Анионной полимеризации амфифильного Сополимер по подготовке блоксополимера мицелл, стабилизированных π-л стэкинг-взаимодействий

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Основные этапы живой анионной полимеризации фенилглицидиловый эфира (PheGE) на метокси-полиэтиленгликоль (MPEG- б) -PPheGE описаны. Результирующие блок-сополимера мицеллы (BCMS) загружались с доксорубицином 14% (мас%) и замедленное высвобождение лекарственного средства в течение 4-х дней при физиологически получали соответствующие условия.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Le Dévédec, F., Houdaihed, L., Allen, C. Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by π-π Stacking Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54422, doi:10.3791/54422 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В этом исследовании, амфифильный сополимер , который включает в себя базовую образующий блок с фенильными группами, синтезировали живой анионной полимеризации фенилглицидиловый эфир (PheGE) на метокси-полиэтиленгликоль (MPEG- б -PPheGE). Определение характеристик сополимера показал узкое молекулярно -массовое распределение (PDI <1,03) и подтвердили степень полимеризации мПЭГ 122 - B - (PheGE) 15. Критическая концентрация мицелл сополимера оценивали с использованием установленного способа флуоресценции с поведением агрегации оценивали с помощью динамического рассеяния света и передачи электронной микроскопии. Потенциал сополимера для использования в приложениях для доставки лекарственных средств оценивали в предварительном порядке , включая в пробирке биосовместимость, загрузка и высвобождения гидрофобного противоракового препарата доксорубицина (DOX). Стабильная рецептура мицелл DOX был подготовлен с уровнем загрузки лекарственного средства до 14% (мас%), погрузка наркотиков efficiencies> 60% (вес / вес) и замедленное высвобождение препарата в течение 4-х дней при физиологически соответствующих условиях (кислых и нейтральных рН, присутствие альбумина). Уровень загрузки высокого наркотиков и замедленным высвобождением приписывается стабилизирующих π-pi; взаимодействия между DOX и центральным блоком формирования мицелл.

Introduction

В водной среде, амфифильные блок-сополимеры, собираются, чтобы сформировать нано-размера блок-сополимера мицелл (BCMS), которые состоят из гидрофобной сердцевины, окруженной оболочкой гидрофильных или короны. Ядро мицеллы может служить в качестве резервуара для включения гидрофобных лекарственных средств; в то время как гидрофильный коронный обеспечивает интерфейс между ядром и внешней средой. Поли (этиленгликоль) (ПЭГ) и его производные являются одним из наиболее важных классов полимеров , и один из наиболее широко используемых в лекарственной композиции. 1-3 BCMS оказались достойной платформой для доставки лекарственных средств с несколько составов , опираясь на этот технологии в настоящее время в поздней стадии клинической разработки. 4 Чаще всего, гидрофобный блок - сополимера состоит из поликапролактон, поли (D, L-лактида), поли (пропиленоксид) или поли (β-бензил-L-аспартат). 5 -9

Группа Катаока исследовала сферические мицеллы , образованные из ПЭО б б . - (Доксорубицин полиаспарагиновой кислоты с сопряженными) для доставки доксорубицина (DOX) 10,11 В своих докладах они выдвинули , что π-pi ; взаимодействие между препаратом полимерконъюгированных или PBLA и свободный DOX действовать, чтобы стабилизировать ядро ​​мицеллы, что приводит к увеличению нагрузки и удержания лекарственного средства. Установлено , что совместимость или взаимодействие между лекарственным средством и блок основного формирования являются определяющими ключевых параметров , связанных с производительностью. 12 В дополнение к DOX, ряд терапии рака включают ароматические кольца в пределах своей основной структуры (например, метотрексат, olaparib, С.Н. -38).

В результате существует значительный интерес к синтезу сополимеров, которые включают бензиловый кольца в их основных образующих блоков. Анионные полимеризация с раскрытием кольца ПЭГ и его производных позволяют контролировать молекулярной массой и привести к материалам с низкой полидисперсностью с хорошим выходом. 13,14 EthyleОксид пе с фенилглицидиловый эфиром (PheGE) или оксид стирола (SO) может быть (со) полимеризуется с образованием блок - сополимеров , которые образуют мицеллы для солюбилизации гидрофобных лекарственных средств. 15-18 В настоящем докладе описываются необходимые шаги для живой анионной полимеризации фенил глицидилэфир мономера на Mpeg-ОН , как макроинициатора (Рисунок 1). Полученный блок-сополимер и его агрегаты затем охарактеризованы с точки зрения свойств релевантности для использования в доставке лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема , показывающая девять ключевых шагов в подготовке б -PPheGE сополимера MPEG-. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Приготовление реагентов в сухих условиях

  1. Приготовление реагентов.
    1. Взвешивают 15 г Mpeg-5К (Мn = 5,400 г / моль, PDI 1,03) и место при 50 ° С в печи под вакуумом в течение 48 ч перед использованием.
    2. Сухие 200 мл диметилсульфоксида (ДМСО) в течение гидрид кальция (CAH 2) (~ 1 г), место под вакуумом в течение 30 мин, продувку в атмосфере аргона и перемешивают в течение 48 часов перед использованием.
    3. Поместите 50 мл в PheGE мономера в сухую и чистую колбу (100 мл), добавляют 1 г CaH 2, уплотнение под вакуумом в течение 15 мин на льду, продувку в атмосфере аргонаи оставить перемешиваться в течение 24 ч в атмосфере аргона до использования.

2. Подготовка калия нафталина

  1. Осторожно, нарезать небольшими кусками натрия (~ 1,5 г) высушивают с гексаном, чтобы удалить избыток минерального масла и добавить в круглую колбу, содержащую тетрагидрофуран (ТГФ) (V = 500 мл).
    Примечание: Куски натрия не должны подвергаться воздействию воздуха для долго из-за риска возникновения пожара.
  2. Добавить бензофенон (~ 5 г) продувку аргоном и запечатать круглую колбу (2 шеями) со стеклянными пробками.
  3. После перемешивания в атмосфере аргона в течение 24 ч, соединить колбу с круглым дном в перегонный аппарат (рисунок 2), перегонку темного раствора в атмосфере аргона в то время как кипячения с обратным холодильником (т.е., рефлюкс в течение приблизительно в течение 2 ч после того, как раствор становится синим). Начинают собирать желаемый объем ~ 150 мл ТГФ, закрыв левый клапан (находится в середине перегонного аппарата).
    Примечание: Если это решение не синеет, остановить Distilтаже, остывать при комнатной температуре (RT) и добавляют больше бензофенон или натрий, и перезапустить дистилляцию. Это указывает на то, что до сих пор ТГФ содержит воду.
  4. В сухом Эрленмейера, добавляют дистиллированную ТГФ (V = 100 мл) и растворить 3,9 г нафталина.
    Примечание: Остановить дистилляцию, остыть при комнатной температуре и откройте правую клапан для передачи объема ТГФ.
  5. Как описано в пункте 2.1, нарезать небольшими кусками калия (1,1 г) и добавляют к раствору, содержащему Нафталин (конечная концентрация ~ 0,3 моль / л). Уплотнение Эрленмейера с адаптером промывочного (T) (вкл / выкл) с перегородкой в ​​верхней и продувают аргоном.
  6. После перемешивания в атмосфере аргона в течение 24 ч, наблюдать полученный раствор калий-нафталина на основание в виде однородного темно-зеленого цвета.
  7. В инертных условиях, удалить 5 мл аликвоты основного раствора из колбы с помощью шприца и добавляют к 10 мл дистиллированной воды. Затем добавляют 1-2 капли индикатора фенолфталеина к этому раствору,который превращает раствор фуксия цвет.
  8. С помощью бюретки титровать калий-нафталина раствора со стандартным раствором соляной кислоты (0,1 N) до тех пор, пока раствор не станет бесцветным.

3. Материалы и необходимые меры для эффективного живой анионной полимеризации

  1. Система аргон / вакуумный коллектор.
    Примечание: Как описано на рисунке 2, двойное остекление многообразие с полыми стеклянными кранами используется для переключения между подачей аргона и вакуума в стеклянной посуде.
    1. Подключите бак аргона (с манометром) в сухой колонке абсорбентом и к коллектору линии с использованием инертного резиновой трубки. На другом конце линии аргона, соединить барботер (содержащий минеральное масло).
    2. Для стеклянных кранами, соедините гибкие инертные трубки и иглы. К другой линии коллектора, соединить стеклянную ловушку погружают в холодную сосуд Дьюара (заполненный льдом / водой или жидким азотом) в насос высокого вакуума.
    3. Аппарат для перегонки мономера и ДМСО.
      Примечание: Удобный (то есть, все в одном) аппарат для высокой вакуумной перегонки используют (рисунок 2). Сухой стеклянной посуды производится с высокими вакуумными клапанами, а также встроенные конденсаторы с внутренним охлажденном головы.
      1. Подключение поток воды через входное отверстие (А) и на выходе (В) охлаждающего устройства (буква). Подключите другой вход / выход (C) к двойственной коллектора для аргона / вакуума. Добавление и запечатать перегородку (металлические провода) в порту доставки / извлечения и соединить стальной канюлю из нержавеющей стали для передачи чувствительных воздушных жидкостей (D) (в верхнем / цикле).
      2. До полимеризации перегонку PheGE и ДМСО на полусферических колбонагреватели при 100 ° С и 70 ° С, соответственно, в течение 2 ч под вакуумом при перемешивании. Точка кипения В PheGE мономер составляет 254 ° С, тогда как температура кипения для ДМСО 189 ° С при (1 атм).
    4. Стеклянная посуда в анионной polymerizatиона.
      1. В дополнение к системе дистилляции, используйте только высокий вакуум стойкую стеклянной посуды в том числе с круглым дном колбы (сертифицировано производителем), градуированные цилиндры (для переноса объемов растворителя, основания и мономеров), канюль, перегородках и металлической проволоки для уплотнения перегородками.
        Примечание: Для получения тщательно живой полимеризации, тепло (под вакуумом) и охлаждают всю стеклянную посуду в потоке аргона до использования. Держите тепловые пушки на расстоянии ~ 10 см от стеклянной посуды.

    фигура 2
    Рисунок 2. Сборка и основные этапы перегонки / передачи. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    4. Описание ключевых шагов живой анионной полимеризации: дистилляция и передачи

    1. Взвесить Mpeg-5K (2 ммоль, 10 г) в сухом Fласк / Шленка (печь), содержащий мешалку и запечатать адаптер гиперемию (T) (вкл / выкл) с перегородкой в ​​верхней части.
    2. Соедините колбу с коллектором и очистить колбу в течение 2-3 мин с флешей аргона. Поверните клапан в вакуумном состоянии очистить колбу.
    3. Поверните колбу вручную и высушить реакционный сосуд с однородно фена (тепловая пушка) до Mpeg-5K не растает.
      Примечание: Держите тепловые пушки на расстоянии ~ 10 см от колбы.
    4. Через 1 мин, перерыв вакуума, поворачивая клапан на коллекторе в направлении позиции аргона с несколькими быстрыми защелками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывный поток аргона должен наблюдаться в барботер. Когда поток непрерывен, клапан остается в положении аргона. дважды Повторные нагрева и охлаждения шаги, чтобы удалить все следы влаги.
    5. Хранить полимерный макроинициатор в вакууме в течение ~ 2 ч и в атмосфере аргона до начала реакции.
    6. Маунт два высокого вакуума ректификационные аппараты под капотом (рисЮр 2); один для дистилляции ДМСО и один для отгонки мономера (PheGE).
    7. Соединить отдельные колбы, содержащие ДМСО и мономера к двум устройствам и установить каждый на полусферической греющим кожухом (или в масляной ванне). Подключение холодной воды к верхней части аппарата (вход / выход) и многообразию (аргон / вакуум).
    8. Убедитесь в том, что каждое устройство является безопасным и хорошо запечатаны. Engage вакуум через клапан.
      Примечание:. Как описано в шаге 3.3, повторите нагрев и стадий охлаждения в два раза, чтобы удалить все следы влаги.
    9. Установите нагрев с помощью регулятора температуры и начать перемешивания растворов. Через 2 ч циркуляционного / перегонки ДМСО, закрыть клапан высокого вакуума (находится в середине перегонном аппарате) для сбора приблизительно 20 мл раствора (для очистки внутренней части аппарата). Затем отпустить фракцию в колбу и повторить операцию еще раз, чтобы гарантировать чистоту желаемой фракции, которая представляет собой Сollected позже.
    10. Нагревают колбу, содержащую Mpeg-5K (под вакуумом) с тепловой пушки пока полимер (мПЭГ-5K) плавится. снова продувают аргоном.
      Примечание: Эта процедура поможет растворению после передачи ДМСО.
    11. Через 2 часа, закрыть клапан высокого вакуума и собирают объем растворителя (V DMSO = ~ 100 мл). Прекратите нагрев и сломать вакуум от коллектора. Выпуск аргон (по защелками) в камеру, как описано выше.
    12. При положительном давлении аргона, соединить одну сторону канюли (Удерживать на запорный кран аппарата) в градуированный цилиндр или непосредственно в колбу, содержащую Mpeg-5K (если перегонный аппарат имеет выпускной) и погружают другой конец осторожно в свежеперегнанного фракции.
    13. Использование аргона давление, привод ДМСО через канюлю в реакционную колбу. Подключите дополнительный барботер в колбу (или цилиндр, если это необходимо для измерения) и закройте стекло кран, соединенный с йе барботера на противоположной стороне коллектора.
      Примечание: Когда одна сторона канюли удаляется для передачи, убедитесь, что применяется положительное давление аргона.
    14. Для того, чтобы избежать каких-либо аварий, вызванных давлением аргона, открыть стеклянную запорного крана в течение 1-2 сек и запечатать, чтобы продолжить поток ДМСО (повторяли один раз за 0,5 мин) до момента получения полной передачи не будет завершено. Повторное открытие запорного крана, когда закончите.
      Примечание: Теперь же процедура должна применяться для дистилляции и сбора мономера. Растворитель и мономер не может быть собрана в то же время.
    15. Передача 5 мл 0,3 М нафталина калия через канюлю в градуированный цилиндр уплотнен перегородке с канюлю (контур).
      Примечание: Такие же меры предосторожности, как описано в примечании 4.13. Положительное давление аргона должно поддерживаться первым из колбы калий-нафталина в цилиндр, а затем из цилиндра в реакционную колбу, чтобы избежать загрязнения воздуха / воды.
    16. Вставьте другую иглу из manifoЛД в цилиндр (аргон). Удалите канюлю, соединенную с системой перегонки осторожно и быстро вставить в реакционную колбу.
      Примечание: Используйте этот метод для переноса базы и мономера.
    17. Добавьте базовую по капле до тех пор, пока раствор не станет темной. После медленного исчезновения цвета, добавьте еще одну порцию, пока темный цвет снова не появится, и повторять до полной передачи.
    18. Перенести желаемый объем мономера (V PheGE = 5 мл) , чтобы достичь степени полимеризации PPheGE ~ п = 18-20.
    19. Оставьте реакционную смесь в течение 48 ч при 80 ° С в атмосфере аргона при постоянном перемешивании, чтобы обеспечить полную полимеризацию.
    20. Гасят реакцию добавлением капли HCl 1 н в метаноле (измеренный с помощью лакмусовой бумаги (нейтральный рН)) и наблюдают цветного исчезновения.
    21. Извлечение нафталин из ДМСО раствора с гексаном (3 × 50 мл). Удалить ДМСО путем перегонки под вакуумом ~ 70 мл (тот же аппарат). ворковатьл раствора вниз шлама и добавляют 50 мл ТГФ.
    22. Удаления соли из раствора суспензии путем центрифугирования при 5000 х г в течение 10 мин. Передача супернатант, и добавьте по каплям к 500 мл холодного диэтилового эфира.
    23. Собирают осадок фильтрованием или центрифугированием (повтор дважды) и сушили под вакуумом при 30 ° С в течение 24-48 ч (выход 85%).
      Примечание: Сополимер теперь готов к характеристике.

    5. Определение характеристик Сополимеры

    1. Взвесьте 5-10 мг сополимера (записи фактической массы) в алюминиевом образце сковороду и запечатать герметически с алюминиевой крышкой. Загрузите образец панорамирование и опорный поддон (пусто) в дифференциальной сканирующей калориметрии.
    2. Программа метод ( "нагрев / охлаждение / нагрев") цикл: 1) высокая температура от 40 ° C до 100 ° C со скоростью 10 ° С / мин, 2) охлаждают до -70 ° С со скоростью 10 ° С / мин, 3) тепла до 100 ° с со скоростью 10 ° с / мин. Повторите 2) и 3) дважды. Определить точку плавления м), кристallization (T c) и температуры стеклования г) и теплота плавления (H е) от тепловых следов от третьего цикла (если это применимо).
    3. Растворение полимеров в ТГФ (2 мг / мл) и фильтруют через фильтр из ПТФЭ 0,2 мкм. Вводят пробы в систему гель - проникающей хроматографии (50 мкл) и использовать время удерживания для образца и калибровочную кривую производится с использованием ряда полистирольных стандартов для определения молекулярной массы полимера. 19
    4. Растворите (со) полимеров (15 мг / мл) в ДМСО d 6 для 1 анализа спектроскопии ЯМР Н. 19
    5. Определение критической концентрации мицеллообразования (ККМ) сополимера с использованием 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен (DPH) в качестве флуоресцентного зонда. 9
      1. Приготовьте DPH маточного раствора в ТГФ (2,32 мг / л) в темноте, и добавить 100 мкл этого раствора в каждую из серии флаконов.
      2. Подготовительномповторно сополимером маточного раствора в ТГФ и добавляют аликвоты равного объема (2 мл) к серии ампул (каждая из которых содержит аликвоты исходного раствора DPH), что приводит к образованию конечных концентраций сополимера, что в диапазоне от 0,01 до 1000 мкг / мл сополимера.
      3. Впоследствии вихревые растворы и добавляют по каплям к 10 мл дважды дистиллированной воды при перемешивании бар сополимер-DPH. Растворы должны быть затем энергично перемешивают в темноте в течение 48 ч в токе азота, чтобы обеспечить медленное испарение ТГФ. Конечная концентрация DPH в каждом растворе составляет 0,232 мг / л.
      4. Измерьте излучение флуоресценции образцов при длине волны 430 нм (λ ех = 350 нм) с использованием двойного сканирования микропланшетов спектрофлуориметре и участок флуоресценции от входа [полимер]. Отрезок между двумя линейными склонами обеспечивает значение ККМ для сополимера.

    6. Процедура Загрузка доксорубицин в BCMS

    1. Растворите 12 мг DOX в 1 мл асеtonitrile, добавить 10 мкл триэтиламина и пусть размешать раствор в темноте в течение 2 часов.
    2. Растворить сополимер (45 мг) в 1 мл ТГФ и перемешивают в течение того же периода времени. Добавьте сополимер раствора к раствору DOX и промыть флакон, содержащий остаточный сополимер с дополнительным объемом ТГФ (0,5 мл).
    3. Добавьте смесь-сополимер-лекарство (2,5 мл) по каплям в пробирку (20 мл), содержащий 15 мл физиологического раствора 0,9% (NaCl) при перемешивании.
    4. Перенесите раствор в диализный мешок (3,5 кД отрезать) и диализ против физиологического раствора 0,9% (500 мл).
      Примечание: Изменение внешнего физиологический раствор через 6 ч, и пусть диализ продолжают в течение 24 ч при перемешивании в темноте при комнатной температуре.
    5. Передача диализата в 50 мл пробирку и центрифугируют при 5000 х г в течение 15 мин.
    6. Передача супернатант на систему ультрафильтрации (емкостью 10 мл), который содержит диализной мембраны (отрезать 10 кДа). Вставьте адаптер перемешивания в систему ультрафильтрации, закройте крышку и открыта какTream азота.
    7. Концентрат ВСМ раствора до объема 4 мл и добавляют 6 мл свежего солевого раствора и повторите процедуру дважды.
    8. Концентрат ВСМ раствора до 4 мл, ополоснуть камеру с 0,5 мл физиологического раствора и добавляют к раствору. Хранить в коричневых флаконах при комнатной температуре в темноте до дальнейшего использования.

    7. Оценка доксорубицина Загрузка в DOX-BCMS

    1. Растворите DOX-BCM в диметилформамиде (100 мкл в 400 мкл), чтобы нарушить мицеллы и разбавляют в водном растворе HCl (0,1 N) до оценки (по 100 мкл в 900 мкл HCl 0,1 N).
    2. Мера загрузки лекарственного средства при 490 нм с использованием системы Benchtop микропланшет спектрофотометрического. Используйте следующие уравнения для определения способности загрузки лекарственного средства (DLC) и эффективность загрузки лекарственного средства (DLE):
      DLC (вес%) = (вес препарата, погруженных / общий вес BCMS) х 100%
      СКД (%) = (масса лекарственного средства, погруженных / вес препарата в корме) х 100%

    8. Оценкаэкстракорпорального Выпуск DOX от DOX-BCMS

    1. Исследовать высвобождение DOX из BCMS при 37 ° С в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7,4) против PBS, рН 7,4, содержащего 0,1% (вес / об) твина 80, BCMS + БСА (50 мг / мл) против PBS рН 7,4 и 0,1 М ацетат-буфер при рН = 5,5. 20,21
    2. Разбавить рецептуру БЦМ-DOX (700 мкл) в выбранном буфере (2,3 мл), чтобы привести к общей сумме ≈ 0,6-0,7 мг DOX в диализной мешке.
    3. Поместите раствор в диализной мешке, запечатать с клипами и погрузить пакет в 200 мл соответствующих внешних носителей.
    4. Удалите 2 мл раствора вне диализного мешка в заранее заданные моменты времени и заменяют тем же объемом свежего буфера.
    5. Хранить аликвот удалены при -20 ° C до проведения анализа с помощью UV-VIS спектрофотометрии (абс 490 нм). Кумулятивный процент высвобожденного лекарственного вещества (Е г) можно рассчитать по следующей формуле:
      "Equation1" ПРИМЕЧАНИЕ: Если м DOX представляет количество DOX в BCMS, V 0 представляет собой общий объем средств массовой информации высвобождения (200 мл), V т является объем замененных носителя (V T = 2 мл), Ci концентрация до коррекции, и с N представляет собой концентрацию DOX в образце.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 3
Рисунок 3. Иллюстрация анионной полимеризации фенилглицидиловый эфира на мПЭГ макроинициатора для получения видеоданных MPEG - B - (PheGE) 15 для получения блок - сополимеров мицелл для загрузки доксорубицина Схема иллюстрирует депротонирования гидроксильной группы мПЭГ с использованием калий - нафталина. как анион-радикала, с последующей полимеризацией фенилглицидиловый эфир (PheGE) мономера. Представитель просвечивающей электронной микроскопии изображений (TEM) из BCMS окрашивали уранилацетате (1% вес / объем) и распределение по размерам мицелл , как определено методом динамического рассеяния света (DLS). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

рисунке 3, анионную полимеризацию фенилглицидиловый эфира на мПЭГ макроинициатора использовали для получения блок - сополимера мицеллы (DOX-MPEG- б - (PhGE) 15 для захвата доксорубицин узкое молекулярно - массовое распределение для MPEG- б -. (PhGE) 15 сополимера подтверждали с помощью ГПХ (PDI = 1,03) и степень полимеризации определяли анализом 1 H - ЯМР (рисунок 4) [а = 7,2 частей на миллион (м , 2H мета, фенил 2 (= СН -)), σ = 6,8 частей на миллион (д, 3H, 2 орто и 1 пункт (- СН -), σ = 3,95 частей на миллион (м, 2H, O - CH 2 -СН-) ] с метил- концевой группы мПЭГ, используемой в качестве опорного пика (σ = 3,22 частей на миллион (с, 3H).

Рисунок 4
Рисунок 4. Характеристика и анализ. А) Анализ методом ГПХ МПЭГ и сополимер в ТГФ. B) 1 НЯМР - спектры mPEG5K (верхний спектр) и MPEG- б -. (PheGE) 15 (нижний спектр) в D 6 - DMCO Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1
Таблица 1. Характеристики сополимера.

В водной среде, амфифильные блок - сополимеры , такие как MPEG - B - (PheGE) 15 собираются , чтобы образовывать мицеллы, состоящие из гидрофобной сердцевины , окруженной гидрофильной оболочки. ККМ сополимера измеряли с использованием установленного способа флуоресценции. КМЦ MPEG- б - (PheGE) 15 была определена ~ 9 мкг / мл (рис 5A вставка). Передача электронной микроскопии подтвердили сферическую морфологию для сополимера агрегатов и, таким образом, динамическийрассеяния света (рис 3 и в таблице 2) использовали для оценки гидродинамический диаметр (D ч ~ 25 нм). Как показано на рисунке 6-А, L929 клетки фибробластов мыши подвергались воздействию MPEG- б - (PhGE) 15 BCMS и не наблюдалось цитотоксичности после инкубационного периода 24 ч.

Рисунок 5
Рисунок 5. Интенсивность флуоресценции и КМЦ характеристика. А) график интенсивности флуоресценции DPH в зависимости от концентрации MPEG- B - (Phe) 15 блок - сополимера. Вставки показывает раннюю стадию агрегации блок - сополимера в 0,1-10 мкг / мл. B) Плот значений КМЦ , полученных из литературы для ряда сополимеров с боковыми фенильными группами на блоке основного формирования. Красные квадраты представляют расчетные значения для энергии Гиббса мышейllization соответствующих сополимеров (± 0,5 кДж / моль). 22,25-28 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 2
Таблица 2. Определение характеристик BCMS полученных методом диализа.

Растворение лекарственного средства в BCMS находится под влиянием водной растворимости лекарственного средства, а также склонность к взаимодействию между лекарственным средством и сам по себе и / или основного блока формирования мицелл. В его солевой форме, DOX является относительно растворимым (~ 10 мг / мл) в воде. Таким образом, для загрузки в BCMS, DOX растворяли в ацетонитриле и нейтрализуют ТЭА, чтобы получить свободное основание (3 экв.). С рКа 8,5, DOX становится относительно нерастворимы в щелочных условиях движения инкапсуляцию в BCMS с Stabiliзация по π-стэкинг взаимодействий П (MPEG- б - (PhGE) 15). Как описано в литературе, аналогичные мощности загрузки для DOX в DOX-MPEG- б -. (PhGE) 15 было зарегистрировано при среднем значении 14% (вес / вес) 21-24 После ультрафильтрации, было установлено , что концентрации сополимера ниже 10 мг / мл успешно солюбилизируют до 1,6 мг / мл DOX. Эффективность загрузка лекарственного средства было до 52% (вес / вес) для MPEG- б - (PhGE) 15 BCMS (таблица 2). Профили высвобождения DOX из BCMS в различных средах были исследованы (рис 6в).

Рисунок 6
Рисунок 6. цитотоксичности и кинетика высвобождения лекарственного средства. А) оценния цитотоксичности в L929 мыши фибробластов клеток MPEG- б -. (PheGE) 15 сополимерных мицелл , как определено с помощью анализа МТС после периода инкубации 24 ч (п = 3 отдельных экспериментов, SD <10%) B) спектры нормализованной выбросов свободного DOX и DOX-нагруженные мицеллы в PBS, рН 7,4 при 10 мкг / мл концентрации DOX. Длина волны возбуждения 480 нм и спектр излучения собрана из 500-700 нм C) профили высвобождения DOX из блока MPEG- B -. (PhGE) 15 сополимер мицеллы (квадраты) в PBS 0,1 М рН 7,4 (кружки) в PBS 0,1 М , рН 7,4 , содержащем БСА 50 мг / мл (в мешке) и (треугольники) в ацетат Na + , буфер 0,1 М , рН 5,5 и (вниз треугольники) свободного DOX (N = 2) в PBS , рН 7,4. (для каждого условия, N = 3 отдельные эксперименты, SD <10%). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого Figurе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В связи с хорошим контролем, что анионной полимеризации обеспечивает более молекулярным весом является одним из наиболее прикладных процессов в промышленности для получения полимеров на основе оксиэтиленовых мономеров (ПЭГ и ППГ). Оптимальные и жесткие условия должны быть использованы для успешной полимеризации должна быть достигнута. Тщательное очищение всех реагентов и соответствующего устройства имеют важное значение для живого характера синтеза. Ограничения текущей настройки в основном связаны с техникой передачи, которая опирается на пункции. Используя соответствующее давление, катетеризация является безопасной методикой лабораторного масштаба для академической обстановке. Применение этих мер предосторожности обеспечит лучшую воспроизводимость и контроль в ходе процесса полимеризации (низкий PDI). Кроме того , эти процедуры передачи и очистки могут быть использованы для получения сополимеров , таких как MPEG- б -PCL, MPEG- б -PLLA и MPEG- б -page. 19,29 Тем не менее, этот удобный Procedure не может быть адекватной для полимеризации некоторых мономеров , которые требуют более жестких условий (например, стирол). В качестве альтернативы, этот метод обкатки уплотнение обычно предпочтительна для анионной полимеризации. 30 Контролировать действия в промышленности, аналогичные системы ( из нержавеющей / стекло) соединены друг с другом с помощью гермоклапанов.

Для оксиэтиленовых мономеров, общий механизм является нуклеофильной атаки оксианиона (свободного иона или пары ионов) на оксиранового кольца, что приводит к полимеризации с раскрытием кольца. Тем не менее, в зависимости от природы замещенных оксиэтиленовых мономеров, некоторые мономеры могут не полимеризуется, или они не могут быть полимеризованы с высокой молекулярной массой. Этот тип полимеризации не переносит кислые или основные компоненты, включая мономер сам, растворитель или другие виды, которые приводят к реакциям прекращения и / или передачи цепи в среде (потеря контроля реакции). Для получения пегилированного блок-сополимер, несущий фенилгруппы анионной полимеризацией, альтернативы фенилглицидиловый эфира мономера можно найти: стирол, оксид стирола или аллилглицидилового эфира с последующим радикальной реакции Михаэля из бензилмеркаптана варианты. мПЭГ могут быть получены путем конденсации этиленоксида мономера , а затем полимеризуется при тех же самых условиях , как описано в данной работе, с использованием гидроксилированного инициатора (например, метанол). Тем не менее, мПЭГ различной молекулярной массы с низкой PDI является коммерчески доступным.

Для того, чтобы избежать остатков воды, макроинициатора (например, в формате MPEG-OH) , должен быть хорошо высушен предварительной сушки в печи, с последующей процедурой тепловой пушки сушки. Реакции можно проводить в полярных апротонных растворителях, координирующий растворителей, или в массе. Когда полимеризация требует особых условий, таких как высокая температура, должны быть использованы растворители с более сильной полярностью, чем ТГФ, такие как ДМСО, диглим или НМРА. Как описано в протоколе (раздел 4 2) требуется. ДМСО является гигроскопичной и если перегонка не очень хорошо проведено, следы воды могут инактивировать активные частицы. Другие растворители могут быть использованы , но ДМСО обладает высокой способностью сольватирующую для катионов, низкую способность сольватирующую для анионов и обеспечивает высокую температуру полимеризации. 31,32 ДМСО является отличным растворителем для катализируемой основанием полимеризации эпоксидов и олефинов с сильными электроноакцепторных заместителей. Инициирование полимеризации может быть достигнуто на месте производства алкоксида калия инициаторов путем титрования Mpeg-OH с разбавленным раствором калий - нафталина. 33 Важно тщательно приготовить раствор нафталина калия и титруют раствор с кислотой до его использование. В самом деле, если концентрация нафталина калия находится под или завышены, макроинициатора могут образовывать агрегаты или не полностью активироватьинициатор и, в свою очередь полимеризация может быть поставлена ​​под угрозу. Когда нафталин калия добавляют по каплям, медленное исчезновение цвета обеспечивает визуальный контроль за потреблением основания инициатором. В этих условиях быстрого протонного обмена между гидроксильными группами ( в состоянии покоя) и алкоксиды (активных) обеспечивает контролируемую полимеризацию мономера. 13

Агрегирование поведение блок - сополимеров такого же состава, мПЭГ 122 - б . - (PhGE) 15 были исследованы несколькими группами с сообщенных значений КМЦ в пределах от 1 до 10 мкг / мл 25,27,28,34-36 значения КМЦ для конкретный сополимер может варьироваться в зависимости от конкретного способа, применяемого для определения. В этом исследовании методом флуоресценции на основе использовался с DPH , выбранной в качестве зонда при условии , что это приводит лишь к флуоресцентного сигнала после его включения в BCMS (Рисунок 5A врезке). Рисунок 5Ввключает в себя значения КМЦ, полученные для различных блок-сополимеров с боковыми фенильными группами. Как показано, значения ККМ сополимеров изменяются в зависимости от характера основной цепи полимера , несущего фенильную группы и степени полимеризации. 25,27,28,34-36 обмене сополимерных цепей между мицелл и внешней среде , зависит от состояние ядра мицеллы, а также параметр взаимодействия Флори-Хаггинс между двумя блоками и растворителя. Температура стеклования (Т г) объемной PPheGE гомополимера , как известно, ниже , чем насыпной PS. 37 Из - за стекловидного характера ПС, сополимеров с высокой степенью полимеризации PS (п> 35) обладают стекловидную ядро при комнатной температуре (Т г ~ 80 ° С). 38

С термодинамической точки зрения, два основных подхода были выдвинуты, чтобы описать процесс мицеллообразования, а именно модель разделения фаз (разделение фаз на CMC), а модель массового действия (задociation-диссоциации равновесной мицеллы / unimers). 39 В соответствии с обоих подходов, стандартная энергия Гиббса изменение (ΔG ◦) для передачи 1 моль амфифила из раствора в мицеллярной фазе (ΔG свободную энергию мицеллообразования), в отсутствие электростатических взаимодействий, дается ΔG = RT LN (CMC). 39 Как показано на рисунке 5В, значения для КМЦ и ΔG согласуются со значениями , полученными для сополимеров, которые подобны по составу (с точки зрения общего сополимера M W и отношение к гидрофобным гидрофильного длины блока) к MPEG- б - (PhGE) 15. Как показано в таблице 1, ДСК анализ видеоданных MPEG - B - (PhGE) 15 сополимер сыпучего материала подтвердили единую Тт при 51 ° с , которая связывается с гидрофильной и подавлена по отношению кмПЭГ в одиночку (60 ° С). В решении, предполагается , что ядра MPEG- б -PS сополимерных мицелл, с полистирольной блоков одинаковой длины к тому из PhGE в MPEG- б - (PhGE) 15, начинают становиться подвижными при физиологической температуре (то есть, 37 ° . C) 38,40 Таким образом, MPEG- б - (PhGE) 15 BCMS вероятно , обладают относительно мобильного ядро , которое позволяет местное движение при комнатной и физиологической температуре.

В этом исследовании диализа и ультрафильтрации использовались в качестве удобного средства для удаления свободного лекарственного средства и повысить концентрацию лекарственного средства / сополимера для последующего в приложениях естественных условиях. С другой стороны, сублимационная сушка может быть использована для концентрирования препарата; Тем не менее, это требует оптимизации , включая возможное добавление стабилизаторов (например, ПЭГ, декстроза) с целью улучшения смачиваемости для восстановления. Полученный DOX-MPEG- б - (PhGE) 15 BCMS показали аналогичные SПрофили ustained высвобождения (PBS 7.4) к системам BCM , разработанных Катаока и его сотрудниками. 21 в PBS при рН 7,4, менее чем 10% от общего лекарственного средства было высвобождено в течение шести часов , в то время как более 95% свободного DOX высвобождается из диализа мешок в течение того же периода времени. Замедленным высвобождением при нейтральном значении рН свидетельствует о хорошей стабильности композиции в течение периода четырех дней.

Человеческой сыворотки крови состоит из приблизительно 7% белка, две трети из которых является альбумин. 41 Таким образом, для того , чтобы смоделировать условия VIVO высвобождение лекарственного средства в обычно оценивается в буферных растворах , содержащих физиологически соответствующие концентрации этого белка. В настоящем исследовании, БСА был включен в пакет диализ при концентрации 50 мг / мл. В присутствии альбумина, высвобождение DOX из BCMS увеличилась примерно до 30% после 4 дней инкубации при температуре 37 ° С. Выпуск DOX из BCMS в буфере при рН 5,5 подтвердили, что protonatион DOX при этих условиях приводит к увеличению высвобождения лекарственного средства после 72 часов, и при этом увеличивается до 60% после 4-х дней. В целом, полученные DOX-BCMS показали обнадеживающие результаты в пробирке, аналогичные или эквивалентные другие составы млрд.куб.м DOX , представленных в литературе, и , таким образом , стимулировать дополнительную оценку в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/HAMF12 Gibco, Life Technologies 12500 Supplemented with 10% FBS. Warm in 37 °C water bath.
Trypsin-EDTA (0.25%) Sigma-Aldrich T4049 Warm in 37 °C water bath
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051 Canada origin
MDA-MB-468 cell line ATCC HTB-132
MTS tetrazolium reagent PROMEGA G111B
Phenazine ethosulfate (PES) Sigma-Aldrich P4544 >95%
mPEG5K (Mn 5,400 g/mol) Sigma-Aldrich 81323 PDI=1.02
Dimethylsolfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 >99.5%
Naphthalene Sigma-Aldrich 147141 >99%
Phenyl glycidyl ether Sigma-Aldrich A32608 >85%
Benzophenone Sigma-Aldrich 427551 >99%
Potassium Sigma-Aldrich 451096 >98%
Tetrahydrofuran Caledon Laboratory Chemicals 8900 1 ACS
Hexane Caledon Laboratory Chemicals 5500 1 ACS
Calcium hydride (CaH2) ACP C-0460 >99.5%
Diethyl Ether Caledon Laboratory Chemicals 1/10/4800 ACS
Microplate reader BioTek Instruments
Differential scanning calorimetry (DSC) TA Instruments Inc DSC Q100
Gel permeation chromatography (GPC) Waters 2695 separation moldule / 2414 detector  2 Columns: Agilent Plgel 5 µm Mixed-D
NMR spectroscopy Varian Mercury 400MHz
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151858 99.96%
DMSO-d Sigma-Aldrich 156914 99.96%
Vaccum pump Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc. Ultimate pressure 1x10-4 torr
Drierit with indicator, 8 mesh Sigma-Aldrich 238988 Regenerated at 230 °C for 2 hr

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
  2. van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, (10), 3717-3756 (2002).
  3. Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49, (36), 6288-6308 (2010).
  4. Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
  5. Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345, (1-2), 35-41 (2007).
  6. Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100, (4), 572-579 (2009).
  7. Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10, (10), 6283-6297 (2010).
  8. Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
  9. Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11, (5), 1273-1280 (2010).
  10. Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47, (1), 113-131 (2001).
  11. Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74, (1-3), 295-302 (2001).
  12. Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93, (1), 132-143 (2004).
  13. Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62, (6), 1561-1565 (1940).
  14. Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7, (10), 1421-1433 (1971).
  15. Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18, (22), 8685-8691 (2002).
  16. Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21, (12), 5263-5271 (2005).
  17. Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22, (18), 7465-7470 (2006).
  18. Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
  19. Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5, (1), 128-133 (2016).
  20. Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16, (6), 427-440 (2001).
  21. Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64, (1-3), 143-153 (2000).
  22. Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4, (4), 241-247 (1997).
  23. Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9, (12), 9330-9342 (2013).
  24. Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21, (10), 981-993 (2013).
  25. Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6, (2), 514-516 (1990).
  26. Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24, (5), 1033-1040 (1991).
  27. Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196, (6), 1899-1905 (1995).
  28. Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9, (4), 945-949 (1993).
  29. Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96, (1), 37-53 (2004).
  30. Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43, (24), 6179-6222 (2005).
  31. Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16, (2), 163-187 (1962).
  32. Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. (1965).
  33. Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
  34. Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
  35. Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31, (22), 7851-7864 (1998).
  36. Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21, (11), 2001-2008 (2004).
  37. Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
  38. Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197, (11), 3697-3710 (1996).
  39. Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. Chapman and Hall. (1983).
  40. Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3, (21), 4769-4773 (2001).
  41. Encyclopædia Britannica Online. http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics