الجمع بين الفحص المجهري نيون إينترافيتال (إيففم) مع النماذج الوراثية لدراسة ديناميات Engraftment الخلايا المكونة للدم لمنافذ نخاع العظام

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يتم تطبيق مجهرية الأسفار إينترافيتال (إيففم) كالفاريوم في تركيبة مع الوراثية نماذج حيوانية لدراسة صاروخ موجه وانجرافتمينت من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم (بي أم) منافذ.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, L., Kamocka, M. M., Zollman, A., Carlesso, N. Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches. J. Vis. Exp. (121), e54253, doi:10.3791/54253 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

أدلة متزايدة تشير إلى أن هيماتوبويسيس طبيعية وينظم العظة ميكرونفيرونمينتال متميزة في بي أم، التي تشمل منافذ الخلوية المتخصصة تحوير الوظائف الحيوية من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC)1،2. وفي الواقع، صورة أكثر تفصيلاً عن المكروية المكونة للدم يظهر الآن، التي تشكل بطانة العظم وعلى منافذ غشائي الوحدات الوظيفية لتنظيم HSC العادي وعلى ذرية3،4،5 . وأظهرت الدراسات الجديدة أهمية ارتشاح الخلايا، adipocytes والخلايا العصبية في الحفاظ على وتنظم HSC الدالة6،،من78. وعلاوة على ذلك، هناك أدلة على أن الخلايا من الأنساب المختلفة، أي من الخلايا النقوي واللمفاوية، والمنزل، ويقيمون في منافذ محددة داخل المكروية BM. تعيين كامل المكروية BM وركابها غير قيد التقدم.

السلالات المحورة وراثيا الماوس يعبر عن النسب المحددة علامات مضيئة أو الفئران المهندسة وراثيا إلى الافتقار إلى جزيئات المحدد في خلايا معينة من مكانة BM متوفرة الآن. المغلوب والنسب تتبع النماذج، في تركيبة مع النهج زرع الأعضاء، وتوفير الفرصة لصقل المعارف بشأن دور محدد "المتخصصة" الخلايا لتعريف السكان المكونة للدم، مثل HSC، ب-الخلايا، خلايا تي، الخلايا النقوي و خلايا محمر. يمكن أن تكون هذه الاستراتيجية potentiated كذلك بدمج استخدام اثنين-فوتون الفحص المجهري كالفاريوم. بتوفير في فيفو تصوير عالية الدقة والتقديم ثلاثية الأبعاد من كالفاريوم بي أم، ونحن الآن تحديد دقة موقع حيث الرئيسية في بي أم في المجموعات الفرعية المكونة للدم محددة وتقييم حركية توسعها على مر الزمن. هنا، يتم استخدام ليز-بروتينات فلورية خضراء الفئران المحورة وراثيا (تمييز الخلايا النقوي)9 ورببج الفئران المغلوب (ينقصها الإشارات الشق الكنسي)10 في تركيبة مع إيففم لتحديد engraftment الخلايا النقوي إلى المكروية BM معيبة درجة.

Introduction

مجهر الأسفار مولتيفوتون إينترافيتال (إيففم) هو تقنية تصوير قوية تسمح لعاليه الدقة في الوقت الحقيقي، والتصوير من الأنسجة بعمق يصل إلى 1 مم، اعتماداً على الأنسجة. عندما يطبق على كالفاريوم الماوس، يسمح بمراقبة سلوك الخلايا المكونة للدم داخل BM بطريقة غير الغازية يصل إلى 60-100 ميكرومتر11. يتم استخدام هذا النهج هنا لتحديد حركية engraftment المتكفل النقوي العادي في الفئران المغلوب BM رببج تفتقر إلى إشارات الشق الكنسي.

العمل مؤخرا من مجموعتنا أثبتت أن عيب المتعارف عليه الشق إشارات يؤدي المكروية BM ل مرض مثل ميلوبروليفيراتيفي12. حصل فقدان الإشارات الشق شرطية حذف مجال رببج، عامل النسخ الحرجة المصب الشق الكنسي يشير، باستخدام Mx1-لجنة المساواة العرقية التي يسببها جزئ10ربط الحمض النووي. في هذه الدراسة، استخدم نموذج الفئرانلوكس/لوكس Mx1-Cre/رببج. يؤدي حذف الشرطي لفكرة ربط الحمض النووي من رببج فقدان الإشارات من جميع حز المستقبلات. في طراز Mx1-لجنة المساواة العرقية، لجنة المساواة العرقية التعبير محكوم بالمروج Mx1 المنشط لدى إدارة polyI:C أدى إلى تنظيم دورات تعريفية لحذف الجينات المستهدفة في خلايا الدم فضلا عن مكونات stromal من أجهزة متعددة، بما في ذلك بي أم والطحال والكبد.

Mx1-لجنة المساواة العرقية+/RBPJلوكس/لوكس و Mx1-لجنة المساواة العرقية/RBPJلوكس/لوكس الفئران التي يسببها مع polyI:C (الممتلكات المشار إليها بوصفها رببجكو ورببجوت، على التوالي) دكت المشع وزرع الخلايا المكونة للدم نوع البرية العادية،. ابتداء من الأسبوع الرابع بعد زرع الأعضاء، وضع رببجكو المستلمين كبير الكريات متبوعاً بتضخم الطحال. على الرغم من أن عرضت الفئران رببجكو زيادة النسبة المئوية لموروث النقوي في بي أم في الأسبوع 8 بعد زرع وفي نقاط زمنية لاحقة، تحليل BM في الأسابيع 4 و 6 لم تكشف عن اختلافات ملفتة للنظر في مضمونها النقوي الخلية مقارنة بالتحكم رببجوت المستلمين. هذه الملاحظة، جنبا إلى جنب مع حقيقة أن هو أعرب عن Mx1-لجنة المساواة العرقية في مختلف الهيئات المكونة للدم، إلى التساؤل عما إذا كان المكروية BM أثر مباشر على الشروع في النمط الظاهري ميلوبروليفيراتيفي.

تحديد ما إذا كان BM موقع أولى حاسمة لتطوير المرض، استخدمت إيففم كالفاريوم الماوس في تركيبة مع بي أم زرع (BMT)، ونموذج المغلوب رببج، ونسب تتبع النظام. الفئران المعدلة وراثيا معربا عن اجفب تحت سيطرة المروج (Lys-التجارة والنقل) lysozyme محددة9 استخدمت للحصول على خلايا المانحين التي يمكن تصور خلال BM التصوير بعد BMT. التعبير lysozyme محددة للخلايا النقوي و Lys-التجارة والنقل يمثل خلايا من السلف النقوي المشتركة (CMP) المحببات ناضجة13.

إيففم BM في نقاط زمنية مختلفة أظهرت أن الخلايا Lys-التجارة والنقل المخزن وبالمثل إلى المستلمين BM رببجوت ورببجكو، لكن توسع وانجرافتيد أسرع في المستلمين BM رببجكو. هذه الفرق كانت مثيرة في النقطة الزمنية السابقة (الأسبوع الثاني) وانخفض مع مرور الوقت (أيام 4 و 6). ومع ذلك، عند هذه النقاط وقت لاحق، التقييم المقصورة المكونة للدم في نفس المتلقي أظهرت زيادة مطردة في عدد الخلايا النقوي المتداولة في الجريدة الرسمية والمترجمة في طحال الفئران رببجكو، مما يدل زيادة ناتج من الخلايا من BM في الدورة الدموية. كشف تحليل للتعريب الخلايا Lys-التجارة والنقل في بي أم فئران زرع في 6 أسابيع أن الخلايا النقوي كانوا يقيمون أبعد عن المفرج في المكروية رببجكو مما في عنصر التحكم.

جماعياً، مزيج إيففم مع هذه النماذج الحيوانية محددة قدمت أفكاراً في ديناميات الخلايا النقوي في المكروية BM رببجكو engraftment. التصميم التجريبي والنهج الكمي الموصوفة هنا يقترح نموذجا يمكن تطبيقه لمعالجة مسائل مماثلة. على سبيل المثال، قد يسمح استخدام النسب المحددة خلية أخرى تتبع النماذج، مثل التجارة والنقل RAG114 أو15 Gata1-بروتينات فلورية خضراء الفئران، في أعقاب سلوك اللمفاوية أو فروعه محمر، على التوالي، في بي أم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات بإذن للعناية بالحيوان واستخدام اللجنة لولاية إنديانا مدرسة الطب في جامعة. ضمان الالتزام بالتشريعات المتعلقة بالتجارب الحيوانية في البلد حيث يتم تنفيذ العمل.

1-إعداد الفئران المستفيدة-/- Mx1CreRBPJ

  1. عبر الفئران Mx1-لجنة المساواة العرقية+ مع رببجلوكس/لوكس الفئران10 للحصول على Mx1-لجنة المساواة العرقيةالإيجابية رببجلوكس/لوكس الفئران12 و Mx1-لجنة المساواة العرقية السلبية رببجلوكس/لوكس ليتيرماتيس لاستخدامها كعناصر تحكم. تحقق من النمط الوراثي PCR10.
  2. استخدم الأسبوع 6-8-Mx1Cre القديمة+/RBPJلوكس/لوكس و Mx1Cre/RBPJلوكس/لوكس الفئران لأداء التعريفي polyI:C.
  3. حقن polyI:C 200 ميكروغرام القائمة في لجنة المساواة العرقية+ ولجنة المساواة العرقية الفئران. إعطاء حقن polyI:C واحد كل يوم لمدة 3 أيام في الأسبوع الأول. إعطاء حقن polyI:C واحدة في الأسبوع الثاني، 7 أيام بعد الحقن السابقة (حقن أربعة في المجموع).
    1. استخدام رببجكو (التي يسببها Mx1Cre+/RBPJلوكس/لوكس) ورببجوت (الناجم عن Mx1Cre/RBPJلوكس/لوكس) الفئران كمتلقين 3 أسابيع بعد الحقن polyI:C الماضي.
      ملاحظة: من المستحسن استخدام الفئران التي تسببها pI: pC 3 أسابيع بعد الحقن. يؤدي إلى تغييرات كبيرة في BM، أدى إلى توسيع إيمونوفينوتيبيك HSC الاستجابة IFNα الناجمة عن polyI:C وانخفض ناتج فروعه ناضجة في ال16،الدم المحيطي17. تمثيل المجموعات المكونة للدم تطبيع 3 أسابيع بعد الحقن والفئران يمكن أن تستخدم دون التباس آثار الالتهاب. وقد تم تحسين هذا البروتوكول التعريفي رببج. إذا حذف مورثة مختلفة، البروتوكول التعريفي قد تختلف تبعاً للبناء، ويجب أن يتم التحقق من صحة الحذف. علينا التحقق من صحة الحذف ~ 100% من منطقة رببج بين مواقع لوكسب قبل RT-PCR بعد ما مجموعة أربعة polyI:C الحقن.

2-إعداد خلايا النخاع المانحة Lys-اجفب لزرع الأعضاء

  1. Euthanize واحد ليز اجفب الماوس (ثاني أكسيد الكربون تليها التفكك عنق الرحم) 1 أو 2 ح قبل عملية الزرع.
  2. رذاذ على سطح جسم الحيوان مع الإيثانول 70%.
  3. استخدم المقص الجراحي لشق جلد على ساقيه حول الكاحل ومع الملقط الجراحي سحب بعيداً الجلد والفراء معا لفضح أنسجة العضلات نظيفة.
  4. استخدم المقص الجراحي لإزالة العضلات قدر من الساقين قدر الإمكان. استخدام مقص، قص العظام (في الركبة والكاحل) وتنظيف أي أنسجة العضلات المتبقية من قصبة وتيبياس باستخدام الأسفنج الشاش. ضع العظام (قصبة اثنين وهما تيبياس) في لوحة 6-كذلك يتضمن دميم 10% FBS.
  5. سحق العظام في قذيفة هاون مع 10 مل الباردة 2 مم يدتا برنامج تلفزيوني وبيبيت خلايا نخاع العظام لإحضار الخلايا إلى تعليق خلية واحدة. وبدلاً من ذلك، مسح العظام مع 2 مم يدتا برنامج تلفزيوني 3 مرات من كل جانب بحقنه 1 مل.
  6. تصفية الخلايا نخاع العظام باستخدام عامل تصفية 70 ميكرومتر في أنبوب الطرد مركزي 15 مل. شطف تصفية مع 2-3 مل من برنامج تلفزيوني. تدور الخلايا أسفل 10 دقائق في 460 x ز، ريسوسبيند الخلايا في 10 مل دميم الطازجة 10% FBS.
  7. عد الخلايا نخاع العظام في هيموسيتوميتير وضبط تركيز إلى 1.5 × 107 خلايا/مل في إيمدم دون المصل. استخدم 3 × 106 خلايا للحيوان الواحد بحجم 200 ميليلتر. هي خلايا حوالي 1/3 من مجموع BM النقوي بروتينات فلورية خضراء + الخلايا. ترك الخلايا على الجليد حتى جاهزة للحقن. استخدام 0.5 × 105 خلايا لتحديد التعبير التجارة والنقل بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية9.

3-النخاع العظمى زرع الخلايا Lys-التجارة والنقل في الفئران رببجكو

  1. كبح جماح الفئران المستفيدة في قفص دائري. تشعيع الفئران بجرعة قاتلة من أشعة غاما (1,200 راد) في إيرادياتور Cs 137. استخدام بروتوكول تقسيم جرعة: 900 راد في المساء تليها 300 راد في صباح اليوم التالي (إلى جانب 16 ح).
  2. زرع الفئران المستفيدة المشع دكت رببجوت ورببجكو ح 5-6 بعد الجرعة الثانية من الإشعاع. حقن BM الخلايا حصادها من الفئران Lys-اجفب بتركيز 3 × 106 خلايا للحيوان عن طريق حقن الوريد الذيل (انظر التفاصيل لحصاد الخلايا في القسم 2).
  3. صورة أفواج مستقلة فئران زرع بها إيففم في نقاط زمنية مختلفة: 24 ح، وفي أسابيع 2 و 4 و 6، كما هو موضح أدناه (انظر القسم 4 و 5 في فيفو التصوير الداخلي).

4-العمليات الجراحية التحضير لتصوير إينترافيتال

  1. تعقيم الأدوات الجراحية. اثنين غرامة الملقط (واحد على التوالي، أحد الزاوية)، زوج واحد مقص جيد وزوج واحد من أصحاب الإبرة. إعداد مجال المنطوق مع جميع اللوازم الضرورية للإجراء.
  2. إعطاء الماوس حقنه IP من مخدر الكيتامين كوكتيل (Xylazine 2.5-5 مغ/كغ + أسيبرومازيني 1.0-2.5 ملغم/كغم + الكيتامين 90-100 مغ/كغ) باستخدام حقنه إبرة ز 26-28.  سيتم رصد الحيوان كل 15 دقيقة أثناء الإجراء ومخدر وسوف تستكمل حسب الاقتضاء في ربع الجرعة الأصلي.
  3. ضع الماوس على مصدر حرارة مناسبة (لوحة تدفئة 37 درجة مئوية، والحيوانات المحمية من الاتصال المباشر مع تدفئة وسادة) وبصريا رصد معدل التنفس.
  4. تحقق من ردود الفعل باستخدام إصبع القدم قرصه استجابة. التأكد من أن الحيوان تماما تحت التخدير قبل البدء بأي من العمليات الجراحية.
  5. قياس استخدام 26-28 حقنه الإبرة لإعطاء الفئران حقن الوريد ذيل علامة نيون الأوعية الدموية (ديكستران، 100 ميكروليتر من حل 20 ملغ/مل).
  6. تطبيق مرهم العين الطبيب البيطري لكلتا العينين. مقطع السطح الظهرية من رأس الحيوان مع لوس أنجليس كليبرز الكهربائية الصغيرة. تطبيق لإزالة شعر كريم للاسفنج الشاش استخدام 5 كحد أدنى إزالة الكريم وشطف ثم مع المالحة. الإعدادية فروة الرأس نظيفة مع 70% من الكحول باستخدام مسحه القطن.
  7. استخدام الملقط غرامة ومقص جعل شق جلد خط الوسط صغيرة (10-20 مم) في فروة الرأس لتعريض سطح الجمجمة الظهرية الكامنة. استخدام الحرير الجراحية 5-0 لوضع اثنين إقامتهم خياطة الجروح في الجلد على كل جانب من الشق، خلق رفرف لفضح كالفاريوم للتصوير.
  8. ضع الفئران على ظهورهم وتغرق فروة الرأس المكشوفة في صحن أسفل زجاج مليئة بالنفط المجهر. نقل الحيوان إلى موتيفوتون غرفة التصوير.
  9. ضع الحيوان في مرحلة مجهر مع كالفاريوم المتمركزة على الطبق الزجاج فوق الهدف وتغطي ثم مع 37وسادة تدفئة درجة مئوية (يجب حماية الحيوانات من الاتصال المباشر مع الحرارة).

5-في فيفو التصوير بدقة عالية من كالفاريوم الماوس

  1. استخدام نظام مقلوب [كنفوكل] تعديل لتصوير مولتيفوتون (انظر المواد الجدول). إرشادات الشركة المصنعة التالية لضبط ليزر 2-فوتون إلى 830 نانومتر، مكان 20 ث س، غ 0.95 عدسة الهدف في المجهر الآنف قطعة والاختيار محاذاة شعاع الليزر.
    ملاحظة: تستخدم نظم مجهر تستقيم الأكثر شيوعاً لهذه الدراسات، ولكن يمكن أيضا استخدام نظام مولتيفوتون لمقلوب. في هذه الدراسة، تم استخدام جهاز ستيريوتاكسيك أتروماتيك تصميم مخصص. على الرغم من أن هناك عدة أجهزة ستيريوتاكسيك المتاحة تجارياً لأنظمة المجهر تستقيم، لا يوجد متاح تجارياً ستيريوتاكسيك جهاز لنظام مجهر مقلوب يهدف إلى تأمين الجمجمة الماوس. كبديل لجهاز ستيريوتاكسيك مخصص، يمكن تأمين الجمجمة في الموقف أعلاه الهدف استخدام مختلف الأساليب الشريط أو الغراء للاستقرار.
  2. فتح برنامج الحصول على صورة. في "إعدادات اقتناء" تحقق الفريق إذا تم تحديد أحد اتجاهي وضع المسح الضوئي. قم بإعداد سرعة المسح الضوئي إلى 4 ميكروثانية بيكسل، معدل الإطار إلى 512 × 512 بكسل وتكبير/تصغير إلى 1.5. حدد 20 X ث نا 0.95 الهدف من قائمة العدسات الهدف المتاحة لمطابقة عدسة المتمركزة في نوسيبيسي.
  3. الوصول إلى قائمة "صبغة" من لوحة "صورة اكتساب التحكم" وحدد "فوتون اثنين". فتح إطار "الأصباغ مسار الضوء" وحدد الإثارة DM690 980 مارك ألماني-فتح مصراع الليزر ف 2 عن طريق التحقق من خانة الاختيار في "وحدة الليزر" 2. في الإطار "وحدة تحكم المجهر"، حدد مرآة RDM690.
  4. حدد "برنامج التحصين الموسع مصباح" واختر المكعب برنامج التحصين الموسع-تصفية B/G ويركز الهدف على العينة لتصور تدفق الأوعية الدموية ومكانه نخاع العظم كالفاريوم، تستخدم كمرجع في التشعب في الاتجاه المركزي (أ) وخياطة الشريان التاجي) ب (الشكل 2A).
  5. جمع الصور باستخدام وضع غير ديسكانيد. حدد ثلاثة أجهزة لكشف خارجي: detector1 PMT لجمع إشارة SHG الكولاجين (تصفية الانبعاثات-430/100 نانومتر)، جاسب detector2 لجمع بروتينات فلورية خضراء إشارة (تصفية الانبعاثات-525/50) و detector3 جاسب جمع إشارة تريتك-ديكستران (تصفية الانبعاثات-605/90 نانومتر).
    1. القيام بتصوير بيكسل 4μs مع لا في المتوسط لتقليل الضيائية بمعدل المسح الضوئي. جمع الصور في اكتساب السلطة وكاشف ليزر مستمر تعديلها للاستفادة من النطاق الديناميكي الكامل للكشف مع الحد الأدنى من الإشباع.
    2. جمع مجموعة من الفروع إلى العمق النسيج (60 × 1 ميكرومتر مكدسات Z) من 6 مناطق نخاع العظم كالفاريوم. استخدام إعدادات حجم الخطوة 1 ميكرومتر، والتكبير 1.5 و 512 × 512 بكسل حجم الإطار (423 مكم x 423 ميكرومتر).
      ملاحظة: عموما إجمالي الوقت المطلوب للصورة الماوس واحد ح 1-1.5.

6-التحليل الكمي

  1. القيام بعمليات كوانتيتيشن و 3D صورة استخدام برمجيات كوانتيتيشن والتصور مكرسة 3D/4d صورة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول المواد). تصور بشكل تفاعلي Z-مكدسات في 3D استخدام الإسقاط حدة الأقصى (MIP)، ألفا-مزيج أو الظل الإسقاط حجم التقديم الخوارزميات.
  2. تقسيم الخلايا بروتينات فلورية خضراء باستخدام "بقعة كائن تجزئة الوحدة النمطية". تطبيق المعالجة الحسابية (قناة الطرح) مكدس الذاكرة المؤقتة للقضاء على الكونت إيجابية كاذبة من الخلايا بروتينات فلورية خضراء (وهذا يلغي إشارة لخلايا العظام عرض fluorescence قوية في قنوات الأخضر والأحمر).
  3. إجراء تجزئة سطح المفرج والعظام باستخدام الوحدة النمطية السطحية تجزئة. إذا لزم الأمر، حساب مسافات خلايا لأي من السطوح أعلاه عن طريق تطبيق خوارزميات X-التوتر تسمى "المسافة من بقعة على السطح".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أفواج من رببجكو 2 و 2 رببجوت المستلمين تم تصويرها في جلسة تصوير فردية في نقاط زمنية مختلفة: ح 24 و 2، 4 و 6 أسابيع بعد زرع الخلايا BM Lys-التجارة والنقل (سير العمل يتضح في الشكل 1A).

في كل الماوس، الصور تم الحصول عليها من 6 مناطق القياسية كالفاريوم BM، حددها موقفهم بالنسبة التشعب في الاتجاه المركزي (الشكل 2 أ، ) وخياطة الشريان التاجي (الشكل 2 أ، ب). حقن من تكساس-الأحمر ديكستران قبل التصوير يسمح تحديد هذه المعالم واختيار 6 مناطق (الشكل 2A): أعلى اليسار والمتوسطة وحق (UL، أم، جولة أوروغواي)، واليسرى السفلي، والمتوسطة وحق (ليرة لبنانية، LM، LR). 60 × 1 ميكرومتر z-مداخن تم جمعها من كل منطقة، والمقدمة كثلاثي الأبعاد القصوى كثافة الإسقاط (MIP)، (الشكل 2)؛ إسقاط الظل ثلاثي الأبعاد، الذي يتضمن عنصر العظام (رمادي) التي تم إنشاؤها بواسطة مجهرية جيل التوافقي (SHG) الثانية السبر منظمة الكولاجين (الشكل 2)؛ وأخيراً، صورة Segmented ثلاثي الأبعاد، مما يسمح كوانتيتيشن للخلايا وقياس هذه المسافات من العظام والأوعية (الشكل 2D).

بسبب الاختلافات المحتملة في تفضيلات صاروخ موجه من الخلايا المكونة للدم في مناطق مختلفة من كالفاريوم بي أم بعد زرع، من المهم أن عينة من مناطق متعددة في كالفاريوم من كل الماوس. ويبين الشكل 3 مثال على خلية التوزيع في منطقتي 6 حلل في واحد رببجوت وواحد رببجكو المستلم في 2 أسابيع بعد BMT (أخضر-خلايا النقوي، رمادي والعظام) باستخدام خوارزمية التقديم ثلاثي الأبعاد لإسقاط الظل. عدد الخلايا في المنطقة تتراوح من 64 إلى 258 في الماوس رببجوت ومن 265 إلى 573 في الماوس رببجكو. ثم يتم التعبير عن النتائج النهائية كمتوسط عدد المناطق 6 حلل: عدد من الخلايا كل منطقة/الواحدة الماوس (متوسط 135 في رببجوت مقابل 469 في رببجكو). هذه التجربة الممثل يشير إلى أن هناك تباين أكبر في توزيع خلية كل منطقة في رببجوت مما في المتلقي رببجكو. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى التباين في مناطق كالفاريوم داخل ماوس، هو أمر شائع، هناك اختلافات بين الفئران الفردية داخل نفس المجموعة. وبالتالي، من المهم أن الفئران على الأقل 4 يتم تقييم لكل نقطة في الوقت الواحد التجربة للحصول على الحد أدنى مجموع المناطق 24 إلى 30 لتحليل كل حالة.

ويبين الشكل 4 ديناميات التوسع السلف النقوي في المكروية BM معيبة درجة مقارنة بمراقبة أكثر من 6 أسابيع بعد زرع الأعضاء. في هذه التجربة التمثيلية، زرع رببجوت 8 و 8 رببجكو الفئران وتصويرها في النقاط الزمنية المشار إليها (2 رببجوت الفئران والجرذان رببجكو 2 عند كل نقطة في الوقت). ويبين الشكل 4A بإعادة بناء ثلاثي الأبعاد ممثل للمناطق 1 من أصل 6 المكتسبة. الخلايا في كل منطقة من المناطق 6 تم حسابها وتم حساب متوسط عدد الخلايا/المنطقة من اثنين من الفئران في كل وقت نقطة (المجموع 12 منطقة) للمستلمين رببجوت ورببجكو (الشكل 4). ويشير هذا التحليل إلى أن: (ط) تحتوي الخلايا المانحة Lys-التجارة والنقل في رببجوت ورببجكو المستفيدين من كفاءة صاروخ موجه مماثلة؛ ثانيا) خلايا في المستلمين رببجكو توسيع أكثر سرعة وهي ضعف عدد الخلايا في المستلمين رببجوت في الأسبوع الثاني بعد BMT؛ ثالثا) الخلايا في المستلمين رببجوت توسيع لاحقاً وهي أعلى 2-fold من الخلايا في رببجكو المستلمين في الأسبوع الرابع بعد BMT؛ ورابعاً) يصبح عدد الخلايا في المتلقين على حد سواء، رببجوت ورببجكو مماثلة في الأسبوع السادس بعد BMT. ويبين تحليل الخلايا المانحة النقوي في الجريدة الرسمية ناتج أعلى من الخلايا النقوي من المستلمين BM رببجكو من المستلمين BM رببجوت في الأسبوع 4، عندما أظهرت الفئران BM رببجكو انخفاض محتوى الخلايا Lys-التجارة والنقل في الوقت. تحليل مجموع المقيمين في BM النقوي الخلايا والخلايا النقوي المتداولة في الجريدة الرسمية، تشير إلى أن الخلايا Lys-بروتينات فلورية خضراء المكروية في BM رببجكو توسيع ومستعدون لتعبئة أكثر سرعة. وأظهر تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية موازية الخلايا Lys-التجارة والنقل في العظام الطويلة BM من الفئران نفس اتجاها مشابهة لتلك التي لاحظها إيففم؛ ومع ذلك، كانت الاختلافات بين ظروف أقل وضوحاً (الشكل 4 باء).

قياس المسافة بين الخلايا الفردية Lys-التجارة والنقل من العظام أو المفرج يرد في الشكل 5. واستخدمت في هذه الدراسة الممثلة، تحليل ثلاثي الأبعاد تجزئة LM منطقة كالفاريوم رببجوت ورببجكو في 6 أسابيع من BMT (الشكل 5A). وحسبت المسافة من العظام والأوعية لكل خلية في المنطقة: 200 الخلايا في خلايا 255 في رببجكو ورببجوت، وهكذا، معبراً عنها بمتوسط. ويبين التحليل أن الخلايا Lys-بروتينات فلورية خضراء تعريب على مسافة مماثلة من العظام في الفئران رببجوت ورببجكو (11 ميكرومتر)، ولكن أبعد من المفرج يقيمون في الفئران رببجكو من الفئران رببجوت (15 ميكرومترات مقابل 5 ميكرومترات، على التوالي). هذه النتيجة مثيرة للاهتمام، كما في رببجكو الفئران الخلايا Lys-التجارة والنقل تعبئة إلى تداول أكثر من الفئران ربجوت، وأن ذلك يكون متوقع لتعريب أقرب إلى السفن. ومع ذلك، من الممكن أن يعكس الفرق في الترجمة إلى مرحلة مختلفة من التمييز بين هؤلاء السكان اثنين (في رببجوت ورببجكو)، نقطة التي لا يمكن معالجتها بهذا التحليل. أهمية هذه النتيجة سوف تكون متابعة مع مجموعة أكبر من الخلايا في جميع المناطق 6 وعن طريق الجمع بين نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل.

يتم الحصول على نتائج دون المستوى الأمثل، وعموما عندما يتم تحليل عدد صغير من المناطق في الماوس. تصوير من تحديات خاصة في نقاط الوقت المبكر عقب BMT، أضرار الإشعاع القاتلة المفرج وتسرب ديكستران من الشعيرات الدموية يقلل من تعريف الصورة. وبالتالي، من المهم أن تحتوي على عدد كبير من التكرار، لا سيما في نقاط زمنية أقرب.

SHG أداة مفيدة للتحقيق المنظمة ألياف الكولاجين في 3D. أنها عملية الدرجة الثانية ضوئية غير خطية التي تنبع من هياكل مثل ألياف الكولاجين حيازة غير سينتروسيميتري ومعامل عالية الدرجة الثانية غير خطية. عندما يتفاعل ضوء الحادث مكثفة مع مثل هذه الهياكل، فإنها تولد الضوء في تواتر الحوادث مرتين أو نصف الطول الموجي الحادث. ولذلك، هناك حاجة إلى لا وسم بغية التقاط الإشارات SHG أثناء الفحص المجهري 2-فوتون. مع 830 الطول الموجي نانومتر الإثارة، ونحن التقاط الإشارات SHG في القناة الزرقاء مع الانبعاثات تصفية 430/100 نانومتر.

Figure 1
رقم 1: سير العمل التجريبي- (أ) التعريفي Mx1-Cre/رببجلوكس/لوكس الفئران لتوليد رببجكو ورببجوت الفئران ~ 4 أسابيع قبل التصوير؛ (ب) "إعداد من بي أم" الخلايا من الفئران المحورة وراثيا Lys-التجارة والنقل؛ (ج) زرع من BM Lys-بروتينات فلورية خضراء الخلايا إلى المشع دكت رببجكو أو رببجوت المستفيدين؛ (د) إيففم من كالفاريوم الماوس في 24 ساعة، 2 و 4 و 6 أسابيع بعد BMT، متبوعاً بالقتل الرحيم وتحليل BM بنظام مراقبة الأصول الميدانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: إيففم مكانة والأوعية الدموية BM. (A) فسيفساء صورة فوتون متعدد Lys-اجفب الماوس كالفاريوم عرض 6 مناطق القياسية للتصوير (ماي: العلوية اليسرى، أم: العلوي الأوسط، جولة أوروغواي: العلوي الحق، ليرة لبنانية: السفلي الأيسر، لم: السفلي الأوسط، LR: اليمنى السفلي) (الخلايا الخضراء، النقوي؛ الأحمر، والمفرج؛ رمادي، العظام) 10 X التكبير؛ (ب-د) BM مكانة التفاصيل المقدمة ك: خطة التأمين الطبي (ب)، (ج) ثلاثي الأبعاد الظل الإسقاط، (د) ثلاثي الأبعاد تجزئة الصورة. تم تجهيز الصور-استخدام برنامج مخصص 3D/4d صورة كوانتيتيشن والتصور (الجدول 1). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر في ب، ج، د الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: Engraftment الخلايا النقوي في الأسبوع 2- صور للعظام وخلايا Lys-التجارة والنقل (الأخضر) السطح (رمادي) في مناطق بي أم 6 من عظم كالفاريوم واحد رببجوت وواحد رببجكو الماوس (u: العلوي، l: اليسار، م: الأوسط، الحق r:). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. شريط الرسوم البيانية (يمين) تشير إلى عدد الخلايا التي تم عدها في كل منطقة (رببجوت مجموعة 64-258؛ رببجكو نطاق 265-573) وعن الأمراض المنقولة جنسياً متوسط عدد 135 +/-73، و 469 STD +/-121. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
4 الرقم: حركية Engraftment الخلايا النقوي ويلي الناتج من BMT- (أ) أشار إلى خلايا الصور من ليز-التجارة والنقل (الأخضر) وعظم السطح (الرمادي) في المنطقة ممثل واحد من كالفاريوم واحدة بالماوس رببجوت ورببجكو في كل نقطة من النقاط في الوقت. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر؛ اسطوانات النقطة (ب) يقوم إظهار النسبة المئوية لبروتينات فلورية خضراء-ليز الخلايا إيجابية بالتدفق الخلوي داخل بي أم العظام الطويلة التي تحصد من الماوس نفسه تصويرها في الحية (أعلاه). (ج) الرسوم البيانية بار تشير إلى متوسط عدد الخلايا/المنطقة في الفئران 2 (المجموع 12 منطقة) في كل مرة نقطة، +/--خط عادي (د) يظهر الرسم البياني زيادة إضعاف في عدد العَدلات (تعداد بواسطة العداد الخلية) قدم في الجريدة الرسمية للفئران نفس مما في (A) في النقاط الزمنية المشار إليها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
5 الرقم: التعريب الخلايا النقوي في النسبية BM للعظام والمفرج. (أ) الصور مجزأة ثلاثية الأبعاد الممثل الخلايا Lys-التجارة والنقل والمفرج، والخلايا Lys-التجارة والنقل والعظام في نفس المنطقة من العظام كالفاريوم في رببجوت ورببجكو من المستفيدين في الأسبوع 6 من BMT. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. (ب) رسم بياني شريطي يلخص متوسط المسافة في ميكرو +/--الخلايا SEM من ليز-التجارة والنقل من سطح العظام أو المفرج. قياس عدد الخلايا في: رببجوت n = 200 الخلايا ورببجكو n = 255 خلية. مسافة خلايا Lys-التجارة والنقل من المفرج أكبر في رببجكو من رببجوت الفئران، ف < 0.001 (الاختبار t للطالب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويصف هذا البروتوكول تصميم تجريبي الأمثل لدراسة حركية engraftment الخلايا المكونة للدم "الفحص المجهري الفلورسنت إينترافيتال". في هذه الدراسة، كان توسيع نطاق الخلايا السلف النقوي في BM WT أو في الشق إشارات BM المعيبة تعقبها في كالفاريوم العظام التالية Lys-بروتينات فلورية خضراء إيجابية النقوي الخلايا بعد BMT إلى المستلمين رببجوت أو رببجكو. ويقترح هذا النهج كنموذج التي يمكن تطبيقها لمعالجة مسائل مشابهة، على سبيل المثال: أنا) لتحديد التوسع والتعريب في منافذ BM الخلايا الأخرى الأنساب، مثل محمر اللمفاوية، أو خلايا ميجاكاريوسيتيك، باستخدام الخلايا المانحة الخلايا المكونة للدم تقل نسب محددة المروجين القيادة بروتينات فلورية خضراء أو الطماطم الحمراء؛ ثانيا) لتقييم مختلف المحددات البيئية الدقيقة باستخدام الفئران المعدلة وراثيا أو كو محددة أخرى كمتلقين.

قوام هذا البروتوكول التصوير في العظام كالفاريوم، وهو أن المعالم التشريحية التي تستخدم لتحديد مناطق BM، التشعب في الاتجاه المركزي وخياطة الشريان التاجي، المصانة معقول في جميع الفئران، تسمح بالاتساق بين الفرد تجارب مع التخلي عن شرط مرحلة الآلي. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام نموذج التجارة والنقل لتعقب الخلايا المكونة للدم ثبت أن تكون فعالة جداً، كالتجارة والنقل المقدمة إشارة مستقرة في ظروف دون المستوى الأمثل، كما هو الحال بعد التشعيع. أخيرا، إنشاء التصوير الموصوفة، استخدام مجهر مقلوب وجهاز ستيريوتاكسيك مخصصة التي الفأر في موقف ضعيف، التقليل إلى حد كبير التحف التنفس.

جانبين لهذا التصميم التجريبي، إذا نفذت، يمكن أن يؤدي إلى استخدام أوسع وأكثر فعالية من إيففم كالفاريوم. أولاً، سيكون من المهم تحسين وتوحيد البروتوكولات طولية التصوير السماح بمراقبة الماوس نفسه في نقاط زمنية مختلفة (من اليوم الثاني لعدة أسابيع) بعد التدخل (أي BMT أو العلاج) بدلاً من استخدام المستقلة أفواج من الفئران. كما يتطلب هذا النهج الظروف الملائمة للإنعاش بعد الجراحة، واستخدام تدابير لمكافحة التهاب، والعدوى، وندبة تشكيل في الموقع التصوير، وتطبيقه يقتصر حاليا. ثانيا، سيكون من قيمة لتطوير مجموعة نسب التي تتبع نماذج الماوس حمل البروتينات الفلورية في خلايا معينة من مكانة BM (ارتشاح الأوعية الدموية، وبطانة العظم، والخلايا العصبية) للجمع بين الخلايا المكونة للدم وظائف محددة خصائص على منافذ بي أم.

تصوير العظام لا تزال لديه بعض التحديات والقيود مقارنة بالانسجة الأخرى. على الرغم من أن يمكن اختراق المجهر اثنين-فوتون 100 1,000 ميكرون في عمق الأنسجة، أنها لا تزال تشكل تحديا للصورة من خلال كامل سماكة العظم كالفاريوم. صور تفقد الجودة مع زيادة العمق حتى البروتوكول هنا يصف تحليل موثوق بها من مناطق BM من رزمة سميكة 60 ميكرون. وثمة عامل آخر يمكن أن يؤدي إلى عدم تناسق أو التصوير الأمثل هو الشكل المنحنى للعظام كالفاريوم، والتي يمكن أن تجلب الصورة خارج التركيز. من الأهمية بمكان أن يكون الجمجمة المتمركزة تماما على الطبق الزجاج فوق الهدف، وربما مع جهاز ستيريوتاكسيك. في الواقع، المهم حجم الجمجمة: الجمجمة فئران صغار جداً أو صغيرة جداً قد لا تناسب تماما في جهاز ستيريوتاكسيك معين. على سبيل مثال، لا تلائم الجهاز المستخدمة هنا الفئران الذين تقل أعمارهم عن 6 أسابيع وأقل من 20 غراما.

قيداً إضافيا أن نظام التصوير المستخدمة في هذه الدراسة يقتصر على 3 قنوات. كما يتم تلقائياً تعيين القناة الزرقاء لجمع غير وسم إشارة SHG استناداً إلى الكولاجين العظام، تتوفر قنوات 2 فقط لتسمية الأسفار محددة. وعلاوة على ذلك، وهذا النظام قد حد سرعة من 1 إطار/ثانية في 2 ميكروثانية بيكسل يسكن الوقت وحجم الإطار 512 × 512 بكسل، التي ليست مثالية للعمليات الدينامية سريعة (مثل قياس تدفق الدم وتقييم لتعبئة الخلايا في مجرى الدم).

يشكل تحديا كبيرا أن يؤديها التشعيع للحلول التوفيقية BMT سلامة المفرج. تسرب الأوعية الدموية الموجودة في بي أم بعد التشعيع يسبب صعوبات مع تجزئة/كوانتيتيشن الهياكل الفردية، التي يمكن أن تشكل صعوبة في التحليل الكمي.

وأخيراً، من المهم أن نعتبر أن تصوير ماوس واحدة يأخذ حوالي 1 ح، ويقتصر العدد الفئران التي يمكن تصويرها في يوم معين (الفئران ~ 4 إلى 6). وهكذا، قد يتطلب زيادة في حجم العينة للحصول على الطاقة لتحليل التجارب المستقلة متعددة، والتي يمكن أن تزيد من تقلب.

وفي أعقاب هذا البروتوكول، عدد الخلايا المكونة للدم الخلايا Lys-التجارة والنقل+ الكشف عنها بواسطة إيففم في بي أم بعد 24 ساعة من BMT ~ 30 الخلايا/المنطقة وأنه عدد صغير جداً مقارنة بالمدخلات الأولية من الخلايا (3 × 106). على الرغم من أن جزءا من هذه المشكلة هو سبب الخلية الملائمة في الرئة والكبد قبل صاروخ موجه إلى BM بعد حقن رابعا، أنها لا تزال إلى استكشاف ما إذا كانت هناك مناطق في كالفاريوم سوى تلك المحددة حيث زرع الخلايا الرئيسية في أعلى الكفاءة.

صاروخ موجه وانجرافتمينت من الخلايا إلى BM بعد BMT عادة يتبعها التدفق الخلوي بقياس علامات CD45.1/CD45.2، التجارة والنقل، إستر سوكسينيميديل "كاربوكسيفلوريسسين" (CFSE) أو تركيبة من علامات الخلية الجذعية والنسب. استخدام إيففم، لا سيما في نقاط زمنية مبكرة، يجعل المعلومات فريدة من نوعها والإضافية المتاحة التي لا يمكن أن توفرها التدفق الخلوي. على سبيل المثال، غالباً ما ليس من السهل التمييز بين الأحداث نظام مراقبة الأصول الميدانية التي هي "الخلايا" من الأحداث التي هي "التحف"، وبخاصة عندما يتم جمع عدد قليل من الأحداث الإيجابية (أي في 24 ساعة من BMT). إيففم معلومات عن مورفولوجيا والتعريب من الخلايا أن الإيدز هذا التمييز. وبالمثل، سوف تشمل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية للخلايا المكونة للدم BM تحصد بالتنظيف أو تحطمها العظام خلايا بالفعل في الدورة الدموية في الأوعية الدموية والخلايا التي كانوا يقيمون في مكانة. في الواقع، إيففم يسمح بتمييز وتقييم الخلايا يستريح داخل محراب BM والخلايا التي يتم تعبئة إلى مجرى الدم. هذا التمييز قيمة كبيرة عند دراسة حركية صاروخ موجه، والترجمة، والتمايز والتعبئة في نموذج معين. الأهم من ذلك، يمكن أن إيففم معلومات فريدة من نوعها في الموقف الخلايا المكونة للدم بالنسبة إلى الخلايا المكروية التي تشكل مكانة محددة.

وقد استخدمت الأساليب الأخرى المستخدمة لمعالجة تكوين مكانة BM، مثل هذا التحليل النسيجي. مقارنة بين الفحص المجهري إينترافيتال BM والتحليل النسيجي بالفحص المجهري [كنفوكل] بدقة وأناقة ناقشته "سيلسو لو" et al. 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

أجرى تصوير في مركز إنديانا "الميكروسكوب البيولوجي" في جامعة إنديانا، الموجهة من قبل الدكتور كين دن. جهاز ستيريوتاكسيك نموذج تصميم ومارك سونبا، آبار مركز بحوث "طب الأطفال". وأيد هذا العمل بالمعاهد الوطنية للصحة/R01DK097837-09 (نورث كارولاينا)، والمعاهد الوطنية للصحة/R01HL068256-05 (NC)، والمعاهد الوطنية للصحة/NIDDK1U54DK106846-01 (NC)، البحوث MPN مؤسسة (NC) و "التعاونية كتسي" مشروع كلية/Notre Dame (NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine cocktail IU School of Medicine Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran Tdb Consultancy TD150-100mg Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer Braintree Scientific CLP-323 75
Gauze sponge Med Vet International PK224 4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream Commercial store
Saline Med Vet International RXSAL-POD1LT 0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe Fisher Scientific 14-826-79 28 g, 1/2 cc
Fine Forceps Fine Science Tools 00108-11, 00109-11 straight forcep, angled forcep
Scissor Fine Science Tools 15018-10
Needle holder Fine Science Tools 12002-14
5-0 silk suture Fisher Scientific MV-682 Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish WillCo GWSt-5040
Optical microscope oil Leica
Stereotaxic stage insert  IU School of Medicine Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system  Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective  Olympus
Small heating pad Commercial store Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software Bitplane 3/4 D Image Visualization and Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17, (4), 281-286 (2010).
  2. Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, (PT 21), 3529-3535 (2011).
  3. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, (6960), 841-846 (2003).
  4. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, (7), 1109-1121 (2005).
  5. Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, (6960), 836-841 (2003).
  6. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, (7308), 829-834 (2010).
  7. Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460, (7252), 259-263 (2009).
  8. Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37, (2), 290-301 (2012).
  9. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, (2), 716-726 (2000).
  10. Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14, (6), 637-645 (2002).
  11. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, (7225), 92-96 (2009).
  12. Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15, (1), 51-65 (2014).
  13. Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3, (1), 137-147 (2002).
  14. Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111, (7), 3424-3434 (2008).
  15. Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29, (5), 1163-1175 (2009).
  16. Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, (7240), 904-908 (2009).
  17. Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211, (2), 245-262 (2014).
  18. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics