Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

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Biology

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Miller, D. E., Patel, Z. H., Lu, X., Lynch, A. T., Weirauch, M. T., Kottyan, L. C. Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and DNA-affinity Precipitation Assay (DAPA). J. Vis. Exp. (114), e54093, doi:10.3791/54093 (2016).

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Abstract

Introduction

Sequenzierung und Genotypisierung basierte Studien, einschließlich der genomweiten Assoziationsstudien (GWAS), Kandidaten-Locus Studien und tiefSequenzierungsUntersuchungen haben viele genetische Varianten identifiziert, die statistisch im Zusammenhang mit einer Krankheit, Zug oder Phänotyp. Im Gegensatz zu dem frühen Vorhersagen, die meisten dieser Varianten (85-93%) werden in nicht-codierenden Regionen und die Aminosäuresequenz von Proteinen nicht 1,2 ändern. Interpretieren der Funktion dieser nicht-kodierenden Varianten und Bestimmung der biologischen Mechanismen , um sie zu dem zugeordneten Krankheit verbindet, trait oder Phänotyp hat Herausforderung erwiesen 3-6. Wir haben eine allgemeine Strategie entwickelt, um die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die Varianten zu einem wichtigen Zwischen Phänotyp verknüpfen - Genexpression. Diese Pipeline wird speziell zu identifizieren, die Modulation der TF-Bindung durch genetische Varianten entwickelt. Diese Strategie kombiniert Rechenansätze und Techniken der Molekularbiologie Ziel vorherzusagenbiologische Wirkungen von Kandidatenvarianten in silico, und überprüfen diese Prognosen empirisch (Abbildung 1).

Abbildung 1
Abbildung 1:.. Strategischer Ansatz für die Analyse von nicht-kodierenden genetischen Varianten Schritte, die in der detaillierten Protokoll sind nicht mit diesem Manuskript assoziiert enthalten sind grau schattiert Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

In vielen Fällen ist es wichtig, durch eine Erweiterung der Liste der Varianten zu beginnen alle, die in hohen Gestänge-Ungleichgewichts (LD) mit jeder statistisch assoziiert Variante enthalten. LD ist ein Maß der nicht-zufällige Assoziation von Allelen an zwei verschiedenen chromosomalen Stellen, die durch die r 2 -Statistik 7 gemessen werden kann. r 2 ist ein Maß für die linKage Ungleichgewichts zwischen zwei Varianten, mit einem r 2 = 1 bezeichnet perfekte Verbindung zwischen zwei Varianten. Allelen in hohen LD gefunden auf dem Chromosom über Vorfahren Populationen zusammen entmischen. Aktuelle Genotypisierung Arrays enthalten nicht alle bekannten Varianten im menschlichen Genom. Stattdessen verwerten sie die LD innerhalb des menschlichen Genoms und sind eine Teilmenge der bekannten Varianten , die 8 für andere Varianten innerhalb einer bestimmten Region des LD als Stellvertreter fungieren. Somit kann mit einer bestimmten Krankheit assoziiert sein eine Variante ohne biologische Folge kann, da es in LD mit dem kausalen varianten der Variante mit einer sinnvollen biologischen Wirkung. Prozedural, wird empfohlen , die neueste Version der 1000 Genome Projekt 9 Variante Call - Dateien (VCF) in binäre Dateien zu konvertieren kompatibel mit PLINK 10,11, einem Open-Source - Tool für Genom - Assoziations - Analyse. Anschließend werden alle anderen genetischen Varianten mit LD r 2> 0,8 mit jedem Eingang genetischen variant als Kandidaten identifiziert werden. Es ist wichtig , die entsprechende Referenzpopulation für diese Schritt- zB zu verwenden, wenn eine Variante , bei Themen von europäischer Abstammung identifiziert wurde, Daten von Patienten mit ähnlicher Herkunft sollte für LD Expansion verwendet werden.

LD Expansion resultiert oft in Dutzenden von Kandidatenvarianten, und es ist wahrscheinlich, dass nur ein kleiner Bruchteil von diesen zu Krankheitsmechanismus beizutragen. Oft ist es nicht durchführbar, experimentell jede dieser Varianten einzeln untersuchen. Es ist daher sinnvoll, die Tausende von öffentlich verfügbaren funktionellen genomischen Datensätze als Filter zu nutzen, um die Varianten zu priorisieren. Zum Beispiel 12 das ENCODE - Konsortium hat Tausende von ChIP-seq Experimente beschreiben die Bindung von Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren, und Histonmarkierungen in einem breiten Spektrum von Kontexten, zusammen mit Chromatin Zugänglichkeit von Daten von Technologien wie DNase-seq 13, ATAC ausgeführt -SEQ 14 und FAIRE-seq 15. DatabAses und Web - Servern wie dem UCSC Genome Browser 16, Roadmap Epigenomics 17, Epigenome Blueprint 18, Cistrome 19 und ReMap 20 bieten freien Zugang zu Daten , die durch diese und andere experimentelle Techniken in einer Vielzahl von Zelltypen und Bedingungen hergestellt. Wenn es zu viele Varianten sind experimentell zu untersuchen, können diese Daten verwendet werden, die innerhalb wahrscheinlich regulatorischen Regionen in entsprechenden Zell- und Gewebetypen angeordnet zu priorisieren. Ferner wird in Fällen, in denen eine Variante für ein spezifisches Protein in einer ChIP-seq peak ist, können diese Daten Potential führt als der spezifischen TF (s) oder Cofaktoren schaffen, deren Bindung könnte beeinflussen.

Als nächstes werden die resultierenden priorisiert Varianten gescreent experimentell vorhergesagt Genotyp-abhängige Protein zu validieren Bindungs ​​21,22 mittels EMSA. EMSA misst die Veränderung in der Migration des oligo auf einem nicht-reduzierenden TBE-Gel. Fluoreszierend markiertes Oligo mit der inkubiertenKern Lysat, und die Bindung von Kernfaktoren wird verzögern die Bewegung des Oligo auf dem Gel. Auf diese Weise Oligo, die mehr Kernfaktoren gebunden hat, als ein stärkeres Fluoreszenzsignal beim Abtasten präsentieren wird. Bemerkenswert ist, erfordert keine EMSA Prognosen über die spezifischen Proteine, deren Bindung betroffen.

Sobald Varianten identifiziert werden, die innerhalb der erwarteten regulatorischen Regionen befinden und in der Lage sind unterschiedlich Bindung Kernfaktoren sind Berechnungsverfahren die spezifische TF (s), dessen vorherzusagen verwendet Bindung sie beeinflussen könnten. Wir bevorzugen CIS-BP 23,24, RegulomeDB 25, UNIProbe 26 zu verwenden, und JASPAR 27. Sobald Kandidaten TFs identifiziert werden, können diese Prognosen ausdrücklich Antikörper gegen diese TFs (EMSA-supershifts und DAPA-Westerns) getestet werden. Eine EMSA-Supershift beinhaltet die Zugabe eines TF-spezifischen Antikörpers an das Kern Lysat und Oligo. Ein positives Ergebnis in einem EMSA-Supershift ist represented als eine weitere Verschiebung der EMSA Band oder einem Verlust des Bandes (in Bezug 28 überprüft). In der komplementären DAPA, eine 5'-biotinylierten Oligokomplexes die Variante und das 20 Basenpaar-flankierenden Nukleotide enthalten, werden mit nuklearen Lysat von relevanten Zelltyp (en) inkubiert alle Kernfaktoren speziell zur Erfassung der Oligos binden. Die Oligokomplexes-nuclear factor-Komplex wird durch Streptavidin-Mikrokügelchen in einer magnetischen Säule immobilisiert. Die gebundenen Kernfaktoren werden direkt durch Elution 29,48 gesammelt. Bindungsvorhersagen können dann durch Western-Blot untersucht werden, um Antikörper, spezifisch für das Protein verwendet wird. In Fällen, in denen es keine offensichtlichen Prognosen oder zu viele Vorhersagen, die Elutionen von Variante Pull-downs der DAPA Experimente können zu einem Proteomik Kern gesendet werden, um Kandidaten TFs mit Massenspektrometrie identifizieren, die anschließend validiert werden können mit diesen zuvor beschriebenen Methoden.

In dem Rest des article wird das detaillierte Protokoll für EMSA und DAPA Analyse genetischer Varianten vorgesehen.

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Protocol

1. Herstellung von Lösungen und Reagenzien

  1. Bestellen Sie kundenspezifische DNA-Oligonukleotid-Sonden zur Verwendung in EMSA und DAPA.
    1. Zur Reduzierung der unspezifischen Proteinbindung, entwerfen kurze Oligos (zwischen 35-45 Basenpaare (bp) in der Länge) 30, und legen Sie die Variante von Interesse direkt in der Mitte , flankiert von seinen 17 bp endogene genomische Sequenz. Für EMSA Oligos, eine 5'-Fluorophor hinzuzufügen. Für DAPA Oligos, eine 5'-Biotin-Tag hinzufügen.
    2. Um sowohl die Sense-Strang und seine Umkehrkomplement Strang. Alternativ bestellen Duplex (vorgeglüht) Oligos. Wenn die Oligos zu benennen, stellen Sie die Nomenklatur, die auf einem festgelegten Referenzgenom.
      Hinweis: "Risiko" und "Nicht-Risiko" -Bezeichnung können Krankheit und projektspezifische, während "Referenz" und "non-reference" sind universell relevant sein.
    3. Bei der Ankunft der Oligos, drehen kurz den Inhalt nach unten und resuspendieren in Nuklease-freies Wasser bis zu einer endgültigen Konzentration von 100 μ; M. Shop suspendiert Lager bei -20 ° C. Schützen Oligos mit einem Fluorophor aus Licht markiert, indem sie mit Alufolie wickeln.
Name Sequenz
rs76562819_REF_FOR GTAATGCCTTAATGAGAGAG A GTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_REF_REV GAAGTGAGAAGATGACTAAC T CTCTCTCATTAAGGCATTAC
rs76562819_NONREF_FOR GTAATGCCTTAATGAGAGAG G GTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_NONREF_REV GAAGTGAGAAGATGACTAAC C CTCTCTCATTAAGGCATTAC

Tabelle 1: Beispiel EMSA / DAPA Oligonukleotid - Entwurf , der eine SNP für Differential bin zu testending. "REF" steht für die Referenz - Allels, während "NONREF" für die Nicht-Referenz - Allels steht. "FOR" steht für den vorderen Strang, während "REV" sein Komplement an. Die SNP wird in rot gesehen.

  1. Vorbereitung zytoplasmatischen Extraktion (CE) Puffer mit einer Endkonzentration von 10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl und 0,1 mM EDTA in deionisiertem Wasser.
  2. Vorbereitung Kernextraktion (NE) Puffer mit einer Endkonzentration von 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,4 M NaCl und 1 mM EDTA in deionisiertem Wasser.
  3. Vorbereitung Anelierungspuffer mit einer Endkonzentration von 10 mM Tris (pH 7,5-8,0), 50 mM NaCl und 1 mM EDTA in deionisiertem Wasser.

2. Herstellung von Kern Lysate aus kultivierten Zellen

Hinweis: Dieses experimentelle Protokoll wurde optimiert B-lymphoblastoiden Zelllinien, hat aber in mehreren anderen unabhängigen adhärenten / Suspensions-Zelllinien und arbeitet universell getestet.

  1. Culture B-lymphoblastoiden Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mit 2 mM L-Glutamin, 10% fötalem Rinderserum und 1x Antibiotikum-Antimykotikum, enthaltend 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin B.
    1. Seed in einem Bereich von 200.000-500.000 lebenden Zellen / ml und Inkubation Kolben bei 37 ° C mit 5% Kohlendioxid in einer aufrechten Position mit belüfteten oder lose Kappen.
      Hinweis: Das Wachstum der B-lymphoblastoiden Zellen verlangsamt, wenn sie über 1.000.000 Zellen / ml erreichen. Break up-Zell-Blasten durch Auf- und Abpipettieren mehrmals und das Rück Zellen zu 200.000-500.000 Zellen / ml eine schnelle Wachstumsrate aufrecht zu erhalten.
  2. Zweimal waschen kultivierten Zellen mit 10 ml eiskaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), Spin-down bei 4 ° C, 300 g für 5 min und entfernen PBS durch Absaugen.
  3. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und Pellet als 1 ml eiskaltem PBS pro 10 7 Zellen.
    Hinweis: Wenn beispielsweise Lysieren von 2 x 10 7 </ Sup> Zellen, Resuspendieren in 2 ml PBS.
  4. Aliquot 1 ml bis 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen so daß jedes Rohr 10 7 Zellen in PBS enthält. Zentrifuge bei 3.300 × g für 2 min 4 ° C und absaugen PBS.
  5. Vor der Verwendung hinzufügen 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1x Phosphatase-Inhibitor und 1x Protease-Inhibitor zu einem Arbeits Lager von CE-Puffer. Resuspendieren Zellpellet mit 400 ul CE-Puffer und Inkubation für 15 Minuten auf Eis.
  6. In 25 ul 10% Nonidet P-40 und mischen durch Pipettieren. Zentrifuge bei 4 ° C, max Geschwindigkeit für 3 min. Dekantieren und den Überstand verwerfen.
  7. Vor der Verwendung hinzufügen 1 mM DTT, 1x Phosphatase-Inhibitor und 1x Protease-Inhibitor zu einem Arbeits Lager von NE-Puffer. Resuspendieren Zellpellet mit 30 ul Puffer NE und durch Vortexen mischen.
  8. Inkubieren bei 4 ° C in einem Rohr Rotator oder auf Eis für 10 min. Zentrifuge 3.300 xg für 2 min 4 ° C.
  9. Sammeln Sie die klare Überstand (nuclear Lysat) und aliquoten vor der Lagerung bei -806; C mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden, die das Protein abbauen kann. Lassen Sie eine 10 - ul - Aliquot Proteinkonzentration unter Verwendung des bichoninic Säure - Assay (BCA) 31 zu messen.

3. elektrophoretische Mobilität Shift Assay (EMSA)

  1. Bereiten Sie Oligo-Funktion Stock und EMSA Gel.
    1. Wenn Oligos im Duplex bestellt wurden, tauen die 100 uM Lager und verdünnt 1: 2000 in Anelierungspuffer 50 nM Arbeits Lager zu erreichen.
    2. Wenn Oligos wurden einsträngige bestellt, tauen die 100 uM Aktien und verdünnen 1:10 in Anelierungspuffer 100 nM Arbeitsvorräte zu erreichen. Kombinieren von 100 ul der 100 nM Komplement Strang Lösung miteinander in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
      1. In einem Heizblock bei 95 ° C für 5 min. Schalten Sie die Hitze Block aus und lassen Sie die Oligos langsam für mindestens eine Stunde auf Raumtemperatur abkühlen vor der Verwendung.
    3. die EMSA Gel Pre-run.
      1. Entfernen Sie die Folie aus einem vorgegossenen 6% TBE Gel und spülen Sie unter entsalztes Wasser mehrmals jeden Puffer aus den Vertiefungen zu entfernen. Vorbereitung 1 l TBE-Puffer 0,5x durch Zugabe von 50 ml 10x TBE zu 950 ml deionisiertem Wasser hergestellt.
      2. Montieren Sie das Gel Elektrophorese-Vorrichtung und auf Dichtigkeit prüfen durch die innere Kammer füllt mit 0,5x TBE-Puffer. Wenn kein Puffer in die äußere Kammer austritt, füllen die äußere Kammer etwa zwei Drittel des Weges.
      3. Pre-run für 60 Minuten das Gel bei 100 V.
      4. Spülen Sie jede Vertiefung mit 200 ul 0,5x TBE-Puffer.
  2. Bereiten Sie Buffer Master Mix Bindung.
    1. Bereiten 10x Puffer mit einer Endkonzentration von 100 mM Tris-Bindungs, 500 mM KCl, 10 mM DTT; pH-Wert 7,5 in entmineralisiertem Wasser.
    2. In einem Mikrozentrifugenröhrchen, schaffen eine Mastermix der Reagenzien bestehend gemeinsam für alle Reaktionen (10 ul 10fach Bindungspuffer, 10 ul DTT / Polysorbat, 5 & mgr; l Poly d (IC), und 2,5 ul Lachssperma - DNA; Tabelle 2). Bereiten Sie eine zusätzliche 10%zur Volumenverlust durch Pipettieren zu berücksichtigen.
Reagens Endkonz. Rxn 1 # Rxn 2 # Rxn 3 # Rxn 4 #
Reinstwassersysteme bis 20 & mgr; l Vol. 13,5 ul 11.98 ul 13.5μl 11.98 ul
10x Binding Buffer 1x 2 ul 2 ul 2 ul 2 ul
DVB - T / TW-20 1x 2 ul 2 ul 2 ul 2 ul
Lachssperma - DNA 500 ng / ul 0,5 ul 0,5 ul 0,5 ul 0,5 ul
1 ug / ul Poly d (IC) 1 & mgr; g 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul
Kernextrakt (5,26 ug / ul) 8 & mgr; g - 1,52 ul - 1,52 ul
NE - Puffer 1,52 ul - 1,52 ul -
Referenz - Allels Oligo 50 fmol 1 ul 1 ul - -
Nicht-Referenz - Allels Oligo 50 fmol - - 1 ul 1 ul

Tabelle 2: Beispiel EMSA Reaktion setup. Die Tabelle zeigt ein Beispiel EMSA die Hypothese zu testen , dass Genotyp-abhängig ist , die Bindung von TFs zu einem spezifischen SNP.

  1. In Nuklease-freies Wasser in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, so dass das endgültige Volumen nach Zugabe aller Reagenzien 20 ul sein wird.
  2. Fügen Sie den entsprechenden Betrag (5,5 ul) Master-Mix zu jedem Reaktionsgefäß.
  3. In 8 ug Kern Lysat zu den entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie Röhren die Oligo ohne Kernextrakt als Negativkontrollen (zB Tabelle 2, Rxn # 1 und Rxn # 3) enthält.
    Anmerkung: Die optimale Menge an Lysat pro Reaktion experimentell durch Titration bestimmt werden. Im Allgemeinen wird ein Bereich von 2-10 & mgr; g Lysat Titrieren ausreichend.
  4. In 50 fmol Oligo an die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen. Flick zu mischen und kurz den Inhalt auf den Boden der Röhre drehen. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Wenn attemptieinen Supershift ng, inkubiere für 20 min mit Antikörper bei Raumtemperatur vor der Zugabe von Oligos des Lysats Mischung. Es wird empfohlen, für die besten Ergebnisse 1 ug eines ChIP-Grade-Antikörper zu verwenden.
  5. In 2 ul 10x orange Loading Dye zu jedem Reaktionsgefäß. Pipette nach oben und unten zu mischen.
  6. Legen Sie die Proben in den Vorlauf 6% TBE-Gel durch Pipettieren nach oben und unten zu mischen und dann jede Probe in einem separaten gut vertreiben. Führen Sie das Gel bei 80 V bis die orange Farbstoff 2/3 bis 3/4 des Weges durch das Gel gewandert ist. Dies sollte etwa 60 bis 75 Minuten dauern.
  7. Entfernen Sie das Gel aus dem Plastikkassette durch sie offen mit einem Gel Messer neugierigen und legen Sie das Gel in einen Behälter mit 0,5% TBE-Puffer, damit er nicht austrocknet.
  8. Legen Sie das Gel auf der Oberfläche eines Infrarot und Chemilumineszenz-Bildgebungssystem, wobei Sie alle Blasen oder Verunreinigungen zu beseitigen, die das Bild stören wird.
  9. Mit dem Scan-System-Software, klicken Sie auf den "Acquire" Registerkarteund dann wählen Sie "Neu Zeichnen", um ein Feld ziehen rund um den Bereich entsprechend, wo das Gel befindet sich auf der Oberfläche des Scanners.
  10. In der "Kanäle" des "Acquire", wählen Sie den Kanal auf der Wellenlänge des Fluorophor-Markierung auf dem Oligo entspricht. In der "Scanner" Abschnitt, klicken Sie auf "Vorschau", um eine minderwertige Scan-Vorschau erhalten. Stellen Sie den Scanbereich durch das blaue Feld ziehen, das erworbene Vorschaubild bis auf den Teil des Gels umgebenden abgebildet werden.
    Hinweis: Wenn zum Beispiel Oligos, markiert mit einem 700 nm Fluorophore verwenden, stellen Sie sicher, dass die "700 nm" Kanal vor dem Scannen ausgewählt wird.
  11. In der "Scan-Steuerungen" Abschnitt, wählen Sie die "84 & mgr; M" Auflösungsoption und das "Medium" Qualität Option. Setzen Sie den Fokus auf die Hälfte der Dicke des Gels zu kompensieren. Hinweis: Zum Beispiel kann ein 1 mm Gel mit einer 0,5 mm Fokusversatz verwenden würde.
  12. In der "Scanner" Abschnitt, klicken Sie auf "Start" zu bEGIN den Scanvorgang.
    Hinweis: Während des Scans die Helligkeit, Kontrast und Farbschema oft manuell angepasst werden je nach Hersteller des Abtastsystems werden kann.
  13. Nachdem die Prüfung abgeschlossen ist, wählen Sie die Registerkarte "Bild" und klicken Sie auf "Drehen oder Kippen" im Abschnitt "Create", um die Ausrichtung zu korrigieren. Speichern Sie die Bilddatei von "Export" im Hauptmenü klicken und dann auf "Einzelbildansicht."

4. DNA-Affinitätsreinigung Assay (DAPA)

  1. Herstellung von 5 & mgr; M Oligo-Funktion Stock.
    1. Wenn Oligos im Duplex bestellt wurden, tauen die 100 uM Lager und verdünnen 01.20 in Anelierungspuffer 5 uM Arbeits Lager zu erreichen.
    2. Wenn Oligos wurden einsträngige bestellt, tauen die 100 uM Aktien und verdünnen 1:10 in Anelierungspuffer 10 uM Arbeitsvorräte zu erreichen. Mähdrescher 10 & mgr; l der 10 & mgr; M komplementäre Stränge miteinander. In einem Heizblock bei 95 ° C für5 Minuten. Schalten Sie die Hitze Block aus und lassen Sie die Oligos langsam auf Raumtemperatur abkühlen vor der Verwendung.
  2. Vor dem Start aufzuwärmen Bindungspuffer, niedriger Stringenz-Waschpuffer, hochstringenten Waschpuffer und Elutionspuffer auf Raumtemperatur.
    Hinweis: eine Endkonzentration von 50 ng / ml Poly d (IC) mit dem Bindungspuffer, niedriger Stringenz-Waschpuffer hinzugefügt und hoher Stringenz-Waschpuffer potentielle nicht-spezifische Bindung von Proteinen an die Oligos zu reduzieren.
  3. Bereiten Sie die Bindung Mischungen für jede Variante.
    1. 1 Volumenteil der Kern Lysat mit 2 Volumina Bindungspuffer.
      Anmerkung: Die erforderliche Menge an Lysat muss experimentell bestimmt werden aufgrund unterschiedlicher Fülle von TFs. zwischen 100-250 ug Kern Lysat pro Spalte ist in den meisten Fällen ausreichend.
    2. In 1x Phosphatase-Inhibitor, 1x Proteaseinhibitor und 1x Bindungsverstärker (optional) und mischen durch das Rohr mehrmals schnippen.
      Hinweis: 100x BindungEnhancer besteht aus 750 mM MgCl 2 und 300 mM ZnCl 2. Hinzufügen Bindungsverstärker, wenn die Bindung des TF an DNA auf Cofaktoren oder Reduktionsmittel abhängig ist. Wenn diese Informationen nicht bekannt ist, fügen Sie den Bindungsverstärker.
    3. In 10 ul 5 uM biotinylierten Fänger-DNA (50 pmol) zu jeder jeweiligen Bindungsmischung. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Die Inkubationszeit und Temperatur variieren in Abhängigkeit von der TF. Die optimalen Werte müssen experimentell bestimmt werden.
  4. 100 l Streptavidin-Mikrokügelchen. Inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur.
  5. Für jede Oligo-Sonde getestet, legen Sie eine verbindliche Spalte in der Magnetscheider. Legen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen direkt unter jeder Bindungssäule und anwenden 100 ul Bindungspuffer der Säule zu spülen.
  6. Pipettieren den Inhalt der einzelnen Bindungsmischung in separaten Spalten und die Flüssigkeit vollständig durch die Säule in die Mikro fließenRohr, bevor Sie fortfahren. Achten Sie darauf, die Spalten mit der Variante Oligo zu kennzeichnen, die in der Bindungsmischung verwendet wurde. Beschriften Sie die Flow-Through-Proben und ersetzen sie durch neue Mikrozentrifugenröhrchen, die mit geringer Stringenz Waschungen zu sammeln.
  7. Bewerben 100 ul niedrig stringenten Waschpuffer auf die Säule; warten, bis die Säule Behälter leer ist. Wiederholen Sie waschen 4x. Beschriften Sie die niedrigen Stringenz Waschproben und ersetzen sie durch neue Mikrozentrifugenröhrchen, die mit hoher Stringenz Waschungen zu sammeln.
  8. Anwenden 100 ul hoher Stringenz-Waschpuffer auf die Säule; warten, bis die Säule Behälter leer ist. Wiederholen Sie waschen 4x. Beschriften Sie die mit hoher Stringenz Waschproben und ersetzen sie durch neue Mikrozentrifugenröhrchen die Vorelution zu sammeln.
  9. In 30 ul nativen Elutionspuffer auf die Säule und lassen Sie sich für 5 Minuten stehen. Beschriften Sie die Vorelution Proben und ersetzen sie durch neue Mikrozentrifugenröhrchen die Elution zu sammeln.
    Hinweis: Das ist nicht das gebundene Protein nicht eluieren; es wäscht die verbleibende hoher Stringenzaus dem Säulenpuffer und ersetzt sie durch Elutionspuffer die Effizienz der Elution zu maximieren.
  10. Fügen Sie einen zusätzlichen 50 ul nativen Elutionspuffer die gebundenen TFs zu eluieren. Für eine höhere Ausbeute, aber weniger konzentrierte Eluat, fügen Sie eine zusätzliche 50 ul nativen Elutionspuffer und die Durchfluss sammeln.
    Hinweis: Analysieren Elution Proben durch Massenspektrometrie 32 die Identität des gebunden TFs zu bestimmen. Anschließend überprüfen Sie die Proteom - Ergebnisse durch Natriumdodecyl- Sulfit - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) , gefolgt von einem Western - Blot - 33. Wenn Massenspektrometrie nicht verfügbar ist, führen Sie eine Silberfärbung unter Verwendung von Standard-Technik anstelle eines Western-Blot, der die Größe des Proteins (e) zeigt Genotyp-abhängige Bindung zu bestimmen. Verwenden Sie diese Informationen zu verengen die Liste der vorhergesagten TFs von den Rechenansätze in der Einleitung beschrieben.

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Representative Results

In diesem Abschnitt repräsentative Ergebnisse von dem, was zu erwarten, zur Verfügung gestellt, wenn ein EMSA oder DAPA Durchführung und die Variabilität in Bezug auf die Qualität des Lysats gekennzeichnet ist. Beispielsweise wurde vorgeschlagen, dass mehrere Male Einfrieren und Auftauen Proteinproben in Denaturierung führen kann. Um die Reproduzierbarkeit der EMSA-Analyse im Rahmen dieser "Frost-Tau" Zyklen, zwei 35 bp Oligos unterschiedlichen an einer genetischen Variante wurden mit einer einzigen Charge von Kern Lysat zu erforschen inkubiert, die aufgetaut und wieder eingefroren wurde für die angegebene Menge . Male Abbildung 2 zeigt , dass Einfrieren und Auftauen dieser besonderen B-Lymphozyten - Zellkernextrakt bis zu 5 mal hat anscheinend keine Wirkung auf die Integrität der Proteine; jedoch Stabilität von Kernprotein variiert von Proben und sollte daher auf jeder einzelnen Zelllinie verwendet, getestet werden. Es ist auch möglich Variation von verschiedenen batch prepar habentionen der Kern Lysaten. Ob diese Variante aufgrund der Phase des Zellzyklus wird vor der Lyse, Zellpassage Nummer oder anderen Faktoren ist es wichtig, EMSA Ergebnisse mit verschiedenen Chargen von Lysat zu replizieren realen Ergebnisse sicherzustellen.

Zusätzlich ist es wichtig, das Signal-Rausch-Verhältnis für die EMSA zu optimieren. Eine wichtige Größe hierbei ist die Oligo-Konzentration. Die Menge an Oligo (5-300 fmol) wurde zu beurteilen titriert , wie verschiedene Mengen von Oligos beeinflussen das Signal (Abbildung 3). Eine Erhöhung der Intensität der Bande wurde bis zu 100 fmol von Oligo beobachtet. Nach diesem Punkt ist das Signal, was darauf hindeutet, Plateaus 100 fmol der optimale Oligo Menge für diesen EMSA Reaktion.

Schließlich eine repräsentative Figur von einem unserer veröffentlichten Studien Teil der Strategie in diesem Manuskript beschrieben unter Verwendung vorgesehen ist (Abbildung 4). in thStudie 34 wird haben wir gezeigt , dass der Lupus-assoziierter Risiko Allel von rs6590330 Erhöhungen von STAT1, einem Transkriptionsfaktor - Bindungs ​​, die stromabwärts von dem Typ - 1 - IFN - Rezeptors in sowohl synergistische Aktivierung und Hemmung der Genexpression komplex 35 teilnimmt. In diesem Beispiel wurde zuerst von STAT1 DAPA gefolgt von Proteom-Analyse unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt Tandem-Massenspektroskopie (DAPA-MS) identifiziert. Ein DAPA-Western-Blot wurde verwendet, um die TF von Proteomanalyse (STAT1) identifiziert, um zu bestätigen und bestätigen, dass die phosphorylierte Form von STAT1 an den Nicht-Referenz wurde Bindung (Lupus-Risiko) Oligo. Diese Figur zeigt, wie die verschiedenen Assays, die in dieser Strategie verwendet werden können Differenzfaktor Bindung von Transkriptions zu einer nicht-kodierenden Variante zu identifizieren.

Figur 2
Abbildung 2: Analyse der Reproduzierbarkeitund die Folgen der Gefrier-Auftau - Zyklen auf EMSA Ergebnisse. Oligos die Referenz (R) oder nicht-reference (NR) Allel eines genetischen Variante enthielten , wurden verwendet , um die gleichen Herstellungs Lysat nach mehreren Zyklen von Einfrieren und Auftauen zu sondieren. (Lys: Lysate). Jede Spur enthält die freie Sonde am unteren Rand des Gels (blauer Pfeil). Bindung der TFs an das Oligo kann als Band in der oberen Hälfte des Gels (roter Pfeil) gesehen werden. Bands in der unteren Hälfte des Gels enthalten (siehe Klammer) sind unspezifisch. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Fig . 3: Die Bewertung der Wirkung verschiedener Konzentrationen oligo Verschiedene Konzentrationen von Oligos wurden eine einzelne Zubereitung von Kern Lysat Sonde verwendet. Fluorescent Signal steigt mit erhöhten Mengen Oligo, was darauf hinweist, dass das Oligo das begrenzende Reagenz ist. Die Signal Plateaus an den 100-300 fmol Gassen, wo die Menge an Protein der limitierende Reagenz wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Der Lupus-Risiko - Allel von rs6590330 erhöht STAT1 Bindung, wie beurteilt durch DAPA-MS STAT1 und Pstat1 zeigen eine höhere Bindung an Oligos das rs6590330 Risiko - Allel im Vergleich zu den nicht-Risiko - Allel enthält.. Biotin-markierten Oligos wurden mit Epstein-Barr-Virus-transformierten B-Zellkernextrakt inkubiert. Proteine, gebunden an die Oligo wurden mit DAPA erfasst. Proteine ​​wurden dann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und detektiert unter Verwendung von anti-Pstat1(A) oder anti-STAT1 (B). M: Marker. NR: Oligo die Nicht-Risiko-Allel von rs6590330 enthält; R: Oligo das Risiko-Allel von rs6590330 enthält; Mutant: Oligo ein unterbrochenes mutmaßliche STAT1-Bindungsstelle stromabwärts von rs6590330 enthält; Zelllysat: Kernextrakt aus B-Zellen. Die relativen Intensitäten der Banden sind unter jeder Band angezeigt. Ergebnisse sind repräsentativ für vier Versuchen; während alle Versuche zeigen in 2/4 Experimenten keine STAT1 oder Pstat1 wurde im Immunpräzipitat aus dem nicht-Risiko oligo detektiert STAT1 Bindung an die Sonden mit dem Risiko-Allel, erhöht, während beide in dem Immunpräzipitat aus der Risiko oligo nachgewiesen wurden. Diese Zahl hat sich von der Referenz 34 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Obwohl Fortschritte in der Sequenzierung und Genotypisierung Technologien stark unsere Fähigkeit, mit der Krankheit genetische Varianten assoziiert zu identifizieren verbessert haben, unsere Fähigkeit, die Funktionsmechanismen von diesen Varianten betroffen zu verstehen, hinkt. Eine wichtige Ursache des Problems ist, dass viele krankheitsassoziierten Varianten in n angeordnet sind on-kodierenden Regionen des Genoms, die wahrscheinlich Einfluss auf schwieriger zu sagen voraus Mechanismen Genexpression steuern. Hier stellen wir ein Protokoll auf der Grundlage der EMSA und DAPA Techniken wertvolle molekulare Werkzeuge zur Identifizierung von Genotyp-abhängig TF Bindungsereignisse, die auf die Funktion von vielen nicht-kodierenden Varianten wahrscheinlich bei. Obwohl diese beiden Techniken wurden in der Vergangenheit ausgiebig verwendet haben, haben sie erst seit kurzem für die genetische Variante Analyse der TF-Bindungs ​​angepasst. Jenseits TFs, EMSA können auch 36 die Wirkung der genetischen Varianten auf RNA - Bindungsproteine ​​mit nur geringfügigen Anpassungen des Protokolls zu analysieren.

ove_content "> Das Protokoll hier vorgestellten einfach und leicht durchzuführen;. Gleichwohl müssen bestimmte Teile erfordern zusätzliche Überlegungen vor dem Experiment Zunächst ist es wichtig, eine erste Liste von Varianten zur Prüfung durch die Durchführung strengen statistischen Analysen wurde ein Fehler bei diesem Schritt zu erzeugen. können alle Downstream-Analysen entgleisen, wie viele Varianten unterschiedlich nuklearen Lysat binden, können zu Krankheitsrisiko ohne beitragen. Darüber hinaus kann die Verwendung von funktionellen Genomik Daten in relevante Zelltypen ausgeführt ist von entscheidender Bedeutung, als irrelevant Zelltypen auf die Erzeugung von falsch positiven TF führen Bindung Prognosen. Derzeit sind die am häufigsten verwendeten funktionelle Genom Ressourcen 17 ENCODE 12 und Roadmap Epigenomics enthalten. weitere Informationen zur Genexpression in Zelltypen relevant für eine Krankheit von Interesse kann von anderen Ressourcen wie ImmGen 37, 38 BioGPS erhalten werden, 39 und SNPsea 20 , z. B. solche Resources können diese TFs enthalten TF Bindung Vorhersagen zu filtern, um nur verwendet werden, die in den relevanten Zelltypen exprimiert werden.

Es ist auch wichtig , um die Einschränkungen von in vitro - Experimenten, wie EMSA und DAPA zu betrachten. Insbesondere ist es notwendig, Experimente mit getrennten Kern Lysat Vorbereitungen zu wiederholen falsch negative Ergebnisse zu reduzieren. Darüber hinaus wird ein erfolgreicher EMSA-Supershift kann im EMSA Band als weitere Verschiebung darstellen, in denen Antikörper gegen den TF bindet, oder einem Verlust von Band, in dem Antikörper blockiert die DNA der TF-Bindungsdomäne. In beiden Szenarien einschließlich eines Isotyp-Kontrollantikörper und / oder einen Antikörper gegen einen anderen TF ist nützlich in der Spezifität der Supershift bestätigt. Eine weitere Überlegung in einen Supershift ausgeführt wird, ob DTT / Polysorbat in der Reaktion enthalten. DVB-T / Polysorbat stabilisiert den Laden Farbstoff für eine genauere Quantifizierung der ungebundenen DNA zu ermöglichen; sie kann jedoch auch Disulfidbindungen von Antikörpern zu reduzieren führening in Ausfall von EMSA-Supershift. Es wird empfohlen, Reaktionen mit und ohne DTT / Polysorbat zu versuchen, wenn man versucht, einen Komplex zu Supershift. Die optimale Menge an Poly d (IC) und Lachssperma-DNA pro Reaktion muss experimentell durch Titration bestimmt werden. Im Allgemeinen wird ein Bereich von 1-6 ug Poly d (IC) und 50-500 ng Lachssperma Titrieren ausreichend. Eine nützliche positive Kontrolle für DAPA umfasst eine Konsensussequenz für eine TF mit einem gut charakterisierten Bindungsmotiv verwendet (erhalten von Datenbanken wie CIS-BP 23 oder Factorbook 40) und einen westlichen mit einem Antikörper spezifisch für diese TF läuft. Für beide Assays kann eine verwürfelte Oligo verwendet werden, um zu zeigen, daß jede beobachtete Bindung ist spezifisch für die Oligos von Interesse.

Sowohl die EMSA und DAPA Techniken haben experimentellen Einschränkungen. Beispielsweise die Bindungsaffinität zwischen einer TF und DNA wird zum großen Teil durch den Pufferbedingungen beeinflusst. Im Idealfall sollten Pufferbedingungen, die endogene conditio nachahmenns des Kerns für eine optimale Bindung zu ermöglichen. Für EMSA, ganz in einem schwachen Band oder den Verlust eines Bandes führen kann falsche Pufferbedingungen. Für DAPA, kann es zu nicht idealen Bedingungen die TF (n) während der Waschschritte eluiert werden. Daher ist jeder Test nur wirksam bei der Identifizierung von TF-Oligo unter bestimmten Pufferbedingungen verbindlich. Die am meisten allgemein nützlichen Pufferbedingungen sind im Protokoll oben dargestellt. Eine zweite Einschränkung ist, dass die experimentellen Ergebnisse von EMSA und DAPA Methoden wenig Informationen über die Mechanismen, durch die TFs binden an die Oligos bereitzustellen. TFs konnte direkt an Oligos binden oder durch andere Faktoren eingestellt werden. Dementsprechend ist es wichtig, die Oligo-Sequenzen rechnerisch zu analysieren, um vorherzusagen, wie TFS Oligos binden könnten und diese Voraussagen experimentell überprüfen. Beispielsweise kann eine spezifische Bindungssequenz mutiert werden oder ein Bindungspartner experimentell abgereichert werden kann. Schließlich muss die Menge an Extrakt verwendet für jedes Experiment t titriert werdeno erwerben optimale Ergebnisse. Zu viel Lysat kann die TF-Oligo-Bindung und verschleiern jede differentielle Bindung zwischen Risiko und nicht-Risiko-Allele zu sättigen. Zur weiteren Fehlersuche kann der Leser auf mehrere ausgezeichnete Bewertung und Methode Manuskripten 30,41,42 beziehen.

Zusätzlich zu den hier beschriebenen Assays, gibt es eine Vielzahl von in vivo - Tests zur Verfügung , um die Rolle von Varianten innerhalb von lebenden Zellen untersucht (Figur 1 unten). Chromatinimmunpräzipitation gefolgt von Allel-spezifische quantitative Polymerase - Kettenreaktionen (ChIP-qPCR) Untersuchungen durchgeführt werden können , um festzustellen , ob die Differential innerhalb der in - vitro - Assays beobachtet Bindung wird in lebenden Zellen 34 repliziert. Wenn beispielsweise Zellen heterozygot für eine Variante von Interesse verwendet werden, können qPCR-Experimente, den Unterschied in Anreicherung zwischen den beiden Allelen in TF immunpräzipitiert Chromatin zu erkennen. ChIP erfordert spezifische ChIP-Grade-Antikörper; however, wenn ChIP-grade TF Antikörper nicht verfügbar sind, ist es, Zellen mit einem Flag-markierten TF Transfizieren eine wirksame Alternative 43. Zusätzlich kann die Wirkung der differentiellen Bindung an Zielgenexpression durch Expression quantitative trait loci (eQTL) -Analyse in entsprechenden Zelltypen unter Verwendung von lokal gesammelten Expressionsdaten aus genotypisiert Zellen oder öffentlich verfügbaren Ressourcen wie die von Genevar 44 zusammengestellt sucht werden. Luciferase-Reporter-Assays können auch den Grad, zu erforschen verwendet werden, auf die Bindung des Proteins differentiellen Genexpression auswirkt. Solche Tests können unabhängig davon zu arbeiten , modifiziert werden , ob die Varianten in einem Promotor, Enhancer oder Repressor - Region 45-47 befinden. Schließlich genomBearbeitungsTechnologien wie CRISPR / Cas9 48 kann verwendet werden , um Zelllinien zu erzeugen , die nur an einer einzigen Variante unterscheiden, die zur Bestätigung der Verursachung von entscheidender Bedeutung ist. Solche Technologien können die experimentelle Varianz beobachtet betw wesentlich reduziereneen Zelllinien aus genetisch diversen Fächer abgeleitet, da funktionelle Auslesungen Analysieren Genexpression oder einen anderen Krankheitszwischen Phänotyp kann auf der bearbeiteten Zelle-line durchgeführt werden, und im Vergleich zu nicht-bearbeiteten Zelllinien.

Der Hauptvorteil der Strategie präsentiert ist, dass es eine einfache und schnelle Erkennung von Genotyp-abhängige TF ermöglicht Bindung. Durch Priorisierung können die wichtigsten genetischen Varianten, weitere Experimente entwickelt werden, um ihre biologische Wirkung zu identifizieren und deren Kausalität demonstrieren. Bemerkenswert ist, kann dieses Protokoll angewendet werden, um jede Krankheit oder Phänotyp assoziiert Variante von GWAS oder Feinkartierung identifiziert zu untersuchen. Eine große, wachsende Fundus an genetischen Daten und Listen von statistisch assoziierten genetischen Varianten ist bereits verfügbar. In den meisten Fällen ist die biologischen Mechanismen statistische Assoziation dieser Varianten der Fahrt nicht klar. Die Strategie in diesem Vorschlag skizzierten ermöglicht eine genaue funktionelle Interpretation der vielen nicht-kodierenden disease-assoziierten Varianten. Dieses Wissen ist für die vollständige Aufklärung der molekularen Mechanismen von entscheidender Bedeutung jedes genetische-basierte Krankheit zu fahren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom DNA Oligonucleotides Integrated DNA Technologies http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500 KCl, for CE buffer
HEPES (1 M) Fisher Scientific 15630-080 For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0 Life Technologies R1021 For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1 NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0 Invitrogen BP1756-100 For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher Scientific MT21040CM PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1 M) Sigma 646563 Reducing agent
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 87786 Prevents catabolism of TFs
Phosphatase Inhibitor Cocktail  Thermo Scientific 78420 Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute IBI Scientific IB01140 NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit Licor 829-07910 Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells Invitrogen EC6265BOX For EMSA
TBE Buffer (10x) Thermo Scientific B52 For EMSA
FactorFinder Starting Kit Miltenyi Biotec 130-092-318 Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx Licor Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contains 10,000 units/ml of penicillin, 10,000 µg/ml of streptomycin, and 25 µg/ml of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079 FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium Gibco 22400-071 Contains L-glutamine and 25 mM HEPES

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