Anionic פילמור של קופולימר amphiphilic עבור הכנת Micelles קופולימר בלוק מיוצב על ידי אינטראקציות הנחת π-π

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

השלבים העיקריים של החיים פילמור anionic של אתר פניל glycidyl (PheGE) על גליקול methoxy-פוליאתילן (-PPheGE ב mPEG-) מתוארים. מיצלות קופולימר לחסום שתעוררנה (BCMs) היו עמוסות דוקסורוביצין 14% (% wt) ו לשחרור מושהה של תרופה מעל 4 ימים בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הושגו.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Le Dévédec, F., Houdaihed, L., Allen, C. Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by π-π Stacking Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54422, doi:10.3791/54422 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במחקר זה, קופולימר amphiphilic הכוללת בלוק ויוצרים ליבות עם פניל היה מסונתז על ידי חיים פילמור anionic של אתר פניל glycidyl (PheGE) על גליקול-פוליאתילן methoxy (-PPheGE ב mPEG-). אפיון של קופולימר גילה התפלגות מולקולרית צרה (PDI <1.03) ואשר את מידת פילמור של MPEG 122 - ב - (PheGE) 15. ריכוז micelle הביקורתי של קופולימר הוערך בשיטת קרינה הוקמה עם התנהגות הצבירה המוערכת על ידי פיזור אור דינאמי מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור. הפוטנציאל של קופולימר לשימוש ביישומי משלוח סמים הוערך באופן ראשוני כולל במבחנת התאמה ביולוגית, העמסה שחרורו של דוקסורוביצין הסמים הידרופובי אנטי-הסרטני (DOX). ניסוח micelle יציב של DOX הוכן עם רמות טעינת תרופה עד 14% (% wt), טעינת סמי efficiencies> 60% (w / w) ומתמשך שחרור התרופה מעל 4 ימים בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית (pH חומצי הניטראלי, בנוכחות אלבומין). רמת הטעינה התרופה גבוהה לשחרור מושהה מיוחסת לייצוב אינטראקציות π π בין DOX ואת גוש יוצרי הליבה של מיצלות.

Introduction

בשנת תקשורת מימית, קופולימרים לחסום amphiphilic להרכיב כדי ליצור מיצלות קופולימר הגוש בגודל ננו (BCMs), מורכבות ליבה הידרופובי מוקפת פגז או קורונה הידרופילי. ליבת micelle יכול לשמש כמאגר עבור שילוב של תרופות הידרופובי; בעוד, העטרה הידרופילי מספקת ממשק בין הליבה לבין הבינוני החיצוני. פולי (אתילן גליקול) (PEG) ונגזרותיו הם אחד השיעורים החשובים ביותר של פולימרים ואחד בשימוש הנרחב ביותר ניסוח סמים. 1-3 BCMs הוכיח להיות פלטפורמת משלוח סמים ראויה עם כמה ניסוחים להסתמך על זה הטכנולוגיה כיום בפיתוח קליני בשלב מאוחר. 4 ברוב המקרים הגוש ההידרופובי של קופולימר מורכבת polycaprolactone, פולי (D, L-lactide), פולי (פרופילן אוקסיד) או פולי (β-בנזיל-L-aspartate). 5 -9

קבוצתו של Kataoka נחקרה מיצלות כדורית נוצרה PEO- ב ב -. (דוקסורוביצין חומצה מצומדות polyaspartic) למסירת דוקסורוביצין (DOX) 10,11 בדוחות שלהם, הם העלו כי π-π אינטראקציות בין התרופה פולימר מצומדות או PBLA וחופשי DOX לפעול כדי לייצב את הליבה micelle וכתוצאה מכך עליית טעינת סמים ושימור. הוא קבע כי תאימות או אינטראקציות בין התרופה לבין בלוק יוצרי הליבה הם הקובעים פרמטרים הקשורים לביצועי מפתח. 12 בנוסף DOX, מספר בריפוי הסרטן כוללים טבעות ארומטיות בתוך מבנה הליבה שלהם (למשל, מטוטרקסט, olaparib, SN -38).

כתוצאה מכך יש עניין משמעותי סינתזה של קופולימרים הכוללים טבעות בנזילות בבלוקי ליבת יוצרים שלהם. פילמור טבעת מאירת anionic של PEG ונגזרותיו מאפשר שליטה על משקל מולקולרי לגרום חומרים של polydispersity הנמוך תשואה טובה. 13,14 Ethyleתחמוצת ne עם אתר פניל glycidyl (PheGE) או תחמוצת סטירן (SO) יכול להיות (שיתוף) polymerized לגבש קופולימרים לחסום היוצרות מיצלות עבור solubilization של תרופות הידרופובי. 15-18 הדו"ח הנוכחי מתאר את הצעדים הדרושים על החיים פילמור anionic של פניל glycidyl מונומר האתר על MPEG-OH כמו macroinitiator (איור 1). קופולימר לחסום וכתוצאה אגרגטים שלה מאופיינים אז במונחים של תכונות רלוונטיות להשתמש ב משלוח סמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

איור 1
איור 1. סכמטי המציג תשעת השלבים העיקריים בהכנת קופולימר ב -PPheGE mPEG-. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. הכנה של ריאגנטים בתנאים יבשים

  1. הכנת ריאגנטים.
    1. לשקול 15 גרם של MPEG-5K (M n = 5,400 g / mol, PDI 1.03) ומניחים על 50 מעלות צלזיוס בתנור תחת ואקום במשך 48 שעות לפני השימוש.
    2. יבש 200 מ"ל של dimethylsulfoxide (DMSO) מעל הידריד סידן (CAH 2) (~ 1 ז), במקום תחת ואקום במשך 30 דקות, טיהור תחת ארגון ומערבבים במשך 48 שעות לפני השימוש.
    3. מניחים 50 מ"ל של מונומר PheGE בבקבוק יבש ונקי (100 מ"ל), להוסיף 1 גרם של CAH 2, חותם תחת ואקום במשך 15 דקות על הקרח, טיהור תחת ארגוןולהשאיר ומערבבים במשך 24 שעות תחת ארגון לפני השימוש.

2. הכנת אשלגן הנפטלין

  1. בזהירות, לחתוך חתיכות קטנות של נתרן (~ 1.5 גרם) מיובשים עם הקסאן להסיר שמן מינרלי עודף ולהוסיף את הבקבוק עגול המכיל את tetrahydrofuran (THF) (v = 500 מ"ל).
    הערה: נתחי נתרן אסור להיות חשוף לאוויר לאורך זמן בשל סכנת שריפה.
  2. להוסיף benzophenone (g ~ 5), טיהור עם ארגון ולאטום את הבקבוק העגול (2 צוואר) עם פקקי זכוכית.
  3. בעקבות תנודות מתחת ארגון למשך 24 שעות, לחבר את הבקבוק מסביב לתחתית כדי מנגנון זיקוק (איור 2), לזקק הפתרון השחור מתחת ארגון תוך refluxing (כלומר, ריפלוקס בערך תקופת 2 שעות לאחר הפתרון הופך לכחול). מתחילים לאסוף את העוצמה הרצויה ~ 150 מ"ל של THF על ידי סגירת שסתום שמאל (נמצא באמצע של המנגנון זיקוק).
    הערה: אם פתרון זה אינו להכחיל, לעצור את לזקקהאוכלוסייה, להתקרר בטמפרטורת חדר (RT) ולהוסיף יותר benzophenone או נתרן מחדש את הזיקוק. זוהי אינדיקציה כי THF עדיין מכיל מים.
  4. בעוד Erlenmeyer יבש, מוסיפים THF מזוקקים (v = 100 מ"ל) ו להתמוסס 3.9 גרם של נפטלין.
    הערה: עצור את הזיקוק, להתקרר ב RT ופתח את השסתום זכות להעביר את היקף THF.
  5. כפי שתואר בנקודה 2.1, לחתוך חתיכות קטנות של אשלגן (1.1 גרם) ולהוסיף הפתרון המכיל את נפתלין (ריכוז סופי ~ 0.3 mol / L). חותם את Erlenmeyer עם מתאם שטיפה (T) (on / off) עם מחצה בראש ולטהר עם ארגון.
  6. בעקבות תנודות מתחת ארגון למשך 24 שעות, להתבונן הפתרון שהתקבל בסיס נפתלין אשלגן כצבע ירוק כהה הומוגנית.
  7. בתנאים אינרטי, להסיר aliquot 5 מ"ל של הפתרון הבסיסי מהבקבוק בעזרת מזרק ולהוסיף 10 מ"ל מים מזוקקים. בהמשך להוסיף 1-2 טיפות של אינדיקטור פנולפתלאין לפתרון זה,ההופך את פתרון צבע פוקסיה.
  8. השתמש ביורטה לכיל הפתרון נפתלין אשלגן עם פתרון חומצה הידרוכלורית סטנדרטי (0.1 N) עד הפתרון הופך חסר צבע.

3. חומרי אמצעי זהירות נדרשים עבור פילמור האפקטיבי Living anionic

  1. מערכת ארגון / סעפת ואקום.
    הערה: כמתואר באיור 2, סעפת עם זיגוג כפול עם והברזים למיניהם זכוכית חלולים משמשת למעבר בין ארגון משלוח ותנאי ואקום זכוכית.
    1. חבר את הטנק של ארגון (עם מד לחץ) לעמודה יבוש יבש לקו סעפת באמצעות צינור גומי אינרטי. בקצהו האחר של הקו ארגון, לחבר bubbler (המכיל שמן מינרלי).
    2. כדי הזכוכית והברזים למיניהם, להתחבר צינורות ומחטים אינרטי גמישים. כדי בקו השני של הסעפת, להתחבר מלכודת זכוכית השקועה בתוך בקבוק דיואר קר (מלא קרח / מים או חנקן נוזלי) משאבת ואקום גבוהה.
    3. מכשירי זיקוק של מונומר DMSO.
      הערה: נוחה (כלומר, כל אחד) מכשיר לזיקוק ואקום גבוה מועסקת (איור 2). את כלי הזכוכית היבשה הוא עשה עם שסתומי ואקום גבוהים, מובנה מעבה עם ראש בקירור פנימי.
      1. מי חבר זרימה דרך הכניסה (א) ו לשקע (B) של יחידת הקירור (מכתב). חבר את הכניסה / היציאה (C) אחרים הסעפת הכפולה עבור ארגון / ואקום. להוסיף ולאטום מחץ (חוטי מתכת) בנמל המשלוח / החילוץ ולהתחבר צינורית נירוסטה להעברת נוזלים רגישים אוויר (ד) (בחלק העליון / הלולאה).
      2. לפני פילמור, לזקק PheGE ו DMSO על מעילים חימום חצי כדור ב 100 מעלות צלזיוס ו -70 מעלות צלזיוס, בהתאמה, עבור 2 שעות תחת ואקום עם ערבוב. נקודת הרתיחה של מונומר PheGE היא 254 ° C ואילו נקודת הרתיחה עבור DMSO היא 189 מעלות צלזיוס ב (1 ATM).
    4. כלי זכוכית עבור polymerizat anionicיוֹן.
      1. בנוסף מערכת הזיקוק, משתמש זכוכית עמידה ואקום גבוהה רק כולל עגול צלוחיות תחתונות (מוסמכים על ידי היצרן), בוגר צילינדרים (עבור העברת הכרכים של ממס, בסיס מונומרים), קנולות, מחיצה וחוטי מתכת לאטום את septa.
        הערה: על החיים פילמור, חום בזהירות (תחת ואקום) להתקרר כל כלי זכוכית תחת זרם ארגון לפני השימוש. שמור על אקדח החום ממרחק ~ 10 סנטימטרים מן הזכוכית.

    איור 2
    איור 2. אסיפה וצעדי זיקוק / העברת מפתח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    תיאור 4. השלבים העיקריים של פילמור Living anionic: לזיקוק העברה

    1. לשקול MPEG-5K (2 מילימול, 10 גרם) בתוך f יבשLask / Schlenk (תנור) המכיל בר ומערבבים ולאטום את מתאם שטיפה (T) (on / off) עם מחצה בראש.
    2. חבר את הבקבוק כדי הסעפת ולטהר את הבקבוק במשך 2-3 דקות עם גלי ארגון. סובב את השסתום לתפקיד הוואקום לטהר את הבקבוק.
    3. סובב את הבקבוק ידני ולייבש את כלי התגובה הומוגנית עם מייבש שיער (אקדח חום) עד MPEG-5K נמס.
      הערה: שמור על אקדח חום ממרחק ~ 10 ס"מ מהבקבוק.
    4. לאחר דקות 1, לשבור את הוואקום על ידי סיבוב שסתום על הסעפת לעבר העמדת הארגון עם כמה מצליפה מהירה.
      הערה: זרימת ארגון מתמשכת צריכה להיות שנצפתה bubbler. כאשר הזרימה היא רציפה, השסתום נשאר על עמדת הארגון. צעדים חימום וקירור וחזור פעמיים כדי להסיר כל עקבות של לחות.
    5. שמור את macroinitiator פולימריים תחת ואקום עבור ~ 2 שעות ותחת ארגון לפני התגובה מתחילה.
    6. הר שני מנגנוני זיקוק ואקום גבוה מתחת למכסה המנוע (איוריור 2); אחד עבור הזיקוק של DMSO ואחד עבור הזיקוק של מונומר (PheGE).
    7. חבר את הצלוחיות הנפרדות המכילות את DMSO ו מונומר שני המנגנונים ולהתקין כל אחד על מעטפת חימום חצי כדור (או באמבט שמן). חבר מים קרים לחלק העליון של המנגנון (ב / החוצה) ואל (ואקום ארגון /) סעפת.
    8. ודא כי בכל מנגנון מאובטח אטום היטב. Engage את הוואקום באמצעות שסתום.
      הערה:. כפי שתואר בשלב 3.3, לחזור חימום וצעדים קירור פעמיים כדי להסיר כל עקבות של לחות.
    9. הגדר את החימום באמצעות בקר טמפרטורה ולהתחיל ערבוב הפתרונות. אחרי שעת 2 ​​של מחזור / זיקוק של DMSO, לסגור את שסתום ואקום הגבוה (נמצא באמצע של מנגנון הזיקוק) לאסוף כ 20 מיליליטר של תמיסה (לשטוף את החלק הפנימי של המנגנון). ואז, לשחרר את החלק היחסי לתוך הבקבוק וחזר על הפעולה פעם נוספת על מנת להבטיח את הטוהר של השבר הרצוי כי הוא גollected מאוחר יותר.
    10. מחממים את הבקבוק המכיל את-5K MPEG (תחת ואקום) עם אקדח חום עד פולימר (MPEG-5K) נמס. טהר שוב עם ארגון.
      הערה: ההליך יעזור הפירוק לאחר העברת DMSO.
    11. לאחר 2 שעות, לסגור את שסתום ואקום גבוה ולאסוף היקף ממס (V DMSO = ~ 100 מ"ל). עצור חימום ולשבור את החלל מן הסעפת. שחרר ארגון (על ידי מצליפה) לתוך התא כמתואר לעיל.
    12. תחת לחץ חיובי של ארגון, להתחבר לצד אחד של הצינורית (להחזיק בבית הברזלים של המנגנון) כדי גליל סיים או ישירות אל הבקבוק המכיל את MPEG-5K (אם מנגנון הזיקוק יש סיום) ו, לטבול את הקצה השני בזהירות לתוך השבר המזוקק הטרי.
    13. שימוש בלחץ ארגון, להסיע את DMSO דרך הצינורית לתוך בקבוק התגובה. חבריו bubbler נוסף כדי הבקבוק (או צילינדר במידת צורך למדידה) ו, סגור את שסתום הזכוכית מחובר thbubbler דואר בצד הנגדי של הסעפת.
      הערה: כאשר צד אחד של צינורית מוסר להעברה, לוודא כי לחץ ארגון חיובי מוחל.
    14. כדי למנוע תאונות שנגרמו על ידי לחץ ארגון, פתח את שסתום הזכוכית במשך 1-2 שניות reclose להמשיך את זרימת DMSO (חזרה פעם אחת לכל 0.5 דקות) עד ההעברה המלאה הושלמה. פתח מחדש את השסתום בסיום.
      הערה: אותה ההליך חייב עכשיו להיות אחריו לזיקוק אוסף של מונומר. הממס ואת מונומר לא ניתן לאסוף בעת ובעונה אחת.
    15. העברה 5 מיליליטר של 0.3 M נפתלין אשלגן באמצעות cannulation ב גליל סיים חתום על ידי מחצה עם צינורית המוכנסת (לולאה).
      הערה: זהירות אותו כמתואר הערה 4.13. לחץ ארגון חיובי חייבים להישמר ראשון מבקבוק אשלגן נפתלין אל הגליל ואז ממכל בקבוק התגובה כדי למנוע זיהום אוויר / מים.
    16. הכנס מחט נוספת מן manifold לתוך הצילינדר (ארגון). הסר את הצינורית המחוברת למערכת הזיקוק בזהירות ולהכניס במהירות לתוך בקבוק התגובה.
      הערה: השתמש בטכניקה זו להעברת בסיס מונומר.
    17. מוסיפים את הירידה בסיס אחר טיפה עד הפתרון הופך לכהה. בעקבות היעלמותו של צבע האיטי, להוסיף עוד מנה עד שהצבע הכהה מופיע שוב, וחזור עד החילופים המלאים.
    18. מעבירים את העוצמה הרצויה של מונומר (V PheGE = 5 מ"ל) להגיע מידת פילמור של PPheGE ~ n = 18-20.
    19. השאר את התגובה במשך 48 שעות ב 80 ° C תחת אווירת ארגון עם ערבוב מתמיד כדי להבטיח פילמור מלא.
    20. להרוות את התגובה על ידי תוספת של טיפות HCl 1 N מתנול (נמדד באמצעות נייר לקמוס (pH ניטרלי)) ו שנצפו על ידי היעלמות הצבע.
    21. חלץ את נפתלין מפתרון DMSO עם הקסאן (3 × 50 מ"ל). הסר את DMSO ידי זיקוק תחת ואקום ~ 70 מ"ל (אותו המנגנון). Cool למטה הפתרון סלארי ולהוסיף 50 מ"ל של THF.
    22. הסר את המלח מפתרון slurry על ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 10 דקות. מעביר את supernatant, ולהוסיף טיפה חכמה 500 מיליליטר של אתר diethyl הקר.
    23. אסוף את המשקע על ידי סינון או צנטריפוגה (וחזור פעמיים) ויבש תחת ואקום ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות (תשואה 85%).
      הערה: קופולימר מוכן כעת אפיון.

    אפיון 5. קופולימרים

    1. לשקול 5-10 מ"ג של קופולימר (שיא המסה בפועל) בסיר מדגם אלומיניום לאטום הרמטית עם מכסה האלומיניום. פאן טענו מדגם והפאן הפניה (ריק) לתוך קלורימטר סריקת הפרש.
    2. חום 1) חום 40 מעלות צלזיוס עד 100 מעלות צלזיוס ב 10 ° C / min, 2) מגניב -70 ° C ב 10 ° C / min, 3): תוכנית שיטה ( "חום / מגניב / חום") מחזור עד 100 מעלות צלזיוס ב 10 ° C / min. חזור על 2) ו -3) פעמיים. לקבוע נקודת ההתכה (T מ '), crystallization T) וטמפרטורות מעבר זכוכית (g T), ואת החום של היתוך ΔH) מן עקבות תרמית מהמעגל השלישי (אם זה אפשרי).
    3. ממיסים את פולימרים ב THF (2 מ"ג / מ"ל) ולסנן דרך פילטר PTFE -0.2 מיקרומטר. להזריק את המדגם לתוך מערכת כרומטוגרפיה ג'ל חלחול (50 μl) ולהשתמש זמן השמירה למדגם ואת עקומת כיול הופק באמצעות מגוון של סטנדרטים קלקר כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של הפולימר. 19
    4. ממיסים את פולימרים (שיתוף) (15 מ"ג / מ"ל) ב DMSO ד 6 1 ניתוח ספקטרוסקופיה H NMR. 19
    5. קבע את ריכוז micelle הביקורתי (CMC) של קופולימר באמצעות 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH) כמו בדיקת קרינה. 9
      1. כן פתרון מניות DPH ב THF (2.32 מ"ג / L) בחושך ולהוסיף 100 μl של פתרון מניות זו לכל אחד בסדרה של מבחנות.
      2. Prepaמחדש פתרון המניות קופולימר ב THF ולהוסיף aliquots של נפח שווה (2 מ"ל) לסדרה של בקבוקונים (שכל אחת מהן מכילה aliquot של פתרון המניות DPH) וכתוצאה מכך ריכוזים קופולימר הסופי אשר נע בין 0.01 ל -1,000 מיקרוגרם קופולימר / מ"ל.
      3. בהמשך לכך, מערבולת קופולימר-DPH פתרונות ולהוסיף dropwise עד 10 מ"ל מים מזוקקים פעמיים עם ערבוב בר. הפתרונים חייבים מכן וערבבו במרץ בחושך במשך 48 שעות תחת זרם של חנקן כדי לאפשר אידוי איטי של THF. הריכוז הסופי של DPH בכל פתרון הוא 0.232 מ"ג / L.
      4. מדוד את פליטת הקרינה של הדגימות ב 430 ננומטר (ננומטר לשעבר λ = 350) באמצעות spectrofluorometer microplate כפול סריקת קרינת עלילה לעומת להתחבר [פולימר]. ליירט בין שני מדרונות ליניארית מספק את הערך CMC עבור קופולימר.

    נוהל 6. לטעינה דוקסורוביצין לתוך BCMs

    1. ממיסים 12 מ"ג של DOX ב 1 מ"ל של אסtonitrile, להוסיף 10 μl של triethylamine ולתת ומערבבים פתרון בחושך במשך שעה 2.
    2. ממיסים את קופולימר (45 מ"ג) ב 1 מ"ל של THF ומערבבים עבור אותו פרק זמן. מוסיפים את פתרון קופולימר לפתרון DOX ולשטוף את בקבוקון המכיל קופולימר שיורית עם נפח נוסף של THF (0.5 מ"ל).
    3. מוסיפים את תערובת קופולימר סמים (2.5 מ"ל) dropwise ל בקבוקון (20 מ"ל) המכיל 15 מ"ל של תמיסת מלח 0.9% (NaCl) עם ערבוב.
    4. עבר פתרון שקית דיאליזה (3.5 kDa מנותקים) ו dialyze נגד מלוח 0.9% (500 מיליליטר).
      הערה: שנו את מלוחים חיצוני לאחר 6 שעות ולתת דיאליזה להמשיך למשך 24 שעות עם ערבוב בחושך ב RT.
    5. מעבירים את dialysate לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל ב 5000 XG במשך 15 דקות.
    6. מעבירים את supernatant מערכת אולטרה סינון (בהספק 10 מ"ל) המכיל קרום דיאליזה (מנותקת 10 KDA). שים את מתאם ערבוב לתוך מערכת אולטרה סינון, לסגור את המכסה פתוח כמוtream של חנקן.
    7. תתרכז פתרון BCM עד נפח של 4 מ"ל ולהוסיף 6 מיליליטר של תמיסת מלח טרי לחזור על התהליך פעמים.
    8. תתרכז הפתרון BCM עד 4 מ"ל, לשטוף את החדר עם 0.5 מ"ל של תמיסת מלח ולהוסיף את הפתרון. חנות צלוחיות חומות ב RT בשימוש הכהה לפני נוסף.

    7. הערכה טוענת דוקסורוביצין ב DOX-BCMs

    1. ממיסים DOX-BCM ב dimethylformamide (100 μl 400 μl) לשבש את מיצלות לדלל בתמיסה מימית HCl (0.1 N) קודם להערכה (100 μl 900 μl HCl 0.1 N).
    2. מדוד טעינת סמים ב 490 ננומטר באמצעות מערכת spectrophotometric microplate המעבדתיים. השתמש המשוואות הבאות כדי לקבוע את קיבולת טעינת סמים (DLC) ויעילות טעינת סמים (DLE):
      DLC (% wt) = (משקל של תרופה טעונה / משקל כולל של BCMs) x 100%
      DLE (%) = (משקל של תרופה טעונה / משקל של תרופה שבעדכון) x 100%

    הערכת 8.של במבחנה שחרור DOX מ DOX-BCMs

    1. חקור את שחרורו של DOX מ BCMs על 37 מעלות צלזיוס ב 0.1 M פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, pH 7.4) נגד PBS pH 7.4 0.1% המכיל (w / v) Tween 80, BCMs + BSA (50 מ"ג / מ"ל) נגד PBS 7.4 pH 0.1 אצטט M-חיץ ב- pH = 5.5. 20,21
    2. לדלל את ניסוח BCM-DOX (700 μl) במאגר שנבחר (2.3 מ"ל) כדי לגרום בסכום כולל של ≈ 0.6-0.7 מ"ג של DOX בשקית דיאליזה.
    3. מניחים את הפתרון בשקית דיאליזה, לאטום עם קליפים לטבול את השקית לתוך 200 מ"ל של מדיה חיצונית בהתאמה.
    4. הסר 2 מ"ל של הפתרון החיצוני של התיק דיאליזה בנקודות זמן קבוע מראש ולהחליף עם נפח זהה של חיץ טרי.
    5. אחסן את aliquots הוסר ב -20 ° C לפני ניתוח על ידי לספקטרופוטומטריה UV-Vis (Abs 490 ננומטר). האחוז המצטבר של תרופה שוחרר (E r) יכול להיות מחושב באמצעות המשוואה הבאה:
      "Equation1" הערה: כאשר m DOX מייצג את כמות DOX ב BCMs, V 0 הוא הנפח הכולל של התקשורת שחרור (200 מ"ל), V t הוא נפח התקשורת מוחלף (V t = 2 מ"ל), Ci הוא ריכוז לפני התיקון, ו- C n מייצג את הריכוז של DOX במדגם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 3
איור איור 3. של פילמור anionic של אתר glycidyl פניל על macroinitiator MPEG לייצר ב mPEG- - (PheGE) 15 להכנת מיצלות קופולימר לחסום לטעינה של דוקסורוביצין סכמטית ממחיש את דה-פרוטונציה של קבוצת הידרוקסיל של MPEG באמצעות אשלגן נפתלין. כמו אניון-רדיקלית, ואחריו פילמור של אתר glycidyl פניל ​​(PheGE) מונומר. תמונה במיקרוסקופ אלקטרוני נציגי הילוכים (TEM) של BCMs מוכתם תצטט uranyl (1% w / v) התפלגות גודל של מיצלות כפי שנקבע על ידי פיזור אור דינאמי (DLS). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

o: keep-together.within-page = "1"> כפי שניתן לראות בתרשים 3, פילמור anionic של אתר פניל glycidyl על macroinitiator MPEG שימש להכנת מיצלות קופולימר בלוק DOX-mPEG- - (PhGE) 15 עבור המלכוד של דוקסורוביצין חלוקת משקל מולקולרי צרה עבור B mPEG- -. (PhGE) 15 קופולימר אושרו על ידי GPC (PDI = 1.03) ואת מידת פילמור נקבעה על ידי 1 ניתוח H NMR (איור 4) [σ = 7.2 ppm (מ ' 2H, מטא, פניל 2 (= CH -)), σ = 6.8 ppm (ד, ח 3, 2 אורתו ו 1 פסקה (- CH -), σ = 3.95 ppm (מ ', 2H, O- CH 2 -CH-) ] עם הקבוצה בסוף מתיל של MPEG משמש שיא הפניה (σ = 3.22 ppm (ים, 3H).

איור 4
איור 4. אפיון וניתוח. א) ניתוח GPC של MPEG ואת קופולימר ב THF. B) 1 HNMR ספקטרה של mPEG5K (ספקטרום העליון) ו- B mPEG- -. (PheGE) 15 (קשת נמוכה) ד 6 -DMSO אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
טבלה 1. מאפייני קופולימר.

בשנת התקשורת מימית, קופולימרים לחסום amphiphilic כגון ב mPEG- - (PheGE) 15 להרכיב כדי ליצור מיצלות המורכבות של הליבה הידרופובי מוקף פגז הידרופילי. CMC של קופולימר נמדד באמצעות שיטת קרינה הוקמה. CMC של b mPEG- - (PheGE) 15 היה נחוש בדעתו להיות ~ 9 מיקרוגרם / מ"ל (הבלעה איור 5 א). הילוכים מיקרוסקופיה אלקטרונית אישר מורפולוגיה כדורית ליחידות קופולימר ובכך דינמיפיזור אור (איור 3 ו טבלה 2) הועסק על מנת להעריך את הקוטר הידרודינמית (D h ~ 25 ננומטר). כפי שניתן לראות באיור 6-A, L929 תאים פיברובלסטים עכבר נחשפו ב mPEG- - (PhGE) 15 BCMs ולא רעילות נצפתה לאחר תקופת הדגירה 24 שעות.

איור 5
איור 5. עוצמת הקרינה ואפיון CMC. א) מגרש של עוצמת הקרינה של DPH כפונקציה של ריכוז של b mPEG- - (Phe) 15 קופולימר לחסום. הבלעה מראה השלב המקדמי של אגרגציה של קופולימר בלוק ב 0.1-10 מיקרוגרם / מ"ל. B) מגרש של ערכי CMC המתקבל ספרות עבור מגוון של קופולימרים עם פניל תליון על בלוק יוצרי הליבה. ריבועים אדומים מייצגים את הערכים שחושבים האנרגיה גבס של עכבריםllization של קופולימרים המקבילים (± 0.5 kJ / mol). 22,25-28 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 2
אפיון טבלה 2. של BCMs שהוכן על ידי שיטת הדיאליזה.

Solubilization של התרופה BCMs מושפעת מסיסות מימית של התרופה, כמו גם את הנטייה לאינטראקציה בין הסם עצמו ו / או לחסום יוצרי הליבה של מיצלות. בצורתו מלח שלה, DOX הוא מסיס יחסית (~ 10 מ"ג / מ"ל) במים. לפיכך לטעינה לתוך BCMs, DOX פורק ב אצטוניטריל ונטרל עם TEA להשיג בסיס חינם (3 EQ.). עם pKa של 8.5, DOX הופך מסיס יחסית בתנאים הבסיסיים נהיגה אנקפסולציה של BCMs עם stabilization ידי אינטראקציות לערום π-π mPEG- - (PhGE) 15). כפי שתואר בספרות, יכולות העמסה דומה DOX ב ב DOX-mPEG- -. (PhGE) 15 דווחו עם ערך ממוצע של 14% (w / w) 21-24 לאחר אולטרה סינון, נמצא כי ריכוזי קופולימר נמוך כמו 10 מ"ג / מ"ל ​​solubilized בהצלחה ל -1.6 מ"ג DOX / מ"ל. יעילות טעינת הסמים הייתה עד 52% (w / w) עבור B mPEG- - (PhGE) 15 BCMs (טבלה 2). פרופילי שחרור DOX מן BCMs מדיה שונה נחקרו (איור 6 ג).

איור 6
איור 6. Cytotoxicity קינטיקה שחרור התרופה. א) Evaluation של cytotoxicity בתאי פיברובלסטים L929 עכבר של b mPEG- -. (PheGE) 15 מיצלות קופולימר כפי שנקבע באמצעות assay MTS לאחר תקופת דגירה 24 שעות (n = 3 ניסויים בודדים, SD <10%) ב) ספקטרום פליטה מנורמל של DOX בחינם מיצלות טעון DOX ב- PBS, pH 7.4 ב 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ריכוז DOX. אורך גל העירור הוא 480 ננומטר בספקטרום הפליטה נאסף 500-700 ננומטר C) פרופילי שחרור DOX מן b לחסום mPEG- -. (PhGE) 15 מיצלות קופולימר (ריבועים) ב- PBS 0.1 M pH 7.4, (עיגולים) ב PBS 0.1 M pH 7.4 המכיל BSA 50 מ"ג / מ"ל (בשקית) ו- (משולשים) Na + חיץ 0.1 M pH 5.5 ו (למטה משולשים) חינם DOX (n = 2) ב PBS pH 7.4 אצטט. (עבור כל תנאי, n = 3 ניסויים בודדים, SD <10%). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של Figur זהדואר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשל שליטה הטובה כי פילמור anionic מספק מעל משקל מולקולרי הוא אחד התהליכים השימושיים ביותר בתעשייה לעריכת הפולימרים המבוססים על מונומרים oxirane (PEG ו PPG). תנאים אופטימליים ומחמירות חייבים לשמש כדי שניתן יהיה להשיג פילמור מוצלח. טיהור קפדנית של כל ריאגנטים והמכשירים נאותים חיונית עבור תו החיים של הסינתזה. מגבלות ההגדרה הנוכחית קשורות בעיקר עם טכניקת ההעברה המסתמכת על cannulation. באמצעות לחץ מתאים, cannulation היא טכניקה בקנה מידת מעבדתי בטוחה עבור בסביבה האקדמית. החלת אמצעי זהירות אלה יספקו שחזור שליטה טובה יותר בתהליך פילמור (נמוך PDI). כמו כן, נוהלי העברת וטיהור אלה יכולים לשמש להכנת קופולימרים כגון -PCL ב mPEG-, -PLLA ב mPEG-, ו mPEG- ב -PAGE. 19,29 עם זאת, proc נוח זהedure לא יכול להיות מתאים פילמור של כמה מונומרים הדורשים תנאים מחמירים יותר (למשל, סטירן). לחלופין, טכניקת פריצה החותמת הוא העדיף בדרך כלל עבור פילמור anionic. 30 כדי לשלוט צעדים אלו בתעשייה, מערכות דומות (נירוסטה / זכוכית) מחוברים זה לזה באמצעות שסתומים הרמטיים.

עבור מונומרים oxirane, המנגנון הכללי הוא התקף nucleophilic של oxyanion (יון חינם או זוג יונים) על טבעת oxirane, מה שמוביל פילמור פתיחת הטבעת. עם זאת, תלוי באופי של מונומרים oxirane להחליף, כמה מונומרים לא יכול לפלמר או שהם עשויים לא להיות polymerized משקל מולקולרי גבוה. סוג של פילמור זה אינו סובל רכיבים חומציים או בסיסיים, כולל מונומר עצמו, המין הממס או אחר להוביל לתגובות סיום ו / או העברת שרשרת בטווח הבינוני (אובדן השליטה של ​​התגובה). כדי לייצר קופולימר גוש PEGylated נושאות פנילקבוצות ידי פילמור anionic, חלופות מונומר אתר פניל ​​glycidyl ניתן למצוא: סטירן, תחמוצת סטירן או אתר allyl glycidyl ואחריו תגובת מייקל רדיקלית של mercaptan בנזיל אפשרויות. MPEG ניתן להכין על ידי עיבוי של מונומר אתילן אוקסיד ואז polymerized באותם תנאים כפי שתואר במאמר זה, באמצעות יוזם hydroxylated (למשל, מתנול). עם זאת, MPEG משתנה משקל מולקולרי עם PDI הנמוך זמינה מסחרית.

כדי למנוע שאריות מים, macroinitiator (למשל, MPEG-OH) צריך להיות מיובש היטב על ידי ייבוש מראש בתנור, ואחריו הליך אקדח הייבוש החום. התגובות יכולות להתבצע ממסי aprotic קוטב, תיאום ממסים או בתפזורת. כאשר פילמור דורש תנאים מסוימים, כגון טמפרטורה גבוהה, ממסים עם קוטביות חזקה יותר THF חייבים לשמש, כגון DMSO, diglyme או HMPA. כפי שתואר בפרוטוקול (סעיף 4 2) נדרש. DMSO הוא היגרוסקופי ואם הזיקוק אינו מתבצע היטב, עקבות של מים עלולות להשבית את המינים הפעילים. ממיסים אחרים ניתן להשתמש אך DMSO יש solvating יכולת גבוהה עבור קטיונים, solvating יכולת נמוכה עבור אניונים ומאפשר פילמור בטמפרטורה גבוהה. 31,32 DMSO הוא ממיס מעולה עבור בסיס זירזה פילמור של epoxides ו אולפינים עם מתמירים למשיכת אלקטרונים חזק. ייזום של פילמור יכולה להיות מושגת על ידי בדור באתרו של יוזמי alkoxide אשלגן דרך טיטרציה של MPEG-OH בתמיסה מדוללת של נפטלין אשלגן. 33 חשוב להכין את הפתרון בקפידה של נפטלין אשלגן כדי לכיל הפתרון עם חומצה לפני השימוש בו. ואכן, אם הריכוז של נפטלין אשלגן הוא מתחת או להפריז, את macroinitiator עשוי ליצור אגרגטים או להיכשל כדי להפעיל לחלוטין אתיוזם בתורו פילמור עלולה לסכן. כאשר נפתלין אשלגן מתווסף dropwise, ההיעלמות האיטית של צבע מספקת שליטה ויזואלית מעל הצריכה של הבסיס על ידי היוזם. בתנאים אלה, חילופי הפרוטון המהירים בין הקבוצות הידרוקסיל (רדומה) alkoxides (פעילה) מבטיחים פילמור מבוקרת של מונומר. 13

התנהגות צבירה של קופולימרים לחסום של הרכב דומה MPEG 122 - ב -. (PhGE) 15 נחקרו על ידי מספר קבוצות עם דיווח ערכי CMC בטווח שבין 1 ל 10 מיקרוגרם / מ"ל 25,27,28,34-36 ערכי CMC עבור קופולימר ספציפי יכול להשתנות בהתאם לשיטה המסוימת המועסקת על נחישות. במחקר זה, שיטה המבוססת קרינה הועסקה עם DPH נבחר החללית בהתחשב בכך שהוא גורם רק אות קרינה המשולבת פעם BCMs (איור 5 א הבלעה). איור 5 בכולל את ערכי CMC המתקבל עבור קופולימרים לחסום שונים עם פניל ​​תליון. כפי שניתן לראות, את ערכי CMC של קופולימרים משתנות בהתאם לאופי של עמוד השדרה פולימר הנושאת את פניל ומידת פילמור. 25,27,28,34-36 חילופי שרשראות קופולימר בין מיצלות והמדיום חיצוני תלוי מדינת הליבה micelle וכן פרמטר האינטראקציה פלורי-האגינס בין שני רחובות הממס. טמפרטורת זכוכית מעבר (g T) של homopolymer PPheGE בתפזורת ידוע להיות נמוך מזה של PS בתפזורת. 37 בשל אופיו המזוגגת של PS, קופולימרים עם רמה גבוהה של פילמור של PS (n> 35) בעלי ליבה מזוגגת ב RT (g T ~ 80 ° C). 38

מבחינה תרמודינמית, שתי גישות עיקריות הוצעו כדי לתאר את תהליך micellization, כלומר, מודל הפרדת פאזות (הפרדת פאזות בבית CMC), ומודל ההמוני לפעולה (תחתmicelle שיווי משקל ociation-ניתוק / unimers). 39 על פי שתי הגישות, האנרגיה גיבס תקן שינוי (ΔG ◦) להעברת 1 mol של אמפיפיליות מפתרון לשלב micellar (ΔG אנרגיה חופשית של micellization), בהעדר אינטראקציות אלקטרוסטטיות, ניתנת על ידי ΔG = ln RT (CMC). 39 כפי שניתן לראות איור 5 ב, את הערכים עבור CMC ו ΔG עולות בקנה אחד עם הערכים שהתקבלו עבור קופולימרים הדומים בהרכבם (במונחים של W ו- יחס M קופולימר הכולל של הידרופובי אורך בלוק הידרופילי) כדי mPEG- ב - (PhGE) 15. כפי שניתן לראות בטבלה 1, ניתוח DSC של b mPEG- - (PhGE) 15 חומר בתפזורת קופולימר אישר מ T יחיד 51 ° C אשר מיוחסת לבלוק הידרופילי יחסית מדוכאMPEG לבד (60 מעלות צלזיוס). בתמיסה, חזק הוא כי הליבות של b mPEG- -PS מיצלות קופולימר, עם קוביות קלקר באורך דומה לזה של PhGE ב mPEG- ב - (PhGE) 15, מתחיל להיות נייד בטמפרטורה פיזיולוגית (כלומר, 37 ° . ג) 38,40 לכן, ב mPEG- - (PhGE) 15 BCMs להחזיק סביר גרעין נייד יחסית המאפשר תנועה מקומית ב חדר וטמפרטורות פיסיולוגיות.

בשנת דיאליזה אולטרה סינון במחקר זה שימשו כאמצעי נוח להסיר סמים בחינם כדי להגדיל את ריכוז התרופה / קופולימר עבור עוקבות ביישומים vivo. לחלופין, ייבוש בהקפאה עשוי להיות מועסק על מנת לרכז את הניסוח; עם זאת, זה דורש אופטימיזציה כולל תוספת אפשרית של מייצבים (למשל, PEG, דקסטרוז) כדי לשפר את יכולת רטיבות כינון מחדש. המלון של לינה DOX-mPEG- וכתוצאה מכך - (PhGE) 15 BCMs הראה s דומהפרופילי שחרור ustained (PBS 7.4) למערכות BCM שפותחו על ידי Kataoka ועמיתים לעבודה. 21 ב PBS ב- pH 7.4, פחות מ -10% של התרופה הכוללת שוחררו תוך שש שעות ואילו יותר מ -95% של DOX חינם הוא שוחרר מן הדיאליזה שקית בתוך אותו פרק זמן. לשחרור מושהה ב- pH נייטרלי מצביע על יציבות טובה של ניסוח פני תקופת ארבעה ימים.

סרום דם אנושי מורכב של כ 7% חלבון, שני שלישים מהם הוא אלבומין. 41 לכן, על מנת לדמות את שחרור תרופת תנאי vivo ב מוערך בדרך כלל בפתרונות מאגר המכילים ריכוזיים רלוונטיות מבחינה הפיזיולוגית של חלבון זה. במחקר הנוכחי, BSA נכללה שקית דיאליזה בריכוז של 50 מ"ג / מ"ל. בנוכחות אלבומין, שחרור DOX מן BCMs גדל לכ -30% בעקבות 4 ימים של דגירה על 37 ° C. שחרור DOX מן BCMs חיץ ב- pH 5.5 אישר כי protonatיון של DOX תחת תוצאות תנאים אלה לעלייה שחרור התרופה לאחר 72 שעות וזה מגביר עד 60% לאחר 4 ימים. בסך הכל, DOX-BCMs וכתוצאה מכך הראה תוצאות מבטיחות במבחנה, דומה או שווה ערך ל ניסוחי BCM אחרים של DOX מוצגים בספרות, ובכך לעודד הערכה נוספת in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/HAMF12 Gibco, Life Technologies 12500 Supplemented with 10% FBS. Warm in 37 °C water bath.
Trypsin-EDTA (0.25%) Sigma-Aldrich T4049 Warm in 37 °C water bath
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051 Canada origin
MDA-MB-468 cell line ATCC HTB-132
MTS tetrazolium reagent PROMEGA G111B
Phenazine ethosulfate (PES) Sigma-Aldrich P4544 >95%
mPEG5K (Mn 5,400 g/mol) Sigma-Aldrich 81323 PDI=1.02
Dimethylsolfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 >99.5%
Naphthalene Sigma-Aldrich 147141 >99%
Phenyl glycidyl ether Sigma-Aldrich A32608 >85%
Benzophenone Sigma-Aldrich 427551 >99%
Potassium Sigma-Aldrich 451096 >98%
Tetrahydrofuran Caledon Laboratory Chemicals 8900 1 ACS
Hexane Caledon Laboratory Chemicals 5500 1 ACS
Calcium hydride (CaH2) ACP C-0460 >99.5%
Diethyl Ether Caledon Laboratory Chemicals 1/10/4800 ACS
Microplate reader BioTek Instruments
Differential scanning calorimetry (DSC) TA Instruments Inc DSC Q100
Gel permeation chromatography (GPC) Waters 2695 separation moldule / 2414 detector  2 Columns: Agilent Plgel 5 µm Mixed-D
NMR spectroscopy Varian Mercury 400MHz
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151858 99.96%
DMSO-d Sigma-Aldrich 156914 99.96%
Vaccum pump Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc. Ultimate pressure 1x10-4 torr
Drierit with indicator, 8 mesh Sigma-Aldrich 238988 Regenerated at 230 °C for 2 hr

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
  2. van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, (10), 3717-3756 (2002).
  3. Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49, (36), 6288-6308 (2010).
  4. Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
  5. Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345, (1-2), 35-41 (2007).
  6. Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100, (4), 572-579 (2009).
  7. Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10, (10), 6283-6297 (2010).
  8. Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
  9. Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11, (5), 1273-1280 (2010).
  10. Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47, (1), 113-131 (2001).
  11. Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74, (1-3), 295-302 (2001).
  12. Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93, (1), 132-143 (2004).
  13. Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62, (6), 1561-1565 (1940).
  14. Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7, (10), 1421-1433 (1971).
  15. Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18, (22), 8685-8691 (2002).
  16. Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21, (12), 5263-5271 (2005).
  17. Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22, (18), 7465-7470 (2006).
  18. Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
  19. Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5, (1), 128-133 (2016).
  20. Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16, (6), 427-440 (2001).
  21. Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64, (1-3), 143-153 (2000).
  22. Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4, (4), 241-247 (1997).
  23. Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9, (12), 9330-9342 (2013).
  24. Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21, (10), 981-993 (2013).
  25. Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6, (2), 514-516 (1990).
  26. Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24, (5), 1033-1040 (1991).
  27. Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196, (6), 1899-1905 (1995).
  28. Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9, (4), 945-949 (1993).
  29. Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96, (1), 37-53 (2004).
  30. Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43, (24), 6179-6222 (2005).
  31. Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16, (2), 163-187 (1962).
  32. Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. (1965).
  33. Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
  34. Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
  35. Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31, (22), 7851-7864 (1998).
  36. Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21, (11), 2001-2008 (2004).
  37. Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
  38. Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197, (11), 3697-3710 (1996).
  39. Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. Chapman and Hall. (1983).
  40. Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3, (21), 4769-4773 (2001).
  41. Encyclopædia Britannica Online. http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics