Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de

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Yeung, M., Thorsen, T. Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species. J. Vis. Exp. (117), e54493, doi:10.3791/54493 (2016).

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Abstract

Infecções alimentares em os EUA causada por espécies de Vibrio têm mostrado uma tendência ascendente. No género Vibrio, V. parahaemolyticus é responsável pela maioria das infecções por Vibrio -associated. Assim, a diferenciação precisa entre Vibrio spp. e detecção de V. parahaemolyticus é extremamente importante para garantir a segurança do nosso abastecimento alimentar. Embora as técnicas moleculares são cada vez mais comuns, métodos, dependendo de cultura são ainda feito rotineiramente e são considerados métodos padrão em determinadas circunstâncias. Assim, um novo meio de agar cromogénico foi testado com o objectivo de proporcionar um melhor método para o isolamento e diferenciação de Vibrio spp clinicamente relevante. O protocolo de comparação do limite de sensibilidade, especificidade e de detecção para a detecção de V. parahaemolyticus entre o novo meio cromogénico e um meio convencional. Vários V. cepas parahaemolyticus (n = 22) reapresentando diversos sorotipos e fonte de origens foram utilizados. Eles foram previamente identificados pela Food and Drug Administration (FDA) e os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), e ainda mais verificada em nosso laboratório por tlh-PCR. Em pelo menos quatro ensaios independentes, estas estirpes foram inoculadas sobre os sais de agar-sacarose e tiossulfato-citrato-biliares cromogénicos (TCBS) de agar, que é a forma recomendada para a cultura desta espécie, seguido de incubação a 35-37 ° C durante 24 hr -96. Três V. cepas parahaemolyticus (13,6%) não cresceu de forma otimizada em TCBS, no entanto exibiram colónias verdes se houve crescimento. Duas cepas (9,1%) não deu as colônias ciano esperados no ágar cromogênico. V. não estirpes parahaemolyticus (n = 32) foram também testados para determinar a especificidade do ágar cromogénico. Entre estas estirpes, 31 não crescer ou exibiu outras morfologias colônia. A recuperação média de V. parahaemolyticus na chromogenic ~ ágar foi de 96,4% em relação ao agar de soja tríptica suplementado com 2% de NaCl. Em conclusão, o novo ágar cromogénico é um meio eficaz para detectar V. parahaemolyticus e diferenciá-lo de outros vibrios.

Introduction

Como um membro do gênero Vibrio, V. parahaemolyticus é, curvo bactéria Gram-negativa, não-formadoras de esporos, em forma de haste. Ele exibe uma elevada motilidade em ambos os ambientes líquidos e semi-sólidos. A maioria V. cepas parahaemolyticus não são patogénicas para os seres humanos, mas os subtipos patogênicos têm causado epidemias e pandemias, portanto, esta espécie é considerada um importante patógeno de origem alimentar em muitos países 1,2. A incidência de infecção Vibrio em os EUA tem mostrado uma tendência ascendente desde 2000 3. Entre Vibrio spp., V. parahaemolyticus é a espécie mais frequentemente relatados que causam doenças em os EUA 4,5. Outras espécies clinicamente relevantes incluem V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Uma pequena porcentagem das doenças é causada por várias espécies simultaneamente.

V. parahaemolyticus é uma i naturaisnhabitant de água do mar e, portanto, amplamente distribuídos em águas marinhas em todo o mundo, incluindo os estuários. A espécie foi descoberta em 1950 na sequência de um surto de intoxicação alimentar no Japão. Em os EUA, a espécie foi isolada pela primeira vez na água do mar, sedimentos, e marisco na região de Puget Sound 6,7. Filtro alimentadores em habitats marinhos, tais como moluscos bivalves, podem abrigar V. parahaemolyticus como parte de sua flora natural 8. Como tal, V. infecções parahaemolyticus em humanos são muitas vezes ligados ao consumo de mariscos contaminados, principalmente mariscos crus ou mal cozidos. Uma rota menos comum de entrada ocorre quando ferida aberta é exposta à água do mar, levando à infecção de pele. A maioria V. cepas parahaemolyticus não causam a doença humana, mas certos subtipos que abrigam fatores de virulência como hemolisina direta termoestável (TDH) são patogênicas. Os sintomas mais prevalentes de origem alimentar V. infecção parahaemolyticus sãodiarreia e dor abdominal, seguida de náuseas, vómitos e febre. Dor de cabeça e arrepios são também relatados. O período de incubação médio é de 15 horas, mas pode ser de até 96 horas após o consumo de uma quantidade suficiente de estirpes patogénicas 9. A doença dura de dois a três dias. Os sintomas de gastroenterite causados por V. parahaemolyticus são amplamente auto-limitada e, por conseguinte, um tratamento especial não é necessário. Os casos leves de gastroenterite podem ser eficazmente tratados por reidratação oral. Mais doenças graves podem ser tratados com antibióticos tais como tetraciclina ou ciprofloxacina 10. A mortalidade é de cerca de 2% para os casos de gastroenterite, mas pode ser tão elevado quanto 29% para os que desenvolvem infecção da corrente sanguínea ou a septicemia. Qualquer pessoa que consome frutos do mar ou tem ferida aberta exposta à água do mar está em risco de V. infecção parahaemolyticus. A forma mais grave da septicemia, doenças com risco de vida, é mais comum em uma subpopulação com o co médica subjacentenditions 11, que incluem alcoolismo, doença hepática, diabetes, doença renal, doença maligna, e outras condições que conduzem a uma resposta imune enfraquecido. Notavelmente, este grupo de indivíduos também está em maior risco de contrair doenças graves causadas por V. vulnificus, que pode ser encontrado em habitats naturais semelhantes a V. parahaemolyticus.

V. parahaemolyticus é rotineiramente isolado utilizando ágar sais de ácido sacarose-tiossulfato-citrato biliares (TCBS) como um meio selectivo e diferencial. Enriquecimento em água peptonada alcalina pode preceder o isolamento em agar TCBS. colónias presumivelmente em TCBS são então testados em uma série de testes bioquímicos e / ou ensaios moleculares visando a presença de genes específicos da espécie. Métodos baseados em PCR são muitas vezes utilizados para confirmar a identidade de V. parahaemolyticus por amplificação do gene da hemolisina termolábeis, tlh 12.

Independentemente do choice de métodos de confirmação, é importante dispor de um meio eficaz para isolar e diferenciar V. parahaemolyticus de outros vibrios marinhos em primeiro lugar. TCBS tem sido rotineiramente usado para diferenciar as espécies dentro do gênero Vibrio acordo com suas habilidades para fermentar sacarose 12. Reacção de fermentação positiva é acompanhada por uma mudança de cor do indicador de pH azul de bromotimol. V. colónias parahaemolyticus são bastante distinta em TCBS, exibindo azul para cor verde. No entanto, este meio não pode facilmente diferenciar V. alginolyticus e V. cholerae. espécies de Proteus-fermentação da sacarose podem produzir colónias amarelas se assemelham V. cholerae ou V. alginolyticus 13. No isolamento inicial em TCBS, V. parahaemolyticus também pode ser identificado erroneamente como Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides e Pseudomonas spp 14. As cepas com ferm sacarose adiadaentação pode ser confundida com outra sacarose não-fermentadoras, Vibrio 13, que incluem V. parahaemolyticus. TCBS foi encontrado para ser não é sensível contra Escherichia coli, putrefaciens Pseudomonas, entre outros. Várias outras espécies render verde para colónias cinzentas que são potencialmente confundidos com V. parahaemolyticus ou V. vulnificus 15. Como resultado, é desejável desenvolver meios alternativos com melhor sensibilidade e especificidade para detectar e isolar V. parahaemolyticus e outras espécies estreitamente relacionadas.

Várias alternativas de mídia têm sido desenvolvidos recentemente. Para além da inclusão de agentes selectivos, mais incorporar substratos cromogénicos para diferenciar espécies com base nas suas actividades enzimáticas diferenciais. Por exemplo, o indoxil-β-glucósido e indoxil-β-galactósido têm sido usadas como os substratos cromogénicos para diferenciar V. páracolónias haemolyticus (que aparecem verde-azulado) dos de V. cholerae (roxo), devido às suas capacidades diferenciais para produzir β-glicosidase e β-galactosidase 16. Diferentes formulações de ágar cromogénico desenvolvidas por diversos grupos foram avaliados e foram relatados para executar comparável ou melhor do que TCBS 17,18,19. Uma vantagem de usar um meio cromogénico é que a coloração do meio circundante é mínima facilitando assim o isolamento de colónias particulares. Neste estudo, avaliou-se a capacidade de um meio cromogénico recentemente formulado para detectar e isolar V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus; com um foco especial sobre a sua capacidade para diferenciar V. parahaemolyticus a partir de outras espécies.

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Protocol

1. Mídia e Cultura de microbianas Cepas

NOTA: Use técnicas assépticas em todos os experimentos. Usar materiais estéreis. Esterilizar todos os recipientes, ferramentas e reagentes antes de usar. Autoclave todos os resíduos antes do descarte, porque eles são considerados de risco biológico. temperatura e tempo autoclave combinação é ≥121 ° C x ≥15 min durante todos os procedimentos a seguir.

  1. Para tornar ~ 1-L-agar de soja tríptica (TSA), primeiro adicionar 1 L de água desionizada num balão de Erlenmeyer de 2 L contendo uma barra de agitação magnética. Usar um balão que é pelo menos duas vezes maior do que o volume final. Adicionar 30 g de caldo de soja tríptica em pó e 20 g de agar grânulos para o frasco.
    NOTA: Use 2% de agar em vez de 1,5% para limitar enxame de algum Vibrio spp.
    1. Misturar bem, rodando sobre o agitador. Enquanto se agitava, ligue o fogo para ferver a mistura. Retirar o frasco do aquecedor, logo que a mistura começa a ferver. Vagamente cobrir the frasco com uma folha de estanho. Tape o papel alumínio para protegê-lo para o frasco antes de autoclave.
    2. Para fazer tríptico caldo de soja (TSB), omitir o agar da receita no passo 1.1.
      NOTA: Pode usar garrafas em vez de Erlenmeyer.
    3. Para fazer agar de soja tríptica suplementado com cloreto de sódio a 2% ou NaCl (CST), adicionar 20 g de NaCl na mistura antes da agitação e aquecimento. Para fazer caldo de soja tríptica suplementado com 2% de NaCl (TSBs), omitir o agar, adicionar 20 g de NaCl na mistura antes da agitação e aquecimento.
  2. Para tornar a infusão de coração e cérebro de agar (BHI), suspensão 37 g de BHI em pó e 15 g de grânulos de agar em 1 litro de água purificada. Aquecer com agitação frequente para dissolver o pó. Autoclave. Omitir o agar para fazer caldo BHI.
  3. Para fazer ágar TCBS, suspensão 89 g do pó em TCBS 1 L de água purificada. Aquecer com agitação frequente e fervura durante 1 min para dissolver completamente o pó. Não autoclave.
  4. Por todos os meios de agar, arrefecer o agar quente para 45-50 ° C num banho de água. Organizar placas de Petri vazios em pilhas de cinco a seis placas. A partir da parte inferior da pilha, verter o agar derretido em cada placa de Petri para atingir cerca de metade cheio. Feche a tampa placa de Petri após o vazamento. Permitir que o agar solidificar, permitindo que as placas de repouso à temperatura ambiente.
    1. Use as placas de ágar no dia seguinte ou após 12 horas. Armazenar placas não utilizados em uma geladeira por até duas semanas. Antes da utilização, remover as placas a partir do frigorífico e equilibrar-los à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min.
      NOTA: agar de um litro faz ~ 45 placas de ágar. Permitir que as placas de ágar para secar suficientemente no dia da preparação, e equilibrar-los à temperatura ambiente após o armazenamento a frio para reduzir eficazmente a propagação das colônias.
  5. Obter chocolate e de ágar cromogênico placas e equilibrar-los à temperatura ambiente antes de cada experimento.
  6. Subcultura todos os 54 cepas microbianas apresentados na Tabela 1 a cada poucos days.
    1. Use um loop de inoculação estéril para transferir culturas a partir de um estoque congelado ou um lote anterior para mídia não-seletivos, como BHI, TSB / TSA ou agar chocolate. Crescer halophilic Vibrio spp. em TSBs / TSAS.
    2. Para verificar a pureza da cultura, raia todas as estirpes em um padrão que permita a observação das colônias isoladas. Por exemplo, usar um padrão de estrias de três fases para diluir uma grande quantidade de bactérias a quantidade menor, originando eventualmente colónias isoladas.
  7. Incubar as placas de cabeça para baixo a 35-37 ° C durante até 48 h. Para Campylobacter spp., Tubos ou placas incubar em um frasco de tampa fechada contendo uma bolsa de gás para produzir um ambiente microaerophilic. Observar morfologia das colónias após incubação. Culturas puras deve produzir colónias que exibem uma morfologia de colónia semelhante.
    NOTA: Incubar todas as placas de cabeça para baixo para evitar que as gotículas de água condensada formadas no lado inferior da tampa de cair na colonies.

2. Espécies Determinação por PCR

  1. Realizar tlh-PCR para confirmar a identidade de V. cepas parahaemolyticus. Utilização iniciadores TLH -F (5 'AAA GCG TAT GAT GCA GAA GCA CTG 3') e -R TLH (5 'TCG ACT TTC CAT TAG TTT CTC TGC 3') para amplificar um fragmento de 450 pb do gene de hemolisina 20 termolábil .
    1. Use um loop de inoculação estéril para transferir algumas colônias isoladas de cada V. estirpe parahaemolyticus a partir TSAS a 5 ml de TSBs. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 hr.
    2. culturas centrifugar a 14.000 xg por 1 min. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Ferver a suspensão durante 3 minutos para se obter lisado celular.
      NOTA: V. parahaemolyticus é fácil de ser lisadas. Portanto reagente de lise não é necessária. É também possível usar um pouco de colónia directamente como molde.
    3. Executar PCR numa reacção de 25-ul volume. Prepara-se uma mistura reaccional contendo uma concentração final de tampão de PCR 1x, MgCl2 1,5 mM, 100 uM de cada dNTP, 1 pM de cada iniciador, 1 U de Taq polimerase e 1 ml de lisado celular. Após pré-incubação a 94 ° C durante 5 min, executar 35 ciclos de amplificação de 94 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 60 seg 21.
    4. alíquotas de carga de amplicão 5-ul em géis de agarose a 1,5%. Ligue a fonte de alimentação para iniciar a electroforese. Visualizar a presença ou ausência de produtos de amplificação sob iluminação com UV, após coloração com brometo de etídio.

3. Crescimento na selectivo e diferencial de mídia

  1. Dois a quatro dias antes do experimento, raia todas as cepas microbianas apresentados na Tabela 1 no meio não selectivo (TSAS, BHI ou agar chocolate) para o isolamento de colónia. Incubar as placas a 35-37 ° C durante 48 h. Verifique a pureza das culturas através da observação da morfologia das colónias após incubação. Culturas puras deve produzir colónias que exibem uma morfologia de colónia semelhante.
  2. Transferir algumas colónias isoladas a partir do passo 3.1 em 5 mL de caldo. Incubar os tubos a 35-37 ° C durante 16-24 hr.
    Nota: Use as colónias jovens, que são menos de quatro dias de idade, para preparar culturas durante a noite em todos os experimentos.
  3. Streak uma ansa de culturas durante a noite em meio selectivo e diferencial (TCBS e agar cromogênico) para o isolamento de colónia. Incubar as placas a 35-37 ° C durante até 96 h.
  4. Grave o crescimento global de todas as estirpes, examinando tanto a densidade da cultura no prato e o tamanho de colônias isoladas. Grave a cor das colónias sob a luz ambiente e / ou UV. Nota outras características da colônia isolada como a altitude, a margem e forma.

Ensaio 4. Recuperação

  1. Seleccionar um subconjunto representativo de V. cepas parahaemolyticus (n = 14) que abrangem diferentes sorotipos e origens de isolamento
  2. Realizar um método de contagem padrão em placa das culturas durante a noite, como descrito abaixo.
    1. Vortex para misturar as culturas durante a noite bem. Adicione uma dobra em 10 ou 10 -1 de diluição por transferência de 100 uL da cultura durante a noite para um tubo contendo 900 jil de PBS. Vortex para misturar bem.
    2. Usar uma nova ponta de pipeta para transferir 100 ul a partir do tubo 10 -1 de diluição para outro tubo contendo 900 ul de PBS. Vortex para misturar bem. Isto constitui 10 -2 diluição. Repetir o processo sequencial para se obter 10 -7 diluição.
    3. Usando os 10 -4 a 10 -7 tubos de diluição, placa 100 ul cada um no, TCBs e CST placas de ágar cromogênico.
      NOTA: O factor de diluição (DF) sobre a placa torna-se 10 -5 a 10 -8, respectivamente.
    4. Espalhe as alíquotas uniformemente em tele agar superfície.
      NOTA: É bem usar o mesmo espalhador por pressão sobre o mesmo meio, enquanto a alíquota mais diluída é espalhado primeiro (ou seja, a partir de 10 -8 a 10 -5). Não use o mesmo espalhador para diferentes mídias.
    5. Incubar as placas a 35-37 ° C durante até 96 h. Contagem das colónias nas placas. Ignorar placas de rolamento colónias que são demasiado numerosas para contar (TnTc) ou menos do que 25. Calcular CFU / ml de acordo com o seguinte:
      equação 1
      Onde
      N = o número de células no tubo não diluído, expresso em CFU / ml ou CFU / g
      C = o número total de colónias contadas em placas que dão 25-300 colónias
      N 1 = o número de placa (s), onde as colónias são contadas a partir do DF inferior
      n = 2 o número de placa (s), onde as colónias são contadas a partir da diluição de 10 vezes subsequente
      dF = factor de diluição menor (isto é, a diluição mais concentrada)
  3. Compare UFC / ml entre os diferentes meios de comunicação. Use UFC / ml em TSAS como 100%, calcular a recuperação% de V. parahaemolyticus cultivadas em agar cromogénico e TCBS.

Ensaio 5. Concorrência

  1. Escolha um subconjunto de estirpes que exibem diferentes morfologias colônia na agar cromogênico e TCBS.
    NOTA: Dessa forma, será possível a contagem das colónias originado V. única parahaemolyticus, apesar da presença de outras espécies no inoculo.
    1. Escolha um V. estirpe parahaemolyticus que produz os turquesa e ciano colónias esperado em TCBS eo agar cromogênico, respectivamente.
    2. Escolha um V. não- parahaemolyticus e uma espécie não-Vibrio que não crescem em qualquer um destes meios de comunicação, ou exibem cor diferente colônia.
      NOTA: Por exemplo, V. metschnikovii cresce muito pouco oN TCBS e não crescem em agar cromogénico. Shigella sonnei que não crescem em TCBS mas produz colónias magenta sobre o ágar cromogénico.
  2. Após a seleção das estirpes anteriores, preparar caldos de cultura durante a noite usando colônias isoladas cultivadas em meio não selectivo.
    1. Faça culturas durante a noite de V. parahaemolyticus e V. metschnikovii transferindo algumas colónias isoladas a partir de TSAS a 5 ml de TSBs. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 hr.
    2. Adicione culturas de uma noite de Shigella sonnei, transferindo-se algumas colónias isoladas a partir de agar de BHI para 5 ml de caldo BHI. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 hr.
  3. Para cada cepa, realizar uma série de diluição semelhante ao Passos 4.2.1 e 4.2.2. Placa diluições apropriadas em TSAS ou BHI para determinar UFC / ml da cultura durante a noite, utilizando-se a equação mostrado no Passo 4.2.5.
    NOTA: Normalmente, 100 ul da diluição de 10 -5 a 10 -7tubos funciona para a maioria das culturas. Use os valores de UFC / mL para trás calcular a quantidade exata de células usadas na próxima etapa. Os valores de CFU / ml calculados são obtidos depois de incubação, embora os seguintes passos são executados na mesma data no passo 5.3.
  4. Usando as culturas durante a noite e tubos de diluição nos Passos 5.2 e 5.3, misturar diferentes quantidades de um V. estirpe parahaemolyticus e V. não espécies parahaemolyticus. Por exemplo, misturar 500 ul da diluição -5 tubo 10 de V. parahaemolyticus com 500 ul das culturas durante a noite de V. metschnikovii.
    NOTA: Esta mistura simula fundo alta microflora. Para simular um fundo baixo microflora, misturar 500 ul cada do tubo 10 -5 diluição de ambas as espécies.
  5. Espalhe 100 uL da mistura de cada um no, TCBS e TSAS placas de agar cromogénicos.
  6. Após incubação a 35-37 ° C durante até 96 h, a contagem de colónias de V. parahaemolyticus e o V. não- espécies parahaemolyticus com base na sua diferença no crescimento e morfologia da colônia no ágar cromogênico e TCBS.
    NOTA: Por exemplo, se o V. não- O parahaemolyticus espécies não crescem em agar cromogénico e TCBS, todas as colónias será de V. parahaemolyticus. Se o V. não- espécies parahaemolyticus cresce em ambos os meios, apenas as colónias azul-turquesa em TCBs e ciano colónias em agar cromogênico será de V. parahaemolyticus. O V. não- espécies parahaemolyticus podem ou não exibem uma morfologia de colónia semelhante a V. parahaemolyticus em TSAS.
    1. Se o V. não- espécies parahaemolyticus cresce de modo semelhante a V. parahaemolyticus neste meio não selectivo, divida o número de colónias por dois para obter números de V. parahaemolyticus somente. Comparar o número de colónias real com a contagem esperada derivada da etapa 5.3.

6. EffECTS de ostra homogeneizados

  1. Pesar ≥50 g carne de ostra de ≥12 moluscos incluindo carne e bebidas alcoólicas.
    1. Adicionar uma quantidade igual de PBS à carne de ostra e bebidas alcoólicas. Mistura-se a mistura a alta velocidade durante 90 segundos. Isto constitui 2 -1 homogenato diluído de ostras.
    2. Adicionar 100 g de 2 -1 homogenato diluído de ostra a 400 g de PBS. Use uma escala para medir o peso, não volume. Mistura-se a mistura a alta velocidade durante 1 minuto. Autoclave a homogenato de ostras.
      NOTA: Este será o homogeneizado ostra usado para spiking.
  2. Repetir o ensaio de recuperação (Passo 4), na presença de homogenato de ostras.
    1. Após a 500 g de ostra homogeneizado esfriar, adicione 100 ml de V. parahaemolyticus culturas durante a noite cultivadas em TSBs a ele. Determinar a quantidade real de V. células parahaemolyticus no inóculo por realização dos procedimentos de contagem padrão em placas descritas no Passo 4.2.
  3. Repcomer o ensaio de competição (Passo 5) na presença de homogenato de ostras.
    1. Após a 500 g de ostra homogeneizado esfria, adicionar 100 ul cada um culturas durante a noite de V. parahaemolyticus e V. não- parahaemolyticus a ele. Determinar a quantidade real de bactérias células do inóculo por realização dos procedimentos de contagem padrão em placas descrito no Passo 4.2
  4. Misturar as células bacterianas com homogenato de ostra bem utilizando um homogeneizador.
    NOTA: Após a mistura, o homogeneizado ostra contendo as células intencionalmente adicionados é chamado cravado ostra homogeneizado.
  5. Fazer diluições do homogeneizado ostra cravada para se obter 10 -1 a -3 10 tubos de diluição de acordo com os procedimentos descritos no Passo 4.2.2. Espalhe 100 ul de cada diluição para o cromogénico TCBS e TSAS ágar,. Incubar as placas a 35-37 ° C durante até 96 h.
  6. Compare o número de colónias real sobre agar cromogênico e TCBS com o experado contagem de colónias deduzida a partir de Passos 6.2.1 e 6.3.1.
    NOTA: Por exemplo, se um tubo de V. parahaemolyticus cultura durante a noite contém 10 8 CFU / ml, um inoculo de 100 ul significa que 10 7 células são adicionadas a 500 g de homogeneizado de ostra, obtendo-se 5 x 10 4 células / g. Após a diluição e em placas, a placa com df = 10 -2 deve render 500 colónias; enquanto que com df = 10 -3 deve rendimento de 50 colónias. Estas são as contagens de colónias esperado.

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Representative Results

Neste estudo, 54 cepas microbianas foram montados, que incluiu 22 cepas dentro do V. espécies parahaemolyticus, 19 outras espécies de Vibrio, e 13 espécies de Vibrio não (Tabela 1). A maioria V. cepas parahaemolyticus ou foram recebidos de FDA, CDC ou de outros departamentos de saúde estaduais. Eles representam diversos sorotipos e fontes de isolamento. Estas estirpes foram previamente identificados pelos órgãos reguladores. Nós confirmou ainda as identidades destes V. parahaemolyticus através da realização de um tlh-PCR 21,22.

Espécies Número de estirpes testadas Crescimento e cor das colónias
TCBS Cmédio hromogenic
Aeromonas hydrophila 2 Nenhum crescimento Uma estirpe nenhum crescimento;
1 estirpe cor magenta
Cândida albicans 1 Fraco crescimento, amarelo Nenhum crescimento
Campylobacter jejuni 1 Nenhum crescimento Nenhum crescimento
Escherichia coli 1 Nenhum crescimento Fraco crescimento, magenta
Proteus mirabilis 1 Nenhum crescimento Nenhum crescimento
Pseudomonas aeruginosa 2 Turquesa Amarelo
Staphylococcus aureus 1 Fraco crescimento, amarelo Nenhum crescimento
choleraesu Salmonellaé 1 Nenhum crescimento Nenhum crescimento
boydii Shigella 1 Nenhum crescimento Nenhum crescimento
Shigella flexneri 1 Nenhum crescimento Nenhum crescimento
sonnei Shigella 1 Nenhum crescimento Fraco crescimento, magenta
alginolyticus Vibrio 3 Amarelo ou azul-turquesa Amarelo
V. cholerae 4 Amarelo ou azul-turquesa Magenta
V. damsela 1 Turquesa Cobalto
V. fisheri 1 Fraco crescimento, amarelo Nenhum crescimento
V. fluvialis 1 Turquesa Cobalto
V.furnissii 1 Amarelo Amarelo
V. hollisae 1 Turquesa Amarelo
V. metschnikovii 1 Nenhum crescimento Nenhum crescimento
V. mimicus 1 Turquesa Magenta
V. parahaemolyticus 22 A maioria das cepas turquesa A maioria das cepas ciano; alguns clara
V. proteolyticus 1 Turquesa Cobalto
V. vulnificus 4 Turquesa ou clara Magenta

Tabela 1. espécies microbianas utilizadas neste estudo e suas características de crescimento no meio selectivo e diferencial. Chamada a cores foi based em uma roda de cores. Cyan é semelhante ao teal; magenta é semelhante ao de lavanda rosada, turquesa é semelhante ao verde, amarelo abrange oliva e marrom.

Quatro ensaios foram conduzidos para determinar a morfologia de crescimento e colónia destas estirpes no meio selectivo e diferencial - TCBS eo agar cromogênico. TCBS é a forma convencional utilizado para o isolamento de algumas espécies de Vibrio, incluindo V. cholerae e V. parahaemolyticus 12. Variação da cor das colónias cultivadas em TCBS era amarelo, turquesa (verde) ou clara (Figura 1).

figura 1
Figura 1. morfologia da colônia de Vibrio spp. em TCBS ágar. V. parahaemolyticus (turquesa), V. cholerae (amarelo), e am ixed inoculação das duas espécies (a). Colónias de V. parahaemolyticus aparecem turquesa, com uma circular, inteira, e morfologia convexa (b). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A capacidade de um novo meio cromogénico para seleccionar espécies de Vibrio clinicamente relevantes de alimentos e amostras ambientais foi testado. Além disso, foi avaliada a capacidade desta forma para distinguir estas espécies simultaneamente uma da outra. Cor de colônia observado no agar cromogênico foram cobalto, ciano, magenta, amarelo ou claro (Figura 2). Como mostrado na Tabela 1, ambos TCBS e o ágar cromogénico exibiu certos graus de selectividade contra microorganismos não Vibrio.

1 "> Figura 2
Figura 2. morfologia da colônia de Vibrio spp. sobre o ágar cromogénico recentemente desenvolvido. V. parahaemolyticus (ciano), V. cholerae (magenta), e uma inoculação mista das duas espécies (a). Colónias de V. parahaemolyticus aparecem ciano, com uma circular, inteira, e morfologia convexa (b). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Seguindo o método contagem padrão em placa em culturas durante a noite, colônias de V. parahaemolyticus foram observadas nas placas de agar cromogénicos receberem o maior factor de diluição (isto é, df = 10 -8). Estes resultados são comparáveis ​​àqueles em um meio não selectivo (CST). Isto sugere que o limite de detecção do meio cromogénico é semelhante ao meio não selectivo, que é de cerca de 10 células ou inferior, na ausência de matriz alimentar. A capacidade de detecção para outras espécies de Vibrio, como V. alginolyticus, V. fluvialis e V. donzela também foi decente em comparação com o meio não selectivo. No entanto, algumas estirpes de V. cholerae, V. vulnificus e V. mimicus rendeu 10 a 100 vezes menos de CFU no ágar cromogénico. Os agentes selectivos utilizados nos meios selectivos cromogénicos ou outros inevitavelmente inibir algumas células. células lesadas, por exemplo, não conseguiu recuperar em meio selectivo. No entanto, a capacidade de detecção ligeiramente mais pobre é um não-problema na maioria dos procedimentos de rotina que empregam uma etapa de enriquecimento. Pequena quantidade de microorganismos nos alimentos ou amostra ambiental seria multiplicar a um nível alto no caldo de enriquecimento, ultrapassando o limite de detecção. Enriquecimento em água alcalina peptona é often feito para determinar a prevalência de espécies de Vibrio em amostras ambientais 12.

Na presença de homogenato de ostra, o ágar cromogénico continuou a apresentar um bom grau de recuperação. Em outras palavras, uma grande proporção (> 70%) de V. parahaemolyticus células foram capazes de crescer em agar cromogénico, não afectada pela presença de matriz de ostra (Figura 3a). O crescimento e recuperação de V. parahaemolyticus células também não foi afectada pela presença de outras espécies Vibrio (Figura 3B). Este é um atributo importante porque as amostras ambientais são obrigados a conter diferentes espécies de Vibrio, que estão em números elevados, especialmente depois de um processo de enriquecimento.

Figura 3
Figura 3. percentual de recuperação de um V. estirpe parahaemolyticus em homogeneizado de ostra com e sem um concorrente bacteriana. A recuperação (média ± SD) foi calculado de acordo com o observado versus o CFU esperado contar com as placas de agar. contagem de CFU esperado foi calculada com base na carga bacteriana no inoculo. Alta recuperação de um V. parahaemolyticus tensão foi observada em todos os suportes sem competição (a). Nível semelhante de crescimento foi observado quando os níveis elevados de V. células metschnikovii estava presente (b). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para comparar ainda mais o ágar cromogénico e TCBS, foram calculados a sensibilidade e especificidade. A Tabela 2 mostra a capacidade de estes meios de comunicação para Accudamente identificar V. parahaemolyticus. Sensibilidade está relacionada com a percentagem de verdadeiros positivos, o que significa que o V. cepas parahaemolyticus rendeu a morfologia da colônia esperado na mídia. Especificidade está relacionada com a percentagem de verdadeiro negativo, o que significa que não V. cepas parahaemolyticus deve apresentar pobre ou nenhum crescimento, ou uma morfologia da colônia diferente do que V. parahaemolyticus. A sensibilidade e especificidade para TCBS para identificar V. parahaemolyticus foram 86,4% e 71,8%, respectivamente. Em comparação, a sensibilidade e especificidade do meio cromogénico foram de 90,9% e 96,9%, respectivamente.

a)
agar TCBS V. parahaemolyticus Non-V. parahaemolyticus
Bom crescimento e turquesa colonies 19 9
colónias fraco crescimento ou não-turquesa 3 23
b)
agar cromogênico V. parahaemolyticus Non-V. parahaemolyticus
Bons colónias de crescimento e ciano 20 1
colónias fraco crescimento ou não-ciano 2 31

Tabela 2. Sensibilidade e especificidade de TCBS (a) e cromogénico (b) de agar na detecção de V. parahaemolyticus. As identidades de V. parahaemolyticus foram previamente determinado por teste bioquímico e PCR tlh-.

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Discussion

Este estudo centra-se no desenvolvimento e avaliação meios de cultura. Convencionalmente, TCBS é o selectivo e diferencial meio utilizado para isolar e detectar V. parahaemolyticus, V. cholerae e V. vulnificus 12. No entanto, limitações têm sido relatados para este meio, tais como a incapacidade para diferenciar V. cholerae a partir de outras espécies de Vibrio. Sacarose e indicador de pH são os agentes de diferenciação de TCBS. Assim, a produção de ácido por fermentador de sacarose provoca a mudança de cor do meio. A coloração do meio é uma desvantagem de TCBS porque pode obscurecer observação da morfologia da colônia. O meio cromogénico recentemente desenvolvido utiliza o pH elevado e salinidade para suprimir o crescimento de espécies Vibrio não encontradas em muitas amostras marinhos. O novo meio cromogénico tem um pH final de 8,6 ± 0,2. Por litro de água desionizada, que consiste em 10 g de peptona, 10 g de mistura de sais do mar, 10 g de bílis de boi, 10 g de sódiotiossulfato, 5 g de extracto de levedura, 5 g de citrato de sódio, 2,2 g de carbonato de sódio, 2 g de lactose, 0,5 g de piruvato de sódio, 0,3 g de uma mistura cromogénica e 15 g de ágar. O mix cromogénico permite a diferenciação entre Vibrio spp. de acordo com as suas capacidades diferenciais para produzir certas enzimas. Em vez de alterar a cor do meio de agar TCBS, diferente Vibrio spp. exibiriam cor diferente colônia no novo meio cromogénico. Em comparação, um meio cromogénico comercialmente disponível contém 15 g de agar, 8 g de peptona e extracto de levedura, 51,4 g de sais, 0,3 g de uma mistura cromogénica e um pH final de 9,0 ± 0,2.

A robustez de uma avaliação do ensaio depende do tamanho da amostra. Uma vez que este estudo enfatiza sobre a eficácia do novo meio cromogénico para isolar e detectar V. parahaemolyticus, é importante para acumular muitos V. diversificada cepas parahaemolyticus. Estudos anteriores comparando TCBS enovos meios de cultura muitas vezes envolvidos amostras ambientais ou alimentares que contenham tipos e quantidade de microorganismos 23,24,25,26 desconhecidos. Várias colónias por amostra foram isoladas ainda a natureza clonal dos isolados muitas vezes era indeterminada. Idealmente, diferentes estirpes devem ser testados em ensaio de desenvolvimento de outra forma a exactidão do ensaio seria aumentado. Estirpe de identidade pode ser estabelecida por métodos convencionais, tais como subtipagem de electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) ou multi-locus de sequenciação. V. cepas parahaemolyticus neste estudo foram previamente caracterizados por ribotipagem e PFGE 19.

Durante o desenvolvimento do ensaio, a sensibilidade, especificidade e limite de detecção estão entre os principais fatores a serem investigados. Sensibilidade, também conhecido como precisão ou sensibilidade de diagnóstico, é o acordo positivo por cento entre os métodos de teste e referência. Especificidade, também conhecido como precisão ou especificidade do diagnóstico, é o negativo por cento ao ACORDO entre os métodos de teste e referência. Neste estudo, utilizou-se o método à base de PCR, como o método de referência, porque os resultados foram verificados entre os diferentes grupos. TCBS e os meios cromogénicos foram os métodos de ensaio. Para determinar a sensibilidade, resulta da V. cepas parahaemolyticus foram utilizados, ou seja, sensibilidade = 100% x Verdadeiro Positivo / (verdadeiro positivo + falso negativo). Por outro lado, resulta de V. não- parahaemolyticus estirpes foram usadas para determinar a especificidade; e, portanto, a especificidade = 100% x Verdadeiro Negativo / (True Negative + Falso Positivo). Para fornecer resultados de especificidade mais confiáveis, V. não cepas parahaemolyticus deve ser isolado de um ambiente no qual a amostragem será conduzida. Nossos cálculos de sensibilidade e especificidade são baseados em documentos escritos pelo governo 27, 28 e academia organização científica 29 sobre um tema relacionado com o desenvolvimento de ensaio e validação.

nt "> Com base em nossos resultados, o meio cromogénico mostraram melhor desempenho do que TCBS na identificação de V. parahaemolyticus. O acordo global por cento entre o método de referência e meio cromogénico é de 94,4%, em comparação com 77,8% entre o método de referência e TCBS. a sensibilidade e a especificidade do meio cromogénico são 90,9% e 96,9%, respectivamente, que são maiores do que os dos TCBS (86,4% e 71,9%, respectivamente). estudos anteriores avaliaram outros meios cromogénicos para a detecção de V. parahaemolyticus encontrado que as sensibilidades variou 85-88%, enquanto especificidades variou de 94 a 95% 23,24,25. Entretanto, esses estudos não usar o mesmo método de cálculo como o nosso estudo. Além disso, eles às vezes utilizado um método de referência diferente ou eles combinaram os resultados de ambos bioquímica analisa e meio cromogénico como um método de teste. como resultado, é difícil comparar directamente os nossos resultados com estes estudos anteriores.

V. parahaemolyticus, o ágar cromogénico utilizado neste estudo também pode diferenciar mais espécies Vibrio que TCBS devido à inclusão de uma mistura cromogénica na fórmula forma, dando origem a cores múltiplas. Embora não tenha sido o foco deste estudo para detectar V. cholerae e V. vulnificus, vale a pena notar que as colónias magenta exibida por estas espécies podem ser ainda diferenciadas por fluorescência sob UV. Uma limitação para utilizar o agar cromogénico para a detecção de V. cholerae e V. vulnificus é sua aparente baixa recuperação para estas espécies. Para contornar este problema, uma etapa de enriquecimento devem ser incluídos. Outra possível limitação do agar cromogênico é a sua vida útil mais curta do que TCBS. otimização contínua deste novo meio é necessário para manter o pH durante o armazenamento.

Apesar da popularidade de técnicas moleculares, Métodos, dependendo da cultura ainda são valiosos como eles são muitas vezes menos caro e ter uma melhor limite de detecção. Estes métodos de cultura pode ser utilizado como uma ferramenta de rastreio. Por outro lado, eles podem ser utilizados para confirmar a identidade e viabilidade dos microrganismos seguintes análises moleculares. Para enumerar as bactérias através de uma abordagem de cultura, dependendo, Plate Count padrão é reconhecido como o método standard. A equação mostrado no Passo 4.2.5 é uma forma mais precisa para determinar a CFU / g ou CFU / mL de uma média de CFUs de diferentes factores de diluição. É importante observar que todos os diluentes e meios de comunicação em todos os processos devem conter sal suficiente para manter a viabilidade das bactérias halófilas como V. parahaemolyticus. A temperatura de incubação e do ambiente deve ser óptimo para o crescimento bacteriano.

O meio cromogénico é projetado para detectar espécies de Vibrio que são importantes patógenos humanos. Portanto, mais estudos devem ser realizados para determine sua eficácia para detectar outras espécies de Vibrio ambientais que não sejam clinicamente relevante. Em futuras aplicações, o novo ágar cromogénico pode ser incorporado em ensaios de rotina de amostras ambientais para V. parahaemolyticus. Isto pode ser realizado por estrias directa de amostras sobre o ágar cromogénico para detectar a presença de V. presuntivo parahaemolyticus. O ágar cromogénico também pode ser usado para enumerar V. parahaemolyticus seguinte diluições. A quantificação pode também ser calculada através da realização de um método do número mais provável usando caldo de enriquecimento, seguido por estrias sobre o ágar cromogénico para confirmação.

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Acknowledgments

Agradecemos a M. Channey, E. Chau, e K. Tomas por sua assistência no projeto. suprimentos do projeto foram parcialmente financiado pela California Polytechnic State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Equipment
Agar Fisher Scientific DF0140-15-4 may use other brands
Autoclave Any
BHI powder Fisher Scientific DF0418-17-7 may use other brands
Blender Any to blend oyster meat
CampyGen gas generator Hardy Diagnostics CN035A to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands
Chocolate agar plates Hardy Diagnostics E14 may use other brands
Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) Any or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)
Culture tubes Fisher Scientific S50712 may use other brands
Eppendorf tubes Fisher Scientific S348903 may use other brands
Gel doc Any
HardyChrom Vibrio agar plates Hardy Diagnostics G319 This study evaluates this medium
Incubator Any
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-606 10 microliter-size was used in this study
NaCl Fisher Scientific BP358-212 may use other brands
Oysters Any
PBS Fisher Scientific R23701 may use other brands
Petri dish Fisher Scientific FB0875713 may use other brands
Pipette and tips Any Sterilized tips
Primers for tlh IDT DNA
Scale Any
Spreader Fisher Scientific 08-100-11 Beads may be used instead
Stomacher blender Stomacher 400 Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.  Other homogenizer can be used.
Sterile filter bags for blenders Fisher Scientific 01-812-5
TCBS powder Hardy Diagnostics 265020 This study evaluates this medium
Thermocycler Any
TSB powder Fisher Scientific DF0370-07-5 may use other brands
UV viewing cabinet Any Emit long-wave UV light
Water bath Any  
 
 
Name Sources Catalog Number Comments
Bacterial species and strains
Aeromonas hydrophila ATCC
Candida albicans ATCC
Campylobacter jejuni ATCC
Escherichia coli ATCC
Proteus mirabilis ATCC
Pseudomonas aeruginosa ATCC
Staphylococcus aureus ATCC
Salmonella Choleraesuis ATCC
Shigella boydii ATCC
Shigella flexneri ATCC
Shigella sonnei ATCC
Vibrio alginolyticus ATCC
V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) FDA, ATCC
V. damsela FDA
V. fisheri Environment
V. fluvialis CDC
V. furnissii CDC
V. hollisae FDA
V. metschnikovii ATCC
V. mimicus FDA
V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) ATCC, FDA, CDC, Environment
V. proteolyticus FDA
V. vulnificus FDA

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References

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