Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo

Bioengineering

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Lazar, I. M., Deng, J., Smith, N. Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor. J. Vis. Exp. (110), e53564, doi:10.3791/53564 (2016).

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Abstract

La gran mayoría de la espectrometría de masas (MS) a base de los métodos de análisis de proteínas implican una etapa de digestión enzimática antes de la detección, por lo general con tripsina. Este paso es necesario para la generación de péptidos de bajo peso molecular, generalmente con MW <3.000-4.000 Da, que caen dentro del rango de escaneado efectivo de la instrumentación de espectrometría de masas. protocolos convencionales implican la digestión enzimática O / N a 37 ºC. Los avances recientes han llevado al desarrollo de una variedad de estrategias, típicamente implica el uso de un microrreactor con enzimas inmovilizadas o de una serie de procesos físicos complementarios que reducen el tiempo necesario para la digestión proteolítica a unos pocos minutos (por ejemplo, de microondas o de alta presión). En este trabajo se describe un método sencillo y rentable que puede ser implementado en cualquier laboratorio para lograr la rápida digestión enzimática de una proteína. La proteína (o mezcla de proteínas) se adsorbe en alta perf de fase inversa C18-unidoormance partículas de sílice líquidos cromatografía (HPLC) precargados en una columna capilar, y tripsina en tampón acuoso se infunde a través de las partículas para un corto período de tiempo. Para habilitar la detección MS en línea, los péptidos trípticos se eluyen con un sistema disolvente con el aumento de contenido orgánico directamente en la fuente de MS de iones. Este enfoque evita el uso de partículas de alto precio enzima inmovilizada y no necesita ninguna ayuda para completar el proceso. La digestión de proteínas y análisis de la muestra completa se puede lograr en menos de 3 min y ~ ~ 30 min, respectivamente.

Introduction

La identificación y caracterización de las proteínas purificadas se consigue frecuentemente mediante el uso de técnicas de EM. La proteína se digiere con una enzima y sus péptidos se analizan además por MS mediante una sencilla configuración experimental de infusión. La digestión proteolítica es necesaria para la generación de pequeños fragmentos de péptidos que se encuentran en el rango de masa útil de la mayoría de los analizadores de MS, y que puede ser fácilmente fragmentado a través de baja energía de disociación inducida por colisión para generar información de la secuencia de aminoácidos. Para las proteínas aisladas o mezclas de proteínas simples, no hay más necesidad de la separación cromatográfica de péptidos antes de la detección EM. Una mezcla de 25-50 péptidos se puede analizar fácilmente mediante la infusión de la muestra con una bomba de jeringa directamente en la fuente de MS de iones.

El espectrómetro de masas puede llevar a cabo el análisis y confirmar la secuencia de una proteína en un breve espacio de tiempo. Con los métodos de adquisición de datos modernos, este proceso puede llevarse a cabo wentro de unos minutos o incluso segundos. El factor limitante en la realización de todo el proceso en una corta escala de tiempo es la etapa de digestión proteolítica. Por lo general, esto se realiza a través de un par de horas (o S / N), en solución, a 37 ºC, usando sustrato: proporciones de enzimas (50-100): 1. Para reducir el tiempo de digestión enzimática para minutos o segundos, microrreactores enzima inmovilizada, en forma de reactores de microfluidos o cartuchos disponibles en el mercado, se han descrito. 1-6 Típicamente, la enzima se inmoviliza por covalente, no covalente de adsorción / física, complejo la formación o la encapsulación, 3,6 la eficiencia mejorada del proceso enzimático ser habilitado por la gran superficie a volumen y las proporciones de enzima a sustrato. Otras ventajas de los reactores inmovilizados incluyen la autólisis y la interferencia reducidos de la enzima en el análisis de MS, la mejora de la estabilidad de la enzima y la reutilización. Se ha descrito una variedad de enfoques, el uso de vidrio o dispositivos microfabricados poliméricos,el uso de enzimas inmovilizadas sobre perlas magnéticas por las interacciones antígeno-anticuerpo, 7,8 atrapados en las redes de nanopartículas de oro, 9 encapsulado en titania-alúmina sol-geles 10 y nanozeolites, 11 o capturados a través de Ni-NTA o His-Tag la formación del complejo. 6 Alternativamente , se han desarrollado capilares abiertos-tubulares con enzimas inmovilizadas, también. 12 por otra parte, el aumento de la escisión proteolítica se ha demostrado mediante el uso de irradiación de microondas controlado 13 o tecnología bicicleta asistida por presión o presión (PCT) para la reducción de los tiempos de reacción a 30-120 min. 14

A pesar de las múltiples ventajas de los reactores de enzimas inmovilizados, los costos de los cartuchos comerciales es alta, la disponibilidad de dispositivos de microfluidos para uso rutinario es limitado, y el uso de los resultados de tecnologías de microondas o PCT en necesidad de instrumentación adicional. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método que circumveNTS estas desventajas, y que se puede implementar fácilmente en cada laboratorio para capacitar a los investigadores un método sencillo y eficaz para llevar a cabo la escisión enzimática de las proteínas en la preparación para el análisis de MS en cuestión de minutos. El enfoque se basa en el uso de hidrófobos, C18-partículas que son pre-cargados en un capilar o un dispositivo de microfluidos, y la adsorción de la proteína (s) de interés en estas partículas, seguido por digestión enzimática durante la infusión de la enzima sobre el lecho compacto y proteína (s) capturada. En este enfoque, el sustrato se inmoviliza a través de interacciones no covalentes, y la enzima se infunde a través de la proteína inmovilizada. La eficiencia de la digestión proteolítica se incrementa por las grandes áreas de superficie de partículas que exponen a la proteína para el procesamiento enzimático, distancias y tiempos de difusión hacia y desde la superficie de partículas reducido, una mejor transferencia de masa, no unión covalente que pueden afectar a la actividad de la enzima, la capacidad de forma rápida evaluate combinaciones de diferentes enzimas, disponibilidad de acceso, y la multiplexación si el proceso se ejecuta en un formato de microfluidos. Este enfoque se demuestra con el uso de una mezcla de proteínas estándar y de tipo tripsina de la enzima más utilizada para la digestión proteolítica antes de la detección ESI-MS. El espectrómetro de masas utilizado para la detección en este estudio fue un instrumento lineal trampa cuadrupolo (LTQ).

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Protocol

1. Preparación del capilar Microreactor

  1. Cortar el diámetro interior 100 mm (ID) x capilar 360 micras de diámetro exterior (OD) a una longitud de 7-8 cm, y el 20 micras ID x 90 micras OD capilar a 3-5 cm con la cuchilla de capilar de vidrio; verificar en el microscopio que ambos extremos capilares tienen un corte limpio y recto, sin las rebabas que sobresalen.
  2. Insertar el 20 micras ID x 90 micras capilar OD en un extremo de la 100 micras ID x 360 micras capilar OD, para una longitud de ~ 6 mm; en caso de necesidad, observar esta operación bajo un microscopio.
  3. Aplique una pequeña gota de pegamento E6000 alrededor de la unión de los capilares 90 micras OD / ID 100 micras con el fin de un Q-tip, y dejar que la cura pegamento O / N a temperatura ambiente.
  4. Cortar el 20 micras ID x 90 micras capilar OD insertado a una longitud de ~ 10-15 mm; este será el emisor de ionización electrospray.
  5. -Pre cortar el 1/32 "OD PEEK, 1/16" PEEK OD y OD bañera de PTFE 1/16 "ing en trozos de 4-5 cm de longitud; estos serán los manguitos utilizados en las uniones capilares para proporcionar una conexión libre de fugas.
  6. Conectar el extremo opuesto de la 100 micras ID x 360 micras OD capilar a una unión PEEK; utilizar un manguito de 1/32 "PEEK para proporcionar una conexión libre de fugas.
  7. Insertar / apretar un pedazo de ~ 5 cm de largo tubo de PTFE 1/16 "en el extremo opuesto de la unión.
  8. Pesar ~ 4 mg de C18 (5 micras) partículas en un pre-limpiado / secado 2 ml vial de vidrio; añadir 0,5 ml de isopropanol, cerrar el vial y dispersar la suspensión en el baño de ultrasonidos.
  9. Retirar con una jeringa de 250 l, aproximadamente 200 l de suspensión, insertar la aguja de la jeringa en el "tubo de PTFE 1/16 de la unión PEEK, y dispensar lentamente la suspensión en el 100 micras DI x 360 micras capilar OD; observar bajo el microscopio como el capilar se llena con partículas de hasta una longitud de mm embalaje 2-3 se consigue, lo que será el microrreactor (Figura 1) el 20 μ.capilar m Identificación retiene las partículas en el micro-reactor a través de un efecto de distorsión trapezoidal. 15
  10. Enjuague el micro-reactor con solución de ~ 50 l de H2O / CH3CN 50:50 v / v, y luego con solución de ~ 50 l de H2O / CH3CN 98: 2 v / v.

2. Preparación de las soluciones de muestra

Nota: Las operaciones que impliquen la manipulación de disolventes y ácidos orgánicos y preparación de la solución se van a realizar en una campana extractora. Llevar gafas, guantes y ropa de protección.

  1. Enjuague con CH 3 OH y secar unos viales de vidrio (4 ml) y los tubos de polipropileno (15 ml).
  2. Preparar 10 ml de una solución de H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) en un tubo de 15 ml de polipropileno por mezcla de 9,8 ml de H 2 O con 200 l CH 3 CN; mezclar mediante ultrasonidos.
  3. Preparar 10 ml de una solución de H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) en un tubo de 15 ml de polipropileno por mezcla de 5 ml H 2 </ sub> O con 5 ml de CH3CN; mezclar mediante ultrasonidos.
  4. Preparar 4 ml de una solución acuosa acidificada (TFA 0,01% v / v) mediante la adición de 4 l de TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) en un vial de vidrio de 4 ml; mezclar mediante ultrasonidos.
  5. Preparar 4 ml de una solución orgánica acidificada (TFA 0,01% v / v) mediante la adición de 4 l de TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) en un vial de vidrio de 4 ml; mezclar mediante ultrasonidos.
  6. Pesar 16 mg NH 4 HCO 3 con una microbalanza analítica en un vial de vidrio de 4 ml; añadir 4 ml de la H 2 O / CH 3 CN: solución (98 / v 2 v) y se dispersan por sonicación; esto se traduce en una solución 50 mM de NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) en tampón acuoso.
  7. Pesar 5 mg de una proteína estándar (por ejemplo, albúmina de suero bovino, la hemoglobina α / β, el citocromo C, anhidrasa carbónica, α-2-HS-glicoproteína, etc.) con una microbalanza analítica en un vial de vidrio de 4 ml; añadir 4 ml finales de DIr y dispersar por sonicación; esto típicamente resulta en una solución de concentración de alto nivel M.
  8. Preparar 1 ml de solución de proteína (1-2 M) diluyendo la solución de concentración de alto nivel mu M con un volumen apropiado de NH 4 HCO 3 (50 mM) de tampón acuoso; mezclar mediante ultrasonidos.
  9. Preparar la solución de tripsina (5 mM) disolviendo 20 g de tripsina de secuenciación grado en 170 l NH 4 HCO 3 (50 mM) de tampón acuoso; dispersar mediante ultrasonidos.

3. Configuración Experimental

Nota: El sistema LTQ-MS está provisto de una fuente ESI modificado que incluye una casa construida XYZ-etapa que permite la interconexión del espectrómetro de masas a diversos enfoques de entrada de muestra.

  1. Desconectar el capilar micro-reactor de la unión PEEK y PEEK conectarse a la camiseta.
  2. Inserte el cable a ~ 2 cm de largo Pt en el brazo lateral del PEEK T; utilizar un "manga 1/32 PEEK para proporcionar unaLibre de fugas y conexiones para el aislamiento del alambre de Pt.
  3. Conectar un 50 micras ID x 360 micras OD (~ 0,5 m de largo) de transferencia de muestras capilar en el extremo opuesto de la PEEK Tee; utilizar un manguito de 1/32 "PEEK para proporcionar una conexión libre de fugas.
  4. Asegurar el Tee PEEK en el XYZ-etapa y la posición del emisor ESI ~ 2 mm de distancia del capilar de entrada de espectrómetro de masas.
  5. Conectar el cable de Pt a la fuente de alimentación ESI del espectrómetro de masas.
  6. Conectar el extremo opuesto del capilar de transferencia de muestra a la unión de acero inoxidable; utilizar un manguito de 1/16 "PEEK para proporcionar una conexión libre de fugas.
  7. Conectar un 4-5 cm de largo tubo de PTFE 1/16 "hasta el extremo opuesto de la unión de acero inoxidable e inserte la aguja de la jeringa 250 l en el tubo de PTFE; encender la bomba y ajustar el caudal al valor deseado (por ejemplo, 2 l / min).
  8. parámetros de adquisición de datos de MS en tándem de entrada en el paquete de software que controla el instrumento EMd guardar como un archivo de método para preparar la instalación para la realización del análisis; para el sistema LTQ-EM, utilice los parámetros de análisis de datos dependientes siguientes: dinámica de exclusión habilitado para 180 seg con un ancho de masas exclusión ± 1,5 m / z; uno miembros de exploración seguido de uno de zoom y MS 2 scans en los 5 primeros picos más intensos, zoom ancho de barrido ± 5 m / z; la disociación inducida por colisión (CID) los parámetros establecidos en el ancho de separación de 3 m / z, la energía de colisión normalizada del 35%, la activación Q 0.25, y el tiempo de activación de 30 ms.

4. Configuración de microfluidos

  1. Preparar un dispositivo microfluídico de vidrio o sustratos poliméricos; 16-18 el diseño del dispositivo se proporciona en la Figura 2A, que consiste en un microrreactor (1) (0,13 mm de ancho x 2 mm de longitud x 50 m de profundidad) conectado a una entrada (2 ), salida (3) y un puerto lateral (4); los canales de interconexión para manipulaciones de fluidos son ~110 micras de ancho y 50 m de profundidad ~; una estructura de múltiples canales (5), que consta de ~ 1,5 a 2 micras de profundidad x 10 m de ancho x 100 micras microcanales largos colocados 25 m de distancia, actuará como un filtro para retener las partículas en el microrreactor.
  2. Habilitar conexiones de fluidos a la entrega al chip por encolado conectores especializados a los puertos de entrada, o mediante la elaboración de un soporte polimérico que tiene capacidad para accesorios de suministro de fluido (Figura 2B). 16
  3. Preparar una suspensión de partículas C18 (5 micras) tal como se describe en el paso 1.8; entregar la suspensión para el microrreactor con una jeringa mediante el uso de 1/16 "tubo de PTFE conectado al puerto de lado de chip (4); sellar el puerto después de la carga de partículas con pegamento epoxi y cura para 1 hr en un horno a 90 ºC 16.
  4. Inserte un capilar (20 micras x 90 micras ID DE x 10 mm de longitud) en el orificio de salida, sellar con pegamento E6000, y curemos O / N; esto se convertirá en el emisor ESI (
  5. Conectar un 50 micras ID x 360 OD m (~ 0,5 m de largo) de transferencia de muestras capilar al puerto de entrada de chip (2); conectar el extremo opuesto del tubo capilar a una jeringa de 250 l y la bomba de jeringa, como se describe en 3.6 a 3.7.
  6. Colocar un peso ligero PEEK Tee conector de la línea de transferencia de muestra justo antes de la abertura de entrada (2) e insertar un alambre de Pt en el lado del brazo de la T, como se describe en 3.2; este será el electrodo ESI.
  7. Fijar el dispositivo de microfluidos en el escenario XYZ con el emisor ESI posicionado ~ 2 mm de distancia del capilar de entrada de espectrómetro de masas; preparar el MS para el análisis como se describe en 3.8.

5. Carga de la muestra, de digestión proteolítica y elución para MS Análisis

Nota: Todos los pasos de transferencia de solución / muestra se llevan a cabo con la ayuda de una bomba de jeringa y debe permitir por unos minutos adicionales para completar, para compensar los muertos-volumES asociados a las líneas de transferencia desde y hacia el micro-reactor; el tiempo necesario dependerá de las velocidades de flujo implicadas.

  1. Enjuague el microrreactor y prepararlo para el análisis mediante la infusión de una solución acuosa de NH 4 HCO 3 (50 mM) en H2O / CH3CN (98: 2 v / v) a 2 l / min durante 5 min; utilizar una jeringa de 250 microlitros.
  2. Cargar la muestra de proteína (1 M) en el microreactor mediante la infusión de la solución de muestra a 2 l / min durante 5 min; utilizar una jeringa de 250 microlitros.
  3. Infundir la solución de tripsina (5 mM) sobre la proteína adsorbida en el microrreactor a 2 l / min para 1-3 min.
  4. Se detiene el proceso de digestión proteolítica enjuagando el microrreactor con una solución acuosa acidificada de TFA (0,01% v / v) en H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 l / min durante 5 min; utilizar una jeringa de 250 microlitros.
  5. Iniciar la elución de la proteína digerir del microrreactor mediante la infusión de una solución orgánica acidificada de TFA (0,01%v / v) en H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) a 300 nl / min.
  6. Encienda el proceso de adquisición de datos de MS y la tensión de ESI (~ 2.000 V); adquirir datos de MS utilizando los parámetros de adquisición de los datos proporcionados en el paso 3.8; observar la elución de los péptidos trípticos.

6. Proceso de Datos

  1. Procesar los datos de MS en tándem con un motor de búsqueda compatible con el formato de datos MS prima.
    1. Procesar los archivos RAW LTQ-MS utilizando un organismo específico de la base de datos de proteínas mínimamente redundante; cargar los datos en bruto en el motor de búsqueda, establecer los límites de tolerancia de masa de los padres y de iones fragmento a 2 y 1 Da, respectivamente, y el uso de fragmentos única plenamente tríptico con hasta dos divisiones perdidas para la búsqueda; no permiten modificaciones posteriores a la traducción; establecer las tasas de descubrimiento de alta y media confianza falsos (FDR) a 1% y 3%, respectivamente, y no permiten modificaciones posteriores a la traducción.
  2. Filtrar los datos para seleccionar únicos de alta confianzapéptido coincide con las proteínas en la base de datos; evaluar la proteína y a nivel de péptido resultados.

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Representative Results

Un resultado representativo de un proceso de digestión proteolítica lleva a cabo de forma simultánea en una mezcla de proteínas, con los microrreactores descritos anteriormente (Figuras 1 o 2), se proporciona en la Tabla 1. La tabla comprende las secuencias de péptidos únicos que identifican una proteína particular, la cruz puntuación de correlación (Xcorr) (es decir, una puntuación que caracteriza la calidad del partido-experimental para teórica para el espectro de masas en tándem correspondiente), el número de divisiones perdidas, el estado de carga de péptidos (z), y la masa / carga ( m / z) de los péptidos protonadas. A nivel de proteínas, la tabla proporciona el ID de proteínas UniProt, la descripción (nombre) de la proteína, la puntuación de la proteína y la cobertura de la proteína. Todas las proteínas eran identificables por múltiples péptidos, después de una digestión proteolítica lleva a cabo durante 90 segundos.

El tiempo necesario para laelución de todos los péptidos era dependiente de la longitud del capilar de transferencia que entrega la solución orgánica se acidificó a 300 nl / min, una velocidad de flujo compatible con nano-ESI funcionamiento óptimo. En capilar mezcla de las soluciones acuosas y orgánicas acidificadas dio como resultado la elución temprana de algunos péptidos, pero la gran mayoría se eluyó durante varios minutos sólo en la solución orgánica. Un espectro de masas muestra el co-elución de varios péptidos representativos de las cinco proteínas, generados con el microrreactor capilar, se proporciona en la Figura 3.

Tabla 1. Lista de péptidos trípticos generados a través de la digestión proteolítica de cinco proteínas utilizando el micro-reactor capilar y protocolos de digestión O / N. Sólo secuencias únicas, con la más alta Xcorr, se muestran. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 1
Figura 1. capilar microrreactor. (A) Montaje experimental para la fabricación de la microrreactor. (B) capilar micro-reactor posicionado en la fuente de iones MS. El micro-reactor se carga manualmente con partículas de sílice unidos a C18 y se coloca en un XYZ-etapa que facilita el posicionamiento adecuado en la fuente ESI-MS. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. microrreactor de microfluidos. (A) Diagrama esquemático del reactor de microfluidos. (B) del reactor de microfluidos asegurado en un soporte PEEK. El reactor de microfluidos unand líneas de transferencia se fabrican en un sustrato de vidrio que se puede fijar en una PEEK polimérico de fabricación casera de pie para su posterior colocación en la fuente MS con la etapa de XYZ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Espectro de masas que comprende péptidos trípticos generados a partir de la mezcla de proteínas sometidas a proteolisis en el micro-reactor. Los iones más intensos de péptidos trípticos se etiquetan con la secuencia de los aminoácidos y el correspondiente identificador de proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El micro-reactor descrito en este trabajo proporciona una forma fácil de implementar montaje experimental para llevar a cabo la digestión enzimática de las proteínas para permitir el análisis de MS y la identificación en menos de 30 minutos. Las ventajas de este sistema, en comparación con los enfoques convencionales, incluyen la simplicidad, velocidad, bajo consumo de reactivo y bajos costos. En particular, no hay necesidad de perlas de tripsina inmovilizada caros y cartuchos. La preparación del microrreactor capilar es sencillo (Figura 1A), y se puede lograr dentro de minutos de alimentación estándar, se encuentran comúnmente en un laboratorio de cromatografía. Mientras que las partículas C18 fase inversa pueden ser enjuagados con disolvente orgánico de alto contenido (CH 3 CN o CH 3 OH) para completar la eliminación de las proteínas adsorbidas o péptidos, y el microrreactor se pueden volver a utilizar, el proceso de fabricación fácil y rentable invita a la fabricación de unidades desechables para un solo uso aplicciones. El microrreactor capilar se puede montar en una fuente ESI construido en casa, como se muestra en la Figura 1B, o puede ser insertado en una fuente de iones comercial estándar. Mientras que el lecho de partículas para la captura y digestión de la muestra no necesita ser superior a ~ 1-2 mm, lo suficiente para capturar el material suficiente para la detección óptima por MS, la longitud de la propia capilar se puede ajustar para adaptarse al tamaño de cualquier particular, fuente de iones.

Para los laboratorios que tienen capacidades para fabricar dispositivos microfluídicos, se proporciona un diseño simple (Figura 2A) que se puede asegurar en un soporte para facilitar la interfaz con MS de detección (Figura 2B). Las dimensiones de los canales de transferencia microreactor y se pueden ajustar a los requisitos de una aplicación particular, y el dispositivo se pueden desarrollar en un formato simple o multiplexado. Para la mayoría de los espectrómetros de masas comerciales, sin embargo, la fuente de iones necesitaría modificaciones para permitir THe la colocación del dispositivo en la fuente. El dibujo fotomáscara para la fabricación de chips se ejecutó con el software AutoCAD y la fotomáscara fueron preparados por la ETS fotomáscara. La fabricación de los microchips se realizó de acuerdo a los protocolos descritos anteriormente: 17,18 alineación del sustrato con la fotomáscara, exposición a la luz UV (360 nm), la eliminación del fotoprotector irradiado y capa de cromo subyacente, grabado químico húmedo de canales con tampón etch óxido, la eliminación de la capa de cromo restante, la perforación de orificios de acceso, la limpieza, la hidrólisis de la superficie microchip (NH 4 OH + H 2 O 2), y la unión térmica del sustrato a la placa de cubierta por calentamiento gradual a 550 ºC. Tanto la placa de sustrato y la cubierta fueron grabadas, una para los canales profundos para el manejo de la muestra (~ 20-50 micras), y el otro para los elementos de filtro de micro-canal poco profundo (1,5-2 micras de profundidad). 16

Los resultados generados con el mi-descrita anteriormentecroreactor son comparables con los resultados obtenidos a partir de O / N, 19 protocolos de digestión convencionales que utilizan sustrato: relaciones enzimáticas de (50-100): 1, seguido por un experimento de infusión péptido con MS de detección (300 nl / min, los péptidos se disolvió en H (50:50 v / v) se acidificó con CH 3 COOH, 0,1% v / v). 2 O / CH 3 CN Tanto micro-reactor y protocolos convencionales permitieron la identificación de todas las proteínas de múltiples péptidos únicos (Tabla 1). Por lo general, un número algo mayor de péptidos únicos por proteínas eran observables con el micro-reactor que con la configuración convencional. Este fue un resultado de la escisión enzimática incompleta en ciertos sitios. A los pocos minutos adicionales de la digestión proteolítica reducen o eliminan este resultado. También, algunos péptidos enzimáticos generados con el microrreactor diferían de los generados en solución, debido al hecho de que para las proteínas adsorbidas sobre las partículas de C18 diferentes sitios fueron expuestos a la enzima tHan en soluciones homogéneas. 20 Las puntuaciones Xcorr demuestran, sin embargo, que la calidad de los espectros de masas en tándem generado con el microreactor era de alta calidad, y que una cobertura suficiente de secuencias de proteínas (11-75%) es alcanzable para la identificación de proteínas sin ambigüedades .

La técnica, como se describe, se limita al análisis de mezclas de proteínas bastante simples que generan en la mayoría de ~ 25-50 péptidos que pueden ser analizados por los experimentos de infusión simples y que no requieren separación de cromatografía de líquidos antes del análisis MS. Crítica para el éxito es el uso de soluciones de tripsina recién descongeladas y preparados, a no reducir o perder la actividad de la enzima proteolítica en el pH operativo de la microrreactor (es decir, pH ~ 8). Además, un equilibrio adecuado se debe encontrar entre las tasas óptimas de flujo para la ionización por electrospray (150-300 nl / min) y las velocidades de flujo máximas que pueden ser toleradas por la configuración experimental y que permitenrápida elución péptido de la microrreactor (2-3 l / min). Mayores que las tasas óptimas de flujo ESI resultar en pérdidas de sensibilidad y límites de detección pobres. Como resultado, la longitud de los capilares de transferencia debe mantenerse lo más corto posible para reducir el tiempo necesario para la elución de los péptidos de la microrreactor cuando se opera a ≤300 nl / min. Todos los componentes que se utilizaron para la configuración experimental puede ser reemplazado por componentes de otros fabricantes que realizan funciones similares. Si las características dimensionales de estos componentes difieren (longitud, diámetro, volumen), la optimización de las tasas de flujo de eluyente, concentración de la muestra, el tiempo para llevar a cabo ciertos pasos y de la tensión de ESI puede ser necesaria para obtener resultados similares.

Una ventaja única habilitada por la configuración de microfluidos es la capacidad de incorporar además en el chip de un sistema de bombeo, por ejemplo, una bomba de flujo electroosmótico impulsado, 21,22 para permitir que el stand-aluna operación de la plataforma y la integración de una etapa de separación adicional. La capacidad de realizar separaciones en el chip de los péptidos generados a través de la digestión proteolítica resultará en límites de detección mejorados, y facilitará el análisis de mezclas complejas de proteínas a partir de extractos celulares. Esto permitirá la integración de la técnica en los flujos de trabajo que hacen uso de plataformas microfabricados y detección MS de alta velocidad para aplicaciones biomédicas. 23

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ion trap ESI-MS Thermo Electron LTQ The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage Newport Multiple parts The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope Edmund optics G81-278 The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler VWR 46600-204 The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson VWR 33995-540 The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22 Harvard Apparatus 552222 The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system EMD Millipore ZD5311595  The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) VWR 53513-410 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl) VWR 53513-406 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl) VWR 53513-402 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP100375 This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) Polymicro Technologies TSP020090 This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP050375 This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver Supelco 23740-U This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue Eclectic Products E6000 Craft This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue Epo-Tek 353NDT This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm) Agilent Technologies Zorbax 300SB-C18 These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl) Hamilton 81130-1725RN The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) Valco ZRU1.5FPK This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”) Valco ZU1XC The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) Valco MT.5XCPK The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight) Valco C-NTXFPK This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm) VWR 66260-126 The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD) Valco TTF115-10FT The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union 
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) Upchurch Scientific 1565 The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) Valco TPK.515-25 The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter Valco JR-797 This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml) Agilent  HP-5183-2069 The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry 
Amber vial (4 ml) VWR 66011-948 The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml) Fisher 12-565-286D The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml) VWR 24710-463 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml) VWR 24710-441 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl) VWR 83007-386 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl) VWR 53503-781 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl) VWR 53511-681 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates Nanofilm B270 white crown, 3” x 3” These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”) Upchurch P203X This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly Upchurch N-122H This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards Sigma Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade Fisher A955
Methanol, HPLC grade Fisher A452
Isopropanol, HPLC grade Sigma 650447
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
Ammonium bicarbonate Aldrich A6141
Trypsin, sequencing grade Promega V5111

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References

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