Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J. Vis. Exp. (108), e53673, doi:10.3791/53673 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

omuriliğe uzun inen lifler lokomosyon, ağrının algılanması ve diğer davranışları için çok önemlidir. Bu lif sistemlerinin çoğunluğunun omurilik fiber sonlandırma desen iyice herhangi türde araştırılmamıştır. omurilik proje serotonerjik lifler, histolojik bölümlerde sıçanlar ve opossum incelenmiştir ve fonksiyonel önemi omurilikte kendi fiber sonlandırma desen çıkarılabilir dayanmaktadır. CLARITY ve KÜBİK tekniklerinin gelişmesiyle birlikte, lif sistemi ve serotonerjik supraspinal yolların önceden bilinmeyen özelliklerini ortaya çıkarmak için büyük olasılıkla omurilik dağıtımını, araştırmak mümkündür. Burada, kombine açıklık ve KÜP teknikleri kullanarak fare omurilik serotonerjik lifler görüntüleme için ayrıntılı bir protokol sağlar. yöntem combin ile doku hidrojel solüsyonu ve aydınlatılması ile bir fare perfüzyon gerektirirreaktifler temizleme tirme. Omurilik dokusu hemen altında iki hafta içinde temizlendi ve serotonin karşı sonraki immunofluorescent boyama az on gün içinde tamamlanmıştır. Bir çoklu foton floresan mikroskop ile, doku taranmış ve bir 3D görüntü OsiriX yazılımı kullanılarak yeniden inşa edildi.

Protocol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri tüm işlemler (onaylı ACEC numarası 14 / 94A ise) New South Wales Üniversitesi'nde Hayvan Bakım ve Etik Komitesi (ACEC) yönergeleri izleyin.

Şeffaf Fare Omurilik 1. Hazırlık

  1. Buz Hidrojel Çözüm hazırlanması
    1. % 16 paraformaldehit solüsyonunun hazırlanması (PFA)
      1. 70 ml önceden ısıtılmış damıtılmış su (50-55 ° C) içine 16 g paraformaldehit tozu eklenir ve paraformaldehit çözünene kadar ısıtılmış bir manyetik karıştırıcı üzerinde karıştırılmıştır. Not: çözüm üzerinde 55 ° C ısı ve paraformaldehit zehirli olduğunu unutmayın izin vermeyin.
      2. bir silindir paraformaldehit çözeltisini ve 100 ml damıtılmış su ilave edilir. 4 ° C buzdolabı kullanarak paraformaldehit çözümü soğutun.
    2. su distile 26.25 ml 125 mg VA-044 başlatıcı eritin ve 4 çözümü serinC buzdolabı °.
    3. Serin 5 mi akrilamid çözeltisi (% 40), 1.25 ml bis çözeltisi (% 2) (DİKKAT: Bis ve akrilamid çözeltiler genetik bozukluklar veya kanser neden olabilir, toksik), 5 mi 10x PBS, 12.5 mi% 16 PFA çözeltisi ve buz üzerinde VA-044 başlatıcı çözeltisi.
    4. buz üzerinde yukarıdaki çözümler karıştırın.
      Not: toplam hacim 50 ml.
  2. Fare Omurilik Perfüzyon ve Koleksiyon
    1. % 0.9 normal serum fizyolojik içinde seyreltildi ketamin (80 mg / kg) ve xyzaline (5 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezi uygulayın. Fare dozaj fareler için daha düşük olabilir.
    2. Fare ayak derisine bir tutam yanıt vermiyor bir kez davlumbaz uygun bir plastik yüzeyde, (yapışkan bant etkilidir) vücuttan uzak fare uzuvlarını düzeltmek.
    3. göğüs üzerine fare deri kesme ve daha sonra kemik göğüs makas ile kalp maruz.
    4. 25 G iğne th bağlanmış olan, bir peristaltik pompa kullanılarakboru e ucu, kalbin sol ventrikül içine iğneyi yaklaşık olarak 10 ml / dk bir oranda kan için bir çıkış noktası ve daha sonra 40 ml% 0.9 normal serum fizyolojik ile yıkanarak başlatmak için sağ atrium makasla kesme.
    5. Tamamlandığında, 35 ml buzlu soğuk hidrojel solüsyonu ile fare serpmek.
      Not: 10 ml'lik bir hızda serpmek / dakika sinir dokusunun şişmesini önlemek için.
    6. Bir bıçak ile arka üzerindeki deriyi insizyon ve daha sonra omurgalı yanındaki kasları kaldırın. Bir tarafta vertebra kemerler kesme ve diğer tarafa, onları saygısız sonra, ince bir makas ile vertebral kolonun dışına omurilik alır.
  3. Fare Omurilik Takas
    1. gece boyunca 4 ° C 'de hidrojel çözeltisi 15 ml omurilik yerleştirin.
    2. Hidrojel çözeltisi 10 ml çıkarın ve 5 ml tüp omurilik segmentleri ile çözeltinin geri kalanı dökün. tamamen dolana kadar hidrojel çözeltisi ile 5 ml tüp doldurun.
    3. 5 ml tüp üstünden parafilm küçük bir parça gerin ve sonra tüpün boynuna parafilm sarın. Not: parafilm kontaklar hidrojel çözümü sağlayın ve hidrojel çözüm ve parafilm arasında hiçbir kabarcıkları vardır.
    4. 37 5 ml tüp koymak   ° C fırın gece boyunca karıştırılmıştır. Bir jel olana dek hidrojel çözümü gözlemleyin.
    5. fırın dışına 5 ml tüpü alın ve (örneğin bir shoveled 1 ml'lik pipet gibi) bir anahtarla tüpten jel çıkarın. jele kaba doku yapışmasını tarafından omurilik dokusu jel çıkarın ve sonra (jel dokusuna sadık olacaktır ve bu nedenle doku tarafından silinecektir) uzakta kaba doku alır.
    6. omurilik dokusu jelin çıkarılmasından sonra, bir çalkalayıcı üzerinde 24 saat boyunca 1 x PBS (pH 7.4) ile Omurilik 4 kez yıkayın.
    7. 3.85 gr üre ve 3.85 g N, N, N ', N'-tetrakis- (2-hidroksipropil), etilendiamintetraasetat eritilmesi kübik temizleme çözeltisi hazırlayın5.38 ml ine damıtılmış su.
      Not: Bir sıcak karıştırıcı kullanılır. açık ve oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra solüsyona 2.31 g polietilen glikol mono-p-isooctylphenyl eter / Triton X-100 ilave edin.
      Not: Bu, üç kimyasal 10 g bir fare için geçerlidir.
    8. bir jilet ile 2-3 mm uzunluğunda bölümler halinde koronal fare omurilik kesin ve yukarıda KÜP temizleme çözeltisi, 5 ml içine koydu. 37 ° C'de bir fırında, bir karıştırıcı üzerine yerleştirin   3 gün boyunca ° C.
    9. Üç gün sonra, yeni bir birine takas çözümü değiştirin. Not: Yukarıdaki çözelti, kullanımdan önce hazırlanmıştır.
    10. İki üç gün sonra KÜBİK takas çözümü ferahlatıcı sonra, yazı 8 harflerle bir kağıda karşı doku şeffaflık kontrol edin. şeffaf ise, harfler temizlenir doku yoluyla görülebilir. (% 0.1 Triton-X100) Doku günde 4 kez (her 6 saatte bir) yıkamak için temizleme çözeltisini çıkarın ve PBST 4 ml.

  1. 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde 3 gün: Primer antikor solüsyonu omurilik segmentleri inkübe (PBST içinde 100, anti-serotonin, tavşan içinde yetiştirilmiş, 1 seyreltilmiş).
  2. Antikor çözeltisi çıkarın ve PBST 4 ml (% 0.1 Triton-X100) 37 ° C bir fırında spinal kord günde 4 kez (her 6 saat) yıkayın.
  3. 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde, 3 gün boyunca doku inkübe etmek: PBST solüsyonu çıkarın ve ikincil antikor solüsyonu (PBST içinde 100 594 konjuge keçi anti-tavşan IgG, 1 seyreltilmiş).
  4. ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde günde spinal kord 4 kez yıkama (her 6 saatte bir) PBST 4 ml. Ertesi gün doku görüntüleme için hazırdır.

3. Görüntüleme

  1. PBST solüsyonu çıkartın ve doku kırılma indeksi yapmak için% 85 gliserol 4 ml.
  2. Omurilik dokusu yanında% 85 gliserol birkaç damla koyun ve bir 22 x 50 mm, 2 lamel camının ile lamel.
    Not: omurilik oryantasyon görüntü benziyor nasıl karar verir.
  3. çoklu foton floresan mikroskop tutma çerçevesi üzerine cam slayt koyun ve hafif yolun içine doku taşıyın.
  4. Helyum Neon lazer hattı 594 nm seçin ve canlı görüntüde olumlu bir sinyal parlaklığını kontrol ederek optimum seviyeye lazer yoğunluğunu ayarlayın.
  5. (Suda, NA 0.7) 20X objektif kullanılarak omurilik dokusu tarama alanı seçin ve z-yığını oluşturmak için hazırlamak, ve 3 mikron ayarlanmış her adımda derinliği.
  6. 20X objec altında z yığının alt üst doku tarayıntif ve (yağda, NA 1.4) sonra 63X objektif sırasıyla (adım büyüklüğü 1 mikron idi). 3D yazılımını 28 kullanarak 3D videoları yeniden yapılandırma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu bölüm, açıklık ve KÜP protokollerin bir kombinasyonu kullanılarak şeffaf bir fare omurilik serotonin antikor boyama sonuçlarını gösterir. Biz (aynı zamanda Video 1 bakınız Şekil 1) serotonerjik lifler ventral boynuz ventral kısmında üstünlüğü ile omuriliğin tüm lamina mevcut olduğunu göstermektedir. kontrol doku pozitif lifler (sonuç gösterilen değil) yoktu. Ventral boynuz olarak, yoğun dolu serotonerjik lifler ventral boynuz ventromedial kısmında bulunur ve bunlar ventral boynuz lateral kısmına doğru uzanan (Şekil 2, aynı zamanda video 2'ye bakınız). Bazı immünopozitif lifler de dorsal boynuz veya merkezi kanalına doğru ventral boynuz uzanır. Immünopozitif lifler dorsal boynuzu tüm tabakalar içinde mevcut olan fakat pozitif lifler arasında küçük bir boşluk, özellikle yanal olarak, tabakanın 2 ve 4'de olduğudorsal boynuz parçası. Dorsal boynuz serotonerjik liflerin çoğunluğu, küçük çaplı ve bunların sadece küçük bir büyük çaplı (Video 1) vardır. yatay bölümünde, ventral boynuzda yoğun şekilde paketlenmiş serotonerjik lifler, omurilikte uzunlamasına ekseni boyunca ve geniş bir elyaf demeti oluşturmak için gözlenmiştir. En ilginç bulgu bu büyük elyaf demeti elyaf demeti dik düzenli uzunlamasına eksen boyunca dalları, sorunları olmasıdır. Bu dallar daha ventral boynuz lateral kısmına kendi yolları boyunca collateralize. Bu dalları ile karşılaştırıldığında, orta hatta doğru uzanan olanlar düzensiz ve daha küçük (Şekil 2). 63x objektif altında, arka boynuzda serotonerjik lifler omurilik ekseni boyunca ve sistemin yol boyunca çeşitli noktalarda sonlandırmak için gözlenmiştir. Kalın lifler düzensiz ince f arasında dağıtılır Ibers (Şekil 3, aynı zamanda video 3).

Şekil 1
Şekil 1:. 200X büyütme Sol Lomber kablosunun bir koronal bölümünde serotonin lifler sağ dorsal boynuz, dorsal spinal kord medial parçası olduğunu ve ventral omurilik lateral parçasıdır ventral boynuz olduğunu. Ölçek çubuğu 100 mm. Serotonerjik lifler özellikle lif yoğunluğu yüksek ventral boynuz ventromedial bölümünde, tüm lamina bulunur. Bu lifler ventral boynuz lateral ve merkezi kanal veya dorsal boynuz hem doğru uzanır. Diğer tabakanın lif yoğunluğu düşüktür. Serotonerjik liflerin çoğunluğu incedir. Sadece bir lif az sayıda kalın ve dorsal boynuzu ve ventral boynuz (her ikisi de görülür> Ayrıca video 1'e bakınız) (Sağ indirmek için tıklayın).

şekil 2
Şekil 2:. Ventral 200X büyütme Sol ventral boynuz kısmı ve sağ serotonin lifler, omurilikte lateral tarafı, sırt omuriliğin rostral parçası olduğunu ve ventral omurilik kuyruk kısmıdır. Ölçek çubuğu 100 mm. Serotonerjik lifler, omurilikte uzunlamasına ekseni boyunca hareket eden gösterilen ve kalın bir elyaf demeti oluşturur Karın boynuzuna mediyal kısmından paketlenir. orta hatta doğru uzanan, diğerleri düzensiz ve kısa iken bu paket dışında, bazı dalları, ventral boynuz lateral kısmına doğru düzenli aralıklarla genişletilmiştir. Bu lifler yolu yol boyunca birçok noktada sonlandırmak ( ayrıca video 2 bakınız) (Sağ indirmek için tıklayın).

Şekil 3,
Şekil 3: 630X büyütmede altında dorsal boynuzunda serotonin lifler Sol sağ omurilik, dorsal ve ventral sırasıyla dorsal ve dorsal boynuz ventral kısmına bakınız medial parçası, omurilik lateral parçasıdır. . Ölçek çubuğu 7 mm. Serotonerjik lifler, omurilikte uzunlamasına ekseni boyunca hareket eden ve sistem yolu boyunca uzanarak. Bu lifler içe kalın liflerin küçük bir sayı ile özellikle küçük çapa sahiptirler. Bu lifler nadiren birbiriyle örtüşen ( aynı zamanda video 3'e bakınız (Sağ) indirmek için tıklayınız ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

protokol kombine CLARITY ve KÜP teknikleri ile fare omurilik görüntü serotonerjik lifleri nasıl gösterir nitelendirdi. Bu Cheung vd. 14 ve TÖMER'ler ve ark., 15 tarafından geliştirilen pasif temizleme protokolüne göre daha hızlı bir temizleme işlemi sunar ve omurilik dokusu de temizleme esnasında hidrojel tarafından desteklenmesi sağlar.

Cheung ve ark., 14 ve Tomer ark. 15 tarafından bildirilen fare omurilik sabitlenmesi sırasında önemli bir adım, tüm çözümler kimyasalların polimerizasyonu engelleyen buz üzerinde serin tutmaktır. Diğer önemli bir adım sinir dokusunun şişmesini önlemek için hidrojel çözeltisi yavaşça fare serpmek için. hidrojel çözüm jel olabilmesi için, gaz alma gereklidir. Buna alternatif olarak, hyd arasında hava kabarcıkları tüpünün üst kapak parafilm kullanılır ve solRogel çözeltisi ve Parafilm. Bu çok iyi çalıştı ve hidrojel çözüm birkaç saat sonra bir jel haline geldi. Bazı kabarcıklar jel bulundu rağmen, omurilik dokusu içinde kabarcıkların olmaması ile ortaya konmuştur, aşağıdaki deneylerde, müdahale etmedi. Takas en kritik adımdır ve reaktif bir arada gerektirir. Amino-alkol içeren temizleme çözümü, orijinal CLARITY protokolü 16 kullanılan SDS / borik asit bazlı temizleme solüsyonu çok daha hızlı omurilik dokusu lipid kaldırır.

Geleneksel immünohistokimyasal tekniklerle üzerinde CLARITY ve CUBIC avantajı tüm doku bloğu bir sonucu olarak, serotonerjik liflerin süreklilik korunur, doku kesit olmadan görüntülü olabilir ki, ve uzun bir mesafeye aynı fiber takip etmek mümkündür z-yığınının içinde. Bu avantajla, teminat güvenle 3D görüntülerle tespit edilebilir, birND, yeni sonuçlar dolayısıyla serotonin yolaklarının doğası hakkında yapılabilir. açıklanan protokol sadece spesifik antikorlar ile doku etiketleme yoluyla lif sistemleri yanı sıra, çekirdeklerin araştırılması için uygun bir araçtır. Bu teknik aynı zamanda ikili ya da üçlü etiketleme kullanarak aynı fare beyninde farklı sistemleri sorgulamak için ideal bir seçimdir. Bizim laboratuvar ortamında, bir çoklu foton floresan mikroskop yaklaşık 300 mikron bir çalışma mesafesi ile kullanılabilir. doku her iki tarafı da taranır, bu 600 um'lik bir en üst düzeye görseli sınırlar. Ancak, hafif bir tabaka floresan mikroskop, tam genişlik, uzunluk ve derinliği ile görüntü tüm fare beyni ve omuriliği yapabilirsiniz. Bu tekniğin diğer bir avantajı antikorlar elüte edilebilir ve daha sonra başka bir farklı antikor veya antikorlar, aynı doku tekrar uygulanmıştır olmasıdır. Bu hayvan kullanımını önemli ölçüde yanı sıra yeni beyin dokusunu hazırlanması ile ilgili maliyetlerini azaltırHer bir deney için. Aynı nedenle, bu teknik, diğer dokulara tatbik edilebilir. Zaten akciğerler, böbrekler, kalp, bağırsak, ve tümör dokusu 26,27 üzerinde yapılan çalışmalar olmuştur.

Ayrıca bu tekniğin sınırlamalar vardır, örneğin, fare Beyin içinde rafe çekirdekleri GABAerjik nöronlar da dahil olmak üzere nöronların çok çeşitli içerir. AÇIKLIK ve CUBIC tek bir fare beyin ve omurilikte raphespinal liflerin farklı tiplerine göre dağılım çalışma için izin verecektir rağmen. onların nörotransmitter veya protein belirteçler tarafından özel olarak tespit edilmemiş olanlar nöronlar, bu ortamda tespit edilemez. Alternatif bir tür, in situ melezleme gibi nükleik asit probları ile belirli bir nöron veya lif sistemleri nitelemektedir. Bu etiketleme sistemi ve flüoresan görüntüleme için uygun filtreler ile sınırlı Öte yandan, bir. tüm raphespinal lifleri Görüntüleme nedenle bir sorun olmaya devam etmektedir.Bu teknikler, bir anterograde izleyici intrakranial enjeksiyonu ile kombine olsaydı (örneğin Phaseolus vulgaris leucoagglutinin olarak - PHA-L), serotonerjik lifler, GABAerjik lifleri ve diğerleri görmek mümkün olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution Bio Rad 161-0140 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution Bio Rad 161-0142 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde Sigma 158127 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea Merck Millipore 66612 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine Merck Millipore 821940 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100 Merck Millipore 648462 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose Sigma S0389 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody Merck Millipore AB938 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate Life Technologies  A-11012 https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope Leica Leica TCS SP5 MP STED http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44, (6), 1039-1057 (1980).
  2. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Struct Funct. 215, (3-4), 159-186 (2011).
  3. Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn. Brain Res. 618, (1), 95-108 (1993).
  4. Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection. Brain Res. 238, (1), 117-126 (1982).
  5. Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus. Neuroscience. 142, (3), 893-903 (2006).
  6. Bullitt, E., Light, A. R. Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X. J Comp Neurol. 286, (2), 231-242 (1989).
  7. Jones, S. L., Light, A. R. Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study. J Comp Neurol. 297, (2), 267-282 (1990).
  8. Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study. J Neurocytol. 20, (4), 310-322 (1991).
  9. Morrison, S. F., Gebber, G. L. Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons. J Neurophysiol. 53, (3), 759-772 (1985).
  10. Barman, S. M., Gebber, G. L. The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord. Brain Res. 441, (1-2), 371-376 (1988).
  11. Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity. J Comp Neurol. 208, (1), 67-84 (1982).
  12. Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique. Brain Res Bull. 9, (1-6), 271-278 (1982).
  13. Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels. Brain Res. 223, (2), 237-255 (1981).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, (7449), 332-337 (2013).
  15. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protoc. 9, (7), 1682-1697 (2014).
  16. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, (3), 726-739 (2014).
  17. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neurosci. 16, (8), 1154-1161 (2013).
  18. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protoc. 7, (11), 1983-1995 (2012).
  19. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosci. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, (6), 1364-1368 (2013).
  21. Ertürk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  22. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17, (12), 596-599 (2013).
  23. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. NeuroImage. 101, 625-632 (2014).
  24. Ando, K., et al. Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D. Acta Neuropathol. 128, (3), 457-459 (2014).
  25. Zhang, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. (2015).
  26. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 781 (2015).
  27. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  28. Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics