عزل، التمايز، والكمي للالإنسان الأجسام المضادة إفراز خلايا B من الدم: ELISPOT باعتبارها قراءات الوظيفية للالخلطية الحصانة

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University
Published 12/14/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Tzeng, S. J. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity. J. Vis. Exp. (118), e54582, doi:10.3791/54582 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

السمة المميزة للمناعة الخلطية هي لتوليد مخولا لصيانة طائرات وظيفية، التي تجميع وتفرز عبس محددة لمولدات المضادات (حج)، مثل مسببات المرض، وتستخدم للدفاع المضيف. لتحديد الكمي للوضع وظيفي للاستجابة المناعية الخلطية للفرد، يتم قياس كل من القيمة المطلقة المصل ومخولا لصيانة طائرات تعميم عادة باسم قراءات الوظيفية. في البشر، الدم المحيطي هو عينة الأكثر ملاءمة ويمكن الوصول إليها بسهولة والتي يمكن استخدامها لتحديد الاستجابة المناعية الخلطية التي تسببها الخلايا المضيفة (ب). متميزة فرعية B-الخلية، بما في ذلك مخولا لصيانة طائرات، ويمكن أن تكون معزولة مباشرة من الدم المحيطي عبر التحديد مع ميكروبيدات-نسب محددة أب مترافق أو عن طريق الفرز الخلية مع التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، النقاء الخلايا البائية ساذجة والذاكرة يمكن تفعيلها ومتباينة في مخولا لصيانة طائرات في الثقافة. الأنشطة الوظيفية للمخولا لصيانة طائرات للمساهمة في إفراز أب يمكن قياسها كميا بواسطة ELISPOT، وهو فحص أن يتقاطع انزيم-linked فحص immunoabsorbance (ELISA) والتكنولوجيات النشاف الغربية لتمكين تعداد مخولا لصيانة طائرات الفردية على مستوى خلية واحدة. في الممارسة العملية، تم استخدام فحص ELISPOT على نحو متزايد لتقييم نجاعة اللقاح بسبب سهولة التعامل مع عدد كبير من عينات الدم. طرق عزل الخلايا البائية الإنسان من الدم المحيطي، وسيتم وصف تمايز الخلايا البائية إلى مخولا لصيانة طائرات في المختبر، وتوظيف ELISPOT لتقدير حجم إجمالي IgM- و IgG-مخولا لصيانة طائرات هنا.

Introduction

الخلايا باء تلعب دورا محوريا في تطوير مناعة الخلطية. أن تتطور في البداية في نخاع العظم وتدخل مجرى الدم وخلايا ساذجة B، والتي يمكن أن تهاجر إلى الأنسجة اللمفاوية، مثل الطحال والغدد الليمفاوية، واللوزتين، لمزيد من التطوير. على لقاء حج، بعض الخلايا البائية ساذجة تهاجر إلى بصيلات اللمفاوية، حيث مركز جرثومي الخلايا باء يمكن أن تفرق في خلايا الذاكرة بي وplasmablasts (PBS) / خلايا البلازما (أجهزة الكمبيوتر). في حين أن معظم ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر الخروج في مجرى الدم، وعدد قليل يقيمون في نهاية المطاف في نخاع العظام الخضوع التمايز النهائي إلى أجهزة الكمبيوتر طويلة الأمد 1. الخلايا البائية في التداول غير متجانسة، وفي حالة مستقرة، في برنامج تلفزيوني / أجهزة الكمبيوتر نادرة في الدم المحيطي 2. ونتيجة لتوافر علامات سطح-نسب محددة، أصبح التدفق الخلوي وسيلة شعبية لتحديد وتوصيف فرعية B-الخلية في الدم المحيطي. تطبيق موسعة من cytometr تدفقذ هو إضافة وظيفة الخلية فارز، الذي يسمح بفصل وعزل مجموعات فرعية فردية الخلايا البائية مع نقاء عالية. واستنادا إلى التعبير عن مستقبلات سطح محددة في مراحل نمو مختلفة، تصنف تعميم الخلايا البائية الإنسان عموما إلى ثلاث مجموعات سكانية فرعية رئيسية هي: الخلايا البائية ساذجة (CD19 + CD27 - CD38 -)، وخلايا الذاكرة بي (CD19 + CD27 + CD38 -)، و ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (الشكل 1). والخلايا البائية ساذجة بطبيعتها لم تواجه قسم الخدمات الزراعية. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تكون متباينة في الغلوبولين المناعي + CD27 + خلايا الذاكرة بي. على الرغم من أن الخلايا البائية ساذجة متجانسة في التعبير عن مستقبلات المستضد B-الخلية (BCR) جزيئات -associated (على سبيل المثال، CD19، CD20 CD22 و) وهم غير متجانسة في الغلوبولين المناعي ذخيرتهم 5. غالبية CD27 + خلايا الذاكرة بي يمكن أن تكون متباينة في CD27+ / مرحبا CD38 + ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر 6. وبالإضافة إلى ذلك، خلايا الذاكرة بي وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر هي بولكلونل ويحمل التنموي وظيفية التجانس 4-7. ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر في التداول قصيرة الأجل عادة ولا تعبر عن CD138، ولكن تلك التي ليستقر في نخاع العظام سوف يفرق عضال وتصبح طويلة الأمد. الميؤوس أجهزة الكمبيوتر متباينة تعبر عن CD138 وأسفل تنظيم جزيئات CD27 على سطحها 8. لأن كلا من برنامج تلفزيوني وأجهزة الكمبيوتر قادرة على إفراز عبس، في مناسبات عديدة يتم الرمز أنها مجتمعة باسم مخولا لصيانة طائرات. في المقابل، يمكن أن لا الخلايا البائية ساذجة ولا خلايا الذاكرة بي تنتج كميات لا يستهان بها عبس 9-10. ومع ذلك، عندما عزل، سواء ساذجة والذاكرة خلايا B ويمكن التفريق في مخولا لصيانة طائرات في 3-10 أيام عندما وضعت في ظروف التربية الصحيحة 6، 11-15. في الواقع، مخولا لصيانة طائرات المستمدة من في المختبر حصة التمايز تعبيرات سطح مماثلة من CD27 و CD38 مع تلك الاب معزولة مباشرةالدم المحيطي OM 6. بالإضافة إلى ذلك، مخولا لصيانة طائرات متباينة في المختبر تعبر عن تدني مستوى CD20 سطح، على غرار أن تعميم ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر 6. على الرغم من أن مخولا لصيانة طائرات المستمدة من الثقافة كلها لم تدم طويلا، فإنها يمكن أن تفرز عبس، مما يشير إلى أنها المختصة وظيفيا وقادرة على المساهمة في مناعة الخلطية.

كل من إليسا وELISPOT هي الآن الأساليب التطبيقية شيوعا التي للحصول على معلومات وظيفية على الاستجابة المناعية الخلطية. إليسا هو 96-كذلك فحص القائم على لوحة، وكثيرا ما يستخدم لقياس التتر من المصل عبس حج محددة والتحاليل الأخرى (على سبيل المثال، السيتوكينات). أنها مريحة وقابلة لل. تم تصميم ELISA لاستخدام الصلبة مرحلة انزيم فحص للكشف عن وجود عبس أو غيرها من المواد، مثل مصل، في عينة السائل 16. وقد استخدمت قراءات من ELISAs المصل على نطاق واسع لتمثيل الاستجابة المناعية للجسم. أداة ضرورية لاكتساب إعادةadouts من ELISA المقايسات هو قارئ صفيحة الطيفي. يمكن للقارئ أن تحديد الكثافة الضوئية (OD) من المنتجات النهائية عادة ينتج من تفاعل البيروكسيداز الفجل (HRP) -conjugated عبس كشف وركائز الخاصة بها (17). وفيما يتعلق الإبلاغ عن الاستجابة المناعية الخلطية، ومستويات أب المصل يحددها ELISA للدلالة على الجماعي، ولكن ليس الفردي، أداء مخولا لصيانة طائرات في الجسم. وبالإضافة إلى ذلك، ELISA لا يأخذ في الاعتبار مشاركة خلايا B الذاكرة، التي لا تفرز عبس.

مثل إليسا، ELISPOT هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع للكشف ورصد الاستجابة المناعية في عينات الدم الطرفية 17-18. ELISPOT هي تقنية تتعلق شطيرة ELISA. في ذلك، وتوضع الخلايا في difluoride البولي فينيل (PVDF) آبار المدعومة من غشاء من 96 جيدا microplates للثقافة على المدى القصير. مقايسة ELISPOT مشابه لأداء الغربية النشاف على صفيحة والناميهز البقع على غشاء (PVDF) في كل بئر. مطلوب نظام قارئ ELISPOT الآلي أو مجهر تشريحي لالعد والفرز اليدوي. والميزة الرئيسية لELISPOT في الكشف عن رد فعل مناعي هي حساسية فائقة في تقدير حجم مخولا لصيانة طائرات والخلايا المفرزة للخلوى. فإنه تقارير الأنشطة الوظيفية في المناعة الخلطية والخلوية، على التوالي. في قياس وظيفة المناعة الخلطية، ومستويات أب المصل الذي يحدده إليسا وعدد من مخولا لصيانة طائرات تعداد بواسطة ELISPOT وغالبا ما ترتبط، ولكن قراءات البيانات من هذه المقايسات لهما بعض الاختلافات في الآثار الوظيفية 19-20. والميزة الرئيسية لELISPOT هي حساسيته من طريقة. وقدم مستوى التتر أب المصل كما ذكرت من قبل ELISA شبه كميا كما قراءات OD، تدل على مستوى أب النسبي، أو أكثر من الناحية الكمية، وقراءات تركيز عندما يتم تضمين كمية معروفة من isotypes المناسبة من القيمة المطلقة للرجوع إليها. في المقابل، فإن نتائج ELISPOT هي PRESENTEد كما أن العدد المطلق للمخولا لصيانة طائرات في بركة من الخلايا في المصالح (على سبيل المثال، غير المجزأ الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs) والخلايا البائية النقاء من PBMCs). ELISPOT يمكن الكشف عن ASC واحدة، ولكن إليسا يتطلب كميات أب من مخولا لصيانة طائرات للوصول إلى تركيزات تعتمد على الفحص الأمثل قبل القياس. وبالتالي، ELISPOT متفوقة الواضح أن إليسا في حساسية الكمي. وعلاوة على ذلك، ELISPOT هو أيضا مناسبة لقياس في المختبر مخولا لصيانة طائرات متباينة من خلايا الذاكرة B تفعيلها. خلايا الذاكرة بي لا تفرز عبس ولكن يمكن أن تفرق في مخولا لصيانة طائرات على تفعيل. وبالتالي ليس لديهم المساهمة في القيمة المطلقة المصل الكشف عنها بواسطة ELISA. وهكذا، ELISPOT هو الأسلوب المفضل في قياس الاستجابة المناعية للتعميم خلايا الذاكرة بي بعد التنشيط في الثقافة. انها تسمح لرصد من الحفاظ على مناعة الخلطية على المدى الطويل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب الحصول على الدم المحيطي الإنسان من المتبرعين الأصحاء تحت الموافقة المستنيرة، واستخدام عينات الدم يجب أن تتفق مع المبادئ التوجيهية المعتمدة التي وضعتها مجالس المراجعة المؤسسية الفردية. في هذه الدراسة، وبروتوكول لاستخدام الدم البشري في مظاهرة لنتائج التدفق الخلوي (الشكل 1) والمقايسات ELISPOT (الشكل 3) وافق عليها مجلس مراجعة الداخلية من مستشفى جامعة تايوان الوطنية (عدد بروتوكول 201307019RINB).

1. عزل وتنقية الخلايا الطرفية الإنسان الدم B

  1. رسم ~ 10 مل من الدم من الوريد المرفقي المتوسط (في الجزء الأمامي الحفرة المرفقي إلى الكوع) في أنبوب 15 مل تحتوي على K 2 EDTA (1،5-2،0 ملغ / مل دم) وعكس على الفور الأنبوب عدة مرات لمنع تجلط تشكيل.
  2. إضافة 35 مل من تعقيمها (121 درجة مئوية، لمدة 15 دقيقة) خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة (150 ملي NH 4 CL، 10 ملي KHCO و 1 ملي EDTA؛ عH 7.4) إلى الأنبوب الذي يحتوي على عينة من الدم الطازج (≥ 3: 1 المجلد / المجلد)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
    ملاحظة: مظهر انتقال الضوء من خلال أنبوب يشير إلى الانتهاء من RBC تحلل.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج في RT لمدة 5 دقائق. تأكد من أن بيليه هو أبيض اللون.
  4. Resuspend وبيليه مع 10 مل من تعقيمها الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 4.3 ملي نا 2 هبو و 1.47 ملي KH 2 PO ودرجة الحموضة 7.4) وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.3.
  5. تجاهل طاف، resuspend الكرية مع 10 مل من المتوسط ​​1640 RPMI (المكملات الغذائية: 10٪ الجنين مصل العجل، و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين، 0.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، و 2 مم L-الجلوتامين)، ثم طبق من ل خلايا في طبق ثقافة 10 سم (10 مل من الدم في طبق). وضع الطبق في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة.
  6. دوامة بلطف الطبق الثقافة عدة مرات ووضعمستنبت (خلايا تعليق) في 15 مل من البلاستيك أنابيب مخروطية. تجاهل الخلايا الملتصقة (ومعظمهم الضامة) على أطباق الثقافة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج في RT لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
  8. Resuspend وبيليه مع 1 مل من المتوسط ​​1640 RPMI. حساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي.
    ملاحظة: الجدوى من الكريات البيض معزولة هي عادة أكبر من 90٪ من الاستبعاد التريبان الأزرق.
  9. الطرد المركزي كما في الخطوة 1.7 و resuspend الخلايا في ~ 200 ميكرولتر من العازلة الباردة برنامج تلفزيوني (0.5٪ زلال المصل البقري (BSA) و 2 ملي EDTA) في تركيز 5-10 × 10 6 خلية / مل.
  10. إضافة 5 ميكرولتر من المعقدة البيروكسيديز كوكتيل أب مكافحة الإنسان محددة لخلايا الدم (لاختيار السلبية للخلايا B) في 10 6 خلايا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة 21.
    ملاحظة: أب كوكتيل مكافحة الإنسان ينبغي أن تشمل على الأقل عبس محددة لCD2 (أو CD3)، CD14، CD16 و.
  11. إضافة حجم فائض بمقدار 10 أضعافمن برنامج تلفزيوني العقيمة إلى الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف.
  12. إضافة كميات متساوية من ميكروبيدات-streptavidin مترافق (5 ميكرولتر في 10 6 خلايا) إلى بيليه وتخلط جيدا.
  13. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في أنبوب 15 مل من البلاستيك مخروطي.
  14. إضافة 2 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني في أنبوب.
  15. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي واحتضان على RT لمدة 8 دقائق. سوف ميكروبيدات البني إرفاق تدريجيا إلى جدار الأنبوب بجانب المغناطيس 22.
  16. مع أنبوب المتبقية في الوقوف المغناطيسي، ونقل بعناية طاف في معقم جديد أنبوب 15 مل 22.
  17. كرر الخطوات 1،14-1،16، والجمع بين supernatants اثنين التي تحتوي على الخلايا البائية يمسها. تجاهل ميكروبيدات.
  18. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج في RT لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
  19. resuspend الكرية في المتوسط ​​1640 RPMI للتجارب المصب.
    ملاحظة: عادة، 1-5 × 10 5 الخلايا ب خفة دمها نقاء أكبر من 95٪ من 10 مل من الدم المحيطي يمكن عزل 23.

2. تنقية وفصل الذاكرة والسذاجة ب خلايا من خلايا B معزولة

  1. استخدام الخلايا تنقيته من الخطوة 1 وتحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة في برنامج تلفزيوني البارد بعد الطرد المركزي في 600 x ج و RT لمدة 5 دقائق.
  3. إضافة 1-2 ميكروغرام من البيروكسيديز ماب CD27 في 10 6 خلايا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. إضافة 10 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني في أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من العازلة في برنامج تلفزيوني.
  6. إضافة كميات متساوية من ميكروبيدات المغناطيسية streptavidin (1-2 ميكروغرام / 10 6 خلايا) إلى خلايا في أنبوب مخروطي البلاستيك 15 مل.
  7. المزيج بلطف جيد واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  8. إضافة 2-3 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني للأنبوب.
  9. ضع الأنبوب في موقف المغناطيسي واحتضان على RT لمدة 8 دقائق للسماح للميكروبيدات البني لنعلق على الجانب الأقرب إلى المغناطيس.
  10. مع أنبوب في موقف المغناطيسي، ونقل بعناية الكسر طاف في أنبوب معقم الجديد. يحتوي هذا الجزء على CD27 المخصب - الخلايا البائية ساذجة.
  11. إضافة 5 مل إلى الأنبوب الذي يحتوي على ميكروبيدات و resuspend بلطف ميكروبيدات (أي الجزء المخصب من CD27 + خلايا الذاكرة بي) 24-25.
  12. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج في RT لمدة 5 دقائق. Resuspend والكريات مع المتوسط ​​1640 RPMI للتجارب المصب.
    ملاحظة: عادة، ~ 30 - 60٪ من الخلايا البائية يمكن تنقيته من خلايا الذاكرة CD27 + من PBMCs من متبرع سليم 7، 25-26.

3. الفرز الخلية لجمع الخلايا السذاجة B، خلايا الذاكرة B، وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر

  1. استخدام الخلايا تنقيته من الخطوة 1، وتحديد عدد الخلايا باستخدام hemocytomeثالثا أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. resuspend الخلايا في العازلة في برنامج تلفزيوني الباردة في تركيز 10 7 لكل مليلتر في أنبوب البوليسترين 5 مل.
  3. إضافة 1-2 ميكروغرام من مفتش الإنسان في 10 6 خلايا واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة للكتلة لكرة القدم.
  4. إضافة 1 ميكروغرام لكل من مكافحة CD19-APC (استنساخ: HIB19)، ومكافحة CD27-eFluor450 (استنساخ: O323)، ومكافحة CD38-PE (استنساخ: HIT2) في 10 6 خلايا. تخلط جيدا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة 4، 27.
  5. في 5 دقائق الماضي في الخطوة 3.4، إضافة 5 ميكرولتر من 7 aminoactinomycin التجاري D (7-AAD).
  6. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. resuspend الخلايا في فرز عازلة (برنامج تلفزيوني العقيمة مع 2٪ BSA و 2 ملي EDTA) بتركيز 1-5 × 10 7 خلايا لكل مليلتر في أنبوب 15 مل.
  8. تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية شبكة من النايلون (40 ميكرون حجم المسام) للقضاء على كتل الخلايا.
  9. فصل الخلايا مع cytometric نوع تدفقإيه مجهزة ثلاثة الليزر: البنفسجي (405 نانومتر) والأزرق (488 نانومتر)، والأحمر (640 نانومتر).
    ملاحظة: ليزر أزرق وحدها تكفي لمدة 3-اللون قياس التدفق الخلوي 27-28.
  10. نوع الخلايا في ثلاثة أنابيب 15 مل (التي تحتوي على 5 مل من RPMI المتوسطة) لجمع في وقت واحد من الخلايا البائية ساذجة (CD19 + CD27 -)، وخلايا الذاكرة بي (CD19 + CD27 +)، وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر (CD19 + CD27 + / مرحبا CD38 +) 3-4، 28.
    ملاحظة: الترتيب الخلايا البائية ساذجة والذاكرة يمكن أن يكون مثقف كما هو موضح في الخطوة 4.

4. التمايز في المختبر من خلايا معزولة CD19 الإنسان + B، CD19 + CD27 + الذاكرة B الخلايا، وCD19 + CD27 - السذاجة B الخلايا

  1. استخدام الخلايا تنقيته في خطوات 1.19، 2.10، 2.11 و 3.10، وتحديد عدد الخلايا مع عدادة الكريات أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. resuspend الخلايا مع المتوسط ​​1640 RPMIبتركيز من 1 - 10 × 10 5 لكل مليلتر وقسامة لهم في الآبار من لوحة ال 12 أيضا.
  3. إضافة الدليل السياسي الشامل (ODN 2006) في 5 ميكروغرام / 10 6 خلية / مل 18، 29.
  4. ثقافة الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 5 أيام.
  5. حصاد الخلايا من كل بئر، ووضع كل منها على حدة في أنابيب 15 مل، إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني على كل أنبوب، وأجهزة الطرد المركزي لهم في 600 x ج و RT لمدة 5 دقائق.
  6. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو عداد الخلايا التلقائي. resuspend الخلايا بتركيز من 1 - 10 × 10 5 في مل مع RPMI 1640 المتوسطة.

5. ELISPOT الفحص

  1. إضافة 30 ميكرولتر من 35٪ من الإيثانول في الماء المقطر إلى كل بئر من لوحات ELISPOT لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: عندما pipetting ل، وتجنب لمس الغشاء في الآبار في جميع الأوقات.
  2. عكس لوحات ELISPOT لإزالة الإيثانول.
  3. وضع 150 ميكرولتر من ده تعقيمها 2 O في كل بئر واحتضانلهم في RT لمدة 5 دقائق لطرد قبالة الإيثانول المتبقية. اتبع مع غسل من برنامج تلفزيوني العقيمة في RT لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: الخطوات 5،1-5،3 قد يكون اختياري، وهذا يتوقف على تصنيع لوحات.
  4. وضع 50 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل بولكلونل F (أ ب ') 2 جزء من مكافحة الإنسان الإيج (مفتش + الغلوبولين المناعي + ايغا) (في برنامج تلفزيوني) في كل بئر من لوحات ELISPOT واحتضان لهم عند 4 درجات مئوية خلال الليل (المفضلة) أو 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة 11.
    ملاحظة: ختم حواف الصفائح مع بارافيلم حتى الاستخدام.
  5. عكس لوحات لإزالة عبس غير منضم، إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على كل جانب، واحتضان لهم مرتين في RT لمدة 3 دقائق في كل مرة.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 5٪ BSA (أو المتوسط ​​1640 RPMI) إلى كل بئر من أجل الحيلولة دون واحتضان لهم في RT لمدة 2 ساعة.
  7. عكس لوحات لإزالة عازلة تمنع. يغسل كل مرتين جيدا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، كما في الخطوة 5.5.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​1640 RPMI إلى كل بئر واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية.
  9. عندما تصبح جاهزة للبذور الخلايا، عكس لوحات لإزالة المتوسطة RPMI 1640.
  10. البذور 100 ميكرولتر (5 × 10 4)، 50 ميكرولتر (2.5 × 10 4)، و 25 ميكرولتر (1.25 × 10 4) من الخلايا (من الخطوات 1.19، 2.10، 2.11، 3.10، و 4.6) في الآبار ل ELISPOT لوحة. مع RPMI 1640 المتوسطة، وتحقيق وحدة التخزين إلى 150 ميكرولتر / جيد.
    ملاحظة: ما لا يقل عن واحد أو اثنين من التخفيفات المسلسل 2 أضعاف لطلاء الخلايا يوصى.
  11. احتضان لوحات في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ل8-14 ساعة 18. تجنب نقل لوحات أثناء الحضانة.
  12. عكس لوحات لإزالة الخلايا والمتوسط ​​1640 RPMI.
  13. إضافة 200 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني-T (برنامج تلفزيوني مع توين 20 0.05٪)، واحتضان لهم 5 مرات في RT، في كل مرة لمدة 3 دقائق. عكس لوحة لإزالة غسل العازلة بين كل من 5 يغسل.
  14. إضافة إما الماعز مكافحة الإنسان الفوسفاتيز القلوية مفتش-(ا ف ب)، وتقاسم المنافع Fcγ محددة (للكشف مفتش، 1: 5000 في برنامج تلفزيوني-T) أو الماعز مكافحة الإنسان الغلوبولين المناعي-AP، Fcμ-جزء محدد القيمة المطلقة (للكشف عن الغلوبولين المناعي، 1: 5000 في برنامج تلفزيوني-T) في الآبار المعينة واحتضانها في RT لمدة 2 ساعة في الظلام.
  15. يغسل كل مرتين جيدا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، كما في الخطوة 5.5.
  16. إضافة 50 ميكرولتر / بئر bromochloroindolyl فوسفات نيترو نتروبلو الأزرق (BCIP / NBT) حل الركيزة. تظهر بقع أرجوانية اللون عادة في 5-15 دقيقة.
  17. إضافة 100 ميكرولتر / بئر [ده 2 O لمنع الإفراط في تطوير المواقع.
  18. شطف لوحات مع تشغيل ماء الصنبور بعد تطوير كاملة لجميع البقع.
  19. إزالة underdrain من لوحات والسماح لهم الهواء الجاف في الظلام.
  20. عدد النقاط باستخدام قارئ لوحة الآلي مع وحدة الحصول على الصور / التحليل (على سبيل المثال، ماسح تلقائي أو يدويا عن طريق مجهر تشريح).
    ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في RT في الظلام وتحليلها في وقت لاحق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استنفاد PBMCs من كرات الدم الحمراء وخلايا ملتصقة (الخطوات 1،2-1،7). تعرض قسامة (2 × 10 6) من الخلايا لتحليل تدفق cytometric لتوضيح سكان خلايا ساذجة B، خلايا الذاكرة بي، وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر في الدم المحيطي (الشكل 1). في PBMCs هذه الجهة المانحة، فإن حوالي 10٪ من الخلايا الليمفاوية CD19 + B الخلايا. في مقصورة B-الخلية، نسبة CD19 + CD27 - كانت الخلايا البائية ساذجة حوالي 50٪. من ناحية أخرى، كان حوالي 50٪ من الخلايا CD19 + B CD27 + ذاكرة الخلايا ب 7، 25-26. وتجدر الإشارة، CD27 + خلايا الذاكرة بي يمكن زيادة فصل مع إدراج من الجمعية الإسلامية 4. النمط الظاهري تعميم ميزانيتي يمكن أفضل محددة مع انخفاض أو أي تعبير سطح CD20 (CD19 + CD27 + / مرحبا CD38 + CD20 لو / -) 30-31. استبعاد الخلايا الميتة، و7-AAD يمكن تضمينها في الخلية تلطيخ (الخطوة 3.5)، ومؤامرة للFSC مقابل 7-AAD يسمح النابضة السكان من الخلايا الحية (7-AAD -).

وصفت الخطوات الرئيسية للمقايسة ELISPOT في الشكل 2. سواء كانت النقاء الخلايا البائية الإنسان وCD19 + CD27 + خلايا الذاكرة بي مثقف في وجود الدليل السياسي الشامل مع المتوسط 1640 RPMI لمدة 5 أيام. وكان حصاد الخلايا لفحص ELISPOT لقياس مخولا لصيانة طائرات ظهرت حديثا. إذا كان موجودا، عزل ميزانيتي القائمة من قبل من الدم المحيطي سيموت في 48 ساعة 11. تم إجراء فحص ELISPOT، وأظهرت الصور البقعة التي حصل عليها لوحة الماسح الضوئي التلقائي في الشكل (3). نتائج ELISPOT عادة سوف تظهر 50-200 الغلوبولين المناعي-مخولا لصيانة طائرات من 10 4 ب الخلايا تعامل مع الدليل السياسي الشامل لمدة 5 أيام، في حين أن عدد مفتش-مخولا لصيانة طائرات و10-50 في 10 4 خلايا (11).

EP-together.within الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1. رسم توضيحي لاستراتيجية المحاصرة لفصل الخلايا السذاجة B، خلايا الذاكرة B، وميزانيتي في PBMCs. (A) خلايا (2 × 10 6) كانت ملطخة مع 2 ميكروغرام لكل من CD19-APC، CD27-eFluor450، وCD38-PE MABS (الخطوة 3.4). تم بوابات مقصورة الخلايا اللمفاوية (G1) على النقطة مؤامرة لنثر الأمام (FSC) مقابل تشتت الجانب (SSC). (ب) الحلل الخليوي، التي يتم تشكيلها من قبل اثنين من خلايا ملتصقة ببعضها البعض استبعدت، (تلك G2 الخارجي) على مؤامرة لFSC-W (العرض) مقابل FSC-H (الارتفاع). تم بوابات (C) خلايا CD19 + B كما G3 على مؤامرة لSSC-A (منطقة) وCD19-APC. (د) من CD19 + الخلايا، مؤامرة نقطة من المعلمات CD27 و CD38 أظهر خلايا ساذجة ب (CD19 + CD27 Q1 و Q4)، وخلايا الذاكرة بي (CD19 + CD27 +.Q2 و Q3)، وبرنامج تلفزيوني (CD19 + CD27 + / مرحبا CD38 G4، و 0.6٪ من Q2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الرسوم التوضيحية للخطوات الرئيسية للELISPOT الفحص. (أ) ضع 50 ميكرولتر / جيد (5 ميكروغرام / مل) من F (أ ب ') 2 جزء من مكافحة الإنسان الإيج (مفتش + الغلوبولين المناعي + ايغا) في لوحة ELISPOT لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات C (المفضلة) (الخطوة 5.4). البذور الخلايا في الآبار من لوحة ELISPOT. السماح للمخولا لصيانة طائرات لنعلق على غشاء PVDF وتفرز عبس لل8-14 ساعة (الخطوة 5.11). (ب) يغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني (مع 0.05٪ توين 20). (C) إضافة املوافقة أو HRP-حرف عطفكشف ugated ABS محددة إما مفتش أو الغلوبولين المناعي. (D) يغسل وعبس الكشف التي هي غير منضم. (E) وضع البقع بمحلول الركيزة ا ف ب أو HRP لتتناسب مع القيمة المطلقة الكشف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. نتائج ELISPOT من لوحة التمثيلية. وضعت (أ) الخلايا تنقية CD19 + B إلى ثلاث الآبار المجاورة (50،000 الخلايا في بئر رقم 1، 25000 الخلايا في بئر رقم 2، و12،500 الخلايا في بئر رقم 3، على التوالي) من لوحة ELISPOT. كانت خلايا ثم تربيتها في RPMI 1640 متوسطة بين عشية وضحاها (~ 14 ساعة). تم إجراء فحص ELISPOT بعد الانتهاء من ثقافة (الخطوات 5،12-5،18). ليحللالبريد النتائج، وتفحص لوحة ELISPOT للحصول على الصور عن طريق محلل التلقائي مجهزة مع الماسحة الضوئية والبرمجيات. خلايا الذاكرة (ب) تنقية CD19 + CD27 + (10 6 / مل) كان المثقف في وجود 5 ميكروغرام / مل من الدليل السياسي الشامل لمدة 5 أيام. تم علاج الخلايا كما في الفقرة (أ) للمقايسة ELISPOT. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عزل وتنقية الخلايا الطرفية الإنسان الدم B

عادة، كرات الدم الحمراء يمكن أن تمزق بكفاءة وبرأت التي تحلل العازلة (الخطوة 1.2). ومن المهم عدم احتضان PBMCs مع العازلة تحلل RBC أطول من 5 دقائق، وبقاء الخلية قد تتأثر كلوريد الأمونيوم. بدلا من ذلك، كرات الدم الحمراء والصفائح الدموية يمكن إزالتها في وقت واحد بواسطة بروتوكول التالي.

خلط الدم الطازج كامل مع (ACD) عازلة حمض سترات سكر العنب (39 ملم حمض الستريك، 75 ملي سترات الصوديوم، و 135 سكر العنب ملي، ودرجة الحموضة 7.4) في نسبة حجم 9: 1، والدم إلى العازلة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. إيلاء الاهتمام لتشكيل طبقات، مما يدل على الانفصال. نضح وتجاهل الطبقة العليا، والذي يحتوي على الصفائح الدموية والبلازما الغنية بالصفائح الدموية (اللون الأصفر). إزالة الطبقة الوسطى رقيقة في واجهة، والتي تحتوي على PBMCs .ه-، ومعطف الشهباء). تجنب التلوث من كرات الدم الحمراء في الطبقة السفلية (دسفينة اللون الأحمر). إضافة العازلة تحلل إلى PBMCs لإزالة كرات الدم الحمراء المتبقية، ثم اتبع الخطوات 1،2-1،19.

نهجين يمكن استخدامها لعزل الخلايا البائية من PBMCs: الإيجابية والسلبية اختيار 21. طريقة اختيار السلبية (الخطوات 1،1 حتي 1،19) يستخدم للحصول على يمسها، الخلايا البائية وظيفية، مع عدم وجود عبس المربوطة أو ميكروبيدات، لإجراء التجارب المصب. ومن الأهمية بمكان أن تأخذ ذلك في الاعتبار عند حدوث التنشيط و / أو تمايز الخلايا البائية تنقيته في الثقافة. ما يثير القلق هو أن الخلايا تنقيته عن طريق الانتقاء إيجابية قد تتأثر بشكل غير مقصود من قبل ميكروبيدات ماب مترافق (0،2-5 ميكرون في القطر). يمكن MABS ربط مستقبلات معينة على الخلايا باء وبالتالي قد تشعبي مستقبلات للتنشيط. وعلاوة على ذلك، ميكروبيدات يمكن endocytosed من قبل خلايا B من خلال مستقبلات ملزمة. على الرغم قابلة للتحلل، يمكن للميكروبيدات البقاء داخل الخلايا لمدة أطول من أسبوع. ما إذا كان الاحتفاظ ميكروبيدات ستؤثر من experiتحتاج إلى أن تحدد تجريبيا النتائج العقلية. في تنقية الخلايا البائية الإنسان عن طريق اختيار إيجابية، ومكافحة CD19 (استنساخ: 4G7 أو HIB19) وتستخدم عادة ميكروبيدات لأن يتم التعبير عن CD19 على نطاق واسع في جميع أنحاء مراحل تطور الخلايا البائية. نقاء الخلايا البائية بعد الانفصال يمكن تحديد التدفق الخلوي مع anti-CD19 MABS (استنساخ: SJ25C1 أو LT19)، والتي تعترف الحواتم متميزة من ميكروبيدات مكافحة CD19.

تنقية وفصل الذاكرة والسذاجة ب خلايا من خلايا B معزولة

CD27 هو علامة السطح مقبولة على نطاق واسع للذاكرة الإنسان والسذاجة B خلية التمييز 24. جزيء CD27 ينتمي إلى أسرة عامل نخر الورم مستقبلات (TNFR). لأنه يتم التعبير عن CD27 على معظم خلايا الذاكرة بي الإنسان، وهي تستخدم عادة للتمييز بينها وبين CD27 - الخلايا البائية ساذجة. ومع ذلك، لأن أعرب CD27 أيضا على خلايا T والخلايا القاتلة الطبيعية، واستخدام microbea مكافحة CD27س (استنساخ: O323) في اختيار إيجابيا خلايا الذاكرة بي يتطلب تنقية مسبقة من الخلايا البائية (الخطوات 1،1 حتي 1،19). لفحص نقاء بعد الانفصال، MABS محددة لCD27 الإنسان: ينصح (استنساخ L128 أو LG.3A10) (الخطوة 2.12). لأن CD27 + B الذاكرة خلايا غير متجانسة، علامات سطح إضافية، مثل الجمعية الإسلامية وFCRL4، ويمكن اعتبار لمزيد من فصل في الخلية الفرز 4 و 7.

الفرز الخلية للحصول على خلايا السذاجة B، خلايا الذاكرة B، وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر

لأن الخلايا البائية تعبر عن FcγRIIB، لذا ينصح باستخدام أي كتلة التيسير (الخطوة 3.3) قبل تلطيخ الخلايا مع MABS لالتدفق الخلوي. شظايا التيسير للمفتش الإنسان وحده يستطيع ان يصد بالتساوي كذلك مفتش البشري كله في 1 ميكروغرام / 10 6 خلايا. مكافحة الإنسان CD32 ماب (استنساخ: 3D3 أو AT10) هي خيار آخر للكتلة لكرة القدم. وتجدر الإشارة، إذا FcγRIIB هو علامة السطح لتكون ملطخة في الخلايا البائية تنقيته، ومكافحة CD32 ماب SH-fluorophore مترافقولد تضاف إلى التنازل عن كتلة التيسير، تليها تلطيخ مع MABS أخرى دون غسل برنامج تلفزيوني.

لثلاثة ألوان التدفق الخلوي، CD38-FITC (فلوريسئين)، CD27-PE (فيكوإيريترين)، وCD19-APC (Allophycocyanin) هي مزيج نموذجي من fluorophores ومع ذلك، إذا تم تجهيز فارز تدفق cytometric مع ثلاثة أشعة الليزر، مثل تلك التي من 405 نانومتر، 488 نانومتر و 640 نانومتر، ثم يكون الباحثون الفاخرة لاختيار fluorophores متحمس ليزر مختلفة لفرز الخلايا. كما هو موضح في الشكل رقم تم صبغ الخلايا مع CD19-APC (استنساخ: HIB19)، CD27-eFluor450 (أي ما يعادل المحيط الهادئ الأزرق، استنساخ: O323)، وCD38-PE (استنساخ: HB7) لفصل الخلايا البائية ساذجة والذاكرة الخلايا باء، وبرنامج تلفزيوني. من المذكرة، وبعض الباحثين يفضلون إدراج CD45 (استنساخ: HI30) كعلامة الكريات البيض النسب والخلايا بوابة B كما CD45 + CD19 + السكان. لأن كشف من برنامج تلفزيوني في الدورة الدموية في حالة مستقرة هو عشية نادرةالإقليم الشمالي في الاشخاص الاصحاء، وانخفاض أو حتى أي التعبير سطح CD20 في برنامج تلفزيوني (CD19 + CD27 + / مرحبا CD38 + CD20 لو / -) يجسد على حسن النية وجود 30-31. وهذا مفيد عندما يتم مقارنة نتائج القياس الكمي من برنامج تلفزيوني من الظواهر السطحية ومخولا لصيانة طائرات من المقايسات ELISPOT. خلال الفترة السابقة على الخلية الفرز، ويفضل 7-AAD ليوديد propidium لاستبعاد الخلايا الميتة، نظرا لطيف الانبعاث أضيق وأقل انتشار في متعدد الألوان التدفق الخلوي.

في المختبر تحفيز وتمايز الخلايا المعزولة B الإنسان

نوع B الدليل السياسي الشامل (ODN 2006) وحده يمكن أن تحدث التمايز محدود من كلا IgM- و IgG-مخولا لصيانة طائرات من خلايا الذاكرة بي. وعلاوة على ذلك، الخلايا البائية ساذجة ليست سوى استجابة ضعيفة إلى الدليل السياسي الشامل وأساسا تثير الغلوبولين المناعي-مخولا لصيانة طائرات 6 و 11. تركيز الدليل السياسي الشامل في الثقافة هو في حدود 2.5 - 5 ميكروغرام / مل لكل 10 6 B الخلاياأو PBMCs 11 و 18. بخلاف الدليل السياسي الشامل، الخلايا البائية تنقيته وPBMCs يمكن تربيتها في وجود مجموعات من الدليل السياسي الشامل مع mitogens، السيتوكينات، ومنبهات BCR، لتميز الخلايا البائية الإنسان في مخولا لصيانة طائرات في الثقافة (الخطوة 4.3). على سبيل المثال، التي يشيع استخدامها وصفات ل10 6 خلايا لكل مل يلي: (أ) الدليل السياسي الشامل (5 ميكروغرام / مل)، المؤتلف الإنسان IL-2 (10 نانوغرام / مل)، والمؤتلف الإنسان IL-10 (10 نانوغرام / مل) 15، 34؛ (ب) الدليل السياسي الشامل (5 ميكروغرام / مل) و F (أ ب ') 2 أجزاء من الإيج مكافحة الإنسان (مفتش + الغلوبولين المناعي + ايغا) (20 ميكروغرام / مل) 11؛ (ج) الدليل السياسي الشامل (5 ميكروغرام / مل) والبروتين (أ) من بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية كوان (SAC) (1: 10000 التخفيف)، والفتلاق mitogen (PWM) (1: 100،000 تمييع) 18. (د) المؤتلف الإنسان IL-21 (100 نانوغرام / مل) وsCD40L المؤتلف (1 ميكروغرام / مل) 12، 15، 33؛ و (ه) المؤتلف الإنسان IL-2 (10 نانوغرام / مل) وR848 (1 ميكروغرام / مل)، وTLR7 ناهض 33-34. على الرغم من أن الخلايا باء يمكن أن تكون متباينة في مخولا لصيانة طائرات في ثلاثة أيام 11، الخلايا بشكل عام ما قبل الصورةtimulated لمدة 5 إلى 6 أيام قبل إضافتها إلى لوحة ELISPOT لتقدير حجم مخولا لصيانة طائرات 11 و 18. خلال الفترة الثقافة، وعادة ما يكون هناك تجديد وكلاء التمايز البدء.

إضافة IL-2 و IL-10 إلى الدليل السياسي الشامل التي تحتوي على الثقافات يمكن أن تزيد بشكل كبير من عدد من يفرق IgM- و IgG-مخولا لصيانة طائرات 15، 35. وجود IL-2 في الثقافة يمكن أن يوفر تحفيز مولد للتفتل لتسهيل التوسع في الخلايا البائية متباينة من الدليل السياسي الشامل. IL-10 في نطاق 10-25 نانوغرام / مل يمكن أن يزيد بدرجة كبيرة من إنتاج مخولا لصيانة طائرات (~ 3- إلى 10 أضعاف) في وجود الدليل السياسي الشامل 35. منبهات BCR، بما في ذلك مكافحة BCR وSAC، وPWM يمكن أيضا أن يحفز تكاثر الخلايا B الإنسان الأساسي 18. احتضان خلايا الذاكرة بي مع الدليل السياسي الشامل وبولكلونل مكافحة BCR ناتج أساسا عن زيادة في الغلوبولين المناعي-مخولا لصيانة طائرات ولكن ليس في مفتش-مخولا لصيانة طائرات 28. للوقاية من تثبيط إشارات من خلال BCR التي كتبها FcγRIIB، واو (أ ب &# 39؛) 2 جزء من مكافحة الإيج (10-20 ميكروغرام / مل لكل 10 6 خلايا) يوصى عندما يشابك BCR 11. بدلا من بولكلونل مكافحة الإيج، ينبغي النظر MABS مكافحة BCR محددة إما الغلوبولين المناعي + أو مفتش + B الخلايا لاستهداف مجموعات فرعية B-خلية نمط إسوي محددة للتمايز في مخولا لصيانة طائرات. مزيج من الدليل السياسي الشامل، SAC (1: 10000 التخفيف)، وPWM (1: 100،000 تمييع) يمكن تفعيل كفاءة خلايا الذاكرة بي على التمايز إلى IgM- و IgG-مخولا لصيانة طائرات 18، 24. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الدليل السياسي الشامل لحث معتدلة التبديل فئة الإيج في المختبر 28-29. في المقابل، IL-21 (100 نانوغرام / مل) وsCD40L (1 ميكروغرام / مل) لحث على نحو فعال الذاكرة بي تمايز الخلايا حصرا لتحول مفتش-مخولا لصيانة طائرات 12، 30. وsCD40L يمكن تنشيط خلايا B عن طريق محاكاة مساعدة T-الخلية من خلال CD40 على الخلايا البائية، والتأثير على التمايز بهم إلى أجهزة الكمبيوتر في الجسم الحي. من المذكرة، ومكافحة CD40 (استنساخ: 89 أو G28.5) يمكن أن تكون بديلا عن sCD40L في الثقافة 15. Howevإيه، لا sCD40L ولا مكافحة CD40 وحدها قادرة على إحداث تمايز خلايا الذاكرة ب. وهكذا، وتفعيل CD40 الخلايا البائية مثقف في كثير من الأحيان جنبا إلى جنب مع وكيل التمايز، مثل IL-4، الدليل السياسي الشامل، R848، أو IL-21، أي من التي يمكن أن تعزز التحول الطبقة الإيج. يلعب IL-4 دورا رئيسيا في تمايز الخلايا TH2 CD4، والسماح للتحريض معظم الخلايا الغلوبولين المناعي + B للتبديل إلى خلايا IgG1 + B في الثقافة. وبالمثل، في حضور IL-21، كل من خلايا B الذاكرة والخلايا البائية ساذجة تفرق حصرا إلى مخولا لصيانة طائرات تبديل الدرجة 12، 32. مثل الدليل السياسي الشامل، ويمكن R848 لحث على التحول الطبقة الهامشية من الخلايا البائية (34). وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من lipopolysaccharide في (LPS) يمكن أن تحفز على نحو فعال تمايز خلايا فأر B إلى مخولا لصيانة طائرات، الخلايا البائية الإنسان تعبر عن مستويات منخفضة من TLR4 وCD14 29. لأن إضافة عامل التمايز في ثقافة تشجع جيل من الخلايا البائية تحول، وينبغي تجنب هذه الإضافةعندما ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر الموجودة مسبقا أو خلايا الذاكرة بي unswitched يتم قياس.

ELISPOT الفحص

مقايسة ELISPOT يجمع ELISAs القائم على لوحة بتقنيات النشاف الغربية التي تعتمد على الأغشية، مما يسمح للكشف عن القيمة المطلقة يفرز من قبل خلايا B واحدة (18). كما تم تكييف ELISPOT لتحديد خلايا تي جي الخاصة التي تفرز السيتوكينات 17، 36. في مقايسة ELISPOT، إما خلايا النقاء أو PBMCs غير المجزأ (خالية من كرات الدم الحمراء) يمكن استخدامها. ومع ذلك، ~ 10 أضعاف الحاجة إلى مزيد من PBMCs من خلايا النقاء للحصول على نتائج متسقة في المقايسات ELISPOT. وهناك نقطة انطلاق جيدة 1-2 × 10 5 خلايا لكل بئر للكشف عن مخولا لصيانة طائرات المتداولة في PBMCs. في الكشف عن حج محددة مخولا لصيانة طائرات، يتم استبدال مكافحة الإيج عادة حج (5-10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) لالتقاط حج محددة ACSS (الخطوة 5.4). استخدام-نمط إسوي محدد الكشف عن القيمة المطلقة يسمح بالتمييز بين الغلوبولين المناعي-مخولا لصيانة طائرات حج محددة ومفتش نمط إسوي-مخولا لصيانة طائرات (خطوة 5.14). وتجدر الإشارة، بغض النظر عن ما إذا كان يتم استخدامها لمكافحة الإيج أو حج لالتقاط مخولا لصيانة طائرات، وعبس الكشف المستخدمة لإليسا قد لا تكون دائما مناسبة للELISPOT. وبالمثل، ليس كل ركائز لون ELISA تعمل بشكل صحيح في ELISPOT. تستخدم املوافقة وعبس HRP مترافق الأكثر شيوعا للكشف عن بقعة في ELISPOT. الحل الركيزة BCIP / NBT هو خيار شعبي للكشف على أساس AP، في حين أن 3،3 '، 5،5'-ميثيل-البنزيدين (تمب) و 3-أمينو-9-ethylcarbazole حلول (AEC) هي ركائز مشتركة لبرنامج الصحة الإنجابية في ELISPOT. إذا كان مترافق ا ف ب أو HRP مباشرة إلى عبس الكشف، هناك حاجة إلى خطوة واحدة فقط للكشف، كما هو موضح في البروتوكول (الخطوة 5.14). في المقابل، البيروكسيديز وعبس كشف وتتطلب التي تلت ذلك الحضانة مع املوافقة أو streptavidin HRP-مترافق قبل التفاعل مع ركائز في طريقة من خطوتين. كلتا الطريقتين من خطوة واحدة وخطوتين تعمل بكفاءة للكشف عن بقع في ELISPOT.

مقايسة ELISPOT يمكن الكمي ليس فقط circulatجي ولكن أيضا متباينة مخولا لصيانة طائرات في الثقافة (خطوة 1.19 مقابل 4،6). إذا كان موجودا، وتعميم مخولا لصيانة طائرات، والتي تعيش عادة لا تزيد عن يومين في الثقافة، ويمكن أن يكون مثقف مباشرة في لوحة ELISPOT، مع أو بدون تنقية من PBMCs 11. في المقابل، فإن التمايز للخلايا الذاكرة بي يتطلب 5 أيام. وبالتالي، زراعة المباشرة في لوحات ELISPOT بعد زنزانة انفرادية (الخطوة 1.19) لا ينصح. حطام خلية ميتة من الفترة الممتدة الثقافة يمكن أن تزيد من خلفية في كشف النقاط. بدلا من ذلك، على حد سواء الخلايا البائية النقاء ومجموع PBMCs يمكن أن يكون أول مثقف في 6 جيدا أو 12-جيدا لوحة في وجود mitogens وكلاء التمايز (الخطوة 4.3). أثناء عملية الثقافة، إضافة المتكررة من وكلاء التحفيز غير ضرورية (الخطوة 4.3). في حين لوحات هي في الحاضنة، من باب الحاضنة يجب فتح بلطف وأغلقت لمنع مخولا لصيانة طائرات المصنفة من التحرك، لأنها يمكن أن تنتشر عبس يفرز على طول مسارات التحرك، وتوليد البقعمع ذيول (ما يسمى "مثل المذنب" نقاط) (الخطوة 5.11). يتم تحديد فترة الحضانة في لوحات ELISPOT من الوقت اللازم للحصول على الخلايا على إفراز كميات ملحوظة من القيمة المطلقة دون السماح للانقسام الخلايا، والذي من شأنه أن يخلق صعوبات في العد الفور. وهكذا، والخلايا وعادة ما تكون مثقف في حدود 8 ساعات ليلة وضحاها (الخطوة 5.11).

مقايسة ELISPOT هو الأسلوب الأكثر استخداما على نطاق واسع لقياس استجابة خلايا الذاكرة بي. لقد أصبحت شعبية، قراءات مستقلة من الاستجابة المناعية الخلطية والذاكرة المناعية. في الممارسة العملية، مطلوب ثقافة مولد للتفتل السابقة لتنشيط خلايا الذاكرة بي للتمايز في مخولا لصيانة طائرات (خطوة 4.3). ومع ذلك، فإن التردد الذي خلايا الذاكرة بي توسيع وتفرق في مخولا لصيانة طائرات يختلف في الوسط ثقافة مختلفة، كما هو موضح أعلاه. على الرغم من دون إجماع، فإن معظم الباحثين تعتمد حالة تحريض والتى تزيد من إنتاج مخولا لصيانة طائرات. من حيث عامل تستخدم لdetectio بقعةن، يمكن للالبيروكسيديز حج قابل للذوبان استبدال غير مرض كشف أب دون المساس حساسية 37. ولهذا الأمر أهمية خاصة عند توافر حج محدودة وذلك لأن هناك حاجة إلى كمية أقل بكثير من حج للكشف عن من لطلاء لوحات. وأخيرا، ELISPOT لا يسمح تحليل المظهري من عدم التجانس الخلوية، وبالتالي يتطلب تجزئة مسبقة من القطعان الخلية. في الآونة الأخيرة، وهو متعدد الألوان ELISPOT مقايسة، والتي وصفت الكشف عن القيمة المطلقة مع fluorophores مختلفة، وقد تم تطويرها للكشف عن أنواع متعددة من الخلايا المفرزة للخلوى في بئر واحدة 38-39. هذه التكنولوجيا الجديدة سوف تكون ذات فائدة خاصة للكشف عن خلايا التردد المنخفض في PBMCs ولتحليل واسع النطاق من ردود B-الخلية التي يسببها اللقاح.

لأن فحص ELISPOT بسرعة وكفاءة في قياس مخولا لصيانة طائرات والخلايا المفرزة للخلوى، وقد تم تمديده لقياس وظائف التع ليس فقطlating الخلايا الليمفاوية، ولكن أيضا الخلايا المناعية الأنسجة مثل الكريات البيض داخل الكبد 40. بسبب حساسيتها تصل إلى مستوى الكشف حتى ASC واحدة، وقد استخدمت مقايسة ELISPOT على نحو متزايد لقياس الاستجابات المناعية الإنسان إلى كفاءات لقاح ضد مسببات الأمراض القائمة والناشئة. على الرغم من أن أداء الإنتاجية العالية ومتانة ELISPOT مقايسة ورائع لتقييم نطاق واسع من الاستجابات المناعية باستخدام PBMCs، نتائج فحوصات يمكن أن تتأثر بعوامل مختلفة، مثل تأخير تجهيز العينات، ما إذا كانت الخلايا الطازجة أو المجمدة ، مكونات المصل في مستنبت، وعدد الخلايا تضاف إلى لوحة ELISPOT 41. وبالتالي، ينبغي إدراج إجراءات التطبيع في بروتوكول ELISPOT لتقليل الاختلافات البينية وبين الفحص في نطاق واسع ودراسات المتابعة طولية (على سبيل المثال، تجارب على لقاح). طريقة تطبيع لوحة القراءة أمر بالغ الأهمية أيضا لالخطي، والدقة، وسلبياتistency في فحص النتائج 41-42. طريقة واحدة لأداء تطبيع لوحة القراءة تمديد الداخلي للتخفيف التسلسلي الخلايا المزروعة لوحات ELISPOT (الخطوة 5.10). عن طريق إنشاء لوحة الإشارة، ينبغي لمزيد من التخفيفات المسلسل يبرهن على وجود علاقة خطية بين أعداد الخلايا مطلي لكل بئر والتهم نقطة لكل بئر. المسح المتكرر لوحة ELISPOT يمكن استخدامها للتحقق من صحة قالب العد بقعة، على حد سواء يدويا وآليا. ومن المتوقع الحد الأدنى من التباين داخل بئر في التهم نقطة بعد إجراءات تطبيع هذه 43. وأخيرا، يمكن تمديد تطبيق ELISPOT في نواح كثيرة، مثل لرصد ردود علاج المرضى الذين يعانون من التهابات وأخذ المناعية السرطان، وكذلك لتقييم المناعية (على سبيل المثال، كبت المناعة والمناعة الذاتية الناجمة عن المخدرات).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer K2E BD Biosciences 367525 10 mL tube
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02 endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution Biological Industries 03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set BD Biosciences 558007
Biotinylated CD27 mAb Biolegend 302804 clone O323
Streptavidin magnetic microbeads BD Biosciences 9000810
15 mL Falcon tubes BD Falcon 352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm BD Falcon 352340
Anti-human CD19-APC Biolegend 302212 clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450 eBioscience 48-0279-42 clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7 Biolegend 303516 clone HIT2 
Anti-human CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 clone HIT2 
Anti-human CD45-FITC Biolegend 304006 clone HI30
Anti-human CD45-FITC BD Biosciences 555482 clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 Biolegend 124213 clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 clone L128
Anti-human CD19-FITC Miltenyi Biotec 130-098-064 clone LT19
Anti-human CD19-FITC GeneTex GTX75599 clone LT19
Anti-human CD20-FITC BD Biosciences 555622 clone 2H7
biotinylated anti-human CD27 Biolegend 302804 clone O323
biotinylated anti-human CD27 eBioscience 13-0279-80 clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Biosciences 559925
CpG (ODN 2006)  InvivoGen tlrl-2006 type B CpG
Recombinant human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant human IL-10 PeproTech 200-10
Recombinant human IL-21 PeproTech 200-21
Recombinant human sCD40L PeproTech 310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC) Sigma-Aldrich 82526
Pokeweed mitogen (PWM) Sigma-Aldrich L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size Merck Millipore MSIPS4510 sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution Sigma-Aldrich B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate Merck Millipore ES006
Human IgG Jackson ImmunoResearch 009-000-003
Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) Jackson ImmunoResearch 109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-043
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit BD Biosciences 551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer C.T.L.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29, (4), 264-284 (2015).
  2. Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105, (4), 1614-1621 (2005).
  3. Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
  4. Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20, (1), 67-82 (2008).
  5. Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78, (Suppl 1), S47-S60 (2010).
  6. Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109, (4), 1611-1619 (2007).
  7. Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
  8. Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
  9. Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
  10. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15, (3), 149-159 (2015).
  11. Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
  12. Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175, (12), 7867-7879 (2005).
  13. Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7, (1), e29806 (2012).
  14. Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298, (5601), 2199-2202 (2002).
  15. Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175, (3), 671-682 (1992).
  16. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. (2001).
  17. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13, (4), 259-263 (1994).
  18. Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286, (1-2), 111-122 (2004).
  19. Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7, (2), 403 (2016).
  20. Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34, (19), 2281-2289 (2016).
  21. Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. (2011).
  22. Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722, (1-2), 33-53 (1999).
  23. Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162, (2), 271-279 (2010).
  24. Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. (2003).
  25. Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188, (9), 1679-1689 (1998).
  26. Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167, (7), 3610-3618 (2001).
  27. Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. (2003).
  28. Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26, (2), 172-177 (1996).
  29. Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36, (4), 810-816 (2006).
  30. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4, (3), 372-384 (2009).
  31. Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95, (6), 1016-1020 (2010).
  32. Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179, (9), 5886-5896 (2007).
  33. Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39, (5), 1260-1270 (2009).
  34. Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391, (1-2), 50-59 (2013).
  35. Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375, (1-2), 68-74 (2012).
  36. Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
  37. Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76, (2-3), 129-136 (2015).
  38. Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195, (7), 3490-3496 (2015).
  39. Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3, (4), 1102-1115 (2014).
  40. Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191, (5), 702-709 (2005).
  41. Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4, (11), e7972 (2009).
  42. Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4, (1), 21-39 (2015).
  43. Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10, (7), 1098-1115 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats