Calcification vasculaire des cellules musculaires lisses et imagerie de Aortic calcification et Inflammation

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O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

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Abstract

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde, y compris les États-Unis où elle représente plus de 780.000 décès par an. 1 calcification de l' artère coronaire et la calcification aortique sont les caractéristiques de la maladie athéroscléreuse et servent de solides prédicteurs d'événements cardiovasculaires. 2- 4 Deux principaux types de calcifications vasculaires ont été rapportés chez les adultes: calcification intimale, associée à l' athérosclérose, et médiale (également connu sous le nom Mönckeberg) calcification, associée à une maladie rénale chronique et le diabète 5 intimale calcification se produit dans le cadre de l' accumulation de lipides et de macrophage. infiltration dans la paroi du vaisseau. 5,6 Medial calcification murale se produit indépendamment de l' intima calcification, se localise dans les fibres d' élastine ou des cellules musculaires lisses, et n'est pas associé à un dépôt de lipides ou de l' infiltration des macrophages. 5,7,8 études sur les mécanismes moléculaires de lacalcification vasculaire se sont appuyés sur des systèmes modèles cellulaires et animaux. Modèles de rongeurs pour les maladies atherocalcific comprennent des souris déficientes en soit apolipoprotéine E (ApoE) 9,10 ou récepteur de lipoprotéines de basse densité (LDLR) 11 nourris avec un régime alimentaire riche en matières grasses, alors que les modèles pour la calcification médiale comprennent des souris avec la protéine matricielle Gla (MGP) déficit 12 ou rats qui développent urémie soit par néphrectomie totale près (le modèle de néphrectomie 5 / 6e) ou par exposition à un régime riche en adénine. 13

Ici, le modèle de la calcification vasculaire médiale associée à un déficit MGP se concentre sur. MGP est une protéine extracellulaire qui inhibe la calcification artérielle. 12 mutations du gène MGP ont été identifiés dans le syndrome Keutel, une maladie humaine rare caractérisée par diffuse calcification du cartilage en plus brachytéléphalangie, la perte auditive, et une sténose pulmonaire périphérique. 14-18 Bien que non souvent observé, 19calcification concentrique de plusieurs artères a été décrite dans le syndrome de Keutel. 20 polymorphismes communs dans le gène MGP humaine sont associés à un risque accru de calcification des artères coronaires, 21-23 tandis que les taux circulants plus élevés de MGP non carboxyle, biologiquement inactif prédire la mortalité cardiovasculaire. 24 Contrairement aux humains avec le syndrome de Keutel, les souris déficientes MGP développent un phénotype vasculaire sévère constitué de calcification artérielle spontanée généralisée à partir de deux semaines d'âge et de mourir 6-8 semaines après la naissance en raison de la rupture de l' aorte 12.

Contrairement à ApoE - / - et LDLR - / - souris nourris avec un régime riche en graisses, qui développent la calcification vasculaire intimale à l' inflammation induite par macrophage associée, MGP - / -. Souris développent une calcification vasculaire médial en l'absence d'infiltration macrophagique 11,25 Bien ces résultats suggèrent différents stimuli sous-jacents pour intimAl et une calcification médiane, il y a chevauchement des mécanismes de signalisation qui interviennent dans les deux formes de calcification. 26 De multiples voies de signalisation ont été identifiées qui contribuent à la calcification vasculaire , y compris des médiateurs inflammatoires tels que le facteur de nécrose tumorale-α et d' IL-1 et des facteurs pro-osteogenes tel que Notch, Wnt et une protéine morphogénétique osseuse (BMP) de signalisation 27,28 . Ces voies de signalisation augmentent l' expression des facteurs de transcription liés à runt-facteur de transcription 2 (Runx2) et osterix qui , à son tour , augmentent l' expression des protéines osseuses ( . par exemple, l' ostéocalcine, sclerostin, et la phosphatase alcaline) dans la vasculature que la médiation calcification 28-30 Nous et d' autres ont démontré que la calcification vasculaire observée dans ApoE - / - et LDLR - / - souris nourris avec un régime riche en graisses et spontanée calcification vasculaire observée dans MGP - / - souris dépendent tous de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) signaling, et il est cette voie qui se concentre sur ici. 11,25,31 PGB sont des facteurs ostéogéniques puissants nécessaires à la formation des os et sont connus pour présenter une expression accrue dans l' athérosclérose humaine. 32-34 Des études in vitro ont mis en cause la signalisation BMP dans la régulation l'expression de facteurs ostéogéniques tels que Runx2. 35-37 surexpression du ligand BMP, BMP-2, accélère le développement de la calcification vasculaire chez les souris déficientes en ApoE nourris avec un régime riche en graisses. 38 en outre, l'utilisation de BMP inhibiteurs spécifiques tels signalisation comme LDN-193189 (LDN) 39,40 et / ou Alk3-Fc empêche le développement de la calcification vasculaire dans les deux LDLR - / - souris nourris avec un régime riche en matières grasses et des souris déficientes MGP 11,25.

Les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) ont un rôle essentiel dans le développement de la calcification vasculaire. 30,41,42 La calcification vasculaire médial qui se développe dans la MGP-souris déficientes est caractérisée par une transdifférenciation des CMLV à un phénotype ostéogénique. Perte de résultats MGP en diminution de l'expression de marqueurs CMLV y compris myocardin et alpha actine musculaire lisse, avec une augmentation concomitante des marqueurs ostéogéniques tels que Runx2 et ostéopontine. Ces changements coïncident avec le développement de la calcification vasculaire. 25,43,44

La calcification de l' aorte et de l' inflammation chez les souris sont généralement évaluées en utilisant des techniques histochimiques comme l' activité de la phosphatase alcaline pour la calcification précoce et l' activité ostéogénique de von Kossa et Alizarine coloration rouge pour la fin de la calcification, et des protocoles d' immunohistochimie qui ciblent les marqueurs protéiques macrophage (par ex., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Toutefois, ces techniques d'imagerie standard nécessite le traitement des tissus aortiques dans des sections transversales, ce qui prend du temps et imparfait dû à un biais d'échantillonnage, et sont limitées dans leur capacité à quantifier l'inflammation et calcifications dans l'ensemble de l'aorte. Ce protocole décrit un procédé pour visualiser et de quantifier la calcification artérielle aortique et moyennes ensemble et l' accumulation de macrophages en utilisant fluorescent dans le proche infrarouge (NIR) d'imagerie moléculaire ex vivo. L' invention concerne également un procédé pour la récolte et la mise en culture CMLV aortiques primaires de souris et l' induction de la calcification de murin et CMLV humains in vitro afin de déterminer les mécanismes moléculaires sous - jacents vasculaire calcification. Ces techniques permettent l'investigateur à la fois in vivo et in vitro , des méthodes d'étude des maladies atherocalcific.

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Protocol

Toutes les études avec des souris ont été effectuées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Logement et toutes les procédures impliquant des souris décrites dans cette étude ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation des comités de l'Hôpital général du Massachusetts (Sous-comité sur la recherche de protection des animaux). Toutes les procédures ont été réalisées avec soin pour minimiser la souffrance.

1. Préparation des réactifs

  1. Near-Infrared Imaging Fluorescence de Whole aortes
    Remarque:. Un bisphosphonate dérivé, dans le proche infrarouge sonde d'imagerie par fluorescence peut être utilisée pour marquer une activité ostéogénique dans le système vasculaire par liaison à l' hydroxyapatite 46,47 Sonde d'imagerie de fluorescence cathepsine activé peut servir de marqueur pour protéolytique macrophage et l' activité élastolytique dans le système vasculaire. 9 Afin de permettre l'utilisation simultanée des deux sondes fluorescentes, il est importantd'utiliser des sondes qui sont spectralement distinctes. La notation calcium RIN sera utilisé pour indiquer le proche infrarouge sonde d'imagerie fluorescente et de la cathepsine NIR spécifiques calcification pour indiquer le proche infrarouge sonde d'imagerie fluorescente spécifique à l'activité de la cathepsine.
    1. Préparer les solutions de calcium NIR et de la cathepsine NIR. Selon les protocoles du fabricant, ajouter 1,2 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS) dans le flacon contenant 24 nmol de calcium NIR ou la cathepsine NIR et agiter doucement.
      Remarque: Selon le fabricant, une fois reconstitué avec du PBS, les solutions NIR de calcium et de la cathepsine NIR restent stables pendant 14 jours lorsqu'ils sont stockés dans l'obscurité à 2-8 ° C.
  2. L'isolement et la calcification de Murine Aortic CMLV
    1. Solution Digestion Aortic:
      1. Préparer une solution fraîche (~ 3-5 ml par aorte récoltées) avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 collagénase et 1,25 U / ml élastase 175 U / ml type. Stériliser la solution wvec un système de filtration de 0,22 um entraîné sous vide et maintenir la solution sur de la glace jusqu'à utilisation.
    2. Cellule médias:
      1. Supplément 500 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. Réchauffez les médias à 37 ° C avant utilisation.
    3. Calcification Médias:
      1. Une calcification (NaPhos, utilisé dans des lignées cellulaires de souris):
        1. Supplément 100-500 ml de DMEM (volume en fonction des besoins) avec 10% de sérum bovin foetal, du phosphate de sodium à 2 mM, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. Réchauffez les médias à 37 ° C avant utilisation.

          OU
      2. Calcification B (βGP / Desc / DEX, utilisé dans les deux souris ou des lignées cellulaires humaines):
        1. Supplément 100-500 ml de DMEM (volume selon les besoins) avec 10% de sérum bovin foetal, disodique 10 mM β-glycerophosphate, 50 pg / ml d'acide L-ascorbique, 10nM de dexaméthasone, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. Réchauffez les médias à 37 ° C avant utilisation.

2. Injection de la veine caudale

  1. Avant l'injection de queue, réchauffer les souris sous une lampe de chauffage doux pendant 5 min.
  2. Retiens la souris dans un porte-tube de rongeur. Désinfecter la queue avec un tampon imbibé d'alcool.
  3. Utiliser une aiguille de 30 G pour l'injection veine de la queue. veines Tail sont situés latéralement.
    1. Appliquer une quantité douce de pression vers l'avant sur la seringue que l'aiguille est avancé dans la queue. La veine est accessible une fois la résistance à l'injection est plus présent.
    2. Injecter un volume de 100 pi de calcium NIR et / ou 100 pi de cathepsine NIR à un rythme régulier. A la fin de l'injection, après une pause de 5 secondes, retirer l'aiguille.
  4. Récolter les aortes (voir section 3) 3-24 h après l'injection.

3. Souris Dissection

  • Euthanize souris avec 200 mg / kg par injection intrapéritonéale de pentobarbital.
  • Poser le supination animal sur le plateau de dissection et de stabiliser en collant chaque patte à la carte. En utilisant un microscope de dissection et de petits ciseaux, faire une incision médiane étendant à partir du bas-ventre à la partie supérieure du thorax.
  • Peler la peau avec des pinces et enlever le péritoine, révélant les organes abdominaux. Retirez les organes gastro-intestinaux, en prenant soin de ne pas sectionner l'aorte.
  • Faire une incision latérale dans le diaphragme antérieur et continuer l'incision dans l'abdomen. Avec des ciseaux de dissection, libérer la cage thoracique en coupant à travers les côtés des nervures et le retrait du adhérente des tissus mous à la partie supérieure du sternum. Retirez la cage thoracique, révélant les poumons.
  • Laissez le coeur en place initialement (à l'aide dans l'identification et la dissection de l'aorte proximale) et retirer soigneusement les poumons. Retirez le thymus, de la trachée et de l'oesophage avec soin, ensuring que l'aorte reste intacte.
  • En utilisant des pinces droites fines et micro-dissection ciseaux, enlever les tissus mous entourant l'aorte de la bifurcation iliaque à la crosse de l' aorte, en accordant une attention particulière lors de la suppression de la graisse péri-aortique (figure 1A). Retirez le tissu adipeux et doux restant entourant les grandes branches de la crosse aortique (c. -à- brachiocéphaliques, carotides et subclavières commune artères, figure 1B).
    Note: Il est important d'enlever la graisse de l'aorte parce que la graisse peut augmenter le signal de fond lors de l'exécution d'imagerie de fluorescence.
  • Retirez le coeur de la cavité thoracique, il détachant soigneusement de l'aorte proximale, et le jeter. Transect l'aorte distale à la bifurcation iliaque. En utilisant une aiguille d'insuline, injecter une solution saline normale dans l'aorte de la crosse de l'aorte pour laver les cellules sanguines restantes. Détachez l'aorte avec les vaisseaux arc aortique, complètement enleverà partir du corps.
  • Placez l'aorte dans une solution saline normale de la glace jusqu'à l'imagerie.
  • 4. Aortic Imaging

    1. Aortes Image ex vivo immédiatement après la récolte par infrarouge proche imagerie de fluorescence de réflectance. 25
      1. Régler l'appareil d'imagerie par fluorescence aux longueurs d' onde multivoies appropriées pour quantifier l' intensité du signal de fluorescence à partir des aortes de calcium RIN et des souris cathepsine NIR injecté, comme décrit précédemment. 25 D' après le fabricant, NIR de calcium peut être excité par ~ 650-678 nm , la lumière avec une émission maximale dans la ~ 680-700 nm gamme. Cathepsine NIR peut être excité par ~ 745-750 nm de lumière avec une émission maximale à ~ 770 nm.

    5. Isolement de murine primaire Aortic vasculaires cellules de muscle lisse

    1. Effectuer les étapes 3,1-3,7 comme décrit plus haut.
    2. Placez aortes dans HBSS froide jusqu'à ce que les dissections sont complets. couper soigneusement toute remaining graisse périaortique et des tissus mous, ne laissant que l'aorte.
    3. Sous une hotte de culture de tissu stérile, transférer les aortes à la solution Digestion Aortic en 35 mm x 10 mm de boîtes de culture de tissus. Placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min avec balancement intermittent doux. Après digestion, les aortes présentent un aspect étiré ou effiloché.
    4. Avec le microscope de dissection et une pince stérile, enlever la couche externe adventice de l'aorte tout en gardant la couche médiane intacte. Une technique pour enlever l'adventice est de décoller la couche externe de l'aorte à une extrémité et le retirer de la couche médiane sous-jacente comme une chaussette peut être décollée et retirée.
    5. Une fois la couche adventice a été retirée, placez les aorte restantes dans une nouvelle boîte de culture de tissu avec des milieux de culture cellulaire et conserver à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 2-4 heures.
    6. Sous une hotte stérile et en utilisant stériles 3 mm ciseaux micro-dissection, couper l'aorte dans 1-2 mm de largeanneaux.
    7. Placez ces anneaux dans une nouvelle boîte de culture de tissu avec la solution Digestion Aortic et incuber à 37 ° C avec intermittent doux balancement pendant 120 minutes. Pipeter la solution monter et descendre plusieurs fois au cours de cette incubation pour remettre en suspension les cellules.
    8. Ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire chaude à la solution de digestion et de transfert dans un tube conique de 15 ml.
    9. Centrifugeuse le tube pendant 5 min à 200 x g.
    10. Aspirer le milieu et les cellules de remettre en suspension dans le volume souhaité de milieux de culture cellulaire (par exemple, 5 ml).
    11. Plaquer la quantité totale de cellules isolées l'une de l'aorte dans une cellule de 25 cm2 flacon de culture et mettre à incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Propager cellules en utilisant des techniques standard, comme décrit précédemment. 25,48 Pendant les 7-10 premiers jours d'incubation, changer les médias tous les 72-96 heures. Comme les cellules approchent la confluence, reconstituer les médias plus fréquemment (toutes les 48 heures).
      Remarque: Il peut prendre plusieurs semaines pour faire croître une qua suffisantentity des cellules.
    12. Une fois confluentes, les cellules de passage avec la trypsine qui est chauffé à 37 ° C.
      1. Ajouter 0,5-1,0 ml de trypsine à chaque flacon de culture et incuber pendant 3-5 min; tapotez doucement le côté du flacon chaque 30-60 sec que nécessaire pour détacher les cellules de la surface.
      2. Une fois que les cellules se détachent du fond du flacon, ajouter 10 ml de milieu cellulaire pour les cellules dans la trypsine. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min. Aspirer les médias et la trypsine à partir du culot cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans la quantité désirée de milieux de cellules fraîches (par exemple, 5 à 10 ml) et transférer dans un nouveau flacon (avec quelques cellules transférées sur une lame de la chambre).
    13. Lors du premier passage des cellules, confirment la lignée lisse des cellules musculaires avec des techniques d'immunocytochimie standard, comme décrit précédemment, 49 en utilisant un anticorps dirigé contre l' α-actine du muscle lisse.

    6. Induire calcification du muscle lisse CulturedCellules

    1. cellules de plaques obtenues à partir de 5.12 dans un format de 6 puits. Note: A partir de 1 x 10 5 cellules / puits dans un volume total de 2,0 ml de milieu de cellules par puits est recommandée.
    2. Laisser les cellules se développent dans la calcification des médias A ou B pendant au moins 7 jours dans un format de plaque à 6 puits. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2.
    3. Changer les médias de cellules toutes les 48 heures.

    7. Évaluation CMLV calcification Utilisation de la coloration de von Kossa Méthode

    . Remarque: La méthode de von Kossa pour la mesure de la matrice extracellulaire , la calcification des tissus ou des cellules en culture est basée sur le remplacement des ions calcium en phosphate lié avec des ions argent 50 En présence des composés légers et organiques, les ions d'argent sont réduits et visualisées sous forme métallique argent. N'importe quel argent qui n'a pas réagi est éliminé par traitement avec du thiosulfate de sodium 50 Le protocole de coloration de von Kossa est le suivant.:

    1. Aspirer le milieu de cu cellulaireplaques lture.
    2. Fixer les cellules en les plaçant dans 1 ml de formol à 10% à la température ambiante pendant 20 min.
    3. Retirez la formaline et laver les cellules fixées avec de l'eau distillée pendant 5 min.
    4. Incuber les cellules dans 1 ml de solution à 5% de nitrate d'argent sous une ampoule de 60 à 100 W pendant 1 à 2 heures.
    5. Aspirer la solution de nitrate d'argent et laver avec de l'eau distillée pendant 5 min.
    6. Éliminer l'argent qui n'a pas réagi en plaçant les cellules dans 1 ml de thiosulfate de sodium à 5% d'une solution dans l'eau distillée pendant 5 minutes (p / v).
    7. Rincer les cellules avec de l'eau distillée pendant 5 min. Répéter les lavages 3x. La coloration de von Kossa est prêt pour l'imagerie par microscopie optique inversé standard.
    8. Étape facultative: Counterstain avec 1ml de rouge nucléaire rapide pendant 5 min. Suivez ce avec trois lavages avec de l'eau distillée (5 minutes chacun).

    OU

    8. Évaluation CMLV calcification avec imagerie fluorescente proche infrarouge

    Note: Similaire à sa capacitépour identifier la calcification dans les aortes de souris, le calcium se lie facilement NIR calcifiée minérale déposée par les cellules en culture. En utilisant cette technique, la microscopie à fluorescence et lecteurs de plaques avec des filtres de longueurs d'ondes longues peut l' image et de quantifier la calcification in vitro, respectivement. La longue émission de longueur d'onde du proche infrarouge de calcium permet l'utilisation simultanée des longueurs d'onde inférieures fluorophores émettant pour détecter d'autres fonctions. Le protocole pour le calcium NIR coloration est la suivante:

    1. Comme décrit dans la section 1.1.1, ajouter 1,2 ml de PBS 1x dans le flacon contenant 24 nmol de calcium NIR.
    2. Diluer le calcium NIR stock 1: 100 dans les médias de calcification ou de contrôle appropriés.
    3. Aspirer milieux cellulaires à partir des plaques de culture et le remplacer par le calcium NIR contenant des milieux de culture.
    4. Incuber les plaques de culture avec les médias NIR de calcium pendant la nuit à 37 ° C.
    5. Aspirer les médias des puits et laver les puits une fois avec PBS.
      Remarque: À ce stade,les milieux de culture d'origine peut être ajouté dans les puits, et les cellules peuvent être imagé en direct. Sinon, passez aux étapes ci-dessous.
    6. Fixer les cellules en les plaçant dans 1 ml de formol à 10% à la température ambiante pendant 20 min.
    7. Retirez la formaline et laver les cellules fixées avec de l'eau distillée pendant 5 min. Répéter les lavages 3x.
    8. Étape facultative:. Effectuer la coloration d'immunofluorescence ou d' autres contre - colorants pour des protéines d'intérêt 8,9
    9. Image ou détecter la tache NIR de calcium en utilisant des longueurs d' onde de fluorescence appropriée d'excitation (par exemple, NIR de calcium peut être excité par 650-678 nm de lumière) et des filtres d'émission (~ 680-700 nm).

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    Representative Results

    Calcification Aortic dans MGP - / - et souris de type sauvage a été mesurée en utilisant l' imagerie de fluorescence NIR de calcium. Aucun signal NIR de calcium a été détectée dans les aortes des souris de type sauvage, ce qui indique l'absence de calcification (figure 2). Un signal NIR de calcium solide a été détectée dans les aortes de MGP souris déficientes, ce qui est compatible avec la calcification vasculaire avancé. Des sections de tissu de aortes de type sauvage et MGP - / - souris ont été colorées avec Alizarine rouge 25 (figure 3A - B), confirmant la calcification vasculaire étendue observée chez les souris déficientes en MGP sans calcification détectée chez des souris de type sauvage. Pour déterminer si la calcification vasculaire associée à une carence MGP est dépendante de la signalisation BMP, MGP - / - souris ont été traitées avec LDN, Alk3-Fc, ou d'un véhicule à partir de 1 jour de vie. Ces souris ont été injectées avec du calcium NIR le jour 27 etaortes ont été récoltés le jour suivant. L' inhibition pharmacologique de la BMP signalisation réduite calcification aortique détectée avec le calcium NIR (Figure 2). Comme pour les résultats avec le calcium NIR, les aortes de LDN- et Alk3-Fc-traités MGP - / - souris avait réduit Alizarine tache rouge pour le calcium par rapport aux véhicules traités MGP - / - souris (Figure 3B - D). Ces résultats indiquent que la signalisation des BMP est nécessaire pour la calcification vasculaire observée dans MGP - / - souris.

    LDLR - / - souris nourris avec un régime riche en graisses développer l'inflammation macrophage et la calcification de la paroi artérielle 11 simultanée injection veine de la queue de calcifiée et spécifiques à la cathepsine sondes NIR dans MGP -. / - Souris a été effectuée pour déterminer si la calcification vasculaire du MGP est associé à -une carence accumulation macrophage 25 LDLR -. / - souris nourriesune souris de régime et de type sauvage haute teneur en graisses ont été utilisées comme témoins positifs et négatifs, respectivement. Aortes de souris de type sauvage présentaient pratiquement aucun signal NIR de calcium ou la cathepsine NIR, comme prévu (figure 4A). Calcium NIR et de la cathepsine NIR signaux de co-localisés qui ont favorisé la région de l' arc aortique ont été observées dans le LDLR - / - souris, ce qui indique une forte association entre l' infiltration des macrophages et la calcification vasculaire dans ce modèle de l' intima athérosclérose. Bien qu'un signal diffus et NIR forte de calcium a été observée dans les aortes des MGP - / - souris, le signal de la cathepsine NIR n'a pas été différente de celle des souris de type sauvage. Ces résultats indiquent que la calcification vasculaire chez un déficit MGP se produit en l'absence d'accumulation de macrophages. Pour confirmer davantage ces résultats, aortes de type sauvage, MGP - / -, et LDLR - / - souris ont été récoltées, sectionnées et colorées avec un anticorps spécifique pour le marqueur macrophage MAC-2 ( - / - souris ont montré abondante MAC-2 coloration; il n'y avait pas détectable MAC-2 coloration dans les aortes des MGP - / - souris, ce qui indique une absence de macrophages vasculaires.

    Pour modéliser la calcification vasculaire in vitro, les CMLV aortiques ont été isolés de type sauvage et MGP - / - souris et cultivées en haute phosphate contenant des médias, en utilisant le protocole décrit ci - dessus. Pour déterminer le rôle de la MGP dans la modulation de la calcification des CMLV en culture, un adénovirus exprimant MGP (Ad.MGP) a été utilisé pour restaurer MGP dans CMLV aortiques de MGP - / - souris. CMLV MGP déficientes infectées par un adénovirus exprimant la protéine fluorescente verte (Ad.GFP) ont été utilisés comme témoin. En outre, afin de déterminer l'effet de supprimer l'expression MGP de CMLV sur calcification subséquente, CMLV aortiques de souris de type sauvage ont été traités avec le siRNA dirigé contre MGP (siMGP) ou siRNA contrôle (SISC). Calcification a été induite dans les CMLV en culture en cultivant les cellules en une calcification pendant 7 jours. Les cellules ont ensuite été fixées et colorées pour le calcium en utilisant la méthode de von Kossa. Restauration de la MGP avec Ad.MGP réduite calcification des MGP - / - CMLV comparées aux cellules témoins d'adénovirus-traitées (Figure 5A - B, E). Le traitement de type sauvage CMLV aortiques avec siMGP, résultant en> 95% knockdown de l' expression MGP, 25 a augmenté la calcification par rapport aux cellules SISC-traitées (Figure 5C - D, F). Ces résultats indiquent que ce modèle de CMLV imite calcification in vitro les résultats chez la souris MGP déficientes et démontre que MGP modulant calcification des CMLV en culture.

    Une autre méthode pour la détection de la calcification des CMLV en culture avec du calcium est proche infrarouge. Pour modéliser la calcification vasculaire en v itro, CMLV des artères coronaires humaines ont été achetées et mises en culture pendant 21 jours dans calcification médias B. Après la période de traitement, la calcification a été identifié par la méthode NIR de calcium et les cultures ont été colorées avec une sonde verte fluorescente personnalisée collagène 51 et le colorant Hoechst (1 ug / ml pendant 5 min après la fixation dans le formol à 10%) (figure 6). Noyaux CMLV ont été observés avec le bleu Hoechst fluorescence par microscopie confocale (figure 6A). Une section optique représentatif montre calcium NIR tachés minérale calcique au sein de la matrice de collagène produit par le CMLV (figure 6B). Reconstructions tridimensionnelles de z-piles optiques illustrent les couches créées dans la culture comme les CMLV sur le fond du puits de produire une matrice de collagène dans lequel le minéral calcique déposé devient piégé (Figure 6C - D).

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    Figure 1:. Représentant Dissection d'un Aorte d'un type sauvage de souris (A) Une image de l'aorte thoracique et abdominale étendant jusqu'à la bifurcation de l' artère iliaque commune est représentée après le retrait des organes sus - jacents et de la graisse péri-aortique. (B) A concentré vue de la crosse aortique avec le brachiocéphalique, gauche carotide commune, et les artères de clavière gauche. Barres d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2: calcification vasculaire en MGP - / - souris dépend de BMP Signaling MGP - / - souris ont été traitées avec intrapéritonéale (ip) injections soit de cinq. souris cule, LDN-193189 (LDN, 2,5 mg / kg / jour), ou Alk3-Fc (2 mg / kg tous les deux jours) et de type sauvage ont été traitées avec des injections ip de véhicules commençant au jour 1 de la vie jusqu'au jour 28 . Au jour 27, les souris ont été injectées avec NIR de calcium par l'intermédiaire de la veine caudale. Aortes ont été récoltées le jour 28 et imagées avec une fluorescence dans l'infrarouge proche. Les images sont au même grossissement dans les quatre panneaux avec la barre d'échelle indiquant 3 mm. Aortes de souris de type sauvage ne ​​présentent pas de calcium le signal NIR tandis aortes de MGP - / - souris ont un signal NIR de calcium solide. Par rapport à MGP traités avec le véhicule - / - souris, les aortes des MGP - / - souris traitées avec soit LDN ou Alk3-Fc présentaient significativement réduites signaux NIR de calcium. Ce chiffre est tiré de la référence 25. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    3 "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    Figure 3: Pharmacologie Inhibition de BMP Signaling Empêche Aortic calcification chez les souris MGP déficientes souris de type sauvage ont été traitées avec des injections ip de véhicule (A) et MGP - / - souris ont été traitées avec des injections ip de véhicule (B), LDN. (C, 2,5 mg / kg / jour), ou Alk3-Fc (D, 2 mg / kg tous les deux jours) commençant au jour 1 de la vie jusqu'au jour 28. Les aortes ont été récoltés, sectionnés et colorés pour le calcium avec Alizarine rouge. Les images ont été prises au même grossissement dans les quatre panneaux avec la barre d'échelle indiquant 400 um. Comme pour les signaux NIR de calcium dans la figure 2, la coloration rouge Alizarine démontre une lourde charge de calcification dans les aortes de véhicules traités MGP - / - souris. La calcification est diminuée dans les aortes de LDN- et Alk3-Fc traités MGP - / - souris. Ce chiffre est tiré deréférence 25. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 4
    . Figure 4: Détermination simultanée de Aortic calcification et Macrophage Infiltration avec Calcium NIR et cathepsine NIR (A) de type sauvage, MGP - / -, et LDLR - / - souris nourris avec un régime riche en graisses ont été injectés avec le calcium NIR et de la cathepsine NIR par injection dans la veine de la queue. Aortes ont été récoltés 24 h plus tard et évaluées par imagerie par fluorescence proche infrarouge. Les images sont au même grossissement avec la barre d'échelle indiquant 3 mm. souris de type sauvage présentent pratiquement pas de calcification aortique ou présence macrophage. Les aortes de LDLR - / - souris ont une vaste calcification qui co-localise avec l' accumulation de macrophages. En revanche, les MGP - / - Souris ont calcification de l' aorte qui se produit en l'absence d'infiltration des macrophages. (B) aortes ont été récoltées à partir de type sauvage, MGP - / -, et LDLR - / - souris nourris avec un régime riche en graisses. Les aortes ont été sectionnés et colorés pour les macrophages avec un anticorps spécifique de MAC-2. Les noyaux ont été colorés avec DAPI. La surface luminale est vers la droite dans chaque panneau. Les images ont été prises au même grossissement dans les trois panneaux avec la barre d'échelle indiquant 100 um. Comme pour les résultats dans (A), il n'y avait aucune preuve de l' accumulation de macrophages dans les aortes des MGP - / - souris. Ce chiffre est une version modifiée d'une figure de référence 25. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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    . Figure 5: MGP Protège CMLV Cultured de calcification CMLV aortiques cultivées ont été isolées à partir de MGP - / - souris et infectées par l' adénovirus exprimant soit GFP (A) ou MGP (B). CMLV aortiques isolées à partir de souris de type sauvage ont été transfectées avec contrôle brouillé siRNA (C) ou siRNA ciblant MGP (D). Les cellules ont été cultivées dans une calcification pendant 7 jours et ensuite fixées et colorées avec de von Kossa. Les images ont été prises au même grossissement dans les quatre panneaux (A - D) avec la barre d'échelle indiquant 200 um. Champs série de vue ont été photographiés et quantifiés pour la coloration de calcium en utilisant l' image du logiciel J après soustraction de fond (E et F), avec des barres d'erreur indiquant SEM. Ce chiffre est une version modifiée d'une figure de référence 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 6
    Figure 6:. Calcium NIR Identifie calcification en association avec la matrice extracellulaire in vitro (A) CMLV des artères coronaires humaines cultivées dans calcification B pendant 21 jours ont été identifiés par une coloration nucléaire en utilisant le colorant Hoechst. (B) une section optique obtenue par microscopie confocale de coloration proche infrarouge de calcium ( en rouge) en combinaison avec une sonde de collagène vert fluorescent montre calcifiée minéral à travers la matrice de collagène. Images A - B ont été prises au même grossissement avec la barre d'échelle indiquant 10 um. Reconstructions en trois dimensions (C et D) montrent le piégeage minéral calcifiée dans les til collagène matrice. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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    Discussion

    Calcification artérielle est un facteur de risque important pour les maladies cardio - vasculaires chez l' homme et peut contribuer directement à la pathogenèse des événements cardiovasculaires. 1,5,52 intimale dépôt de calcium dans les calottes fibreuses minces de maladie athéroscléreuse a été proposé d'augmenter le stress biomécanique local et contribuer à rupture de la plaque. 53,54 impacts de calcification médiale sur les résultats cliniques en augmentant la rigidité artérielle, ce qui peut induire une hypertrophie cardiaque et affecter la fonction cardiaque. 55 par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous - tendent la calcification vasculaire fournira des informations importantes sur les maladies humaines et potentiellement identifier de nouvelles cibles pour thérapie.

    Ici, un procédé de détection de la calcification de l' aorte et de l' accumulation de macrophages dans des modèles murins de l' athérosclérose et de la calcification vasculaire en utilisant l' imagerie NIRF est décrite. 9 Il est essentiel d'injecter avec précision le RNIagents F dans la veine de la queue. Ceci est une technique qui exige de la pratique significative avant la maîtrise est atteint. 56 En outre, il est important d'enlever toutes les graisses péri-aortique de l'aorte, comme cette graisse peut provoquer un signal autofluorescente à la même longueur d' onde que le RIN de calcium et de la cathepsine signaux NIR. L'utilisation d'agents NIRF présente de nombreux avantages importants par rapport aux méthodes histologiques classiques d'évaluation de la calcification vasculaire et l'inflammation. Contrairement aux techniques histologiques classiques, ces agents permettent la quantification de la calcification de l'aorte entière et l'infiltration des macrophages. En outre, ils offrent une méthode plus sensible pour la détection précoce des changements associés au développement de la calcification aortique que la coloration histologique et peuvent donc offrir un aperçu mécanistes dans les premiers stades de la maladie. 9 Sites de début signal NIR de calcium sont associés à des marqueurs de formation osseuse y compris l' augmentation l'activité phosphatase alcaline comme well comme expression du gène Runx2 et ostéopontine. De plus, l'utilisation simultanée de sondes spectralement distinctes pour la calcification et l' activité de la cathepsine permet de quantifier et d' association de la progression spatio - temporelle des deux maladie athéromateuse et calcifiée. 9

    Identifier les caractéristiques spatiales et temporelles des aides à la calcification et l'inflammation vasculaire dans notre compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents de la maladie vasculaire. Par exemple, l'utilisation d'agents NIRF a démontré que dans des modèles de l' intima calcification (ApoE - / - et LDLR - / - souris à un régime riche en graisses), la calcification vasculaire co-localise à des sites d'accumulation de macrophages (figure 4) et que la calcification suite à l'accumulation de macrophages temporellement. Il est intéressant de 9,11, pas d' accumulation de macrophages avec de la cathepsine proche infrarouge a été détecté dans la calcification vasculaire interne observée chez des souris déficientes en MGP. 25 Jeus, à partir d'expériences utilisant des agents NIRF, on peut conclure que, bien que l'accumulation de macrophages est associée à vasculaire intimale calcification, il est pas nécessaire pour la calcification médiale vasculaire.

    Similaire à son rôle dans l' imagerie et à l' étude des maladies vasculaires, l' imagerie NIRF a été utilisée pour étudier la maladie de la valvule aortique. 47 maladie valvulaire aortique est marquée par des macrophages et calcifiés lésions lipidiques chargées de la soupape et qui présente des mécanismes moléculaires sous - jacents similaires et les déterminants génétiques de l'athérosclérose . 57-59 Aortic calcification de la valve entraîne une altération de la fonction dépliant et est la principale cause de la sténose aortique clinique chez les personnes âgées. Le seul traitement actuellement disponible pour la sténose aortique symptomatique est le remplacement de la valve. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la maladie de la valve aortique est nécessaire pour empêcher la fin du stade des complications cliniques de l'aorte progressive calcification de la valve. Utilisation de NIAgents RF comme des outils d'imagerie moléculaire dans des modèles animaux fournit une méthode sensible pour évaluer la maladie de la valve aortique à ses débuts 60.

    Des techniques standard pour visualiser les plaques de l' artère coronaire ont été axées sur la gravité de la sténose, mais la majorité des syndromes coronaires aigus résulter de la rupture des plaques d'écoulement non limitatifs. 6 Les processus biologiques au sein de plaques, telles que l' inflammation, servent de meilleurs prédicteurs de la rupture de plaque que le degré de sténose. 61 contrairement aux techniques d'imagerie classiques, l' imagerie NIRF fournit l'occasion de mesurer l' activité cellulaire ( à savoir, l' activité protéolytique macrophage avec une métalloprotéinase matricielle (MMP) agent activable, l' activité protéolytique et élastolytique avec cathepsine NIR, et l' activité ostéogénique NIR de calcium). 9 Cette méthode permet donc l' évaluation fonctionnelle et anatomique simultanée des maladies cardiovasculaires. imagerie NIRF utilise eles longueurs d'onde XCitation dans la gamme 650-900 nm, ce qui présente l'avantage d' une pénétration tissulaire accrue par rapport à la lumière à une longueur d' onde plus faible, permettant ainsi une meilleure évaluation de la profondeur des lésions pathologiques. 60 Il est également réduite autofluorescente signal du tissu vasculaire d'arrière - plan dans le proche gamme de longueurs d'onde -Infrarouge. Bien que ce protocole met l' accent sur ​​l'utilisation de NIRF imagerie ex vivo, l' imagerie NIRF représente également une plate - forme utile pour l' imagerie moléculaire longitudinale in vivo. Imagerie 9 NIRF, lorsqu'il est combiné avec microscopie intravitale, peut avoir des applications diagnostiques à venir chez les humains. 61 Toutefois, une limitation du NIR imagerie calcique est longitudinalement que la sonde de bisphosphonate dérivé peut se modifier le processus physiologique de la calcification. 62

    Calcification cardiovasculaire est un processus régulé activement qui implique la transdifférenciation des CMLV à un phénotype ostéogénique 25,41,42. 63 et a atteint un nombre suffisant de cellules par l' aorte de souris pour effectuer des études in vitro (figure 5). Une solution de rechange methode pour l'isolement de CMLV ne comporte pas de digestion enzymatique, mais plutôt la culture directe des anneaux aortiques explantées; cette technique a été rapporté pour produire moins de cellules que la technique utilisant une digestion enzymatique 63,64.

    Deux milieux de calcification différentes, soit avec βGP / Asc / ou DEX 65,66 NaPhos, 25,43 sont décrits qui peuvent être utilisés pour induire une calcification des VSMC. Les deux types de médias ont été utilisés pour calcifier CMLV murins avec succès équivalent. Alors que les médias de calcification contenant βGP / Desc / DEX a été utilisé pour calcifier CMLV humains (figure 6), le support contenant NaPhos n'a pas été efficace dans la calcification CMLV humaines dans notre expérience. En outre, 21 - 28 jours de culture de VSMC humaines dans calcification B peuvent être nécessaires avant que la calcification est détectée. Calcification des CMLV de type sauvage in vitro a augmenté lorsque les niveaux de MGP d'expression ont été réduits avec siRNA et calcificatisur a été réduit en MGP - / - CMLV lorsque l' expression MGP a été restaurée (Figure 5). Ces résultats sont cohérents avec la calcification aortique observée dans MGP - / - souris et suggèrent que cette méthode in vitro de CMLV calcification sert de modèle utile de calcification in vivo. Il est important de noter, cependant, qu'il ya des limites à tirer des conclusions sur intacts les vaisseaux sanguins de CMLV cultivées. CMLV Cultured peuvent perdre leurs propriétés in vivo contractiles, en particulier à des passages supérieurs, en plus de développer des changements dans les profils d'expression des gènes, la morphologie et la rigidité. 67-70 CMLV cultivées dans calcifiant médias ne distinguent à une lignée ostéoblastique avant calcification, mais ne pas exposer un intermédiaire chondrocytes qui est souvent observée in vivo. 71 Il est donc important que les conclusions tirées de mécanistiques des cellules cultivées être validées dans des systèmes in vivo. Sure méthode potentielle de surmonter cette limitation est d'étudier les CMLV dans leur état ​​in vivo en utilisant un anneau de vaisseau intact cultivé. 70

    Deux méthodes différentes sont présentées pour détecter une calcification des CMLV en culture, le procédé de von Kossa (figure 5) et proche infrarouge de calcium coloration (figure 6). Bien souvent utilisé pour évaluer la calcification, la méthode von Kossa est quelque peu limitée par sa spécificité réduite pour des cristaux de calcium. 50 Calcium NIR est ressenti comme spécifique pour calcification et est particulièrement avantageuse en ce qu'elle permet une coloration simultanée avec supplémentaire fluorescent spectralement distincts agents. 9 applications futures de ce protocole en utilisant NIR de calcium avec des sondes moléculaires supplémentaires peuvent fournir des informations importantes sur les mécanismes de calcification et peut permettre l'évaluation rapide des inhibiteurs de petites molécules de CMLV calcification d'une manière à haut débit, à identifier nouvelles thérapies potentielles pour la calcification vasculaire.

    En résumé, la calcification cardiovasculaire est un facteur de risque important et la contribution potentielle à la maladie clinique. La connaissance des mécanismes de calcification cardiovasculaire et une maladie athéroscléreuse repose à la fois sur des modèles animaux et cellulaires. Méthodologies pour évaluer la calcification in vivo, ex vivo et in vitro des modèles sont essentiels pour faire progresser notre compréhension des maladies cardio - vasculaires.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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