utilisation d'un mélange de protéines standards et trypsine l'enzyme la plus couramment utilisée pour la digestion protéolytique avant la détection ESI-MS. Le spectromètre de masse utilisé pour la détection dans cette étude était un instrument linéaire piège quadripolaire (LTQ).

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Protocol

1. Préparation du microréacteur Capillaire

  1. Couper le diamètre interne de 100 um (ID) x 360 um de diamètre extérieur (OD) capillaire à une longueur de 7-8 cm et le diamètre intérieur x 20 um 90 um OD capillaire 3-5 cm avec le hachoir à capillaire en verre; vérifier sous le microscope que les deux extrémités capillaires ont, une coupe droite propre, sans bavures saillantes.
  2. Insérer le 20 um x 90 um ID OD capillaire dans une extrémité de l'ID de 100 um x 360 um diamètre extérieur capillaire, pour une longueur de ~ 6 mm; en cas de besoin, d'observer cette opération sous un microscope.
  3. Appliquer une petite goutte de colle E6000 autour de la jonction des 90 um OD / 100 capillaires um d'identité avec la fin d'un Q-tip, et laisser la colle cure O / N à la température ambiante.
  4. Couper l'insertion 20 um x 90 um ID OD capillaire à une longueur de ~ 10 à 15 mm; ce sera l'ionisation électrospray émetteur.
  5. Pré-couper le 1/32 "PEEK OD, 1/16" PEEK OD et 1/16 "PTFE baignoire ODtion en morceaux de 4-5 cm de longueur; ce seront les manches utilisés dans les syndicats capillaires pour fournir une connexion sans fuite.
  6. Connectez l'autre extrémité du 100 um ID x 360 um OD capillaire à une union de PEEK; utiliser un manchon 1/32 "PEEK pour fournir une connexion sans fuite.
  7. Insérer / serrer un morceau de ~ longue 1/16 "tube de PTFE 5 cm dans l'extrémité opposée de l'union.
  8. Peser ~ 4 mg de C18 (5 um) des particules dans un pré-nettoyée / séchée de 2 ml du flacon de verre; ajouter 0,5 ml d'isopropanol, fermer le flacon et disperser la boue dans le bain de appareil à ultrasons.
  9. Retirer avec une seringue de 250 pi environ 200 en suspension ul, insérer l'aiguille de la seringue dans le "tube de l'union de PEEK 1/16 de PTFE, et distribuer lentement la suspension dans le 100 um ID x 360 um OD capillaire; observer au microscope comme capillaire remplit avec des particules jusqu'à une longueur de 2-3 mm d' emballage est réalisé, ce sera le microréacteur (Figure 1) le 20 μ.m ID capillaire retient les particules dans le microréacteur par un effet Keystone. 15
  10. Rincer le microréacteur avec une solution ~ 50 ul de H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, puis avec une solution ~ 50 ul de H 2 O / CH 3 CN 98: 2 v / v.

2. Préparation de l'échantillon Solutions

Remarque: Les opérations qui impliquent la manipulation de solvants et d'acides organiques et de la préparation de la solution doivent être effectuées dans une hotte. Porter des lunettes, des gants et des vêtements de protection.

  1. Rinçage avec CH3OH et sécher quelques flacons en verre (4 ml) et des tubes de polypropylene (15 ml).
  2. Préparer 10 ml d'une solution de H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) dans un tube de 15 ml en polypropylene en mélangeant 9,8 ml de H 2 O avec 200 pi de CH3CN; mélanger par sonication.
  3. Préparer 10 ml d'une solution de H 2 O / CH3CN (50:50 v / v) dans un tube de 15 ml en polypropylene en mélangeant 5 ml de H 2 </ sub> O avec 5 ml CH 3 CN; mélanger par sonication.
  4. Préparer 4 ml d'une solution aqueuse acidifiée (TFA 0,01% v / v) par addition de 4 ul de TFA (10%) à 4 ml d' H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) dans un flacon de 4 ml en verre; mélanger par sonication.
  5. Préparer 4 ml d'une solution organique acidifiée (TFA 0,01% v / v) par addition de 4 ul de TFA (10%) à 4 ml d' H 2 O / CH3CN (50:50 v / v) dans un flacon de 4 ml en verre; mélanger par sonication.
  6. Peser 16 mg NH 4 HCO 3 avec une microbalance analytique dans un flacon de 4 ml en verre; ajouter 4 ml d'H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) et de se disperser par sonication; il en résulte une solution à 50 mM de NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) dans un tampon aqueux.
  7. Peser 5 mg d'une protéine standard (par exemple, l' albumine de sérum bovin, l' hémoglobine α / β, le cytochrome C, l' anhydrase carbonique, l' α-2-HS-glycoprotéine, etc.) avec une micro - balance analytique dans un flacon de 4 ml en verre; ajouter 4 ml DI water et disperser par sonication; cela se traduit généralement par une solution de concentration de niveau élevé iM.
  8. Préparer 1 ml de solution de protéine (1-2 uM) en diluant la solution de concentration au niveau iM haut avec un volume approprié de NH 4 HCO 3 (50 mM) , un tampon aqueux; mélanger par sonication.
  9. Préparer la solution de trypsine (5 uM) en dissolvant 20 ug séquençage teneur trypsine dans 170 pl de NH 4 HCO 3 (50 mM) , un tampon aqueux; disperser par sonication.

3. Configuration expérimentale

Remarque: Le système LTQ-MS est équipé d'une source ESI modifiée qui comprend une étape de XYZ-maison construite qui permet l'interface du spectromètre de masse à diverses approches d'entrée d'échantillon.

  1. Débranchez le microréacteur capillaire du syndicat PEEK et se connecter au PEEK Tee.
  2. Insérez un ~ 2 cm de long fil Pt dans le bras latéral du PEEK Tee; utiliser un "manchon 1/32 PEEK pour fournir unconnexion et pour isoler le fil Pt sans fuite.
  3. Connectez un 50 pm ID x 360 um OD (~ 0,5 m de long) transfert d'échantillon capillaire à l'extrémité opposée de la PEEK Tee; utiliser un manchon 1/32 "PEEK pour fournir une connexion sans fuite.
  4. Fixer le PEEK T sur le XYZ-scène et positionner l'ESI émetteur ~ 2 mm de la masse capillaire d'entrée du spectromètre.
  5. Connectez le fil Pt à la source d'alimentation ESI du spectromètre de masse.
  6. Connectez l'autre extrémité du transfert de l'échantillon capillaire à l'union en acier inoxydable; utiliser un manchon 1/16 "PEEK pour fournir une connexion sans fuite.
  7. Connectez un 4-5 cm de long 1/16 "tube en PTFE à l'extrémité opposée de l'union en acier inoxydable et insérer l'aiguille de la seringue 250 pi dans le tube de PTFE, tourner sur la pompe et régler le débit à la valeur désirée (par exemple, 2 pl / min).
  8. tandem d'entrée d'acquisition de données MS paramètres dans le logiciel qui contrôle l'instrument MSd enregistrer en tant que fichier de méthode pour préparer le programme d'installation pour effectuer l'analyse; pour le système LTQ-MS, utilisez les paramètres d'analyse dépendant de données suivantes: exclusion dynamique activé pour 180 secondes avec une largeur de masse d'exclusion ± 1,5 m / z; un MS scan suivi d'un zoom et MS 2 scans sur le top 5 des pics les plus intenses, zoom largeur de balayage ± 5 m / z; dissociation induite par collision (CID) des paramètres fixés à la largeur d'isolement 3 m / z, normalisée énergie de collision de 35%, l'activation Q 0,25, et le temps d'activation de 30 msec.

4. Configuration microfluidique

  1. Préparer un dispositif microfluidique à partir de verre ou de substrats polymères; 16-18 l'agencement du dispositif est pourvu sur la figure 2A, constitué d'un micro - réacteur (1) (0,13 mm Longueur Largeur x 2 mm x 50 um de profondeur) reliée à une entrée (2 ), la sortie (3) et un orifice latéral (4); les canaux d'interconnexion pour les manipulations fluidiques sont ~110 m de large et de ~ 50 um de profondeur; une structure multi - canaux (5), composé de ~ 1,5 à 2 um de profondeur x 10 um de largeur x 100 um de long microcanaux 25 um placés à part, va agir comme un filtre pour retenir les particules dans le microréacteur.
  2. Activer les connexions fluides livraison à la puce par collage des connecteurs spécialisés aux ports d'entrée, ou en concevant un stand polymère qui accueille des raccords pour la distribution de fluide (figure 2B). 16
  3. Préparer une suspension de particules C18 (5 um) comme décrit à l'étape 1.8; fournir la suspension dans le microréacteur avec une seringue à l'aide de 16.01 "tube en PTFE relié à l'orifice latéral de la puce (4) scelle l'orifice après le chargement des particules avec de la colle epoxy et durcir pendant 1 heure dans une étuve à 90 ° C 16.
  4. Insérez un capillaire (20 pm ID x 90 um OD x 10 mm de longueur) dans l'orifice de sortie, sceller avec E6000 colle et laisser sécher O / N; cela deviendra l'émetteur ESI (
  5. Connectez un 50 pm ID x 360 OD um (~ 0,5 m de long) transfert d'échantillon capillaire à l'orifice d'entrée de la puce (2); connecter l'extrémité opposée du tube capillaire à une seringue de 250 ul et la pompe de seringue, comme décrit dans 3,6 à 3,7.
  6. Placez un léger PEEK Tee connecteur sur la ligne de transfert d'échantillon juste avant l'orifice d'entrée (2) et insérer un fil de Pt sur ​​le côté-bras du T, comme décrit dans 3.2; ce sera l'électrode ESI.
  7. Fixer le dispositif microfluidique sur la platine XYZ avec l'émetteur positionné ESI ~ 2 mm par rapport à la masse capillaire d'entrée du spectromètre; préparer le MS pour l'analyse comme décrit dans 3.8.

5. Sample Loading, Digestion protéolytique et Elution pour MS Analysis

Remarque: Toutes les étapes de transfert solution / échantillon sont effectuées à l'aide d'une pompe à seringue et devrait permettre pendant quelques minutes supplémentaires pour terminer, pour compenser les morts-volumes associés aux lignes de transfert vers et depuis le microréacteur; le temps nécessaire dépendra des débits en cause.

  1. Rincer le microréacteur et la préparer pour l' analyse par infusion d' une solution aqueuse de NH 4 HCO 3 (50 mM) dans du H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) à 2 ul / min pendant 5 min; utiliser une seringue de 250 pi.
  2. Charger l'échantillon de protéine (1 uM) dans le microréacteur en injectant la solution d'échantillon à 2 pi / min pendant 5 min; utiliser une seringue de 250 pi.
  3. Perfuser la solution de trypsine (5 uM) sur la protéine adsorbée sur le microréacteur à 2 ul / min pendant 1-3 min.
  4. Étancher le processus de digestion protéolytique par rinçage du micro - réacteur avec une solution aqueuse acidifiée de TFA (0,01% v / v) dans H2O / CH3CN (98: 2 v / v) à 2 ul / min pendant 5 min; utiliser une seringue de 250 pi.
  5. Lancer l'élution de la digestion protéique du microréacteur en infusant une solution organique acidifiée de TFA (0,01%v / v) dans H 2 O / CH3CN (50:50 v / v) à 300 Nl / min.
  6. Allumez le processus d'acquisition de données MS et la tension ESI (~ 2,000 V); acquérir des données MS en utilisant les paramètres d'acquisition de données fournies à l'étape 3.8; observer l'élution des peptides tryptiques.

6. Traitement des données

  1. Traiter les données avec un moteur de recherche compatible avec le format de données MS brut tandem MS.
    1. Traiter les fichiers bruts LTQ-MS à l'aide d'un organisme de base de données spécifique de la protéine peu redondante; télécharger les données brutes dans le moteur de recherche, définissez les parents et le fragment d'ions tolérances de masse à 2 et 1 Da, respectivement, et utiliser des fragments seulement entièrement tryptiques avec jusqu'à deux clivages pour la recherche manquée; ne permettent pas de modifications post-traductionnelles; fixer les taux de découverte haute et moyenne confiance faux (FDR) à 1% et 3%, respectivement, et ne permettent pas de modifications post-traductionnelles.
  2. Filtrer les données pour sélectionner seulement de haute confiancepeptide correspond aux protéines contenues dans la base de données; évaluer les protéines et niveau peptide résultats.

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Representative Results

Un résultat représentatif d'un procédé de digestion protéolytique effectuée simultanément sur ​​un mélange de protéines, avec des microréacteurs (figures 1 et 2) est fournie dans le tableau 1 décrit ci-dessus. Le tableau comprend les séquences peptidiques uniques qui identifient une protéine particulière, la croix score de corrélation (Xcorr) (ie, un score qui caractérise la qualité du match expérimentale à théorique pour le spectre de masse en tandem correspondante), le nombre de clivages manqués, l'état de charge de peptide (z), et la masse / charge ( m / z) des peptides protonés. Au niveau de la protéine, la table fournit l'ID de protéine UniProt, la description (nom) de la protéine, le score de la protéine et la couverture des protéines. Toutes les protéines ont été identifiés par plusieurs peptides, après une digestion protéolytique effectuée pendant 90 secondes.

Le temps nécessaire à lal'élution de tous les peptides était dépendante de la longueur du capillaire de transfert qui a rendu la solution organique acidifiée à 300 nl / min, un taux compatible avec les nano-ESI fonctionnement optimal écoulement. In-capillaire mélange des solutions aqueuses et organiques acidifiés a entraîné l'élution précoce de quelques peptides, mais la grande majorité élue pendant plusieurs minutes seulement dans la solution organique. Un spectre de masse affichant la co-élution de plusieurs peptides représentatifs des cinq protéines, produites par le microréacteur capillaire, il est prévu dans la figure 3.

Tableau 1. Liste des peptides tryptiques générés par la digestion protéolytique de cinq protéines en utilisant le microréacteur capillaire et des protocoles de digestion O / N. Seulement des séquences uniques, avec le plus haut Xcorr, sont présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 1
Figure 1. Capillaire microréacteur. (A) Montage expérimental pour la fabrication du micro - réacteur. (B) Capillaire microréacteur positionné dans la source MS ion. Le microréacteur est chargé manuellement avec des particules de silice C18-collés et placé sur un XYZ-étape qui facilite le positionnement correct de la source ESI-MS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. microréacteur microfluidique. (A) Schéma du réacteur microfluidique. (B) réacteur microfluidique fixé dans un stand de PEEK. Le réacteur microfluidique unnd lignes de transfert sont fabriqués dans un substrat de verre qui peut être fixé dans un PEEK polymère fait maison reposer davantage le positionnement de la source avec le stade XYZ MS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Spectre de masse comprenant des peptides tryptiques générés à partir du mélange de protéines soumis à la protéolyse dans le microréacteur. Les ions de peptides tryptiques les plus intenses sont étiquetés avec la séquence des acides aminés et l'identifiant de la protéine correspondante. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande ce chiffre.

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Discussion

Le microréacteur décrit dans ce travail fournit un outil facile à mettre en œuvre l'installation expérimentale pour effectuer la digestion enzymatique de protéines pour permettre l'analyse MS et l'identification en moins de 30 min. Les avantages distincts de ce système, par rapport aux approches conventionnelles, notamment la simplicité, la rapidité, la faible consommation de réactifs et de faibles coûts. En particulier, il n'y a pas besoin de billes de trypsine immobilisée coûteux et des cartouches. La préparation du microréacteur capillaire est simple (figure 1A), et peut être accompli en quelques minutes de fournitures standard, on trouve couramment dans un laboratoire de chromatographie. Alors que les particules C18 de phase inverse peuvent être rincés avec un solvant organique à haut contenu (CH 3 CN ou CH 3 OH) pour le retrait des protéines ou peptides adsorbées et le microréacteur peuvent être réutilisés, le procédé de fabrication facile et rentable invite pour la fabrication d'unités jetables à usage unique applications. Microréacteur capillaire peut être monté dans une source ESI maison construite, comme représenté sur la figure 1B, ou peut être insérée dans une source d'ions type commercial. Alors que le lit de particules pour la capture et la digestion échantillon n'a pas besoin d'être plus long que ~ 1-2 mm, juste assez pour capturer suffisamment de matériel pour une détection optimale par MS, la longueur du capillaire lui-même peut être adapté à la taille d'un particulier la source d'ions.

Pour les laboratoires qui ont des capacités pour fabriquer des dispositifs microfluidiques, une conception simple (figure 2A) qui peut être fixé dans une position pour faciliter l' interfaçage avec MS détection (figure 2B) est fourni. Les dimensions des canaux de transfert et microréacteurs peuvent être ajustés aux exigences d'une application particulière, et le dispositif peut être mis au point dans un format unique ou multiplexe. Pour la plupart des spectromètres de masse commerciale, cependant, la source d'ions aurait besoin de modifications pour permettre l'ele placement du dispositif électronique dans la source. Le dessin de photomasques pour la fabrication des puces a été exécuté avec le logiciel AutoCAD et le photomasque ont été préparés par HTA photomasque. La fabrication des micro - puces a été effectuée selon les protocoles décrits précédemment: 17,18 alignement du substrat avec le masque photographique, une exposition à la lumière UV (360 nm), l' enlèvement de la résine photosensible irradiée et la couche de chrome sous - jacente, une gravure chimique humide de canaux avec un tampon gravure d'oxyde, l' enlèvement de la couche de chrome restant, le perçage de trous d' accès, le nettoyage, l' hydrolyse de la surface de la puce électronique (NH 4 OH + H 2 O 2), et la liaison thermique du substrat à la plaque de recouvrement par chauffage progressif à 550 ° C. Les deux plaque de substrat et la couverture ont été gravées, un pour les canaux profonds pour la manipulation des échantillons (~ 20-50 um), et l'autre pour les éléments de filtre micro-canaux peu profonds (1,5-2 um de profondeur). 16

Les résultats générés avec le mi décrit ci-dessuscroreactor sont comparables aux résultats obtenus à partir de O / N, 19 protocoles de digestion classiques qui utilisent le substrat: les rapports de (50-100) d'enzyme: 1, suivie d'un essai de perfusion de peptide avec MS détection (300 nl / min, les peptides dissous dans H 2 O / CH3CN (50:50 v / v) , on l' acidifie avec CH3COOH, 0,1% v / v). Microréacteur et les deux protocoles classiques ont permis l'identification de toutes les protéines par de multiples peptides uniques (tableau 1). En général, un peu plus grand nombre de peptides uniques par protéine était observable avec le microréacteur qu'avec la configuration classique. Cela est le résultat d'un clivage enzymatique incomplète à certains sites. Quelques minutes supplémentaires de digestion protéolytique réduits ou éliminés ce résultat. En outre, certains des peptides enzymatiques générées par le microréacteur diffèrent de celles générées dans la solution, en raison du fait que, pour les protéines adsorbées sur les particules C18 différents sites ont été exposés à l'enzyme than dans des solutions homogènes. 20 Les scores Xcorr démontrent, cependant, que la qualité des spectres de masse en tandem généré avec le microréacteur est de haute qualité, et une couverture de séquence de protéine suffisante (11-75%) est obtenue pour l' identification de protéines non ambiguës .

La technique, tel que décrit, est limitée à l'analyse des mélanges de protéines plutôt simples qui génèrent la plupart ~ 25-50 peptides qui peuvent être analysés par des expériences simples de perfusion et qui ne nécessitent pas une séparation chromatographique liquide avant analyse MS. Critique du succès est l'utilisation de solutions de trypsine fraîchement décongelés et préparés, pour ne pas réduire ou perdre l'activité de l'enzyme protéolytique au pH opérationnel du microréacteur (ie, pH ~ 8). En outre, un bon équilibre doit être trouvé entre les taux optimaux d'écoulement pour ionisation par électronébulisation (150-300 nl / min) et les débits maximaux qui peuvent être tolérées par le dispositif expérimental et qui permettentPeptide rapide élution à partir du microréacteur (2-3 pl / min). Plus haut que les taux optimaux d'écoulement ESI entraînent des pertes de sensibilité et des limites de détection pauvres. Par conséquent, la longueur des capillaires de transfert doit être maintenue aussi courte que possible pour réduire le temps nécessaire à l'élution des peptides à partir du microréacteur quand on opère à ≤300 nl / min. Tous les composants qui ont été utilisés pour le montage expérimental peuvent être remplacés par des composants d'autres fabricants qui exécutent des fonctions similaires. Si les dimensions de ces composants diffèrent (longueur, diamètre, volume), l'optimisation des débits d'éluant, la concentration de l'échantillon, le temps pour l'exécution de certaines étapes et de la tension ESI peuvent être nécessaires pour obtenir des résultats similaires.

Un avantage unique activée par la configuration microfluidique est la capacité d'intégrer davantage sur la puce d' un système de pompage, par exemple, une pompe flux électroosmotique entraînée, 21,22 pour permettre le stand-alune exploitation de la plate-forme et l'intégration d'une étape de séparation supplémentaire. La capacité à effectuer sur puce séparations des peptides générés par la digestion protéolytique se traduira par des limites de détection améliorées, et facilitera l'analyse des mélanges complexes de protéines à partir d'extraits cellulaires. Cela permettra également de permettre l'intégration de la technique dans les workflows qui utilisent des plates - formes micro - usinés et la détection MS à haute vitesse pour des applications biomédicales 23.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ion trap ESI-MS Thermo Electron LTQ The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage Newport Multiple parts The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope Edmund optics G81-278 The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler VWR 46600-204 The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson VWR 33995-540 The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22 Harvard Apparatus 552222 The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system EMD Millipore ZD5311595  The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) VWR 53513-410 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl) VWR 53513-406 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl) VWR 53513-402 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP100375 This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) Polymicro Technologies TSP020090 This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP050375 This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver Supelco 23740-U This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue Eclectic Products E6000 Craft This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue Epo-Tek 353NDT This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm) Agilent Technologies Zorbax 300SB-C18 These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl) Hamilton 81130-1725RN The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) Valco ZRU1.5FPK This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”) Valco ZU1XC The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) Valco MT.5XCPK The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight) Valco C-NTXFPK This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm) VWR 66260-126 The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD) Valco TTF115-10FT The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union 
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) Upchurch Scientific 1565 The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) Valco TPK.515-25 The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter Valco JR-797 This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml) Agilent  HP-5183-2069 The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry 
Amber vial (4 ml) VWR 66011-948 The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml) Fisher 12-565-286D The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml) VWR 24710-463 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml) VWR 24710-441 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl) VWR 83007-386 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl) VWR 53503-781 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl) VWR 53511-681 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates Nanofilm B270 white crown, 3” x 3” These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”) Upchurch P203X This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly Upchurch N-122H This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards Sigma Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade Fisher A955
Methanol, HPLC grade Fisher A452
Isopropanol, HPLC grade Sigma 650447
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
Ammonium bicarbonate Aldrich A6141
Trypsin, sequencing grade Promega V5111

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References

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