正常に伝達する初代ヒト気管支上皮細胞に必要な最適なレンチウイルスの生産および細胞培養条件

Biology

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Baumlin-Schmid, N., Salathe, M., Fregien, N. L. Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e54176, doi:10.3791/54176 (2016).

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Abstract

初代ヒト気管支上皮(HBE)細胞のインビトロ培養気液界面条件を用いて気道細胞の分化と機能の過程を研究するための有用なモデルを提供します。過去数年間で、導入遺伝子の送達のためのレンチウイルスベクターの使用は、一般的な慣行となりました。特定の非HIV擬似型付けされたレンチウイルスと完全に分化した気道上皮細胞の形質導入の報告がありますが、全体的な形質導入効率は、通常15%未満です。ここで紹介するプロトコルは、レンチウイルスを生成すると、一次ヒト気管支上皮細胞を形質導入するために信頼性の高い効率的な方法を提供します。細胞が付着しながら4の感染因子の多重度で、未分化の気管支上皮細胞、気管支上皮増殖培地で形質導入を使用すると、100%に近い効率を提供します。このプロトコルは、高力価のレンチウイルスベクターの、ステップ・バイ・ステップ、準備と集中を説明し、第電子伝達プロセス。これは、初代ヒト気管支上皮細胞の高効率形質導入を達成するために最適な培養条件を決定した実験について説明します。

Introduction

複製欠損、偽レンチウイルス(LV)の開発は、 インビトロ 1 導入遺伝子を提供するために、安全かつ効率的な方法で研究者に提供してきました。それらの長期発現のために、これらのLVはまた、 インビボ 2,3 における治療剤の送達のために使用することができます。トランスファーベクター、パッケージングのgag / POL、パッケージ回転 、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G)プラスミドエンベロープ:LVの製造は、いくつかのプラスミドを有するヒト胚腎臓(HEK)細胞の同時トランスフェクションを必要とします。 rev遺伝子は、別々のパッケージングプラスミド上にコードされているため、第三世代のパッケージングシステムは、それによって複製コンピテントレンチウイルスを生成するための組換えの可能性を低減する、第二世代のシステムよりも安全と考えられています。第二世代のパッケージングシステムが5倍高い総伝達ユニットを得ているが、元のウイルスゲノムの分割が作成します第三世代のシステムは、最小限3,4形質導入のレベルを減少しました。

細胞株は、より容易かつ効率的に形質導入することができるが、これらは、 インビボの組織5,6のより代表的なものであるため、研究者らは、一次細胞へのフォーカスをシフトしています。しかし、初代細胞は、形質導入に不応性です。完全に分化した気道上皮細胞の形質導入が報告されているが、全体の効率は15%7を超えいません。

ここで説明した高力価のLVの製造を可能にするプロトコルです。ステップバイステップのアプローチは、一次HBE細胞中にほぼ100%の形質導入効率を達成するために概説されています。具体的には、プロトコルは、3を成功するために尽力し、最適な培養条件を説明します。簡単に言えば、HEK 293T細胞を、強化緑色蛍光のEF-1プロモーター駆動発現を有するレンチウイルス発現ベクターpCDHを用いてトランスフェクションされていますタンパク質(EGFP)またはmCherryを、赤色蛍光タンパク質、および第三世代のパッケージングシステム。培地中に放出されたLVは24〜72時間後に回収されています。ウイルス粒子は、p24抗原の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを用いて力価を推定する前に、ポリエチレングリコール(PEG)、ウイルス濃度の便利で簡単な方法で濃縮されています。 、4の(トリプシン処理された後)、感染の多重度(MOI)因子を取り付けるヘキサジメトリンブロミドを添加し、16時間インキュベートしながら、その後、未分化の一次HBE細胞(増殖培地(気管支上皮成長培地またはBEGM)8で形質導入され一晩)。次いで、細胞を分化させます。ウイルス導入遺伝子は(説明を参照してください、適切なプロモーターを用いて)、長期発現されるので、式は多列気道上皮への分化を通して維持されますまたは分化後(誘導性プロモーターを使用して)誘導することができます。

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Protocol

1.ステージ1:HEK 293Tの文化

  1. 高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%(v / v)のウシ胎児血清(FBS)および1%(v / v)のペニシリン/ストレプトマイシンを添加することにより(HEK媒体という)HEK細胞の培地を調製します。
  2. コー​​トコラーゲンのコラーゲンI.ミックス30μlの私の蒸留水2ml中で1 10cmの組織培養皿。皿にミックスを広げ、37℃で2時間、5%CO 2インキュベートします。
  3. ミックスを削除し、15分間クリーンベンチ内の食器乾燥させます。
  4. 10ミリリットル中に1×10 6細胞の密度HEKメディアでコーティングされたディッシュ上にプレートHEK細胞と、37℃、5%CO 2でインキュベートします。
  5. HEK細胞50〜60%コンフルエント( 図1a、メッキ後2-3日)である場合、密集度の2視覚的評価が十分にあるステージに進みます。いいえ定量化は必要ありません。
    注:HEK細胞(上記参照)HEK培地中で培養されます。彼らはコンフルエントに達し、トンちょっと分割( 例えば 1/5)以降の使用のためにダウンして凍結することができます。

2.ステージ2:HEK細胞でのレンチウイルス(LVの)の生産と集中

注:プロトコルは、BSL-2 USAで+(拡張BSL-2)の条件で、制度や政府の規制に沿って実行する必要があります。

  1. カルシウム沈殿法を用いてトランスフェクト(リポフェクタミンおよび他のトランスフェクション剤がカルシウム沈殿法ほど効率的ではなかったです)。次のように手順が変更されたものの商業トランスフェクションキットの使用は、再現性を確保することをお勧めします。室温にすべての試薬を持参。これは、0日目です。
  2. HEK293細胞のそれぞれ10cmディッシュの場合は、エンベロープDNA PMD2-VSVGの4.5μgの、7.5μgのDNA pMDLg / pRREを包装、3.75μgのDNAのpRSV-REV、レンチウイルス発現ベクター10μgのDNA、2 Mカルシウム溶液の86μLを混ぜます700μlの最終容量に15mLの遠心管中に、滅菌水(後者の二つの溶液を、市販のトランスフェクションキットで提供されています)。
  3. (待っている間、ステップ4を実行)、賢明なドロップボルテックスしながら(クリーンベンチ内で)(トランスフェクションキットで提供さHBS)2×HEPES緩衝生理食塩水の700μlを添加し、30分間室温でインキュベートします。
  4. 初期のインキュベーション時間の間に、スライド上のミックスの堆積物5μlの。ゆっくりと上下に焦点を当て、10倍の対物レンズと顕微鏡下での液滴を確認してください。微細な沈殿物が、リン酸カルシウム沈殿法を確認し、可視であるべきである( 図1B)。
  5. 混合するために上下HEK細胞メディアやピペットの10ミリリットルを追加することにより、30分後、沈殿を停止します。
  6. ステップ2.1から2.5からHEK細胞の皿を取り、そして培地(0日目)を削除します。皿の縁に沿って慎重にゆっくりとステップ2.5からの沈殿物の溶液を加えます。
  7. 次の日(1日目)には、削除して、沈殿物を含む培地を破棄し、wはそれを置き換えますHEK媒体のi番目の10ミリリットル。顕微鏡下で微細な沈殿を確認してください:それは、細胞( 図1cd)の間の空きスペースに皿に表示されるはずです。
  8. 2日目に、シリンジを用いて40%のポリエチレングリコール(PEG)溶液3.8 mlを含有する15mLの遠心管に0.45μmのシリンジフィルターを通してフィルター媒体を集めます。ウイルスコレクションのすべてが完了するまで反転5Xは、(PEGを形成するために、沈殿したが、もはや5日以上の場合)、少なくとも24時間、4℃で混合し、ストアします。
  9. 4日目3日目と4上の手順を繰り返し2.8は、HEK培地と交換したが、10%の漂白剤で除染し、皿を破棄することはありません。
  10. 遠心分離機すべてのコレクションチューブ(通常は5日目に一緒にすべてのコレクション)4℃で20分間、1650×gでは、ウイルスをペレット化します。削除し、上清を捨て、そして収集し、任意のPEG上清の残りを除去するために、4℃で5分間、1650×gで再びスピン。
  11. Resus保留アムホテリシンB 8なし気管支上皮成長培地(BEGM)の200μl中各管のペレット。それらを一緒にプールし、200μlにアリコート。 -80℃で保存ウイルス。 HIV-1のGag(P24)抗原ELISAアッセイを実行するために追加の10μLを分注し。
  12. 市販のELISAキットを用い、製造業者のプロトコルに従ってp24抗原アッセイを行います。アッセイは、pg / mlで中のウイルスのp24の推定を与えます。

3.ステージ3:文化初代HBE細胞

  1. 10 mlのBEGM培地でプレートHBE細胞はIを10cm組織培養皿コーティングされたコラーゲンで1×10 6細胞の密度で(100μlのアムホテリシンBで継代0細胞は、可能な真菌の汚染を除去するために使用される場合)。 37℃で培養し、5%CO 2。
  2. 翌日、培地を除去し、4日間の合計(継代0細胞のための100μlのアムホテリシンBを含む)10ミリリットルBEGMと交換してください。インキュベーターに戻します。
  3. 4日後にAYS、一日おきにアムホテリシンBを変更メディアなしのみBEGMを使用します。
  4. 細胞が80〜90%のコンフルエント( 図2a;〜7日めっき後)である場合には、形質導入を進める(形質導入前の準備のために3.5に注意を払います)。再び、密集度の視覚的評価で十分です。いいえ定量化は必要ありません。
  5. 形質導入の前に、コートコラーゲンIV溶液で透過性支持体の挿入は、無菌蒸留水で1/10に希釈しました。各インサートに200μlを添加して、クリーンベンチ内で一晩乾燥してみましょう。

4.ステージ4:HBE細胞の形質導入

  1. 、メディアを削除するリン酸緩衝生理食塩水(EDTA / PBS)中に1mMのエチレンジアミン四酢酸中の0.1%トリプシンを3mlを添加し、37℃、5%CO 2で5分間インキュベートします。すべてのセルが切り離されているかどうかを確認するために、顕微鏡(10倍対物レンズ)の下で確認してください。ない場合は、さらに5分間インキュベーターに戻します。
  2. 全ての細胞が分離されている場合、3を追加大豆トリプシンインヒビターのミリリットル(SBTIを1mg / ml)を、混合し、15mlの遠心管に移します。室温で5分間、460×gで回転させて細胞をペレット。
  3. BEGMの3ミリリットルに上清および再懸濁ペレットを削除して、カウントを進めます。
  4. BEGM400μlの( 表2参照)内の1つの12ミリメートルの透過性支持体インサートあたり2×10 5細胞の割合で再懸濁HBE細胞(今継代1またはP1)。形質導入される透過性支持体インサートの量に基づいて、これらの数値を推定。
</ TR>
表面 表面積 細胞計数 メディア ボリューム(メディア)
10cmディッシュ cm 2の52.7 1×10 6 BEGM 10ミリリットル
12ミリメートルフィルター 1.13センチメートル2 2×10 5 BEGM 400μlの
た24mmフィルター 4.52センチメートル2 8×10 5 BEGM 800μlの

表2:細胞数あたりのメディアの外挿。

  1. 4の感染(MOI)因子の多重度を使用して、細胞懸濁液にウイルスの適切な量を追加します。
  2. 2 / mlの最終濃度に臭化ヘキサジメトリンを追加します。
  3. 先端区画に挿入透過性支持体あたりのミックス(BEGM、HBE細胞、ウイルスおよび臭化ヘキサジメトリン)の400μLを分注し、および側底コンパートメントに単独BEGMの1ミリリットルを追加します。該当する場合は、必ずコントロールおよび試験ピューロマイシン選択としてウイルスなしHBE細胞をプレート37℃で一晩インキュベートし、5%CO 2。
  4. 翌日、レムオベ頂端および側底メディアは、PBSで洗浄し、気液界面(ALI)メディア8との両方の区画を交換してください。
  5. 細胞がコンフルエントである場合、(気液界面を確立するとして知られている)頂端流体を除去。彼らは完全な成熟に達するまで、ボトムコンパートメント日おきに培地(ALI)を変更し続けます。通常3〜4週間後。
    注:レンチウイルスベクターは、ピューロマイシンのような選択遺伝子が含まれている場合、細胞は、選択濃度曲線に従ってピューロマイシンを添加することによって選択することができます。 HBE細胞は、を1μg/ mlの濃度で形質導入した細胞の一貫した選択するための理想的であることが決定されています。しかし、この濃度は、他の細胞または条件ごとに異なる​​可能性があり、カーブを殺すことによって決定されるべきです。ピューロマイシンの添加は、メディアが選択遺伝子の完全な発現を可能にするALIメディアまたはそれ以降(2-3日)に置き換えられました後、早ければ1日として開始することができます。その時間1インサートにピューロマイシンを追加してください形質導入されていません。細胞が完全に分化されるまで、ピューロマイシンを添加することができます。

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Representative Results

図1は、トランスフェクションプロセス中に細胞およびソリューションを評価する別の重要なステップを示している。 図1aは、従来のウイルス産生のためのトランスフェクションHEK293T細胞の最適なコンフルエンシーを示します。細胞をシャーレ全体に均等に分配されることが重要である。 図1bは、明視野光学と10倍の対物レンズを用いてトランスフェクション混合物の低下に沈殿物を明らかにする。より多くの析出物は砂粒よりもむしろ凝集塊のように見え、より効率的なトランスフェクションになります。この絵では、沈殿物は、ビット粗いです。沈殿物をトランスフェクションは、ウイルスの高力価を生成するかどうか信頼できる指標です。成分のいずれかが欠落しているか、品質に問題(例えば、ベクターDNA)のいずれかである場合、凝集体は不吉な兆候である、形成されます。このような場合は、その確認して、手順を中止して再起動する賢明です全ての成分は混合されている、および/ ​​またはベクターDNAとパッケージDNAの品質をチェックする。 図1Cは、一晩のインキュベーション後に、Aと同じ料理を示します。沈殿物は、細胞間に表示され(とすべきです)。我々は、細胞が24時間後、トランスフェクション時にあまり増殖しないことに気づきました。

図2は、HBE細胞が前に見て、3日間形質導入後方法を示します。 図2aは、トリプシン処理の前および形質導入の約80%コンフルエントの一次HBE細胞を示しています。 80%コンフルエンスで10cmディッシュは約4×10 6細胞が得られる。 図2bは、透過性支持体の挿入時に4のMOIを使用して、未分化P1 HBE細胞のほぼ100%伝達を示しています。 HBE細胞は、これらの通気性支持インサート上に播種された場合、細胞は、比較的平坦です。この絵では、細胞の高さは、理由を説明し、わずか数ミクロンであります0.4μmの細孔は、細胞かかわらず表示されます。

図3は、提示プロトコルにつながる最適化実験を示しています。全ての実験は、ウェルあたり2×10 5の一次HBE細胞を、コラーゲンIコートしたウェル(24ウェルプレート)上に三連で行われています。ほとんどの実験はBEGMメディアbromideinヘキサジメトリンを2μg/ mlの最終濃度で0.4のMOIを使用していました。蛍光細胞は、3日目の形質導入後に計数しました。プロトコルの最初の最適化は、プラスチック上で実行されているにもかかわらず、結果は、透過性支持体の挿入に確認されています。また、以前の報告を確認する(データは示していない)成功しなかった完全に分化したP1 HBE細胞を形質導入することを試みます。 図3aに見られるように、HBE細胞の高い割合は、ALIに比べBEGM培地で形質導入されます。細胞はBEGM媒体に導入する前に、一日をメッキしている場合は、効率有意に細胞が( 図3b)を装着している間伝達に比べて低減されます。 P1 HBE細胞(代わりBEGMの)ALI培地中で形質導入の前日にプレーティングされた場合、形質導入効率(データは示されていない)がさらに減少します。これら2つの媒体間の差は、カルシウムの濃度です。 BEGMメディアはALIメディア(1 mM)のに比べ、カルシウム(0.1ミリモル)の低濃度が含まれています。カルシウムフォームとは、タイトジャンクションを維持し、ウイルス粒子が9を横断し、側底膜でその受容体にアクセスするために、したがって、それが難しくなる可能性があります。実際には、いくつかの感染症は、例えば10のためのエチレングリコール四酢酸(EGTA)を使用してタイトジャンクションを破壊することによって低レベルで成功しました。先に述べたように、完全に分化P1 HBE細胞は難治性であるとのみによる高カルシウム含有培地中でタイトジャンクションへの可能性が低い効率5-7、で形質導入することができます。以下のための別の説明完全に分化した細胞中の低形質導入効率は、粘液がバリアとして作用することができるアクティブな粘液線毛輸送機構です。バルシによって報告されているように、または、HBE細胞である、分化の段階は、形質導入効率10の決定要因です。より多くの細胞がALIのメディアに比べBEGMで形質導入されますという事実は( 図3a)、この文をサポートしています。

図3bに見られるような細胞を形質導入したときに装着しながら、ほぼ50%の形質導入効率の増加は、細胞と比較観察した前日に播種しました。形質導入は、トリプシン処理11の後に実行されたときに彼らの研究では、リックスらは、20%の増加を示しました。一緒に、これらの結果は、メディアや細胞の成熟の状態が導入成功の鍵であることを示唆しています。

中のパネル図3c、ヘキサジメトリンが導入効率にatrivial役割をbromideplaying示しています。それは負の影響を持っていないのでそれにもかかわらず、その使用は、このプロトコルで提案されているが、潜在的に有益である可能性があります。ヘキサジメトリンブロミドは、形質導入効率12を強化するためにウイルス学で使用されるカチオン性ポリマーです。その他には、他のカチオン性ポリマーをプロタミンの使用を公表しているが、有意な差は、臭化ヘキサジメトリン13と比較して、形質導入効率に関しては見つかりませんでした。臭化ヘキサジメトリンは成長や分化14-16には影響ません。

最後に、異なるのMOIは、 図3dに調査した:MOI 0.4は75%のみを形質導入したのに対し、最も高い形質導入効率は4のMOIで発生したMOI 0.4と4の間に有意差はなかった、しかし、MOI 4はHBE細胞の100%を形質導入しました。 MOIは、どのように多くのウイルス粒子のwiを定義します1細胞に感染する可能性があるでしょう。 MOIを決定するための異なる方法があります。それらの一つは、形質導入単位(TU)の数を定義することです。 ELISAを使用して、p24抗原の量は、pg / mlで決定することができます。ピコグラムにおけるウイルスのp24は、MOIを計算するために必要なTUに変換することができます。 MOIは細胞数によってTUの数を割ることによって計算されます。ピコグラムのp24あたり10-100形質導入単位(TU)があります。 MOIに関するテキスト内のすべての参照はピコグラムのp24あたり100 TUとの計算に基づいています。 (http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html)。

図1
図1:10X対物レンズ下で見たHEK 293T細胞のトランスフェクション (A)HEK 293T細胞を、50〜60%のコンフルエンシーまで増殖させました。 (b)は 、すべてのレアージュを混合した後、5μlのドロップ5分で目に見える沈殿物顕微鏡(10倍対物レンズ)下NTS。 (c)に一晩トランスフェクション(10×対物レンズ)以下、セルに次の皿に沈殿させます。 (d)(c)の中央の倍率。ホワイト指す矢印は、沈殿させました。スケールバー=100μmの。 a、b、cのための同じである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
2:NHBE 細胞の形質導入 (a)は、HBE細胞は、5日間BEGM培地中で80〜90%の密集度(約4×10 6細胞)(10×対物レンズ)にコラーゲンIコートディッシュで増殖させましたスケールバー=100μmです。 (b)は EGFPが透過性支持体インサート(12ミリメートル)、3日後に形質導入(共焦点、20X)にHBE細胞を形質導入しました。この状態では、HBEセル画 LSは平坦であり、膜の細孔が表示されます。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3:導入効率のメディアの伝達プロトコルの最適化 (a)の影響。装着しながら、(b)は HBE細胞における形質導入の比較は前日と細胞の形質導入をメッキ。 (c)の形質導入効率のヘキサジメトリンブロミドの影響。 (d)に異なるのMOIを使用して、改善された形質導入効率の評価。分析は、スチューデントt検定又はクラスカル・ワリス及びダンの多重比較検定を用いて行きました。エラーバーはSEを表し、全ての* P <0.05を表します。ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明するプロトコルは、100%の形質導入効率に近い保証します。しかし、この目標を達成するために重要な工程中のステップがあります。例えば、トランスフェクションプロセスの間に、日形質導入( 図1b及びd)の後、形質導入ミックス(ドロップ)または皿の中の析出物の存在は、両方の良いトランスフェクションのために関連しています。沈殿物または凝集体の存在の欠如が原因のトランスフェクション試薬の1つの省略、pHが発行、または不良のプラスミド調製物であることができます。沈殿物が存在しない場合は、いずれも次の日に表示されなくなる可能性が高いです。さらに、トランスフェクションおよび歩留まりを妨げ、HEK細胞をデタッチすることがありすぎて、高速トランスフェクション混合物またはHEKメディアを追加します。良好な収率の別の指標は、遠心分離工程の前に6日目である:白色沈殿物をチューブの底に見えるはずです。ほとんどと悪いトランスフェクション何のウイルスは、この白色沈殿物を作成しないだろう。導入プロセスの間に、脱分化し、高い形質導入効率を達成するために、状態のような幹細胞であるれている一次HBE細胞を使用することが重要です。簡単に可視化されるなどのeGFPまたはmCherryをのような蛍光タンパク質を含むベクターの使用は、良いツールとなることができます。

修飾は、異なる一次細胞にこのプロトコルを適合させることができます。一つの方法は、培地中のカルシウム濃度を低下させるであろう。 図3aに見られるように、BEGM培地を使用してカルシウムの低濃度を含有する一次HBE細胞において有意に高い形質導入効率をもたらしました。別のアプローチは、MOIを増加させることができました。 図3dは 、より高いMOI、より良い形質導入効率を示します。しかし、より高いMOIを使用すると、いくつかの細胞に対して毒性になる可能性があります。

それにもかかわらず、いくつかのlimitaがありますこのプロトコルへン。この技術は、通路1 HBE細胞を用いて開発されました。移植のために拒否された肺は、ヘルシンキ宣言によって設定された規格に準拠した研究のための適切な同意を得て入手しました。商業的供給源からの一次HBE細胞を得ることは、高価であることができます。これらの細胞はまた、通常より高いの通路でのみ使用可能です。このプロトコルは、別の制限要因は、p24のELISA抗原アッセイである2よりも高い通路にテストされていません。いくつかの企業は、キットを提供していますが、高コストで。テストは、レンチウイルスのp24および一過性トランスフェクション17の間にリリースされたフリーのp24を検出するため、また、アッセイによって与えられたウイルス濃度は、唯一の近似値です。したがって、MOIのこの評価はあくまでも目安です。最後に、異なる発現構築物(サイズが大きいまたは小さい)を使用すると、同じ結果が得られない場合があります。例えば、異なる効率はmCherryをおよびEGFP(データは示さず)を用いて記録しました。

ENT ">利点は、他の方法に比べて、このプロトコルにあります。そのうちの一つは、トランスフェクション法である。実際には、提案されたプロトコルは、ウイルスを含む収集したメディアは、もはや集中する必要がありますこのような高いウイルス力価を得ることができ、使用することができました直接ウイルスを濃縮するために、このプロトコルで使用される細胞。ポリエチレングリコール(PEG)を、形質導入する、哺乳動物細胞18に対して毒性であることが知られている。より高いMOIを使用した場合に加えて、これはさらに、毒性の危険性を増大させるであろう。しかし、 PEGの濃縮工程が古くなった場合、成功していない研究者は、レンチウイルスの使用を再考するかもしれない毒性効果による形質導入する。このプロトコルの別の利点は、プラスチック又は透過性支持体インサートの形質導入効率の違いがないことである。という利点をプラスチックに形質導入​​することは、細胞およびウイルス粒子が必要とされるより少​​ない。その結果、細胞は形質導入後に拡張し、転送することができるということですコンフルエント(データは示さず)の透過性支持体インサートの上に。

ベクターの選択は、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)などのピューロマイシンまたはマーカータンパク質の発現と形質導入した細胞の選択のようないくつかの問題に依存します。 (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre、pCDH-EF1-MCS-IRES-Puroを、pCDH-EF1-MCS-T2A-プーロ、をpGEM-Tイージー)15,19-21に適している利用可能な複数の市販のベクターがあります。一般的に使用されるCMVプロモーターは、分化した気道上皮細胞15にサイレンシングされているのでプロモーターの選択は、課題を提起します。繊毛細胞特異的発現のために、キツネ-J1プロモーターの使用が推奨されます。代替的に、EF-1プロモーターは、全ての気道細胞20,21における発現のために使用することができます。タンパク質の過剰発現が求められる場合には、挿入物の大きさは、部分的には、形質導入効率を決定します。しかし、大きなサイズは、全長可溶性アデニル酸シクラーゼ2の成功導入によって見られるように収容することができます2【選択ラボが公開しているいくつかの成功の過剰発現は、15,16,20-22を構築します 。 (通常、U6またはH1プロモーター下)shRNA発現のために、複数の構築物が検討される必要があります。これは、分化(PCRおよびウエスタンブロット法)の終了時に行わテストで退屈することができますが、未分化の細胞が分化を受ける細胞の成功の良い表現ではないかもしれないので、処理は省略することができません。ここでも、研究室ではshRNAのは14,20,21,23を構成する複数の成功を発表しました。

このプロトコルを使用して、より多くの研究者が大幅に以前の悪い形質導入を改善するために有効にする場合があります。いくつかは、それが有用ないくつかの調整を行うことで、効率性を高めるために見つけるかもしれません。一部では、新しい生物学的プロセスを発見するために、このツールを使用する場合がありますまたは両方がノックダウンまたは過剰発現戦略を使用して、コンセプトを証明することができるように。

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Acknowledgments

我々は肺を提供するためのマイアミ大学のライフアライアンスオルガン回復庁に感謝します。我々はまた、我々はまた、ガブリエルGaidoshに感謝図2Bおよび3-D、Cに図3(a)に実験に使用しmCherryをウイルス博士ベンGerovacとリサ・ノヴァクに示す実験に使用したDNA調製のために博士リサキュンチに感謝しますイメージング施設から、マイアミ大学眼科学科。

この研究は、NIH、CF財団博士マティアスSalatheへのフライトアテンダント医学研究所からの助成金が主催されています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293T/17 cells ATCC CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)  Sigma 12306C use at 10%
DMEM Thermo Scientific 11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x) Thermo Scientific 15140-122 use at 1x
Collagen I BD Biosciences 354231 dilute 1:75 in distilled water
Calphos Clontech 631312 Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000 VWR scientific 101108-210 stock of 40%
Amphotericin B Sigma A9528 use at 1x
Trypsin Sigma T4799
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9128
Transwell 12 mm Corning 3460
Collagen IV Sigma C7521 dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 stock of 2 mg/ml
Puromycin (10.000x) Thermo Scientific A11138-03 use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA PerkinElmer NEK050001KT
F12 Thermo Scientific 11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro System Biosciences CD532A-2 lentiviral expression vector
pMD2-VSVG Addgene 12259 packaging DNA
pMDLg/pRRE Addgene 12251 packaging DNA
pRSV-rev Addgene 12253 packaging DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
  2. Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
  3. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
  4. Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
  5. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
  6. Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
  7. Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
  8. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
  9. Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
  10. Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
  11. Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
  12. Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
  13. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
  14. Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
  15. Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
  16. Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
  17. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
  18. Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
  19. Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
  20. Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
  21. Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
  22. Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
  23. Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).

Comments

3 Comments

  1. Using the methodology described, were you able to get these Primary HBE's to fully differentiate after the lentiviral transduction?

    Reply
    Posted by: Eugene G.
    February 15, 2017 - 3:04 PM
  2. Hi Eugene. Yes, primary HBE cells differentiate just fine after the transduction. However, it depends what shRNA is used. If the gene silenced is important for the differentiation process, this might be an issue.
    Let me know if there is anything I can help you with. Here is my email address nschmid@med.miami.edu.

    Reply
    Posted by: Nathalie B.
    February 16, 2017 - 8:13 AM
  3. Yes, they differentiate very well. See refs 15 and 22 for examples.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 15, 2017 - 4:32 PM

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