Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Neuroscience

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Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J. Vis. Exp. (108), e53673, doi:10.3791/53673 (2016).

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Abstract

Las fibras largas de descender a la médula espinal son esenciales para la locomoción, la percepción del dolor, y otros comportamientos. El patrón de terminación de fibras en la médula espinal de la mayoría de estos sistemas de fibra no se han investigado a fondo en cualquier especie. fibras serotoninérgicos, que se proyectan a la médula espinal, se han estudiado en ratas y zarigüeyas en secciones histológicas y su significado funcional se ha deducido en base a su patrón de terminación de fibras en la médula espinal. Con el desarrollo de la claridad y técnicas cúbico, es posible investigar este sistema de fibras y su distribución en la médula espinal, que es probable que revelar características hasta ahora desconocidas de las vías supraespinales serotoninérgicos. A continuación, ofrecemos un protocolo detallado para obtener imágenes de las fibras serotoninérgicos en la médula espinal de ratón usando la claridad combinado y técnicas cúbicos. El método consiste en la perfusión de un ratón con una solución de hidrogel y la clarificación del tejido con una combinación de la limpieza de los reactivos. el tejido de la médula espinal fue despejada en menos de dos semanas, y la posterior tinción de inmunofluorescencia contra la serotonina se completó en menos de diez días. Con un microscopio de fluorescencia multi-fotón, el tejido fue escaneada y una imagen 3D se reconstruyó usando software Osirix.

Protocol

Ética Declaración: Todos los procedimientos que involucran sujetos animales siguen las directrices del Comité de Cuidado de Animales y Ética (ACEC) en la Universidad de Nueva Gales del Sur (el número ACEC aprobado es de 14 / 94A).

1. Preparación de la cuerda del ratón transparente espinal

  1. Preparación de hielo solución de hidrogel frío
    1. Preparación de solución de paraformaldehído al 16% (PFA)
      1. Añadir 16 g de polvo en 70 ml de paraformaldehído-calentado previamente en agua destilada (50-55 ° C) y se agita en un agitador magnético se calienta hasta que se disuelva paraformaldehído. Nota: No permita que la solución se caliente más de 55 ° C y tenga en cuenta que paraformaldehído es tóxico.
      2. Transferir la solución de paraformaldehído a un cilindro y añadir agua destilada hasta 100 ml. Se enfría la solución de paraformaldehído usando un 4 ° C refrigerador.
    2. Disolver 125 mg iniciador VA-044 en 26,25 ml de agua destilada y se enfría la solución en un 4° C nevera.
    3. solución fresca 5 ml de acrilamida (40%), 1,25 ml de solución de bis (2%) (PRECAUCIÓN: Bis y soluciones de acrilamida son tóxicos, puede causar defectos genéticos o cáncer), 5 ml 10x PBS, solución PFA 12,5 ml 16%, y el solución de iniciador VA-044 en hielo.
    4. Mezclar las soluciones anteriores en hielo.
      Nota: el volumen total es de 50 ml.
  2. Perfusión y la Colección de la cuerda del ratón espinal
    1. Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg / kg) y xyzaline (5 mg / kg) diluido en solución salina normal al 0,9%. La dosificación para el ratón puede ser inferior a la de las ratas.
    2. En una superficie de plástico adecuado en una campana extractora, fijar las extremidades del ratón fuera del cuerpo (cinta adhesiva es eficaz) una vez que el ratón no responde a una pizca de su piel del pie.
    3. Cortar la piel del ratón sobre el pecho y luego el pecho hueso para exponer el corazón con una tijera.
    4. Usando una bomba peristáltica, con una aguja de 25 G unida a the extremo del tubo, inserte la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón, snip la aurícula derecha para crear un punto de salida para la sangre y luego comenzar el lavado con solución salina normal 40 ml de 0,9% a razón de aproximadamente 10 ml / min.
    5. Cuando se haya completado, perfundir el ratón con 35 ml de solución de hidrogel de hielo frío.
      Nota: la perfusión a una velocidad de 10 ml / min para evitar la hinchazón del tejido nervioso.
    6. Incisión en la piel sobre la parte posterior con una cuchilla y luego retire los músculos al lado del vertebrado. Después de cortar los arcos vertebrales en un lado y dándoles la vuelta hacia el otro lado, tomar la médula espinal de la columna vertebral con una multa de tijera.
  3. Borrado de la cuerda del ratón espinal
    1. Coloque la médula espinal en 15 ml de solución de hidrogel durante la noche a 4 ° C.
    2. Eliminar 10 ml de la solución de hidrogel y verter el resto de la solución con los segmentos de la médula espinal a un tubo de 5 ml. Llenar el tubo 5 ml con la solución de hidrogel hasta que esté completamente lleno.
    3. Estirar un pequeño trozo de Parafilm sobre la parte superior del tubo de 5 ml y luego envolver Parafilm alrededor del cuello del tubo. Nota: Asegúrese de que los contactos parafilm la solución de hidrogel y no haya burbujas entre la solución de hidrogel y la parafina.
    4. Poner el tubo de 5 ml en un 37   ° C horno durante la noche. Observe la solución de hidrogel hasta que se convierte en un gel.
    5. Tome el tubo de 5 ml del horno y quitar el gel del tubo con una llave (tal como una punta de pipeta 1 ml pala). Quitar el gel a partir del tejido de la médula espinal por pegar el tejido grueso para el gel y luego tomar el papel grueso de distancia (el gel se adhiere al tejido y, por tanto, será eliminado por el tejido).
    6. Después de quitar el gel a partir del tejido de la médula espinal, lavar la médula espinal 4 veces con 1 x PBS (pH 7,4) durante 24 horas en un agitador.
    7. Preparar la solución de limpieza CUBIC disolviendo 3,85 g de urea y 3,85 g de N, N, N ', N'-tetrakis (2-hidroxipropil) ethylenediamine en 5,38 ml de agua destilada.
      Nota: Se utiliza un agitador caliente. Añadir 2,31 g de polietilenglicol mono-p-isooctilfenil éter / Triton X-100 a la solución una vez que es claro y se enfría a temperatura ambiente.
      Nota: 10 g de estos tres productos químicos son de un ratón.
    8. Cortar la médula espinal de ratón coronal en 2-3 mm de largo segmentos con una hoja de afeitar y ponerlas en 5 ml de la solución de aclaramiento CÚBICO anteriormente. Colocar en un agitador en el horno a 37   ° C durante 3 días.
    9. Tres días más tarde, cambiar la solución de intercambio de información para una nueva. Nota: la solución anterior se prepara antes de su uso.
    10. Dos o tres días más tarde después de actualizar la solución de aclaramiento cúbico, comprobar la transparencia del tejido contra un papel con tipo de letra 8 letras. Si es transparente, las letras se pueden ver a través del tejido despejado. Eliminar la solución de compensación y añadir 4 ml de PBST (0,1% Triton-X100) para lavar el tejido 4 veces al día (cada 6 horas).

  1. Incubar los segmentos de la médula espinal en la solución de anticuerpo primario (anti-serotonina, criado en conejo, diluido 1: 100 en PBST) durante 3 días en un agitador en un horno de 37 ° C.
  2. Eliminar la solución de anticuerpo y añadir 4 ml de PBST (0,1% Triton-X100) para lavar los segmentos de la médula espinal 4 veces al día (cada 6 horas) en un horno a 37 ° C.
  3. Quitar la solución PBST y agregar la solución de anticuerpo secundario (conjugado de cabra 594 IgG anti-conejo, diluido 1: 100 en PBST) incubar el tejido durante 3 días en un agitador en un horno de 37 ° C.
  4. Retirar la solución de anticuerpo secundario y añadir 4 ml de PBST para lavar los segmentos de la médula espinal 4 veces al día (cada 6 horas) en un agitador en un horno de 37 ° C. Al día siguiente, el tejido está listo para la imagen.

3. Imaging

  1. Eliminar la solución de PBST y añadir 4 ml de 85% de glicerol para hacer que el índice de refracción del tejido uniforme.
  2. Ponga unas gotas de 85% de glicerol al lado del tejido de la médula espinal y el cubreobjetos con un vaso cubreobjetos 22 x 50 mm 2.
    Nota: La orientación de la médula espinal decide cómo la imagen se parece.
  3. Ponga el portaobjetos de vidrio en el bastidor de soporte del microscopio de fluorescencia de múltiples fotones y mover el tejido en la vía de la luz.
  4. Elija el helio-neón línea de láser 594 nm y ajustar la intensidad del láser al nivel óptimo marcando el brillo de la señal positiva en la imagen en vivo.
  5. Seleccionar el área de escaneo del tejido de la médula espinal utilizando el objetivo 20X (en agua, NA 0,7) y se preparan para crear una pila Z, y la profundidad de cada paso se establece en 3 m.
  6. Analiza el tejido desde la parte superior a la parte inferior de la pila Z bajo el objec 20Xtivo y luego objetivo 63X (en aceite, NA 1,4) (tamaño del paso fue de 1 m), respectivamente. Reconstruir videos en 3D utilizando un software de 3D ​​28.

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Representative Results

Esta sección muestra los resultados de la tinción de anticuerpos de la serotonina en la médula espinal de ratón transparente usando una combinación de la claridad y protocolos cúbicos. Se demuestra que las fibras serotoninérgicos están presentes en todas las láminas de la médula espinal con un predominio en la parte ventral del asta ventral (Figura 1, también ver video 1). El tejido de control no tuvo fibras positivos (resultado no se muestra). En el asta ventral, fibras serotoninérgicos densamente empaquetadas están presentes en la porción ventromedial del asta ventral y se extienden hacia la parte lateral del asta ventral (Figura 2, también ver video 2). Algunas fibras immunopositive también se extienden desde el asta ventral hacia el asta dorsal o el canal central. fibras Immunopositive están presentes en todas las láminas del cuerno dorsal, pero hay un pequeño espacio entre fibras positivas en la lámina 2 y 4, especialmente en el lateralparte del asta dorsal. La mayoría de las fibras serotoninérgicos en el asta dorsal son de pequeño diámetro y sólo un pequeño número de ellos son de gran diámetro (Video 1). En una sección horizontal, se observaron fibras serotoninérgicos densamente empaquetadas en el asta ventral de viajar a lo largo del eje longitudinal de la médula espinal y formar un gran haz de fibras. El hallazgo más interesante es que esta gran haz de fibras emite ramas regularmente a lo largo del eje longitudinal, que son perpendiculares al haz de fibras. Estas ramas más garantías en la obtención largo de sus trayectorias a la parte lateral del asta ventral. En comparación con estas ramas, los que se extienden hacia la línea media son irregulares y más pequeño (Figura 2). Bajo el objetivo 63X, se observaron las fibras serotoninérgicos en el asta dorsal de viajar a lo largo del eje de la médula espinal y terminar en varios puntos a lo largo de la trayectoria de las vías. Las fibras gruesas se distribuyen de forma esporádica entre la delgada f IBERS (Figura 3, véase también el vídeo 3).

Figura 1
Figura 1:. Fibras serotoninérgicos en una sección coronal del espinal lumbar ampliación de 200X izquierda es el asta ventral, a la derecha es el asta dorsal, dorsal es la parte medial de la médula espinal, y el ventral es la parte lateral de la médula espinal. La barra de escala es de 100 micras. fibras serotoninérgicos están presentes en todas las láminas, especialmente en la parte ventromedial del cuerno ventral donde la densidad de fibra es alta. Estas fibras se extienden tanto hacia la parte lateral del asta ventral y el canal o el asta dorsal central. La densidad de las fibras en otro láminas es baja. La mayoría de las fibras serotoninérgicos son delgadas. Sólo un pequeño número de fibras son gruesas y se les ve tanto en el asta dorsal y el cuerno ventral (> También ver video 1 (Haga clic derecho para descargar)).

Figura 2
Figura 2:. Fibras serotoninérgicos en la parte ventral del cuerno ventral en una ampliación de 200X izquierda y derecha son los lados laterales de la médula espinal, dorsal es la parte rostral de la médula espinal, y ventral es la parte caudal de la médula espinal. La barra de escala es de 100 micras. fibras serotoninérgicos se muestran viajando a lo largo del eje longitudinal de la médula espinal y se embalan en la parte medial del cuerno ventral donde forman un haz de fibras de espesor. Fuera de este paquete, algunas ramas se extienden a intervalos regulares hacia la porción lateral de la asta ventral, mientras que otros que se extienden hacia la línea media son irregulares y más corto. Estas fibras terminan en muchos puntos a lo largo de la trayectoria de las vías ( también ver video 2(Haga clic derecho para descargar)).

figura 3
Figura 3: fibras serotoninérgicos en el asta dorsal bajo con un aumento de 630x izquierda es la parte lateral de la médula espinal, a la derecha es la parte medial de la médula espinal, dorsal y ventral consulte la dorsal y parte ventral del asta dorsal, respectivamente. . La barra de escala es de 7 micras. fibras serotoninérgicos están viajando a lo largo del eje longitudinal de la médula espinal y terminan a lo largo de la trayectoria de la vía. Estas fibras son principalmente de pequeño diámetro con un pequeño número de fibras gruesas entremezclado. Estas fibras raras veces se superponen entre sí ( véase también el vídeo 3 (clic derecho para descargar) ).

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Discussion

El protocolo descrito se muestra cómo las fibras de imagen serotoninérgicos en la médula espinal de ratón con la claridad combinado y técnicas cúbico. Se introduce un proceso de compensación más rápido en comparación con el protocolo de compensación pasiva desarrollada por Cheung et al. 14 y Tomer et al. 15 y permite que el tejido de la médula espinal a estar bien apoyado por el hidrogel durante la limpieza.

Un paso importante durante la fijación de la médula espinal de ratón, según lo informado por Cheung et al. 14 y Tomer et al. 15, es mantener todas las soluciones se enfrían en hielo, lo que impide la polimerización de los productos químicos. El otro paso es crítico para perfundir el ratón lentamente con la solución de hidrogel con el fin de evitar la hinchazón del tejido nervioso. Para la solución de hidrogel para convertirse en un gel, se requiere desgasificación. Como alternativa a esto, se utilizó parafina para cubrir la parte superior del tubo y la izquierda no hay burbujas de aire entre la hydsolución Rogel y la parafina. Esto funcionó muy bien y la solución de hidrogel se convirtió en un gel después de unas horas. Aunque algunas burbujas se encontraron en el gel, que no interfieren con los siguientes experimentos, que se demostró por la ausencia de burbujas en el tejido de la médula espinal. La compensación es el paso más crítico, y requiere una combinación de reactivos. La solución de compensación, que contiene amino-alcohol, elimina los lípidos del tejido de la médula espinal mucho más rápido que la solución de SDS / bórico a base de ácido de compensación utilizada en el protocolo original de CLARITY 16.

La ventaja de la claridad y CUBIC sobre las técnicas de inmunohistoquímica tradicionales es que todo el bloque de tejido se pueden obtener imágenes sin seccionar el tejido, como resultado, la continuidad de las fibras serotoninérgicos se retiene, y es posible seguir la misma fibra para una larga distancia dentro de la z-pila. Con esta ventaja, la constitución de garantías se puede con confianza identifica con las imágenes en 3D, unand nuevas conclusiones, por lo tanto se pueden hacer sobre la naturaleza de las vías serotoninérgicas. El protocolo descrito es una herramienta conveniente para la investigación de sistemas de fibra, así como los núcleos, simplemente marcar el tejido con anticuerpos específicos. Esta técnica también es una opción ideal para interrogar a diferentes sistemas en el mismo cerebro del ratón mediante el uso de etiquetado doble o triple. En nuestro laboratorio, un microscopio de fluorescencia multifotónica estaba disponible con una distancia de trabajo de aproximadamente 300 micras. Esto limita nuestra imagen a un máximo de 600 micras si se escanean ambos lados del tejido. Sin embargo, una lámina de microscopio de fluorescencia de luz, pueden tomar imágenes de todo el cerebro y la médula espinal del ratón a través de su anchura, longitud y profundidad. La otra ventaja de esta técnica es que los anticuerpos pueden eluirse y luego otro anticuerpo o anticuerpos diferentes aplicadas de nuevo para el mismo tejido. Esto reduce considerablemente el uso de animales, así como los costos asociados con la preparación de un nuevo tejido cerebralpara cada experimento. Por la misma razón, esta técnica se puede aplicar a otros tejidos. Ya ha habido estudios realizados sobre los pulmones, los riñones, el corazón, el intestino y el tejido tumoral 26,27.

También hay limitaciones a esta técnica, por ejemplo, los núcleos del rafe en el cerebro posterior ratón contiene muchos tipos de neuronas, incluyendo neuronas GABAérgicas. Aunque CLARITY y cúbicas permitirán el estudio de la distribución de los diversos tipos de fibras raphespinal en un solo cerebro de ratón y la médula espinal. Esas neuronas, que no están identificados específicamente por sus neurotransmisores o los marcadores de proteínas, no pueden ser identificados en este contexto. Una alternativa es etiquetar las neuronas específicas o sistemas de fibra con sondas de ácido nucleico tal como en la hibridación in situ. Esto es, por otra parte, limitado por el sistema de etiquetado y los filtros disponibles para formación de imágenes fluorescentes. La formación de imágenes de todas las fibras raphespinal tanto, sigue siendo un desafío.Si estas técnicas se combinaron con una inyección intracraneal de un trazador anterógrado (como Phaseolus vulgaris leucoaglutinina - PHA-L), podría ser posible ver fibras serotoninérgicos, fibras GABAérgicas, y otros.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution Bio Rad 161-0140 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution Bio Rad 161-0142 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde Sigma 158127 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea Merck Millipore 66612 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine Merck Millipore 821940 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100 Merck Millipore 648462 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose Sigma S0389 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody Merck Millipore AB938 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate Life Technologies  A-11012 https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope Leica Leica TCS SP5 MP STED http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

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References

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