انتقائية القضاء خلية من الثقافة 3D المختلطة باستخدام تقنية الأشعة تحت الحمراء بالقرب من Photoimmunotherapy

1Molecular Imaging Program, National Cancer Institute
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

القضاء على خلايا معينة دون الإضرار خلايا أخرى أمر صعب للغاية، وخاصة في الأنسجة المعمول بها، وهناك حاجة ملحة لطريقة القضاء خلية في الحقل هندسة الأنسجة. في الوقت الحاضر في مجال الطب التجديدي، مزارع الأنسجة باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ES)، والخلايا الجذعية المحفزة (الأمنية الخاصة)، أو الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (آي بي إس) هي مواد واعدة 1-3.

على الرغم من أن هذا تجديد الأنسجة واعد، وتلوث مع الخلايا غير المرغوب فيه هو مصدر قلق كبير. وعلاوة على ذلك، هناك قلق سلامة tumorigenicity بعد زرع 4،5. وعلى الرغم من العديد من الدراسات التي تركز على هذه القضايا للقضاء على خلايا معينة، وخاصة في مجال الطب التجديدي 6-8، ولم تستحدث طريقة عملي.

photoimmunotherapy الأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد الوطني PIT) هو علاج يقوم على conjugat الأجسام المضادة photoabsorberه (APC). يتكون من APC من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة خلية محددة (ماب) وphotoabsorber، IR700. IR700 هو ماء السيليكا فثالوسيانين مشتق ولا يسبب الضيائية في حد ذاته 9. ومترافق IR700 تساهميا إلى الضد عبر بقايا أميد على الجانب سلسلة من الجزيئات يسين. آسيا والمحيط الهادئ تربط الجزيئات المستهدفة على غشاء الخلية ومن ثم يدفع نخر خلية فوري تقريبا بعد التعرض لضوء الجرد الوطني في 690 نانومتر. خلال التعرض لقوائم الجرد الوطنية للضوء، وتمزق الغشاء الخلوي مما يؤدي إلى موت الخلايا 9-14. وقد ثبت الجرد الوطني حفرة لتكون فعالة مع الأجسام المضادة متعددة أو شظايا الأجسام المضادة، بما في ذلك مكافحة EGFR، ومكافحة HER2، ومكافحة PSMA، ومكافحة CD25، ومكافحة mesothelin، ومكافحة GPC3، ومكافحة CEA 15-21. لذلك، الجرد الوطني PIT يمكن استخدامها ضد طائفة واسعة من الجزيئات المستهدفة. وعلاوة على ذلك، الجرد الوطني PIT هو علاج جيد للرقابة التي تسمح المعاملة الانتقائية من مناطق معينة عن طريق تقييد الجرد الوطني من lighر التشعيع 18،22.

هنا، فإننا نقدم وسيلة للقضاء خلية معينة باستخدام الجرد الوطني حفرة من الثقافات 3D المختلطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يصف بروتوكول التالي الخطوات اللازمة للقضاء على خلايا محددة باستخدام الجرد الوطني حفرة. الضوابط وغيرها من التفاصيل حول الجرد الوطني حفرة وبقاء الخلية يمكن العثور عليها في أي مكان آخر (18).

1. الإقتران من IR700 إلى وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (ماب)

  1. إعداد خريطة موقع من الفائدة في 2-5 ملغ / مل في 0.1 م نا 2 هبو 4 (درجة الحموضة 8.6) حل.
  2. خلط 6.8 نانومول من ماب مع 30.8 نانومول من 10 ملي IR700 في 0.1 M نا 2 هبو 4 الحل (درجة الحموضة 8.6) في أنبوب microcentrifuge واحتضان في RT لمدة 1 ساعة، مغطاة بورق الألومنيوم.
  3. غسل العمود PD-10 (انظر جدول المواد / المعدات) مع 15 مل PBS، مرتين. تحميل عينة من الخطوة 1.2.
  4. تنقية خليط عبر العمود PD-10 بواسطة برنامج تلفزيوني شطف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: وهنا، كان شطف طول اللون عصابة من IR700. للحصول على نموذج 300 ميكرولتر، PBS شطف جزء عادة بين 2.5 مل إلى 4.4 مل.
  5. تحديدتركيز البروتين مع Coomassie تلطيخ عن طريق قياس امتصاص عند 595 نانومتر مع معمل 9. تحديد تركيز IR700 مع امتصاص عند 689 نانومتر إلى تأكيد عدد من الجزيئات fluorophore مترافق إلى كل جزيء ماب 9.
    ملاحظة: من المهم تحديد عدد الاقتران الأمثل للجزيئات IR700 في 1 ماب مع معمل. عموما، حوالي 3 جزيئات IR700 في 1 ماب جزيء هو الأمثل لكل من في المختبر وعمل الجسم الحي. طرق HPLC وSDS-PAGE يمكن استخدامها لتأكيد ما إذا كان ماب وIR700 ملزمة أم لا.
  6. تخزين عند 4 درجات مئوية بعد تحديد تركيز البروتين.

2. إعداد المختلطة خلية الثقافة 3D (المختلطة الجسم الشبه الكروي)

  1. تطبيق الماء المعقم (حوالي 1 مل) في القسم خزان لوحة من لوحات معلقة الهبوط.
  2. إعداد نسب مختلفة من أنواع الخلايا من الفائدة - خلايا A431-لوك-GFP والخلايا 3T3-طلب تقديم العروض -مع كل عينة تحتوي على 5000 خلايا الكلية، وعلقت في 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة.
    ملاحظة: إعداد 1: 100، 10: 100، 25: 100، 50: 100، الخ نسب الخلايا أنواع من الاهتمام في وسائل الإعلام ثقافة تبعا لنوع الخلية.
  3. احتضان هذا المزيج لمدة 5-7 أيام في شنقا جيدا لوحة انخفاض 96 في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل يوم 2. ملاحظة: لجعل كروي في 3D على وجه التحديد، والتعامل مع لوحة بلطف، وقطرات تحتوي على خلايا تسقط بسهولة قبل تشكيل الأشكال 3D.
  4. مراقبة الصرف وحجم الكروية باستخدام المجهر brightfield مقلوب في 10X - 40X التكبير. ملاحظة: على الرغم من أنه يعتمد على أنواع الخلايا وحجم القطرة المعلقة، تأكد من أن قطر كروي حوالي 400-600 ميكرون بعد 7 أيام من الحضانة في ال 96 جيدا شنقا انخفاض لوحة.

3. في المختبر الجرد الوطني حفرة لالمختلطة خلية الثقافة 3D

  1. تغيير وسائل الإعلام للهكتارnging لوحات قطرة إلى 10 ميكروغرام / مل الأجسام المضادة photoabsorber المترافقة (APC) التي تحتوي على وسائل الإعلام، واحتضان لمدة 6 ساعات في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
  2. بعد 6 ساعات الحضانة، وغسل كروي مرتين مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة (الفينول الحمراء الحرة). نقل بلطف كروي على طبق القاع الزجاجي 50 ملم مع 100 ميكرولتر الفينول الطازجة وسائل الإعلام الثقافة الحرة الأحمر باستخدام معقم 200 ميكرولتر ماصة مع قطع قبالة الطرف. وضع كروي واحد في كل طبق.
  3. مراقبة كروي مع المجهر brightfield مقلوب للكشف عن تغيير التشكل. لمراقبة الصحفيين البصرية (على سبيل المثال، GFP وطلب تقديم العروض) استخدام المجهر مضان مع إعدادات التصفية التالية: GFP - 469 نانومتر تصفية الإثارة، وتصفية الانبعاثات 525 نانومتر. طلب تقديم العروض - 559 مرشح نانومتر الإثارة، و 630 مرشح الانبعاثات نانومتر.
  4. وضع الصمام الثنائي الباعثة للضوء (LED) فوق طبق القاع الزجاجي للإشعاع.
    ملاحظة: الأجسام الشبه الكروية يمكن أن يتعرض لقوائم الجرد الوطنيةالضوء إما على المجهر أو في غطاء محرك السيارة الصفحي.
    1. قياس كثافة الطاقة من نير الضوء مع السلطة متر البصرية 9. ووفقا لهذا القياس، أشرق نير الضوء عبر الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح) والتي تنبعث منها الضوء بأطوال موجية من 670-710 نانومتر في 2 J / سم 2.
      ملاحظة: ضوء LED يمكن ان تخترق أقصى عمق حوالي 5 بوصات. الآثار السامة للخلايا من الجرد الوطني حفرة تعتمد فقط على الطاقة نظرا بغض النظر عن كثافة القوة ومدة التعرض 23.
  5. بعد التشعيع، ونقل كروي إلى قطرة شنقا لوحة جديدة مع 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة جديدة واحتضان لمدة 1 يوم في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
  6. نقل بلطف كروي على طبق القاع الزجاجي مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة جديدة (أحمر الفينول مجاني) باستخدام معقم 200 ميكرولتر ماصة مع طرف قطع. مراقبة كروي مع مضان المجهر 1 يوم بعد الجرد الوطني حفرة باستخدام فايإعدادات lter هو موضح في الخطوة 3.3.
    1. كشف الخلايا الميتة عن طريق إضافة يوديد propidium إلى وسائل الإعلام بتركيز نهائي من 2 ميكروغرام / مل، أو فقدان حشوية GFP مضان باستخدام المجهر مضان (الشكل 2B) 14،18،22.
  7. كرر الخطوات من 3.1-3.6 إذا لم يتم القضاء على الخلايا المستهدفة تماما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لمراقبة بصريا تأثير الجرد الوطني حفرة، خط الخلية A431، التي overexpresses EGFR، والمعدلة وراثيا للتعبير أيضا GFP ووسيفيراز (A431-لوك-GFP). باعتباره غير المستهدفة من نير-حفرة، تم تعديل خط خلية BALB / 3T3 بصريا للتعبير عن طلب تقديم العروض (3T3-RFP). آسيا والمحيط الهادئ، panitumumab-IR700 (عموم IR700)، تم تصنيعه. ملفقة الكروية المختلطة، والتي كانت تتألف من نسب مختلفة من الخلايا (A431-لوك-GFP و3T3-RFP) وفقا لهذا البروتوكول (الشكل 1). تم تنفيذ المتكررة الجرد الوطني PIT مع حضانة عموم IR700 (انظر نظام في الشكل 2A). وقد تحقق خلية هدف التخلص من هذه الثقافة 3D المختلطة ومراقبتها مع مضان ووسيفيراز الأنشطة (الشكل 2B، C). من ناحية أخرى، واصلت الخلايا غير المستهدفة للنمو.

الشكل 1
16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الهدف القضاء خلية في الكروية خلية 3D (الكروية مختلطة من خلايا لوك-GFP-A431 و3T3-RFP). (A) قوائم الجرد الوطنية والحفر (2 J / سم 2) ويظهر النظام. (ب) تكرار الجرد الوطني حفرة القضاء تماما الخلايا المستهدفة (A431-لوك-GFP) مع أي ضرر للخلايا غير المستهدفة (3T3-RFP)، في كروي 3D مختلطة. بار = 200 ميكرون. (C) الكمي لأنشطة وسيفيراز (نسبة RLU)أثبت القضاء التام على الخلايا المستهدفة (ن = 10 الكروية في كل مجموعة). تم تعديل هذا الرقم من 18. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ونحن لشرح طريقة القضاء على خلية معينة من ثقافة خلية 3D المختلطة دون تلف خلايا غير المستهدفة باستخدام الجرد الوطني حفرة. حتى الآن، ليس هناك طريقة عملية لإزالة الخلايا مرة واحدة يتم تأسيس الأنسجة أو بعد الزرع. وهكذا، الجرد الوطني PIT هو وسيلة واعدة لتحقيق ذلك. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية في الجسم الحي 18،22، منذ ناقلات الجنود المدرعة تظهر الدوائية مماثلة لماب نفسها. نوع من الخلايا المستهدفة يمكن تكييفها مع مختلف APC. الأجسام المضادة المختلفة أو شظايا الأجسام المضادة، بما في ذلك مكافحة EGFR، ومكافحة PSMA، ومكافحة mesothelin، ومكافحة CEA استخدمت بالفعل كما ناقلات الجنود المدرعة 15-21. بالإضافة إلى ذلك، تغيير منطقة الجرد الوطني إشعاع يمكن أن تقلل من المنطقة المعالجة. هنا، مع تقدير حجم النشاط وسيفيراز ومضان على الخلايا المستهدفة، وقد أكد القضاء التام على خلايا معينة.

الجرد الوطني PIT هو العلاج بالضوء مقرها، وبالتالي إلى نقطة حرجة هي رانه المسافة بين مصدر الجرد الوطني خفيفة والهدف، لأن الطاقة الضوئية، وبالتالي انخفاض خلية نخر وفقا لقانون التربيع العكسي (الخطوة 3.4). لجعل 3D كروي على وجه التحديد، لوحة ينبغي أن يعامل وحضنت كما بلطف قدر الإمكان. الخلايا التي تحتوي على قطرات بسهولة يتم تدميرها أو تسقط من صدمة قليلا قبل تشكيل الأشكال 3D.

الجرد الوطني حفرة ديها العديد من المزايا الفريدة. أولا، الجرد الوطني حفرة ناقلات الجنود المدرعة إثبات الدوائية عن طريق الوريد مماثلة إلى أجسام الأبوية غير مترافق، نظرا لخصائص ماء من IR700، التي تؤدي إلى غاية محددة ملزمة لاستهداف الخلايا والحد الأدنى من تراكم غير المستهدفة. وهكذا، حتى بعد زرع الأنسجة، ويمكن الجرد الوطني حفرة علاج الخلايا المستهدفة عن طريق الحقن في الوريد من APC تليها تعرض المنطقة التي تهم الجرد الوطني. ثانيا، يمكن الجرد الوطني للضوء تخترق أعمق من ذلك بكثير في الأنسجة من الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء المرئي، لذلك، الجرد الوطني PIT يمكن علاج ليس فقط على السطح ولكن أيضا انتيإعادة سمك الأنسجة المزروعة عن التعرض لقوائم الجرد الوطنية على السطح. وأخيرا، الجرد الوطني PIT يمكن استخدامها مرارا وتكرارا للقضاء على الخلايا المستهدفة سبيل المثال لا الحصر. هذه الطريقة مفيدة عندما الخلايا المستهدفة تعبر عن نسخ كافية من الجزيئات المستهدفة على سطح الخلية 18.

ومع ذلك، هناك عدد قليل من القيود لهذه التقنية. أولا، نفاذية APC محدودة نظرا لأنه هو جزيء كبير. للتغلب على هذه المشكلة، كرر الجرد الوطني حفرة العلاج أو الأجسام المضادة شظايا يمكن استغلال 18،19،22. الحد الآخر هو اختراق الضوء. على الرغم من أن الجرد الوطني للضوء يمكن ان تخترق بشكل صحيح في المختبر الثقافة والترجمة في الجسم الحي العلاج يتطلب النهج تكييفها مثل التنظير الهضمي، القصبات، أو تنظير الصدر المباشر مع البصريات الليفية للتحرك مصدر الضوء أقرب إلى المنطقة المستهدفة.

سوف مزيد من التعديلات من الجرد الوطني حفرة تسمح لاستخدام هذا الأسلوب في الصعيدين المحلي والمواصفاتالقضاء خلية IFIC في العديد من المجالات، مثل تعديل مناعي أو ورم microenvironments 24-26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث من قبل برنامج جماعية البحوث في المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للسرطان، مركز لأبحاث السرطان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, (7381), 295-305 (2012).
  2. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10, (6), 678-684 (2012).
  3. Birchall, M. A., Seifalian, A. M. Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation. Lancet. 6736, (14), 11-12 (2014).
  4. Ben-David, U., Benvenisty, N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat. Rev. Cancer. 11, (4), 268-277 (2011).
  5. Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 143, (4), 508-525 (2010).
  6. Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (35), 3281-3290 (2013).
  7. Miura, K., Okada, Y., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27, (8), 743-745 (2009).
  8. Tang, C., Lee, A. S., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat. Biotechnol. 29, (9), 829-834 (2011).
  9. Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nat. Med. 17, (12), 1685-1691 (2011).
  10. Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy. BMC Cancer. 12, (1), 345 (2012).
  11. Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging. Cancer Res. 72, (18), 4622-4628 (2012).
  12. Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET. J. Nucl. Med. 54, (5), 770-775 (2013).
  13. Sato, K., Watanabe, R., et al. Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Mol. Oncol. 8, (3), 620-632 (2014).
  14. Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Lett. 365, (1), 112-121 (2015).
  15. Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer. Mol. Cancer Ther. 14, (8), 141-150 (2014).
  16. Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PloS one. 9, (11), 113276 (2014).
  17. Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience. Theranostics. 5, (7), 698-709 (2015).
  18. Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine. RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).
  19. Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies. J. Nucl. Med. 56, (1), 140-144 (2014).
  20. Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model. Theranostics. 3, (6), 357-365 (2013).
  21. Shirasu, N., Yamada, H. Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy. Int J Cancer. 135, (11), 1-14 (2014).
  22. Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, (23), 19747-19758 (2015).
  23. Nakajima, T., Sato, K., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC cancer. 14, (1), 389 (2014).
  24. Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 7, (2), 131-142 (2008).
  25. Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 10, (2), 77-88 (2014).
  26. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 12, (4), 252-264 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics