Zebrafish भ्रूण से अंतर्जात रिसेप्टर्स की आत्मीयता लेबल जांच

1Cell and Developmental Biology, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
Developmental Biology

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Molina-Villa, T., Mendoza, V., López-Casillas, F. Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (114), e54405, doi:10.3791/54405 (2016).

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Abstract

Protocol

जानवरों में किए गए सभी प्रयोगों, प्रयोगशाला पशु की देखभाल और मेक्सिको के स्वायत्त राष्ट्रीय विश्वविद्यालय (UNAM) के उपयोग के लिए समिति द्वारा अनुमोदित किया गया CICUAL-प्रोटोकॉल संख्या के तहत: FLC40-14। (CICUAL: "Comité institucional पैरा एल Cuidado Y Uso डे लॉस Animales डी Laboratorio डेल Instituto डी Fisiologìa सेल्यूलर, Universidad Nacional ऑटोनोमा डे मेक्सिको")।

1. भ्रूण प्रोटीन निकालने की तैयारी

  1. हर हालत में वांछित स्तर पर (morphants बनाम जंगली प्रकार) की तुलना करने के लिए, उदाहरण के 72 घंटा बाद निषेचन (HPF) के लिए 200 भ्रूण - 100 लीजिए।
  2. मछली पानी युक्त पेट्री डिश में रखें भ्रूण (1 टेबल देखें) और मैन्युअल ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग भ्रूण Dechorionate। इस कदम (या प्रोटोकॉल भर में किसी भी अन्य प्रोटीज) के दौरान pronase का उपयोग कर के रूप में यह लक्षित रिसेप्टर को पचा सकता से बचें।
  3. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में रखें भ्रूण और भ्रूण TW धोने1x फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) के साथ बर्फ (1 टेबल देखें)।
  4. Deyolk बफर के 500 μl जोड़ें (1 टेबल देखें)।
  5. समाधान में भ्रूण - (40 बार के बारे में 30) धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा जर्दी का सबसे रिलीज। 72 HPF और 48 HPF भ्रूण के लिए क्रमश: नीले और पीले रंग पिपेट सुझावों का उपयोग करें। पीला सुझावों का थोड़ा भ्रूण को नष्ट करने से बचने के लिए कटौती करने की आवश्यकता हो सकती है। सफल जर्दी रिहाई माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण देख द्वारा जाँच की जा सकती है।
  6. 15 सेकंड के लिए 600 XG पर centrifugation द्वारा भ्रूण लीजिए।
  7. एक pipet का उपयोग करके ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  8. धो भ्रूण दो बार 500 μl धोने बफर के साथ धीरे सबसे कम गति पर vortexing द्वारा (1 टेबल देखें)।
  9. 15 सेकंड के लिए 600 XG पर centrifugation द्वारा भ्रूण लीजिए।
  10. यहां से शुरू, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रक्रिया जारी है।
  11. एक pipet का उपयोग करके ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  12. lysis बफर के 350 μl में Resuspend भ्रूण (1 टेबल देखें) और एक प्लास्टिक मूसल का उपयोग homogenize।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक टेस्ट ट्यूब घुमाव पर lysed भ्रूण सेते आंदोलन के साथ 30 मिनट।
  14. अपकेंद्रित्र अघुलनशील मलबे को हटाने के क्रम में 15 मिनट के लिए 11,000 XG पर भ्रूण lysed।
  15. स्थानांतरण एक ताजा ट्यूब एक pipet का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला को मंजूरी दे दी।
  16. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख 4, या अन्य उपयुक्त प्रक्रिया द्वारा कुल प्रोटीन निर्धारित करते हैं। ब्रैडफोर्ड परख के लिए इस्तेमाल किया जाता है तो, lysis बफर में डिटर्जेंट प्रस्तुत की बराबर सांद्रता की उपस्थिति में अंशांकन वक्र प्रदर्शन के रूप में वे प्रोटीन मानक 4 के एक मूल्यवान समझना के कारण।

2. अंतर्जात रिसेप्टर प्रोटीन का पता लगाने

  1. आत्मीयता लेबल और Immunoprecipitation (4 सी में इन सभी चरणों)
    1. 500 माइक्रोग्राम कुल भ्रूण प्रोटीन का एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में और बफर 1 (1 टेबल देखें) के साथ 1 माइक्रोग्राम / μl के लिए पतला - 400 रखें।
      नोट: आदेश की कुल भ्रूण प्रोटीन, के बारे में 100 से 500 माइक्रोग्राम प्रति प्राप्त करने के लिए - 200 भ्रूण शुरू में कार्रवाई की जानी चाहिए। 72 HPF भ्रूण नियमित तौर पर उपज ~ 5 कुल भ्रूण प्रोटीन है, जो betaglycan का पता लगाने के लिए पर्याप्त है की माइक्रोग्राम।
    2. लेबल TGF-β2 शेयर के लिए पर्याप्त मात्रा में जोड़ें 150 बजे के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक टेस्ट ट्यूब घुमाव 2 घंटा पर आंदोलन के साथ सेते हैं। TGF-β2 के रूप में Cheifetz एट अल। 5 से वर्णित chloramine टी विधि द्वारा पहले AFLIP शुरू कर दिया है लेबल किया जाना चाहिए, 125 के साथ मैं।
      चेतावनी: उपयोग करते हैं जबकि 125 से निपटने मैं ligand लेबल जोखिम को कम करने के लिए परिरक्षण।
    3. 100 कमजोर पड़ने और (ऊष्मायन हो सकता हे / एन) 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 2 घंटे के लिए ऊष्मायन जारी: ब्याज की रिसेप्टर के खिलाफ undiluted एंटीबॉडी की पर्याप्त मात्रा के क्रम में एक 1 तक पहुँचने के लिए जोड़ें। यह सीरमरोधी # 31 की इष्टतम कमजोर पड़ने है इस अध्ययन में इस्तेमाल किया है और कहीं वर्णित 3, लेकिन एक की गुणवत्ता पर निर्भर करता हैtibody, एक बड़ा या छोटा कमजोर पड़ने इष्टतम हो सकता है।
    4. उपयुक्त इम्युनोग्लोबुलिन बाध्यकारी मोतियों की 50 μl जोड़ें (जैसे, जी-प्रोटीन-Sepharose है, जो पहले TNTE में equilibrated और resuspended था 1: TNTE में अपने मूल मात्रा का 5) और 4 डिग्री पर एक टेस्ट ट्यूब घुमाव पर आंदोलन के साथ 50 मिनट के लिए सेते सी।
    5. 20 सेकंड के लिए 11,000 XG पर microcentrifugation द्वारा मोतियों की वसूली।
    6. एक उचित रेडियोधर्मी कचरा कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    7. आईपी ​​मोती 20 सेकंड प्रत्येक समय के लिए 11,000 XG पर, vortexing और microcentrifugation द्वारा आईपी धोने बफर (1 टेबल देखें) के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं।
    8. Resuspend आईपी मोती आईपी धो बफर के 250 μl में।
    9. (10 मिलीग्राम / एमएल DSS, DMSO में भंग) disuccinimidyl suberate के 1.5 μl जोड़ें। सिर्फ इस चरण में इसके उपयोग से पहले DSS समाधान तैयार है।
    10. आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    11. आदेश crosslinking प्रतिक्रिया बुझाने के लिए, 500 μl हे जोड़ेंएफ आई पी धो बफर, पर्याप्त Tris-सीएल 7.4 पीएच शेयर के साथ पूरक 25 मिमी Tris-सीएल तक पहुंचने के लिए। Tris में मुक्त अमीनो समूहों unreacted DSS कब्जा।
    12. 20 सेकंड के लिए 11,000 XG पर अपकेंद्रित्र आईपी मोती को इकट्ठा करने और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    13. Resuspend आईपी मोती Laemmli बफर को कम करने के 30 μl में।
    14. उबाल लें नमूने 94 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट।
    15. वैकल्पिक रूप से, निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक गामा काउंटर में नमूनों का विश्लेषण।
  2. नमूना विश्लेषण
    1. denaturing एसडीएस पृष्ठ के अधीन रहते हुए नमूने हैं। रिसेप्टर के द्रव्यमान के लिए उपयुक्त प्रतिशत पर polyacrylamide का प्रयोग करें और मानक प्रक्रिया के तहत जेल चला रहे हैं।
    2. लगानेवाला समाधान में विसर्जित कर दिया जेल आरटी पर 30 मिनट के लिए (1 टेबल देखें)।
    3. 15 मिनट के लिए पानी के साथ distillated जेल धो लें।
    4. पहले से हाइड्रेटेड फिल्टर पेपर में जेल प्लेस और सरन लपेटें फिल्म के साथ कवर।
    5. 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी जेल।
    6. एक सफेद phosphorimager scre पर जेल बेनकाबआर टी ओ / एन एन।
    7. उजागर स्क्रीन एक phosphorimager निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर का उपयोग कर स्कैन करें।

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Representative Results

चित्रा 1 एक प्रतिनिधि AFLIP के साथ प्राप्त परिणाम से पता चलता। लेन 1 में सिग्नल 125 मैं-ligand से आते हैं covalently या तो zebrafish betaglycan कोर प्रोटीन (बीजी कोर, 150 केडीए मार्कर नीचे) या बीजी कोर कि glycosaminoglycans की कुर्की (भूमिकाः, धब्बा द्वारा अपने proteoglycan प्रपत्र को संसाधित किया गया है से जुड़े 170 केडीए से जेल के शीर्ष से लेकर)। पलायन का यह पैटर्न, एक तेज कोर प्रोटीन के साथ साथ एक लिप्त proteoglycan (भूमिकाः जंजीरों की लंबाई में विविधता के कारण), TGFBR3 2 की विशेषता है। चूंकि इस के बारे covalently लिंक नहीं है हर एक ligand रिसेप्टर जटिल गठन, वहाँ मुफ्त 125 मैं-ligand जेल (125 मैं-TGF-β2) के प्रवास के मोर्चे पर दिखाई दे रहा है। यह मुफ्त ligand रिसेप्टर के लिए बाध्य किया गया था, और immunoprecipitation दौरान बाध्य बने रहे, लेकिन जब से यह covalently संलग्न नहीं किया गया था, एसडीएस पृष्ठ की प्रक्रिया के दौरान अलग। नहींnetheless, इसके संकेत की ताकत अभी भी लेबल रिसेप्टर द्वारा दिए गए एक करने के लिए संबद्ध। इस गलियों 2 और 3 की तुलना 48 zebrafish भ्रूण HPF पर द्वारा सराहना की जा सकती प्रदर्शन कर 72 HPF भ्रूण 3 से बीजी की कम मात्रा, जो झूठ और बीजी मूल में बेहोश संकेत है, कि की तीव्रता के अनुरूप द्वारा देखा जा सकता है मुक्त ligand जेल के मोर्चे पर प्रदर्शित होने के द्वारा दिए गए संकेतों (2 लेन)। यह देखते हुए कि चूहे के खिलाफ एंटीबॉडी बीजी 6 नहीं जेडएफ बीजी के साथ पार प्रतिक्रिया करते हैं, एंटीबॉडी जब AFLIP में इस्तेमाल कोई संकेत दे दी है, इसलिए, एक नकारात्मक नियंत्रण (3 लेन) के रूप में सेवारत। इसी तरह के नकारात्मक परिणाम विरोधी जेडएफ बीजी एंटीबॉडी 3 के पूर्व प्रतिरक्षा सीरम के साथ प्राप्त किया गया।

चित्रा 2 से पता चलता है कि कैसे AFLIP में morpholino के कारण एक दिया रिसेप्टर की अभिव्यक्ति के स्तर पर, इस मामले में, betaglycan की कमी एक प्रयोगात्मक हेरफेर के अधीन भ्रूण में गेज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताjection 3। जबकि 2 लेन एक morpholino जेडएफ बीजी प्राथमिक प्रतिलेख के exon2-intron2 सीमा के लिए निर्देशित के 7 एनजी प्रशासन के प्रभाव से पता चलता लेन 1, एक 72 HPF जंगली प्रकार भ्रूण में TGFBR3 के स्तर से पता चलता। ध्यान दें कि बीजी नीचे विनियमन इस morpholino के साथ प्राप्त की अपनी एमआईएस मिलान नियंत्रण (3 लेन) द्वारा reproduced नहीं है। इन परिणामों की पुष्टि की है कि इस phenotype morpholino के साथ प्राप्त TGFBR3 की पछाड़ना के लिए विशिष्ट रूप में 3 से पहले वर्णित किया गया था।

आकृति 1
Zebrafish भ्रूण में बीजी की चित्रा 1. AFLIP जांच। 72 घंटा बाद निषेचन (HPF) में भ्रूण से कुल प्रोटीन निकालने (गलियों 1 और 3) और 48 HPF (2 लेन) 125 मैं-TGF-β2 समानता लेबलिंग का पालन करने के लिए किए गए बीजी (3 लेन, RBG खरगोश विरोधी zebrafish बीजी (गलियों 1 और 2, zBG) या खरगोश विरोधी चूहा के साथ आईपी से) एक नियंत्रण के रूप में। Autoradiography में बड़ी भूमिकाः (बीजी कोर) के बिना पता लगाया जा सकता है या के रूप में एक ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन संशोधित बीजी (भूमिकाः)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. बीजी morpholino पछाड़ना AFLIP द्वारा पता लगाया। अनुपचारित गुम्मट भ्रूण (lane1), विशिष्ट बीजी morpholino (2 लेन) या एक बेमेल नियंत्रण (3 लेन) के साथ microinjected से बीजी के 125 मैं-TGF-β2 समानता लेबलिंग। प्रति मिलियन (सीपीएम) की गिनती के बाद immunoprecipitation और पार से जोड़ने कदम संकेत कर रहे हैं। बरामद यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बफर रचना
बफर 1 50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 0.1% ट्राइटन X-100
Deyolk बफर 55 मिमी NaCl, 1.8 मिमी KCl, 1.25 मिमी 3 NaHCO
मछली पानी सामग्री तालिका देखें
लगानेवाला समाधान 50% सीएच 3 ओह, 12% CH 3 COOH, 0.185% HCHO
आईपी ​​धो बफर 10 मिमी ना 2 HPO 4, 2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 0.1% ट्राइटन X-100, 0.02% एसडीएस, 7.4 पीएच
Laemmli बफर 2% एसडीएस, 10% ग्लिसरॉल, 100 मिमी डीटीटी, 60 मिमी Tris (पीएच 6.8), 0.001% bromphenol नीला।
लिसेस बफ़र 50 मिमी Tris एचसीएल pH7.4, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी PMSF, 0.5% ट्राइटन X-100, 0.1% एसडीएस, 0.5% सोडियम Deoxycholate
पीबीएस 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 HPO 4, 2 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, pH7.4
TNTE 50 मिमी Tris एचसीएल pH7.4, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 0.1% ट्राइटन X-100
धुलाई बफर 110 मिमी NaCl, 3.5 मिमी KCl, 2.7 मिमी CaCl 2, 10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.5

तालिका 1: बफर रचनाएं

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Discussion

ब्याज की एक प्रोटीन के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी blots का उपयोग embryogenesis दौरान अपनी अभिव्यक्ति 7 अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। हालांकि, उच्च ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन की immunoblotting उनकी अक्षम हस्तांतरण और nitrocellulose या PVDF झिल्ली 8,9 करने के लिए कमजोर बाध्यकारी होने के कारण बहुत सफल नहीं रहा है।

प्रोटेयोग्लाईकैन्स क्योंकि उनके covalently जुड़ी ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन चेन (भूमिकाः) कि नकारात्मक चार्ज किया जाता है और या तो polystyrene सतहों या हाइड्रोफोबिक सोख्ता झिल्ली अच्छी तरह से बाध्य नहीं है, इस कमी का एक अच्छा उदाहरण है। इसके अलावा, भूमिकाः चेन का आकार विविधता जेल के एक क्षेत्र से अधिक प्रोटीन "फैलता है", प्रभावी ढंग से दाग के क्षेत्र के प्रति अपनी राशि कम। इसके अलावा, अगर ब्याज की प्रोटीन अभिव्यक्ति के निम्न स्तर है, नियमित रूप से पश्चिमी blots द्वारा अपनी पहचान एक मुश्किल काम है। रिसेप्टर (TGFBR3) या betaglycan β प्रकार III बदलने वृद्धि कारक(बीजी), स्तनधारियों 1 में दो भूमिकाः के लगाव साइटों और zebrafish 3 में एक के साथ एक झिल्ली रिसेप्टर, इन गुणों के सभी है। हालांकि, इन बाधाओं को पार करने के लिए प्रोटोकॉल तैयार किया गया है, avidin बायोटिन परिसर (एबीसी) प्रणाली 10,11 या सकारात्मक आरोप लगाया झिल्ली 12 पर प्रोटेयोग्लाईकैन्स की immunobloting द्वारा पता लगाने की तरह है, वे एक ही प्रोटोकॉल में दोनों समस्याओं को हल नहीं कर सकते। अपनी प्राकृतिक ligand TGFβ2 के लिए और एक विशिष्ट एंटीबॉडी की उपलब्धता के बीजी के उच्च आत्मीयता का लाभ उठाते हुए, AFLIP, एक तकनीक है कि समानता लेबलिंग और immunoprecipitation के लाभों को जोड़ती है, ऊपर चर्चा की पश्चिमी धब्बा का पता लगाने की सीमाओं को पार किया जा सकता है।

उनकी radiolabeled ligands के साथ झिल्ली बाध्य रिसेप्टर्स की आत्मीयता लेबलिंग एक अच्छी तरह से इस्तेमाल उपकरण है कि पहचान और कई महत्वपूर्ण विकास के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है संवर्धित कोशिकाओं 13-16 में रिसेप्टर्स कारक है।जबकि पारंपरिक समानता कोशिकाओं की एक monolayer लेबलिंग में टिशू कल्चर पकवान पर ligand लेबलिंग सहसंयोजक के अधीन है और फिर lysed, AFLIP में ligand रिसेप्टर परिसरों पहले भ्रूण lysates, तो immunoprecipitation द्वारा शुद्ध और अंत में, covalently पार से जुड़े में बनते हैं। radiolabeled ligands के अपने प्रयोग के कारण, AFLIP बहुत संवेदनशील है और सिद्धांत रूप में अन्य विकास कारकों या साइटोकिन्स रिसेप्टर्स जिसके लिए एक लेबल ligand और एक अच्छा एंटीबॉडी उपलब्ध हैं अनुकूलित किया जा सकता है। AFLIP की इस संभावित इन कम प्रचुर मात्रा में है, लेकिन शारीरिक प्रासंगिक अणुओं का पता लगाने में मदद मिलेगी।

आत्मीयता के लेबलिंग के पार से जोड़ने कदम में निहित परिवर्तनशीलता के कारण, AFLIP मात्रात्मक मापा रिसेप्टर्स के स्तर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। हालांकि, अगर पर्याप्त समानांतर नियंत्रण के साथ प्रदर्शन किया, यह उनकी अभिव्यक्ति के रिश्तेदार के स्तर की एक काफी सटीक गेजिंग प्रदान कर सकते हैं। AFLIP कुल प्रोटीन के अर्क का उपयोग के रूप में, यह restri नहीं हैरिसेप्टर के एक विशिष्ट सेलुलर स्थान पर cted, यह अपनी अभिव्यक्ति पूरे व्यक्ति या अंग में, अगर विच्छेदित वयस्क नमूनों के लिए लागू पता चलता है। अंत में, यदि आवश्यक हो तो AFLIP अन्य जैव रासायनिक प्रोटोकॉल से जोड़ा जा सकता है, कार्बोहाइड्रेट एंजाइमी digestions की तरह, आगे ब्याज की रिसेप्टर को चिह्नित करने के लिए।

पारंपरिक समानता लेबलिंग करने के लिए भी इसी तरह, एक हौसले से 125 मैं लेबल ligand पुरजोर सिफारिश की है। 125 मैं से कम आधा जीवन को देखते हुए, ligand ताजा आइसोटोप के साथ लेबलिंग के बाद पहले 2 हफ्तों के भीतर किया जाना चाहिए। हालांकि प्रोटोकॉल का निरंतर का सबसे इसी चरणों में उल्लेख किया गया है, एक विशेष उल्लेख की जर्दी से सावधान हटाने, जो के रूप में पूर्ण और संभव के रूप में एक समान होना चाहिए करने के लिए दी जाएगी। जर्दी के असमान मात्रा में छोड़कर lysates में सदाशयी भ्रूण प्रोटीन की गलत quantitation में नतीजा होगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS) ThermoFisher Scientific 21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0618-01
Gel Dryer Model 583  BIO-RAD 1651745
Typhoon 9400 GE Healthcare Life Sciences 63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter Packard
Exposure Cassette Molecular Dynamics 63-0035-44
NaCl J.T. Baker 3624
KCl J.T. Baker 3040
Na2HPO4 J.T. Baker 3828
K2HPO4 J.T. Baker 3246
CH3OH J.T. Baker 9070
CH3COOH J.T. Baker 9508
HCHO J.T. Baker 2106
SDS Sigma-Aldrich L4509
EDTA Sigma-Aldrich ED
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306
NaHCO3 Fisher Scientific S233
PMSF Sigma-Aldrich P7626
Crystal Sea Marine Mix Marine Enterprises International http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix

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References

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