骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

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Developmental Biology

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Summary

ホーミングや骨髄 (BM) のニッチに造血細胞の生着を研究する遺伝的動物モデルとの組み合わせで、calvarium の生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) が適用されます。

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Wang, L., Kamocka, M. M., Zollman, A., Carlesso, N. Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches. J. Vis. Exp. (121), e54253, doi:10.3791/54253 (2017).

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Abstract

増加する証拠は、その正常造血が特殊な細胞ニッチ重要な造血幹細胞 (HSC) 機能1,2を調節することを含む、BM の個別のアイソレータケージ手がかりによって規制されてを示します。確かに、造血微小環境のより詳細な画像は今浮上して、骨と血管内皮のニッチが正常 HSC とその子孫3,4,5 の規制の機能ユニットを形成.新しい研究は、血管周囲細胞、脂肪細胞、神経細胞の維持と HSC 機能6,78を規制することの重要性を明らかにしました。さらに、異なる系統、すなわち骨髄性とリンパ性細胞、家から細胞、骨髄微小環境の内で特定のニッチに存在する証拠があります。しかし、BM 微小環境とその居住者の完全なマッピングは、まだ進行中です。

トランスジェニック マウス系統系統固有蛍光マーカーあるいは BM のニッチの特定のセルに選択した分子を欠いた遺伝子改変マウスの表現ができます。ノックアウトと系列移植アプローチとの組み合わせで、モデルを追跡、HSC などの定義済みの造血集団の固有の「ニッチ」の役割に関する知識を絞り込むこと細胞 B 細胞、T 細胞、骨髄細胞、赤芽球系細胞。この戦略は、マージ、calvarium の 2 光子顕微鏡を使用することによってさらに増強することができます。体内の高分解能イメージングと BM calvarium の 3d レンダリングを提供することにより造血の特定のサブセットが BM のホームし、時間をかけて彼らは拡張の動態を評価の場所正確に今判断できます。ここでは、Lys GFP トランスジェニック マウス (骨髄細胞マーキング)9と RBPJ (正規 Notch シグナルに欠けている) ノックアウト マウス10はノッチ欠陥 BM の微小環境に骨髄系細胞の生着を確認する IVFM との組み合わせで使用されます。

Introduction

生体多光子蛍光顕微鏡 (IVFM) は、高解像度、リアルタイム イメージングの深さを持つ組織の最大のことができる強力なイメージング技術によって組織の 1 mm。マウスの calvarium を適用すると、60-100 μ m11を非侵襲的な方法で BM 内造血細胞の挙動を観察が許可されます。このアプローチは、正規 Notch シグナルに欠けている BM の RBPJ ノックアウト マウスで通常の骨髄前駆細胞の生着の動態を決定するここで使用です。

私達のグループからの最近の作品は、その欠陥正規 Notch シグナルのような骨髄増殖性疾患12BM 微小環境リードを示した。Notch シグナルの損失は、RBPJ、下流正規 Notch シグナル、組換え10を誘発 Mx1 Cre を使用しての重要な転写因子の DNA 結合ドメインの条件付き削除によって得られました。本研究では Mx1-Cre/RBPJlox/loxマウス モデルが使用されました。RBPJ の DNA 結合モチーフの条件付き削除すべてのノッチの受容体から信号の損失で起因します。式は複数の臓器の間質成分のだけでなく、血液細胞のターゲット遺伝子欠失の誘導の結果 polyI:C の管理時にアクティブ Mx1 プロモーターによる Cre Mx1 Cre モデルで BM、脾臓と肝臓を含みます。

Mx1-Cre+/RBPJlox/loxと Mx1 Cre-/RBPJlox/loxマウス (ここに至って示される RBPJKO と RBPJWT、それぞれ) polyI:C による致死的照射し、正常な野生型造血細胞移植されました。移植後 4 週目から始まって、RBPJKO の受信者は脾腫に続いて重要な白血球を開発しました。RBPJKO マウスでは、移植後およびそれ以降の時点で BM の 8 週目骨髄前駆細胞の増加割合を提示、週 4 と 6 で BM の分析はコントロール RBPJWT と比較して、骨髄球系細胞内容に顕著な違いを明らかにしなかった受信者。この観測は、一緒に実際に Mx1 Cre が異なる造血臓器の単位があること提起した BM 微小環境骨髄増殖性の表現型の発生に直接的な影響を持っていたかどうか。

BM が病気の開発の重要な最初のサイトであるかどうかを判断するには、マウス calvarium の IVFM は BM の移植 (BMT)、RBPJ ノック アウト モデル系列のシステムを追跡との組み合わせで使用されました。特定リゾチーム プロモーター (Lys GFP)9の制御の下で EGFP を発現するトランスジェニック マウスを用いて BM BMT 後の画像の中に可視化することができるドナー細胞を入手します。リゾチーム発現は骨髄細胞に固有、Lys GFP が成熟した顆粒球13(CMP) 一般的な骨髄前駆細胞をマークします。

異なる時点で BM の IVFM を示した、Lys GFP の細胞同様に BM の RBPJWT と RBPJKO の受信者にホーム拡大や高速 RBPJKO BM 受信者の中にしみ込んでいます。この違い以前の時点 (2 週目) で劇的だったし、時間の経過とともに減少 (週 4 と 6)。しかし、これらの後の時点で PB で循環する骨髄細胞数の着実な増加を示した同じ受信者の造血のコンパートメントの評価、細胞の高められた出力を示す RBPJKO マウスの脾臓でローカライズ循環に BM。Lys GFP の細胞における局在の解析 BM 移植マウスの 6 週間では、骨髄細胞がコントロールにより RBPJKO 微小環境で血管系から遠い寝泊まりしていたことを明らかにしました。

総称して、これらの特定の動物モデルと IVFM の組み合わせは RBPJKO BM 微小環境における骨髄系細胞の生着の動力学の洞察力を提供されています。同じような質問に対処するため適用することができますパラダイムとして実験的なデザインとここで説明する定量的な手法を提案する.たとえば、RAG1 GFP14または15 Gata1 GFP マウスなどのモデルを追跡他のセルの特定の血統を使用する次のリンパの動作許可可能性がありますや赤芽球系前駆細胞、BM のそれぞれ。

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Protocol

動物の使用を含むすべてのプロシージャを動物のケアおよび使用委員会のインディアナ大学医学部の承認を行った。行われる国の動物実験に関する法律を遵守することを確認します。

1. Mx1CreRBPJ-/-受信者のマウスの作製

  1. Mx1-Cre+ RBPJlox/loxマウス10 Mx1 Cre を取得するマウスをクロスRBPJlox/loxマウス12と Mx1 Cre 負 RBPJlox/lox同腹子コントロールとして使用します。PCR10遺伝子型を確認します。
  2. 6-8 週を使用して-古い Mx1Cre+/RBPJlox/loxと Mx1Cre-/RBPJlox/loxマウス polyI:C 誘導を実行します。
  3. PolyI:C 200 μ g i. p. Cre+と Cre-マウスでを挿入します。1 つの polyI:C 注入 3 日間最初の週の毎日を与えます。1 つの polyI:C 注入 7 日 (合計で 4 回の注射) の前の注入後第 2 週を与えます。
    1. RBPJKO を使用 (Mx1Cre を誘導+/RBPJ液体酸素/液体酸素) と RBPJWT (Mx1Cre を誘導-/RBPJ液体酸素/液体酸素) 最後の polyI:C 注射後 3 週間の受信者としてマウス。
      注: 注射後 3 週間 pI: pC によるマウスを使用することをお勧めします。PolyI:C によって引き起こされるインターフェロン応答は HSC の肺浸潤拡大の結果、BM の重要な変化を誘導して末梢血16,17に成熟した前駆細胞の出力を減少します。造血のサブセットの表現は、正規化された 3 週間後に炎症の交絡影響せず利用できる注入とマウスです。この誘導のプロトコルは、RBPJ のために最適化されています。異なる遺伝子の削除、誘導プロトコルは、構成によって異なる場合があります、削除を検証する必要があります。合計 4 つ polyI:C 注射後 RT-PCR による loxP サイト間 RBPJ 地域の ~ 100% 削除を検証しました。

2. Lys EGFP ドナー骨髄細胞の移植のための準備

  1. 1 つの Lys EGFP マウス (頚部転位続いて二酸化炭素) を安楽死させる 1 または 2 の移植の前に h。
  2. 70% エタノールで動物の体の表面をスプレーします。
  3. 足首周りの両方の足で皮膚切開を行い、手術用鉗子を引いて離れて一緒にきれいな筋肉組織を公開する毛皮外科はさみを使用します。
  4. 外科はさみを使用して、可能な限り足から同様に多くの筋肉を削除します。はさみを使用して、(膝・足関節の骨を切り取ってきれいに大腿骨と脛骨のガーゼを使用してから任意の残りの筋肉組織。DMEM に 10% を含む 6 ウェル プレートに (2 つの大腿骨および脛骨の 2 つ) の骨を置く政府短期証券。
  5. ピペット 10 mL 冷たい 2 mM EDTA PBS とモルタルで噛み砕く骨髄細胞単一細胞懸濁液に細胞をさせる。また、1 mL 注射器で各側面から 2 mM EDTA PBS 3 回で骨をフラッシュします。
  6. 骨髄細胞を 15 mL 遠心管に 70 μ m フィルターを使用してフィルターします。2-3 ml の PBS のフィルターをすすいでください。460 x g で 10 分間ダウン セルをスピン、10 %10 mL の新鮮な DMEM に細胞を再懸濁します FBS。
  7. 診断に骨髄細胞をカウントし、1.5 倍の 107セル/mL を IMDM の血清濃度を調整します。200 μ L のボリュームを持つ動物あたり 3 x 10 の6セルを使用します。合計 BM の約 1/3 セル骨髄性 GFP + セルです。注射の準備ができるまで、氷の上セルを残します。105セル × 0.5 を使用して、FACS9GFP 発現を確認します。

3 RBPJKO マウスに Lys GFP 細胞骨髄移植

  1. パイ ケージで受信者のマウスを抑制します。ガンマ放射の致命的な線量を持つマウスに照射 (1,200 Rad) Cs 137 照射に。分割投与プロトコルを使用: 夕方 900 ラドに続いて 300 ラド (離れて 16 h) 次の朝。
  2. 致死的放射線照射した RBPJWT と RBPJKO の受信者マウス移植放射線の 2 回目投与後 5 〜 6 時間。BM を注入動物を介して尾静脈注射 (セクション 2 のセルを収穫の詳細を参照してください) あたり 3 x 10 の6セルの濃度リス EGFP マウスから採取した細胞。
  3. 異なる時点での IVFM による移植マウスの独立したコホートのイメージ: 24 h のと週 2、4、6、前述の下で (4

4. 手術に備えて生体イメージング

  1. 手術器具を滅菌します。2 本の細い鉗子 (1 つストレート、角度の 1 つ)、1 組の高級はさみとニードル ホルダーの 1 つのペア。手続きに必要なすべての供給で術野を準備します。
  2. 麻酔薬ケタミン カクテルの IP 注入マウスを与える (キシラジン 2.5-5 mg/kg + アセプロマジン 1.0 〜 2.5 mg/kg + ケタミン 90-100 mg/kg) 26-28 G 針の注射器を使用して。 動物のプロシージャの間に 15 分毎が監視され、元の用量の 1/4 で必要に応じて麻酔薬、補われます。
  3. 適切な熱源 (37 ° C 加熱パッド、パッドを加熱との直接接触から保護動物) の上にマウスを置くし、視覚的に呼吸数を監視します。
  4. つま先を利用した反射がピンチの応答を確認します。確実に動物完全に麻酔、手術を開始する前に。
  5. 使用 26 28 ゲージ与えるマウス蛍光血管マーカー (デキストラン、20 mg/mL の溶液 100 μ L) の尾静脈注射針注射器です。
  6. 両方の目に獣医眼軟膏を適用されます。小さな電気バリカンで動物の頭の背側表面をクリップします。脱毛クリームを削除し、生理食塩水、すすぎを 5 分使用ガーゼ スポンジにクリームを適用します。綿棒を使用して 70% アルコールできれいな頭皮を準備します。
  7. 微細鉗子、はさみを使用して小さな正中皮膚切開 (10-20 mm) を基になる背側頭骨表面を公開するのに頭皮に。5-0 外科シルクを使用すると、イメージングのため calvarium を公開するのにフラップを作成する、切開の各側に皮膚の縫合糸に宿泊 2 を配置します。
  8. 自分の背中にマウスを置き、顕微鏡油で満たされたガラス底皿に露出した頭皮が水没します。多光子イメージング部屋に動物を輸送します。
  9. 顕微鏡ステージ上目的上ガラス皿の上に配置 calvarium と動物を配置し、37 でカバーします° C 加熱パッド (動物は熱との直接接触から保護する必要があります)。

5 体内マウス Calvarium の高分解能イメージング。

  1. 多光子イメージングの変更倒立共焦点システムを使用して (材料の表を参照してください)。次の製造元の指示調整 830 2 光子レーザー nm、20 の場所 X W、NA 0.95 顕微鏡鼻部分およびチェック レーザーのビーム配置の対物レンズ。
    注: 正立顕微鏡システムはこれらの研究でよく使用が、反転の多光子吸収システムも利用できます。本研究では、カスタム設計された非外科的脳定位固定装置が使用されました。正立顕微鏡システムのいくつかの市販脳定位固定装置が市販脳定位固定装置マウス頭蓋骨のセキュリティ保護を目的とした倒立顕微鏡システムはありません。カスタムの脳定位固定装置に別の方法として、上記の安定性のための様々 なテープや接着剤の手法を活用して目的位置に頭蓋骨を保護できます。
  2. 画像集録ソフトウェアを開きます。「設定の取得」パネルは、1 方向スキャン モードを選択した場合確認してください。4 μ s/ピクセル、512 × 512 ピクセルにフレーム レートのためにスキャンの速度を設定し、1.5 にズームします。レボルバで配置されているレンズに合わせて利用可能な対物レンズのリストから 20 X W Na 0.95 目的を選択します。
  3. 「画像取得制御」パネルから「色素リスト」にアクセスし、、「光子」を選択します。「光パス & 染料」ウィンドウを開き、レーザー ユニット 2 のチェック ボックスをチェックすることによって DM690 980 励起 DM 2 P レーザー シャッターの開きを選択します。「顕微鏡コント ローラー」ウィンドウで RDM690 のミラーをを選択します。
  4. 「エピ ランプ」を B/G エピ フィルター キューブを選択選択して血流と中心静脈 (a) と (b) (図 2 a) 冠状縫合の分岐を参照として使用して、calvarium 骨髄ニッチを視覚化する試料の上に目的に焦点を当てます。
  5. 非 descanned モードを使用して画像を収集します。外部検出器を選択: コラーゲンの SHG 信号を収集する PMT detector1 (排出フィルター - 430/100 nm)、収集の GFP 信号 (排出フィルター - 525/50) GaAsP detector2 と TRITC デキストランの信号を収集する GaAsP detector3 (排出フィルター - 605/90 nm)。
    1. 光毒性を最小限に抑えるための平均で 4μs/ピクセルのスキャン レートでイメージングを実行します。一定のレーザー パワーと検出器のゲインが最小限の飽和検出器のダイナミック レンジを活用する調整で画像を収集します。
    2. Calvarium 骨髄の 6 地域から一連の組織 (60 × 1 μ m Z スタック) の深さによってセクションを収集します。ズーム 1.5 と 512 × 512 ピクセルのフレーム サイズ (423 μ x 423 μ m)、1 μ m のステップ サイズ設定を使用します。
      注: 全体的に 1 つのマウスを画像に必要な合計時間は 1 〜 1.5 h です。

6. 定量解析

  1. 製造元の指示に従って専用 3 D ・ 4 D 画像の定量化と可視化ソフトウェアを使用して画像の定量と 3 D 再構成を行う (を参照)。対話的にアルファ ブレンドまたはシャドウ射影ボリューム レンダリング アルゴリズム最大強度投影法 (MIP) を利用した 3 D で Z スタックを視覚化します。
  2. セグメントの GFP の細胞を使用して、"スポット オブジェクト分割モジュール"。(これは緑と赤のチャンネルで強い蛍光を表示する骨細胞の信号を排除) GFP の細胞数の偽肯定的な排除するスタック算術処理 (チャネル減算) を適用します。
  3. 曲面の分割モジュールを使用して血管と骨の表面の分割を実行します。必要な場合は、「表面にスポットの距離」と呼ばれるエックス テンション アルゴリズムを適用して細胞上の表面のいずれかへの距離を計算します。

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Representative Results

2 RBPJKO、2 RBPJWT 受信者のコホートを異なる時点で各撮像セッションでイメージしました: 24 h、2、(ワークフロー、図 1 aに示されている) BM Lys GFP の細胞移植後 4 〜 6 週間。

各マウスの画像に(図 2 a、)中心静脈と冠動脈縫合 (図 2 a、b) の分岐に関連して彼らの位置によって識別され、BM calvarium の 6 標準地域から買収されました。イメージ作成前デキストラン テキサス-赤のインジェクションによって、これらのランドマークの識別と 6 地域 (図 2 a) の選択: 左、中と右 (UL、UM、ウル) と左下、中と右 (LL、LM、LR)。60 x 1 μ m z スタックの各地域から収集され、レンダリングとして 3次元最大強度投影法 (MIP)、(図 2 b)。プロービング ・ コラーゲン組織 (図 2); 第二高調波発生 (SHG) 顕微鏡による骨コンポーネント (灰色) が含まれています 3 D プロジェクション シャドウ最後に、3-D 分割イメージの細胞の定量、骨や血管 (図 2 D) からの距離の測定を可能にします。

移植後 BM calvarium のさまざまな地域で造血細胞のホーミング設定で潜在的な違いがあるため、それぞれのマウスの calvarium で複数の領域をサンプルすることが重要です。図 3は、BMT (緑 - 骨髄細胞、灰色の骨) 後 2 週間で 1 RBPJWT と 1 つの RBPJKO の受信者の分析 6 地域の細胞分布の例を示していますシャドウ投影 3D レンダリング アルゴリズムを使用しています。RBPJWT マウスで 258 に 64 と RBPJKO マウスに 573 に 265 から遠隔地域ごとのセルの数。最終結果は、6 地域分析の数の平均値として表されます: マウス (平均 135 RBPJKO で RBPJWT 対 469)/地域ごとのセルの数。この代表的な実験は、受信者の RBPJKO よりも RBPJWT の地域ごとの細胞分布の季節変動が大きいがあることを示します。さらに、一般的ですが、マウスの内の calvarium 領域の変動に加えて、同じグループ内の個々 のマウスの中でバリエーションがあります。したがって、時間の各ポイント 1 つの条件を分析するために合計 24 を 30 領域の最小値を取得するための実験あたりの少なくとも 4 匹が評価が重要です。

図 4は、移植後 6 週間にわたってコントロールと比較してノッチ欠陥 BM 微小で骨髄前駆拡張動態を示します。この代表的な実験では、8 RBPJWT 8 RBPJKO マウス移植し、示された時点 (2 RBPJWT マウス、各時点で 2 RBPJKO マウス) でイメージします。図 4 aは、取得 1 のうち 6 地域の代表的な 3次元復元を示しています。6 領域の各セルが数えられたし、RBPJWT と RBPJKO の受信者 (図 4) のそれぞれの時点 (合計 12 地域) で 2 つのマウスの細胞/地域の平均数を計算しました。この分析ことを示す: (i) 受信者が RBPJWT と RBPJKO でドナー Lys GFP の細胞同様ホーミング効率; があります。ii) RBPJKO 受信者のセルより急速に拡大して RBPJWT 受信者で細胞数の 2 倍は、BMT; 後 2 週目iii) 細胞 RBPJWT 受信者の後を展開し、BMT; 後 4 週時 RBPJKO 受信者の細胞よりも 2 倍大きい値が・ iv) 携帯番号 RBPJWT と RBPJKO の両方の受信者に BMT 後 6 週時と同様になります。PB でドナーの骨髄系細胞の解析は、BM の RBPJKO マウスが Lys GFP の細胞のより低い内容を示したときに, 4 週で RBPJWT BM 受信者からより BM の RBPJKO の受信者からの骨髄系細胞のより高い出力を示します。骨髄系細胞の BM の居住者の骨髄細胞、PB で循環の連成解析を示す RBPJKO BM の微小環境 Lys GFP の細胞を展開し、迅速に動員する準備ができています。同じマウスから長い骨 BM の Lys GFP セルの並列の FACS 解析 IVFM; で観測されたような傾向を示したしかし、条件の違いは、以下の発音 (図 4 b) でした。

骨や血管から個々 の Lys GFP の細胞までの距離の測定は、図 5に示すです。BMT から 6 週間で RBPJWT と RBPJKO calvarium の LM 領域の 3次元セグメンテーション分析本の代表的な研究で使用された (図 5 a)。地域内の各セルを計算した骨と血管からの距離: 200 RBPJWT および RBPJKO、255 細胞における細胞し、従って、平均として表現。分析の結果、Lys GFP の細胞が RBPJWT と RBPJKO マウス (11 μ m) の骨から同じような距離でローカライズすることが、RBPJKO マウスよりも RBPJWT マウスにより血管から遠くなった (15 μ m5 μ m、それぞれ)。この結果は、血管に近いローカライズする Lys GFP の細胞 RBJWT マウス以上の循環に動員し、そのマウス、RBPJKO で期待と興味をそそられる。ただし、ローカリゼーションの違いが (RBPJWT と RBPJKO) のこれらの 2 つの集団の分化の別の段階を反映していることはこの分析では対応できないポイント。この結果の意義がする後まで細胞の FACS 解析を組み合わせることにより、すべての 6 地域でのより大きいプール。

マウスあたり少数の領域を分析するときは、全体的に、最適の結果が得られます。画像は、特に致命的な照射損傷血管と毛細血管からデキストランの漏洩削減イメージ定義次の BMT、初期の時点で挑戦です。したがって、初期の時点で特に繰り返しの数が多いを持つことが重要です。

SHG は 3 D でコラーゲン繊維組織を調査するための便利なツールです。それは非 centrosymmetry と高い二次非線形係数を有する膠原線維などの構造に由来する二次の非線形光学過程です。強い入射光は、このような構造を操作したとき、入射周波数の 2 倍、または半分の入射波長で光を生成します。したがって、ラベルは必要ありません 2 光子励起顕微鏡で SHG 信号をキャプチャするために。830 nm 励起波長発光フィルター 430/100 nm の青チャンネルの SHG 信号を捉えます。

Figure 1
図 1:実験的ワークフロー 。(A) RBPJKO と RBPJWT マウス 〜 4 週間事前イメージング; を生成する Mx1 の誘導-Cre/RBPJlox/loxマウス(B) BM 準備細胞 Lys GFP トランスジェニック マウス;(C) 移植の BM Lys-GFP 細胞致死的照射の RBPJKO または RBPJWT の受信者;(D) 24 h、BMT、続いて安楽死と FACS による BM 解析後 2、4、6 週間でマウス calvarium の IVFM。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:BM 血管ニッチの IVFM.(A) モザイク多光子像イメージングの 6 標準的な地域を示す Lys EGFP マウス calvarium (UL: UM を左上: 上中間、UR: 右上、LL: LM を左、下: 中間、LR を下げる: 右下) (緑、骨髄性細胞; 赤、血管; 骨グレー)10 倍の倍率。(BD)BM ニッチ詳細として表示: MIP (B), (C) 3-D 影投影, (D) 3-D 分割画像。画像は、専用の 3 D ・ 4 D 画像の定量化と可視化ソフトウェアの (表 1) を使用して - 処理されました。スケール バー B, C, D で 50 μ m =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3:2 週目で骨髄系細胞生着します。Lys GFP の細胞 (緑) と骨の画像は、1 RBPJWT と 1 つの RBPJKO マウス (u: 上、l: 左、m: 中間、r: 右) の calvarium の骨から 6 BM 地域 (グレー) を表面します。スケール バー = 50 μ m。バー グラフ (右) は、セル (RBPJWT 範囲 64-258; を地域ごとにカウント数を示すRBPJKO の範囲 265 573) と +/73 と 469 の平均数 135 STD 121 ± STD。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4:骨髄細胞の生着と出力次の BMT の動力学。(A) 画像 Lys GFP の細胞 (緑) と骨表面 (グレー) 1 つの代表的な地域の各時間のポイントで 1 つの RBPJWT と RBPJKO マウスの calvarium から示されます。スケール バー = 50 μ m;(B) ドットのしみ Lys GFP 同じマウスから採取した長骨の骨髄内でフローサイトメトリーによる陽性細胞イメージング (上) 生体内でのショーの割合。(C) 棒グラフ表示セル/2 マウス (合計 12 地域) 各時点での地域の平均数、標準 (D) ライン ± グラフは同じマウスの PB で好中球 (セル カウンターによって列挙) の合計数は倍に増加を示しています。示された時点で (A)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5:BM 相対的血管と骨に骨髄の細胞の局在。(A) 代表的な 3-D 分割画像 Lys GFP の細胞と血管と Lys GFP の細胞および BMT から 6 週目で RBPJWT と RBPJKO の受信者の calvarium 骨の同じ領域の骨。スケール バー = 50 μ m。(B) 棒グラフが骨の表面や血管系から SEM Lys GFP 細胞 + μ m で平均距離をまとめたもの。細胞数の測定: RBPJWT n = 200 細胞と RBPJKO n = 255 セル。Lys GFP、血管から細胞までの距離が RBPJWT マウス、p を超える RBPJKO の < 0.001 (スチューデントの t 検定)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

このプロトコルでは、生体の蛍光顕微鏡による造血細胞移植の動力学を調査するように最適化実験デザインについて説明します。本研究では WT BM または欠陥のある BM をシグナリング ノッチ骨髄前駆細胞の拡張追跡された骨 calvarium で次 Lys GFP 陽性骨髄性細胞によって BMT 後 RBPJWT または RBPJKO の受信者に。たとえばアドレス同様の質問に適用できるモデルとしてこのアプローチが提案されて: 私) よう拡大と他系統の BM ニッチ細胞の局在を決定するリンパ球、赤芽球またはドナー細胞として使用して、巨核球の細胞造血細胞が GFP やトマト、赤; 運転系統特定の促進者を運ぶii) に受信者として他の特定 KO やトランスジェニック マウスを用いた異なる微環境要因を評価します。

このイメージング プロトコルを calvarium 骨の強さはバミューダ諸島地域、中心静脈と冠状縫合の分岐を選択するために使用する解剖学的ランドマークは個人間の整合性を許可するすべてのマウスの保存合理的に自動ステージの要件を取りやめている間実験。さらに、造血細胞を追跡する GFP モデルの使用は、GFP は照射後など最適な条件下で安定した信号を提供される非常に効果的なことが分かった。最後に、倒立顕微鏡とマウスは仰臥位で、カスタマイズされた固定デバイスを使用して、画像のセットアップは大きく呼吸の成果物を最小限に抑えます。

この実験的なデザインの 2 つの側面を実装する場合、calvarium の IVFM のより広範なより効果的な使用可能性があります。最初に、それは最適化し、縦画像を許可する (数週間には、2 日目) から異なる時点で同じマウスの観察介入 (すなわちBMT または療法) 後使用する代わりにプロトコルを標準化することが重要になります独立した集団での。この方法は、手術後の回復と炎症、感染症に対抗し、イメージングのサイトで瘢痕の措置の使用のための適切な条件を必要とする応用は現在限られる。系列マウス モデル BM のニッチの特定のセルに蛍光タンパク質を追跡の配列を開発する貴重なことが第二に、(血管、骨、血管と神経) 特定の造血幹細胞の機能を結合するにはBM のニッチの特性。

骨の画像は、まだいくつかの課題と他の組織と比較して制限を持っています。2 光子顕微鏡が 100 1,000 ミクロンの深い組織を浸透することができますがまだ calvarium 骨の全体の厚さを介して画像に挑戦です。画像は、深さを増加するので、ここのプロトコル記述 60 ミクロン厚スタックからバミューダ諸島地域の信頼性の高い分析と品質を失います。矛盾または準最適イメージングにつながるもう一つの要因は、ピンぼけ画像をもたらすことができる calvarium の骨の湾曲した形です。脳定位固定装置とおそらく目的は、上記のガラス皿に完全に配置頭蓋骨を持っていることが重要です。確かに、頭蓋の大きさは重要です: マウスは若すぎるまたは小さすぎるの頭蓋骨が脳定位固定装置、特定のデバイスで完全に合わない場合があります。例として、ここで利用デバイス マウス未満 6 週間と 20 g 未満が適合しません。

追加の制限は、本研究で利用したイメージング システムは 3 つのチャンネルに制限されてです。青のチャネルが自動的に骨コラーゲンの非標識に基づいて SHG 信号を収集するために割り当てられているとおり 2 つのチャネルは特定の蛍光標識します。さらに、このシステムには、住む時、512 × 512 ピクセル フレーム サイズは、高速な動的プロセス (血流や血流中の細胞動員の評価の測定) などには適していません 2 μ s/ピクセルで 1 フレーム/秒の速度制限があります。

重要な課題は、照射が血管性の BMT 妥協の実行です。照射後 BM に血管漏れセグメンテーション/定量、定量分析の難しさをもたらすことができます個々 の構造の問題が発生します。

最後に、1 つのマウスの画像は、約 1 時間し、特定の日のイメージを作成することができますマウスの数が限定されることを考慮することが重要だ (~ 4 に 6 マウス)。したがって、分析の力を取得するサンプル サイズの増加は、変動を増やすことができます複数の独立した実験を必要があります。

このプロトコルに従い造血細胞 BMT から 24 h は ~ 30 セル/地域およびそれ後 BM の IVFM によって検出された Lys GFP+細胞の数は細胞 (3 x 106) の初期入力に比べるとかなり数が少ないです。とはいえ、この問題の一部は肺にトラップを携帯し、は肝静脈注入 BM へのホーミングする前に、選択したもの以外の calvarium の領域があるかどうかを検討するためには、移植された細胞ホームで高い効率。

ホーミングと BMT BM に細胞の生着がよく続きますフローサイトメトリーによる GFP、Carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) または系統および幹細胞マーカーの組み合わせ CD45.1/CD45.2 マーカーの測定。特に早期の時点で、IVFM の使用は、フローサイトメトリーによって提供されることができないユニークで追加情報を利用できます。たとえば、しばしば簡単じゃない肯定的なイベントの数が少ないを収集する場合、特に「アーティファクト」をされているイベントから「セル」は、FACS イベントを区別する (すなわちBMT から 24 h)。IVFM では、この区別を助ける細胞の局在と形態について説明します。同様に、ニッチ市場で寝泊まりしていた細胞と血管系の循環に既にあった細胞のフラッシュ、または骨のクラッシュによって収穫される BM 造血細胞の FACS 解析が含まれます。確かに、IVFM は、区別と BM のニッチと血液中に動員されて細胞内にある細胞の評価を許可します。この区別は、ホーミング、ローカリゼーション、分化および特定のモデルの動員の機構研究偉大な価値です。重要なは、IVFM は、特定のニッチを構成する微小細胞に対する造血細胞の位置に固有の情報を提供できます。

BM のニッチは、このような組織学的解析の構成に対処するために使用する他の方法が使用されています。BM の生体顕微鏡と共焦点顕微鏡による組織学的解析の比較議論されている徹底的にかつエレガントな Lo セルソによって18

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

イメージングを行ったインディアナ センター博士ケン ・ ダン監督、インディアナ大学で生物顕微鏡用。脳定位固定装置は、設計、マーク Soonpaa、ウェルズ小児研究センターによって製作したプロトタイプです。この作品は NIH/R01DK097837-09 (NC) によってサポートされていた、NIH/R01HL068256-05 (NC)、NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC)、MPN 研究財団 (NC)、CTSI 共同プロジェクト IUSM/ノートルダム大聖堂 (NC)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine cocktail IU School of Medicine Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran Tdb Consultancy TD150-100mg Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer Braintree Scientific CLP-323 75
Gauze sponge Med Vet International PK224 4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream Commercial store
Saline Med Vet International RXSAL-POD1LT 0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe Fisher Scientific 14-826-79 28 g, 1/2 cc
Fine Forceps Fine Science Tools 00108-11, 00109-11 straight forcep, angled forcep
Scissor Fine Science Tools 15018-10
Needle holder Fine Science Tools 12002-14
5-0 silk suture Fisher Scientific MV-682 Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish WillCo GWSt-5040
Optical microscope oil Leica
Stereotaxic stage insert  IU School of Medicine Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system  Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective  Olympus
Small heating pad Commercial store Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software Bitplane 3/4 D Image Visualization and Analysis software

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References

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