La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

Bioengineering

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Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

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Abstract

Introduction

La eliminación de células específicas sin dañar otras células es extremadamente difícil, especialmente en el tejido establecido, y hay una necesidad urgente de un método de eliminación de células en el campo de la ingeniería de tejidos. Hoy en día en el campo de la medicina regenerativa, cultivos de tejidos utilizando células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes (PSCs), o célula madre pluripotente inducida (iPS) son materiales prometedores de 1 - 3.

Aunque esta regeneración de tejidos es prometedor, la contaminación con células no deseadas es una preocupación importante. Por otra parte, hay un problema de seguridad de la tumorigenicidad después del trasplante 4,5. Aunque muchos estudios se han centrado en estos temas para eliminar células específicas, sobre todo en la medicina regenerativa 6-8, ningún método práctico se ha desarrollado.

photoimmunotherapy infrarrojo cercano (NIR-PIT) es un tratamiento basado en un anticuerpo conjugat-fotoabsorbentee (APC). Una APC consiste en un anticuerpo específico de células monoclonal (mAb) y un fotoabsorbente, IR700. IR700 es un derivado de sílice-ftalocianina hidrofílica y no induce por sí mismo fototoxicidad 9. IR700 está conjugado covalentemente al anticuerpo a través de los residuos de amida en la cadena lateral de moléculas de lisina. La APC se une moléculas diana en la membrana celular y luego se provoca necrosis celular casi inmediata después de la exposición a la luz NIR a 690 nm. Durante la exposición a la luz NIR, se rompe la membrana celular que conduce a la muerte de 9 celdas - 14. NIR-PIT ha demostrado ser eficaz con múltiples anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, incluyendo anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelina, anti-GPC3, y anti-CEA 15-21. Por lo tanto, NIR-PIT se puede utilizar contra una amplia variedad de moléculas diana. Por otra parte, NIR-PIT es un tratamiento bien controlado que permite el tratamiento selectivo de regiones específicas mediante la restricción de la NIR-light irradiación 18,22.

A continuación, presentamos un método de eliminación de células específicas mediante NIR-PIT 3D a partir de cultivos mixtos.

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Protocol

Nota: El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para eliminar las células específicas utilizando NIR-PIT. Controles y otros detalles acerca de NIR-PIT y la viabilidad celular se pueden encontrar en otro lugar 18.

1. Conjugación del IR700 a anticuerpos monoclonales (mAb)

  1. Preparar mAb de interés a 2-5 mg / ml en solución (pH 8,6) 0,1 M Na 2 HPO 4.
  2. Mezclar 6,8 nmol de mAb con 30,8 nmol de IR700 10 mM en M Na 2 HPO 4 solución 0,1 (pH 8,6) en un tubo de microcentrífuga y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr, cubierto con papel de aluminio.
  3. Lavar la columna PD-10 (véase la Tabla de Materiales / Equipos) con 15 ml de PBS, dos veces. Cargar la muestra desde el paso 1.2.
  4. Se purifica la mezcla a través de la columna de la PD-10 por PBS elución de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    Nota: En este caso, la elución fue a lo largo del color de la correa de IR700. Para una muestra de 300 l, fracción de elución de PBS es típicamente entre 2,5 ml a 4,4 ml.
  5. Determina ella concentración de proteínas con la tinción de Coomassie mediante la medición de la absorción a 595 nm con un espectrofotómetro 9. Determinar la concentración de IR700 con absorción a 689 nm para confirmar el número de moléculas de fluoróforo conjugados con cada molécula de mAb 9.
    Nota: Es importante determinar un número óptimo de conjugación de moléculas IR700 en 1 mAb con un espectrofotómetro. Generalmente, alrededor de 3 moléculas IR700 en 1 molécula de mAb es óptimo para tanto in vitro como in vivo en el trabajo. métodos de HPLC y SDS-PAGE se pueden utilizar para confirmar si el MAB y IR700 están obligados o no.
  6. Almacenar a 4 ° C después de la determinación de la concentración de proteína.

2. Preparación de Mixta cultivo celular 3D (Mixed esferoide)

  1. Aplicar agua estéril (alrededor de 1 ml) a la sección de depósito de la placa de colgar placas de caída.
  2. Preparar diversas proporciones de los tipos de células de interés - células A431-luc-GFP y células 3T3-RFP -con cada muestra que contiene 5.000 células totales, en suspensión en 50 l de medio de cultivo.
    Nota: Preparar 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, etc. proporciones de tipos de células de interés en los medios de cultivo en función del tipo de célula.
  3. Incubar la mezcla durante 5-7 días en el pozo colgar la placa de caída 96 en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono. Cambiar los medios de cultivo cada 2 días. Nota: Para que el esferoide 3D, precisamente, manejar suavemente la placa, en forma de gotas que contienen las células se caen fácilmente antes de la formación de formas 3D.
  4. Observar la morfología y el tamaño de los esferoides utilizando un microscopio de campo claro invertida en 10X - 40X aumentos. Nota: Aunque depende de los tipos de células y el tamaño de gota colgante, asegurarse de que el diámetro del esferoide es de alrededor de 400 a 600 micras después de 7 días de incubación en el 96 así colgar la placa de caída.

3. En Vitro NIR-PIT para el cultivo celular mixto 3D

  1. Cambiar el soporte de la HAnging placas gota a 10 g / ml conjugado anticuerpo-fotoabsorbente (APC) medios que contienen, y se incuba durante 6 horas en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono.
  2. Después de 6 horas de incubación, lavar el esferoide dos veces con medio de cultivo fresco (sin rojo fenol). transferir suavemente el esferoide a un plato con fondo de vidrio de 50 mm con 100 l de fenol fresco medio de cultivo libre de rojo utilizando una punta de pipeta de 200 l estéril con la punta cortada. Coloque un esferoide en cada plato.
  3. Observe el esferoide con un microscopio de campo claro invertida para detectar el cambio de la morfología. Para observar los reporteros ópticos (por ejemplo, GFP y RFP) utiliza el microscopio de fluorescencia con los siguientes ajustes de filtro: GFP - filtro de excitación de 469 nm y de emisión de 525 nm; RFP - 559 nm filtro de excitación y 630 nm de emisión filtro.
  4. Coloque el diodo emisor de luz (LED) por encima del plato con fondo de cristal para la irradiación.
    Nota: Los esferoides pueden estar expuestos a NIRla luz ya sea en el microscopio o en la campana laminar.
    1. Medir la densidad de potencia de la luz NIR con un medidor de potencia óptica 9. De acuerdo con esta medida, irradiar luz NIR a través de diodos emisores de luz (LED) que emiten luz en longitudes de onda de 670 a 710 nm a 2 J / cm2.
      Nota: La luz del LED puede penetrar en la profundidad máxima de aproximadamente 5 pulgadas. Los efectos citotóxicos de NIR-PIT sólo depende de energía dada, independientemente de la densidad de potencia y duración de la exposición 23.
  5. Después de la irradiación, la transferencia de la esferoide en una nueva placa de gota colgante con 50 l de medio de cultivo fresco y se incuba durante 1 día en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono.
  6. transferir suavemente el esferoide a un plato con fondo de vidrio con 100 l de medio de cultivo fresco (sin rojo fenol) usando una punta de pipeta de 200 l estéril con la punta cortada. Observar el esferoide con un microscopio de fluorescencia después de 1 día NIR-PIT usando filtro ajustes descritos en el paso 3.3.
    1. Detectar las células muertas mediante la adición de yoduro de propidio a los medios a una concentración final de 2 mg / ml, o por la pérdida de GFP-citoplasmática de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 2B) 14,18,22.
  7. Repita los pasos 3.1-3.6 si las células diana no se eliminan por completo.

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Representative Results

Para monitorizar ópticamente el efecto de NIR-PIT, la línea celular A431, que sobreexpresa el EGFR, fue modificado genéticamente para expresar también GFP y luciferasa (luc-A431-GFP). Como que no son objeto de NIR-PIT, la línea de células Balb / 3T3 se modificó para expresar ópticamente RFP (3T3-RFP). La APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), se sintetizó. Esferoides mixtos, que se componen de diversas relaciones de células (A431-luc-GFP y 3T3-RFP) se fabricaron de acuerdo con este protocolo (Figura 1). Repetida NIR-PIT se realizó con la incubación de pan-IR700 (ver régimen en la Figura 2A). Target eliminación de células de este cultivo mixto 3D se consiguió y se controló con las actividades de fluorescencia y de luciferasa (Figura 2B, C). Por otro lado, las células no objetivo continuaron creciendo.

Figura 1
16 años. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Target eliminación celular en esferoides de células 3D (esferoides mixtos de células A431-luc-GFP y 3T3-RFP). (A) NIR-PIT (2 J / cm 2) se muestra régimen. (B) La reincidencia en NIR-PIT eliminó por completo las células diana (A431-luc-GFP) con ningún daño a las células no diana (3T3-RFP), en un esferoide 3D ​​mixto. Bar = 200 micras. (C) Cuantificación de actividades de luciferasa (relación RLU)demostrado la eliminación completa de las células diana (n = 10 esferoides en cada grupo). Esta cifra ha sido modificado a partir de 18 años. Los datos se expresan como medias ± SEM favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se demuestra un método de eliminación de células específica de un cultivo celular mixto 3D sin daño a las células no diana mediante el uso de NIR-PIT. Hasta ahora, no hay ningún método práctico de eliminación de células una vez establecido el tejido o después del trasplante. Por lo tanto, NIR-PIT es un método prometedor para lograr esto. Esta técnica podría utilizarse también in vivo 18,22, ya que las CPA muestran una farmacocinética similar a sí mismo mAb. El tipo de célula diana puede ser adaptado con varios APC. Varios anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, incluyendo anti-EGFR, anti-PSMA, anti-mesotelina, y anti-CEA ya se utilizaron como APC 15-21. Además, el cambio de la región de NIR-irradiación puede minimizar la región tratada. Aquí, con la cuantificación de la actividad de la luciferasa y la fluorescencia en las células diana, se confirmó la eliminación completa de las células específicas.

NIR-PIT es una terapia basada en la luz, por lo tanto es un punto crítico tque la distancia entre la fuente de luz NIR y el objetivo, ya que la energía de luz y por lo tanto disminución de necrosis celular de acuerdo con una ley del cuadrado inverso (paso 3.4). Para hacer que el esferoide 3D, precisamente, la placa debe ser tratada y se incubó la mayor suavidad posible. Las células que contienen gotas fácilmente se destruyen o se caigan por un pequeño choque antes de formar figuras en 3D.

NIR-PIT tiene varias ventajas únicas. En primer lugar, NIR-PIT APCs demostrar la farmacocinética intravenosa similar a los anticuerpos no conjugados parentales, debido a las características hidrófilas de IR700, que conducen a la unión altamente específica a las células diana y la acumulación no diana mínima. Por lo tanto, incluso después del trasplante del tejido, NIR-PIT puede tratar células diana a través de inyección intravenosa de la APC seguido de la exposición de la región de interés a NIR. En segundo lugar, NIR-luz puede penetrar más profundamente en el tejido de luz UV o visible, por lo tanto, NIR-PIT podría tratar no sólo la superficie, sino también la entire espesor del tejido trasplantado por la exposición a NIR en la superficie. Finalmente, NIR-PIT se puede utilizar varias veces para eliminar las células diana sin limitación. Este método es útil cuando las células diana expresan suficientes copias de moléculas diana en la superficie celular 18.

Sin embargo, hay algunas limitaciones a esta técnica. En primer lugar, la permeabilidad de la APC se limita ya que es una molécula grande. Para superar este problema, el tratamiento repetido o de anticuerpos fragmentos NIR-PIT pueden ser explotados 18,19,22. Otra limitación es la penetración de la luz. Aunque el NIR-luz puede penetrar adecuadamente la cultura, la traducción al tratamiento in vivo requeriría enfoques adaptados como la endoscopia digestiva, broncoscopía o toracoscopia directo con la fibra óptica para mover la fuente de luz más cerca de la región diana in vitro.

Otras adaptaciones de NIR-PIT permitirán la utilización de este método en tanto locales como de especificacionesla eliminación de células IFIC en muchos campos, como la inmunomodulación o tumor microambientes 24 - 26.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

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