O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University
Published 12/14/2016
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Immunology and Infection

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Tzeng, S. J. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity. J. Vis. Exp. (118), e54582, doi:10.3791/54582 (2016).

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Abstract

A marca da imunidade humoral é gerar ASC funcionais, que sintetizam e segregam Abs específica para um antigénio (Ag), tal como um agente patogénico, e são usados ​​para a defesa do hospedeiro. Para a determinação quantitativa do estado funcional da resposta imune humoral de um indivíduo, tanto Abs circulantes no soro e ASC são geralmente medidos como leituras funcionais. Nos seres humanos, o sangue periférico é a amostra mais conveniente e facilmente acessível e que pode ser utilizado para a determinação da resposta imune humoral induzida por células hospedeiras B. subconjuntos distintos de células B, incluindo ASC, podem ser isolados directamente a partir de sangue periférico por meio de selecção com micropérolas Ab-conjugados específicos de linhagem ou através de separação de células com citometria de fluxo. Além disso, as células B naive e de memória purificados podem ser activadas e diferenciadas em cultura em ASC. As actividades funcionais de ASC para contribuir para a secreção de Ab pode ser quantificada por ELISpot, que é um ensaio de enzima que convergeensaio -Conectado imunoabsorvência (ELISA) e tecnologias de transferência Western para permitir a enumeração de ASC individuais no nível de uma única célula. Na prática, o ensaio ELISpot tem sido cada vez mais utilizadas para avaliar a eficácia da vacina por causa da facilidade de manuseamento de um grande número de amostras de sangue. Os métodos de isolamento de células B humanas a partir de sangue periférico, a diferenciação de células B em ASC in vitro, e o emprego de ELISpot para a quantificação de um total de IgM e IgG-ASC serão descritos aqui.

Introduction

As células B desempenham um papel central no desenvolvimento da imunidade humoral. Eles inicialmente se desenvolvem na medula óssea e entram na corrente sanguínea como células naive B, que podem migrar para os tecidos linfóides, tais como o baço, nódulos linfáticos, amígdalas, e para um maior desenvolvimento. Após a Ag encontro, algumas células B naïve migrar para folículos linfóides, onde as células de centro germinal B podem se diferenciar em células B de memória e plasmablasts (PBS) / células plasmáticas (PCs). Enquanto a maioria dos computadores PBS / egressos para a corrente sanguínea, alguns, eventualmente, residem na medula óssea a sofrer diferenciação terminal em PCs 1 de vida longa. As células B em circulação são heterogêneos, e no estado estacionário, PBS / PCs são raros no sangue periférico 2. Como resultado da disponibilidade de marcadores de superfície específicos da linhagem, citometria de fluxo tornou-se um método popular para a identificação e caracterização das subpopulações de células B no sangue periférico. Uma aplicação alargada dos cytometr fluxoy é a adição de uma função de separação de células, que permite a separação e isolamento de subconjuntos individuais de células B com elevada pureza. Com base na expressão de receptores de superfície específicos em diferentes fases de desenvolvimento, as células B circulantes humanos são geralmente classificados em três subpopulações principais: células B virgens (CD19 + CD27 - CD38 -), células B de memória (CD19 + CD27 + CD38 -), e PBS / PCS (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figura 1). células B virgens, por natureza, não encontrei Ags. No entanto, eles podem ser diferenciadas em células CD27 + IgM + B de memória. Embora as células B virgens são homogêneos em expressar receptor do antigénio das células B (BCR) moléculas -associated (por exemplo, CD19, CD20 e CD22) eles são heterogêneos em seu repertório imunoglobulina 5. A maioria das células CD27 + B de memória podem ser diferenciados em CD27+ / CD38 + oi PBS / PCs 6. Além disso, as células B de memória e PBS / PCs são policlonais e exibem desenvolvimento e funcionais heterogeneidade 4-7. PBS / PCs em circulação são normalmente de curta duração e não expressam CD138, mas aqueles feitos para se estabelecer na medula óssea irá terminal diferenciar e se tornar longa duração. Terminalmente PCs diferenciadas expressam CD138 e para baixo-regular moléculas CD27 em suas superfícies 8. Uma vez que tanto PBS e PCs são capazes de secretar Abs, em muitas ocasiões, eles são colectivamente denotado como ASC. Em contraste, nem as células B naive nem células B de memória pode produzir quantidades apreciáveis de Abs 9-10. No entanto, quando isolados, tanto em células B naive e de memória podem ser diferenciadas em ASC em 3 - 10 dias, quando colocado em condições de cultura adequadas 6, 11-15. Na verdade, ASC derivado in vitro compartilhar diferenciação expressões superficiais semelhantes de CD27 e CD38 com os fr diretamente isoladosangue periférico om 6. Além disso, as ASC diferenciadas in vitro expressam um baixo nível de superfície CD20, semelhante que circula de PBS / PCs 6. Embora as ASC derivado de cultura são todos de curta duração, podem secretar Abs, indicando que eles são funcionalmente competentes e capazes de contribuir para a imunidade humoral.

Ambos ELISA e ELISpot são, de longe, os métodos mais geralmente aplicado com o qual para obter informação funcional sobre a resposta imunológica humoral. ELISA é um ensaio baseado em placa de 96 poços, e é frequentemente utilizado para medir os títulos de soro Abs Ag-specific e outros analitos (por exemplo, citocinas). É conveniente e escalável. ELISA foi concebido para utilizar um ensaio de enzima de fase sólida para detectar a presença de ABS ou de outras substâncias, tais como soro, numa amostra de líquido 16. As leituras de ELISA no soro têm sido amplamente utilizados para representar a resposta imune do corpo. Uma ferramenta necessária para a aquisição de readouts de ensaios de ELISA é um leitor de microplacas espectrofotométrico. O leitor pode determinar a densidade óptica (DO) dos produtos finais normalmente resultantes da reacção de peroxidase de rábano (HRP) Abs detecção -conjugated e seus substratos específicos 17. No que diz respeito a informações sobre a resposta imunológica humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA representam a colectiva, mas não indivíduo, o desempenho de ASC no corpo. Em adição, a ELISA não tem em conta a participação de células B de memória, que não secretam Abs.

Tal como ELISA, ELISpot é um método amplamente utilizado para a detecção e monitorização da resposta imunitária em amostras de sangue periférico 17-18. ELISpot é uma técnica relacionada com um ELISA de tipo sanduíche. Nele, as células são colocadas dentro do difluoreto de polivinilideno (PVDF) poços apoiados por uma membrana de microplacas de 96 poços para uma cultura de curto prazo. O ensaio ELISpot é análoga à execução de uma transferência de Western em microplacas e developing as manchas na membrana de (PVDF) em cada poço. Um sistema de leitor de ELISpot automatizado ou um estereomicroscópio para contagem manual é necessária. A principal vantagem de ELISpot na detecção de uma resposta imunitária é a sua excelente sensibilidade na quantificação da ASC e células secretoras de citocinas. Ela reporta as suas actividades funcionais na imunidade humoral e celular, respectivamente. Na medição da função imune humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA e o número de ASC enumerados por ELISPOT são frequentemente correlacionados, mas as leituras de dados a partir destes dois ensaios têm algumas diferenças em implicações funcionais 19-20. A principal vantagem de ELISpot é a sua sensibilidade do método. O nível dos títulos de soro AB como relatado por ELISA apresenta-se semi-quantitativamente, como leituras de DO, que denota o nível de Ab relativa, ou mais quantitativamente, como leituras de concentração quando uma quantidade conhecida dos isotipos apropriados de Abs é incluída para referência. Em contraste, os resultados de ELISpot são Presented como o número absoluto de ASC em uma associação de células de interesse (por exemplo, células não fraccionadas mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células B purificadas a partir de PBMCs). ELISpot pode detectar um único ASC, mas ELISA requer quantidades ab a partir da ASC para atingir concentrações dependente de ensaio optimizadas antes da medição. Assim, é obviamente superior ELISpot para ELISA na sensibilidade da quantificação. Além disso, também ELISpot é adequada para a quantificação dos ASC diferenciadas in vitro a partir de células B de memória activadas. células B de memória não secretam Abs, mas podem se diferenciar em ASC sobre a ativação; Eles, portanto, não tem nenhuma contribuição para Abs de soro detectados por ELISA. Assim, ELISpot é o método de escolha para a medição da resposta imune de células de memória B em circulação após a activação em cultura. Ele permite o acompanhamento da manutenção da imunidade humoral a longo prazo.

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Protocol

sangue periférico humano deve ser obtido a partir de dadores saudáveis ​​sob consentimento informado, bem como a utilização de amostras de sangue devem estar em conformidade com as orientações aprovadas estabelecidas por conselhos de revisão institucionais individuais. Neste estudo, o protocolo de usar sangue humano em uma demonstração dos resultados de citometria de fluxo (Figura 1) e ensaios ELISPOT (Figura 3) foi aprovado pelo Conselho de Revisão Interna do National Taiwan University Hospital (número de protocolo 201307019RINB).

1. Isolamento e purificação de células B de sangue periférico humano

  1. Desenhar ~ 10 mL de sangue a partir da veia cubital mediana (no anterior fossa cubital ao cotovelo) para um tubo de 15 ml, contendo K 2 EDTA (1,5 a 2,0 mg / mL de sangue) e inverter imediatamente o tubo várias vezes para evitar coágulos formação.
  2. Adicionar 35 mL de autoclavada (121 ° C, 15 min) de glóbulos vermelhos (RBC) de tampão de lise (150 mM de NH4Cl, 10 mM de KHCO3, e EDTA 1 mM; pH 7,4) ao tubo que contém a amostra de sangue fresco (≥ 3: 1 v / v) e incuba-se à temperatura ambiente (TA) durante não mais do que 5 minutos.
    NOTA: O aparecimento de transmissão de luz através do tubo indica a conclusão de lise de RBC.
  3. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Certifique-se de que o sedimento é de cor branca.
  4. Ressuspender o sedimento com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na 2 HPO 4, e 1,47 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) e centrifuga-se tal como no passo 1.3.
  5. Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com 10 ml de meio RPMI 1640 (suplementos: 10% de soro fetal de vitelo, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 0,25 mg / mL de anfotericina B, e 2 mM de L-glutamina), e, em seguida, a chapa células em uma placa de cultura de 10 cm (10 ml de sangue por prato). Colocar a cápsula num incubador a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 30 min.
  6. Agite suavemente o prato de cultura algumas vezes e colocar omeio de cultura (células de suspensão) em 15 mL tubos cónicos de plástico. Descartar as células aderentes (principalmente macrófagos) nas placas de cultura.
  7. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante.
  8. Ressuspender o sedimento com 1 ml de meio RPMI 1640. Contar o número de células com um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
    NOTA: A viabilidade de leucócitos isolados é normalmente superior a 90% por exclusão com azul de tripano.
  9. Centrifugar como no passo 1.7 e ressuspender as células em ~ 200 uL de tampão de PBS frio (0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA) a uma concentração de 5-10 x 10 6 células / ml.
  10. Adicionar 5 mL de cocktail de anticorpo anti-humano biotinilado específico para as células do sangue (para a selecção negativa das células B) por 10 6 células e incubar em gelo durante 30 min 21.
    NOTA: O cocktail Ab anti-humana deve incluir, pelo menos Abs específico para CD2 (ou CD3), CD14 e CD16.
  11. Adicionar um excesso de volume de 10 vezesde PBS estéril para as células, centrifugar a 600 xg durante 5 min, e desprezar o sobrenadante.
  12. Adicionar quantidades iguais de microesferas de estreptavidina conjugada (5 mL por 10 6 células) para o pellet e misture bem.
  13. Incubar em gelo durante 30 min num tubo cónico de 15 mL, em plástico.
  14. Adicionar 2 ml de tampão PBS para dentro do tubo.
  15. Colocar o tubo em um suporte magnético e incubar à temperatura ambiente durante 8 min. As micropérolas Brown vai anexar gradualmente para a parede do tubo ao lado do íman 22.
  16. Com o tubo restante no suporte magnético, transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo estéril de 15-mL 22.
  17. Repita os passos de 1,14-1,16, e combinar os dois sobrenadantes que contêm as células B intactas. Descartar as microesferas.
  18. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante.
  19. Ressuspender o sedimento em meio RPMI 1640 para experiências a jusante.
    NOTA: Normalmente, 1 - 5 x 10 5 células B witha pureza superior a 95% a partir de 10 ml de sangue periférico pode ser isolado 23.

2. purificação e separação de Memória e Naïve B As células a partir de células B isoladas

  1. Use células purificadas a partir do passo 1 e determinar o número de células utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automático.
  2. Ressuspender as células em 100 ul de tampão PBS frio depois da centrifugação a 600 xg e TA durante 5 min.
  3. Adicionar 1 - 2 ug de mAb CD27 biotinilado por 10 6 células e incubar em gelo durante 30 min.
  4. Adicionar 10 ml de tampão PBS ao tubo e centrifugar a 600 xg durante 5 min.
  5. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 50 ul de tampão PBS.
  6. Adicionar a mesma quantidade de microesferas magnéticas de estreptavidina (1 - / 10 6 células 2 ug) às células num tubo cónico de plástico de 15 ml.
  7. Com cuidado, misturar bem e incubar em gelo durante 30 min.
  8. Adicionar 2 - 3 ml de tampão PBS ao tubo.
  9. Coloque otubo num suporte magnético e incubar à temperatura ambiente durante 8 min para permitir que as microesferas castanhos para anexar ao lado mais próximo do íman.
  10. Com o tubo no suporte magnético, transferir cuidadosamente a fracção de sobrenadante para um novo tubo de ensaio estéril. Esta fracção contém a CD27 enriquecido - células B virgens.
  11. Adicionam-se 5 ml para o tubo contendo as micro-esferas e suavemente ressuspender as microesferas (isto é, a fracção enriquecida de células CD27 + de memória B) 24-25.
  12. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Ressuspender as peletes com meio RPMI 1640 para os experimentos a jusante.
    NOTA: Tipicamente, ~ 30 - 60% de células B podem ser purificadas como células de memória CD27 + a partir das PBMC de um dador saudável 7, 25-26.

3. células de classificação para a coleta de células Naïve B, células B de memória, e PBS / PCs

  1. Usando as células purificadas a partir do passo 1, determinar o número de células utilizando um hemocytometer ou um contador de células automático.
  2. Ressuspender as células em tampão de PBS frio a uma concentração de 10 7 por ml num tubo de polistireno de 5 ml.
  3. Adicionar 1 - 2 ug de IgG humana por 10 6 células e incubar em gelo durante 10 min para o bloco de Fc.
  4. Adicionar 1 ug de cada anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323), e anti-CD38-PE (clone: HIT2) por 10 6 células; misturar bem e incubar em gelo durante 30 min 4, 27.
  5. Na última 5 min na etapa 3.4, adicionar 5 mL do 7-D aminoactinomycin comercial (7-AAD).
  6. Adicionar 2 ml de PBS ao tubo, vórtice, e centrifugar a 600 xg durante 5 min.
  7. Ressuspender as células em tampão de triagem (PBS estéril com 2% de BSA e EDTA a 2 mM) a uma concentração de 1 - 5 x 10 7 células por ml num tubo de 15 mL.
  8. Filtrar as células através de um filtro de células de malha de nylon (40 um de tamanho de poro) para eliminar aglomerados de células.
  9. Separaram-se as células com uma citometria de fluxo tipoer equipado com três lasers: violeta (405 nm), azul (488 nm) e vermelha (640 nm).
    NOTA: O laser azul por si só é suficiente para 3 cores citometria de fluxo 27-28.
  10. Ordenar as células em três tubos de 15 ml (contendo 5 mL de meio RPMI) para a recolha simultânea de células B virgens (CD19 + CD27 -), células B de memória (CD19 + CD27 +), e PBS / PCS (CD19 + CD27 + / oi CD38 +) 3-4, 28.
    NOTA: Ordenar as células B naive e de memória podem ser cultivadas tal como descrito no passo 4.

4. Na diferenciação in vitro de células isoladas CD19 Humano + B, CD19 + CD27 + células B de memória, e CD19 + CD27 - células naive B

  1. Usando as células purificadas nos passos 1.19, 2.10, 2.11 e 3.10, determinar o número de células com um hemocitómetro ou um contador de células automático.
  2. Ressuspender as células com meio RPMI 1640a uma concentração de 1 - 10 x 10 5 por ml e aliquotar-los para os poços de uma placa de 12 poços.
  3. Adicionar CpG (ODN 2006) a 5 ug / 10 6 células / ml 18, 29.
  4. Cultura das células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 5 dias.
  5. Colher as células de cada poço, colocá-los separadamente em tubos de 15 ml, adicionar 5 mL de PBS a cada tubo e centrifugar-los a 600 xg e RT durante 5 min.
  6. Contar as células usando um hemocitômetro ou um contador de células automático. Ressuspender as células a uma concentração de 1 - 10 x 10 5 por ml com meio RPMI 1640.

5. ELISpot Assay

  1. Adicionar 30 uL de 35% de etanol em água destilada a cada poço das placas ELISpot durante 30 s.
    NOTA: Quando pipetagem, evitando tocar na membrana nas cavidades em todos os momentos.
  2. Inverter as placas ELISpot para remover o etanol.
  3. Colocar 150 mL de DDH autoclavados 2 O em cada poço e incubar-los à temperatura ambiente durante 5 minutos para lavar o etanol residual; seguir com uma lavagem de PBS estéril à temperatura ambiente durante 3 min.
    NOTA: As etapas 5.1 a 5.3 pode ser opcional, dependendo do fabrico das placas.
  4. Coloque 50 uL de 5 ug / mL de anticorpo policlonal de F (ab ') 2 de anti-Ig humana (IgG + IgM + IgA) (em PBS) a cada poço das placas ELISpot e incubar a 4 ° C durante a noite (preferida) ou 37 ° C durante 2 h 11.
    NOTA: Selar as bordas de placas com parafilme até à sua utilização.
  5. Inverter as placas para remover Abs não ligado, adicionar 200 ul de PBS a cada poço e incubar duas vezes à temperatura ambiente durante 3 min de cada vez.
  6. Adicionar 200? L de PBS com BSA a 5% (ou meio RPMI 1640) a cada poço para bloquear, e incubar à TA durante 2 h.
  7. Inverter as placas para remover o tampão de bloqueio. Lavar cada poço duas vezes com 200 ul de PBS, tal como no passo 5.5.
  8. Adicionar 100 uL de meio RPMI 1640 a cada poço e incubar a 37 ° C.
  9. Quando estiver pronto para semear as células, inverter as placas para remover o meio RPMI 1640.
  10. Semente de 100 uL (5 x 10 4), 50 mL (2,5 x 10 4), e 25 uL (1,25 x 10 4) das células (de passos 1.19, 2.10, 2.11, 3.10, e 4.6) para os poços de uma placa ELISpot. Com meio RPMI 1640, perfazer o volume de 150 uL / ​​poço.
    NOTA: Um mínimo de uma ou duas diluições em série de 2 vezes para plaqueamento das células é recomendada.
  11. Incubar as placas em uma incubadora a 37 ° C com CO2 a 5% durante 8-14 h 18. Evitar mover as placas durante a incubação.
  12. Inverter as placas para remover as células e meio RPMI 1640.
  13. Adicionar 200? L / cavidade de PBS-T (PBS com Tween 20 a 0,05%) e incuba-se-lhes 5 vezes à TA, cada vez durante 3 minutos. Inverta a placa para remover o tampão de lavagem entre cada um dos 5 lavagens.
  14. Adicionar quer fosfatase alcalina de IgG de cabra-anti-humano (AP), Abs Fcy-específico (para a detecção de IgG, 1: 5000 em PBS-T) Ou de cabra anti-IgM humana-AP, Fcμ Abs específicos do fragmento (para a detecção de IgM, 1: 5000 em PBS-T) nas cavidades designadas e incubar à TA durante 2 h, no escuro.
  15. Lavar cada poço duas vezes com 200 ul de PBS, tal como no passo 5.5.
  16. Adicionar 50 / poço de solução de substrato de fosfato uL bromochloroindolyl-nitro azul de tetrazólio (BCIP / NBT). manchas de cor roxa normalmente aparecem em 5-15 min.
  17. Adicionar 100 uL / poço de ddH2O para evitar o sobre-revelação de manchas.
  18. Lavar as placas com água corrente da torneira após o desenvolvimento completo de todos os pontos.
  19. Remover o underdrain das placas e permitir-lhes secar ao ar, no escuro.
  20. Contar as manchas utilizando um leitor automático de placas com um aparelho de imagem aquisição / análise (por exemplo, um scanner automático ou manualmente por meio de um microscópio de dissecção).
    NOTA: As placas podem ser armazenadas à temperatura ambiente no escuro e analisadas mais tarde.

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Representative Results

PBMCs foram depletados de glóbulos vermelhos e células aderentes (passos 1.2 a 1.7). Uma alíquota (2 X 10 6) de células foram submetidos a uma análise por citometria de fluxo para ilustrar as populações de células B naive, as células B de memória, e PBS / PCs no sangue periférico (Figura 1). Em PBMCs de dadores este, cerca de 10% dos linfócitos foram células B CD19 +. No compartimento de células B, a percentagem de CD19 + CD27 - células B virgens foi de cerca de 50%. Por outro lado, cerca de 50% das células B CD19 + CD27 + foram células B de memória 7, 25-26. Digno de nota, as células CD27 + B de memória podem ainda ser separados com a inclusão de IgD 4. O fenótipo de circulação de OP pode ser melhor definido com expressão baixa ou nenhuma superfície de CD20 (CD19 + CD27 + / oi CD38 + CD20 lo / -) 2, 30-31. Para excluir as células mortas, a 7-AADpodem ser incluídas na coloração de células (passo 3.5), e uma trama para o FSC versus 7-AAD permite modular a população de células vivas (7-AAD -).

As principais etapas do ensaio ELISpot estão representados na Figura 2. Tanto as células B humanas purificadas e células B de memória CD19 + CD27 + foram cultivadas na presença de CpG com meio RPMI 1640 durante 5 dias. As células foram colhidas para o ensaio ELISpot para quantificar as ASC recentemente emergiram. Se estiver presente, o pré-existente OPs isolado a partir do sangue periférico irão morrer em 48 h 11. O ensaio ELISpot foi realizada, e as imagens adquiridas no local por um scanner automático de placa são demonstradas na Figura 3. Os resultados de ELISpot tipicamente irá mostrar 50 - 200 IgM-ASC de 10 4 células B tratados com CpG, durante 5 dias, ao passo que o número de IgG-ASC é 10 - 50 na 10 4 11 células.


Figura 1. Ilustração da Estratégia Gating para separar as células Naïve B, células B de memória, e PBS no PBMC. (A) As células (2 x 10 6) foram coradas com 2 ug de cada CD19-APC, CD27-eFluor450, e mAbs CD38-PE (Passo 3.4). O compartimento de linfócitos foi fechado (G1) no gráfico de pontos de dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC). (B) dupletos celular, que são formados por duas células grudadas, foram excluídos (as G2 fora) sobre a trama para o FSC-W (largura) contra FSC-H (altura). As células CD19 + B (C) foram fechado como G3 sobre o enredo para SSC-A (área) e CD19-APC. (D) das células CD19 +, o gráfico de pontos de parâmetros CD27 e CD38 mostrou células naïve B (CD19 + CD27 -; Q1 e Q4), células B de memória (CD19 + CD27 +;Q2 e Q3), e de PBS (CD19 + CD27 + / CD38 + oi; G4, 0,6% de Q2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Ilustrações dos principais passos do ELISpot de Ensaio. (A) Colocar 50 uL / poço (5 ug / ml) de F (ab ') 2 de anti-Ig humana (IgG + IgM + IgA) em uma placa de ELISpot durante 2 h a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C (preferido) (passo 5.4). Semear as células nos poços da placa de ELISPOT. Permitir que as ASC para anexar à membrana PVDF e para secretar Abs para 8 - 14 h (passo 5.11). (B) Lavar as células com PBS (com 0,05% de Tween 20). (C) Adicione o AP- ou HRP-conjdetecção ugated Abs específico para IgG ou IgM. (D) Lavar o Abs de detecção que sejam liberados. (E) Desenvolver as manchas com uma solução de substrato de AP ou HRP para coincidir com o Abs detecção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Resultados de ELISpot de uma placa representativas. (A) células purificada B CD19 + foram colocados em três poços adjacentes (50.000 células no poço # 1, 25.000 células no poço # 2, e 12.500 células no poço # 3, respectivamente) da placa de ELISPOT. As células foram então cultivadas em meio RPMI 1640 durante a noite (~ 14 h). O ensaio ELISpot foi realizada depois de completar a cultura (passos 5,12-5,18). para analyze os resultados, a placa ELISpot foi digitalizada para adquirir imagens através de um analisador automático equipado com o scanner e software. Células de memória (B) purificada CD19 + CD27 + (10 6 / ml) foram cultivadas na presença de 5 ug / mL de CpG, durante 5 dias. As células foram tratadas como em (A) para o ensaio de ELISPOT. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Isolamento e Purificação de Células de Sangue Periférico Humano B

Normalmente, os glóbulos vermelhos podem ser eficientemente rompido e afastada pelo tampão de lise (passo 1.2). É importante que não se incubar PBMCs com o tampão de lise dos glóbulos vermelhos mais do que 5 minutos, como a viabilidade das células pode ser afectada pelo cloreto de amónio. Alternativamente, os glóbulos vermelhos e as plaquetas podem ser removidos simultaneamente por o protocolo seguinte.

Misturar com sangue total fresco (ACD) tampão de ácido-citrato-dextrose (ácido cítrico 39 mM, citrato de sódio 75 mM, e dextrose 135 mM; pH 7,4) numa proporção de volume de 9: 1, sangue-para-tampão. Centrifugar a 250 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Prestar atenção à formação de camadas, indicativos de separação. Aspirar e desprezar o camada superior, que contém plaquetas e de plasma rico em plaquetas (cor amarela). Retirar a camada intermédia fina na interface, o qual contém PBMC (i .e., O buffy coat). Evitar a contaminação de glóbulos vermelhos na camada inferior (dark cor vermelha). Adicionar tampão de lise ao PBMC para remover os glóbulos vermelhos residuais, e, em seguida, siga os passos 1,2-1,19.

Duas abordagens podem ser utilizadas para isolar as células B a partir de PBMC: selecção positiva e negativa 21. O método de selecção negativa (passos 1,1-1,19) é usado para obter as células B intactas, funcionais, sem ABS ou microesferas de ligado, para experiências a jusante. É fundamental levar isso em conta quando a ativação e / ou diferenciação de células B purificadas ocorre em cultura. A preocupação é que as células purificadas por selecção positiva pode ser inadvertidamente influenciada pelas microesferas mAb conjugados (0,2 a 5 um de diâmetro). mAbs podem ligar-se a receptores específicos nas células B e, portanto, pode reticular receptores para a activação. Além disso, microesferas pode ser sujeita a endocitose pelas células B através de receptores ligados. Embora biodegradáveis, as microesferas pode ficar dentro das células durante mais de uma semana. Se a retenção de microesferas irão influenciar experiResultados mentais precisa de ser determinada empiricamente. Na purificação de células B humanas por meio de selecção positiva, anti-CD19 (clone: 4G7 ou HIB19) micropérolas são vulgarmente utilizados porque CD19 é amplamente expresso em todas as fases de desenvolvimento de células B. A pureza das células B, após a separação pode ser determinada por citometria de fluxo com os mAb anti-CD19 (clone: ​​SJ25C1 ou LT19), que reconhecem epitopos distintos de microesferas anti-CD19.

Purificação e Separação de Memória e Naïve células B a partir de células B isoladas

CD27 é um marcador de superfície amplamente aceito para a memória humana e distinção de células naïve B 24. A molécula CD27 pertence à família dos receptores do factor de necrose tumoral (TNFR). Porque CD27 é expresso na maioria das células B de memória humanos, é comumente usado para discriminar os de CD27 - células B virgens. No entanto, por causa de CD27 também é expresso em células T e células NK, a utilização de anti-CD27 microbeads (clone: ​​O323) na selecção positiva de células B de memória requer a purificação prévia de células B (Passos 1,1-1,19). Para uma verificação de pureza após a separação, os mAbs específicos para CD27 humano (clones: L128 ou LG.3A10) são recomendadas (passo 2.12). Como as células CD27 + B de memória são heterogêneos, marcadores de superfície adicionais, tais como IgD e FCRL4, podem ser considerados para posterior separação em células de classificação 4, 7.

Separação de células para obter células Naïve B, células B de memória, e PBS / PCs

Uma vez que as células B expressam FcγRIIB, um bloco de Fc (passo 3.3), é recomendado, antes de corar as células com o mAb para citometria de fluxo. Os fragmentos Fe de IgG humana sozinho pode bloquear igualmente bem como todo o IgG humano a 1 ug / 10 6 células. Anti-humanos CD32 mAb (clones: 3D3 ou AT10) é outra opção para o bloco Fc. De nota, se FcγRIIB é um marcador de superfície de ser marcadas em células B purificadas, o mAb anti-CD32 SH-fluororo conjugadoould ser adicionado ao dispensar o bloco Fc, seguido de coloração com outros mAbs sem uma lavagem PBS.

Por três cores citometria de fluxo, CD38-FITC (fluoresceína), CD27-PE (ficoeritrina) e CD19-APC (aloficocianina) são uma combinação típica de fluoróforos. No entanto, se o separador de citometria de fluxo é equipada com três lasers, tais como os de 405 nm, 488 nm e 640 nm, os investigadores têm, em seguida, o luxo de escolher fluoróforos excitados por diferentes tipos de laser para a separação de células. Tal como ilustrado na Figura 1, as células foram coradas com CD19-APC (clone: HIB19), CD27-eFluor450 (equivalente a Pacific Blue, clone: O323), e CD38-PE (clone: HB7) para separar as células B virgens, memória As células B, e PBS. De nota, alguns pesquisadores preferem a inclusão de CD45 (clone: HI30) como um marcador de leucócitos linhagem e células portão B como um CD45 + CD19 + população. Porque a detecção de OPs em circulação no estado de equilíbrio é uma véspera rarant em indivíduos saudáveis, de baixa ou mesmo nenhuma expressão de superfície de CD20 na PBS (CD19 + CD27 + / oi CD38 + CD20 lo / -) comprovativo da sua bona fide existência 2, 30-31. Isso é útil quando os resultados de quantificação de PBS por fenótipos de superfície e ASC por ensaios ELISpot estão sendo comparados. Durante o período anterior à célula-ordenação, 7-AAD é preferível a iodeto de propídio para a exclusão de células mortas, devido ao seu espectro de emissão mais estreito e menor spillover em multicolor citometria de fluxo.

Estimulação in vitro e diferenciação de células B humano isolado

O tipo B CpG (ODN 2006) por si só pode induzir a diferenciação limitada de ambos IgM e IgG-ASC a partir de células B de memória. Além disso, células B virgens são apenas fracamente responsivas ao CPG e principalmente dar origem a IgM-ASC 6, 11. A concentração de CpG em cultura está na gama de 2,5-5 ug / ml por 10 6 células Bou PBMC 11, 18. Para além de CpG, as células B purificadas e as PBMC podem ser criadas em cultura na presença de combinações de CpG com mitogénios, citocinas e agonistas BCR, para diferenciar as células B humanas em cultura em ASC (Passo 4.3). Por exemplo, as receitas comumente usado por 10 6 culas por mL incluem (a) de CpG (5 ug / mL), recombinante humano IL-2 (10 ng / mL) e recombinante IL-10 humana (10 ng / mL) 15, 34; (b) de CpG (5 ug / mL) e F (ab ') 2 fragmentos de Ig anti-humana (IgG + IgM + IgA) (20 ug / mL) 11; (c) de CpG (5 ug / mL), a proteína A de S. aureus Cowan (SAC) (diluição 1: 10000), e mitogénio de Pokeweed (PWM) (1: 100.000 diluição) 18; (d) recombinante humano de IL-21 (100 ng / mL) e sCD40L recombinante (1 ng / mL) 12, 15, 33; e (e) recombinante humano IL-2 (10 ng / mL) e R848 (1 ug / mL), um agonista do TLR7 33-34. Embora as células B podem ser diferenciadas em ASC em três dias 11, as células são geralmente pré-Stimulated durante 5 a 6 dias antes de serem adicionados à placa de ELISpot para a quantificação de ASC 11, 18. Durante o período de cultura, normalmente não há reabastecimento dos agentes de diferenciação de partida.

A adição de IL-2 e IL-10 para culturas contendo CpG pode aumentar significativamente o número de IgM e IgG diferenciadas ASC-15, 35. A presença de IL-2 em cultura pode proporcionar a estimulação mitogénica para facilitar a expansão das células B diferenciadas por CpG. IL-10 na gama de 10-25 ng / mL pode aumentar significativamente a produção de ASC (~ 3 a 10 vezes) na presença de CpG 35. Agonistas BCR, incluindo anti-BCR e SAC, e PWM também pode estimular a proliferação de células B humanas de 18 primário. A incubação de células B de memória com CpG e policlonal anti-BCR principalmente resulta em um aumento na IgM-ASC mas não em IgG-ASC 28. Para a prevenção da inibição da sinalização por meio de BCR por FcγRIIB, um F (ab# 39;) 2 de anti-Ig (10 - 20 mg / mL por 10 6 células) é recomendado quando reticulação BCR 11. Em vez de anticorpos policlonais anti-Ig, mAb anti-BCR específicas para a utilização de células IgM + IgG + ou B devem ser considerados como alvo para subconjuntos de células B específicas de isotipo para a diferenciação em ASC. Uma combinação de CpG, SAC (1: 10.000 de diluição), e PWM (1: 100.000 diluição) pode eficientemente activar as células B de memória de se diferenciar em IgM e IgG-ASC 18, 24. Além disso, CpG pode moderadamente induzir a mudança de classe de Ig in vitro 28-29. Em contraste, a IL-21 (100 ng / mL) e por sCD40L (1 ug / ml) de forma eficaz induzir a diferenciação de células B de memória exclusivamente de comutação de IgG-ASC 12, 30. A sCD40L pode activar as células B, imitando a ajuda de células T através do CD40 em células B, que influencia a sua diferenciação em PCs in vivo. De nota, anti-CD40 (clones: 89 ou G28.5) pode substituir sCD40L na cultura 15. However, nem por sCD40L ou anti-CD40 sozinho é capaz de induzir a diferenciação de células B de memória. Assim, a activação de CD40 de células B cultivadas é muitas vezes combinado com um agente de diferenciação, tais como IL-4, CpG, R848, ou IL-21, qualquer um dos quais pode promover a troca de classe de Ig. A IL-4 desempenha um papel fundamental na diferenciação de células Th2 CD4, permitindo a indução da maior parte das células B IgM + para mudar para células de IgG1 + B em cultura. De modo semelhante, na presença de IL-21, ambas as células B de memória e células B virgens diferenciar exclusivamente em ASCs de comutação de classe 12, 32. Como CpG, R848 pode induzir uma mudança de classe marginal de células B 34. Finalmente, vale a pena mencionar que, apesar de lipopolissacarídeo (LPS) pode efetivamente induzir a diferenciação de células B de ratinho em ASC, as células B humanas expressam baixos níveis de TLR4 e CD14 29. Uma vez que a adição de um agente de diferenciação na cultura promove a geração de células B comutados, esta adição deve ser evitadaquando PBS / PCs pré-existentes ou células B de memória não comutadas estão a ser medido.

ELISpot Assay

O ensaio ELISpot combina ELISAs baseados em placa com tecnologias de transferência de Western baseadas em membrana, permitindo a detecção de Abs segregada por uma única célula B 18. O ELISpot também foi adaptada para quantificar as células T específicas de Ag-que secretam citocinas 17, 36. Em um ensaio ELISpot, pode ser utilizado tanto em células purificadas ou PBMC não fraccionados (isento de glóbulos vermelhos). No entanto, ~ 10 vezes mais do que as CMSPs são necessárias células purificadas para se obter resultados consistentes em ensaios ELISPOT. Um bom ponto de partida é de 1 - 2 x 10 5 células por poço para a detecção da ASC circulam em PBMCs. Na detecção de Ag-ASC específica, anti-Ig é geralmente substituído por Ag (5 - 10 ug / ml em PBS) para capturar Ag-ACSs específico (passo 5.4). O uso de Abs detecção específica de isotipo permite a distinção entre IgM-ASC específicas-Ag e isotipo IgG-ASC (passo 5.14). É de notar, independentemente de se o anti-Ig ou Ag são usados ​​para capturar ASC, o sistema ABS de detecção utilizados para ELISA pode não ser sempre adequada para ELISPOT. Da mesma forma, nem todos os substratos de cores para ELISA funcionar correctamente, de ELISPOT. AP- e Abs HRP-conjugados são mais comumente utilizado para detecção de ponto no ELISpot. A solução de substrato BCIP / NBT é uma escolha popular para a detecção baseada em PA, enquanto que 3,3 ', 5,5'-tetrametil-benzidina (TMB) e 3-amino-9-etilcarbazole (AEC) são substratos soluções comuns para HRP em ELISPOT. Se o AP ou HRP é directamente conjugado com o Abs detecção, apenas um passo é necessário para a detecção, tal como descrito no protocolo (passo 5.14). Em contraste, o sistema ABS de detecção são biotinilados e requerem que se seguiu a incubação com estreptavidina AP ou HRP-conjugado antes de reagir com os substratos em um método de dois passos. Ambos uma etapa e de duas etapas métodos funcionam de forma eficiente para detectar manchas em ELISpot.

O ensaio ELISpot pode quantificar não só circulating, mas também diferenciada ASC em cultura (passo 1,19 contra 4,6). Se estiver presente, ASC, os quais normalmente não mais do que dois dias em cultura vivem em circulação, pode ser directamente cultivadas na placa de ELISpot, com ou sem purificação a partir de PBMCs 11. Em contraste, a diferenciação de células B de memória requer 5 dias. Assim, a cultura direta em placas ELISpot após o isolamento de células (passo 1.19) não é recomendado; os restos de células mortas resultante do período de cultura prolongada pode aumentar o fundo no local de detecção. Em vez disso, ambas as células B purificadas e PBMC totais pode primeiro ser cultivadas num de 6 poços ou 12 poços da placa, na presença de mitogénios e agentes de diferenciação (Passo 4.3). Durante o processo de cultura, a adição repetida de agentes de estimulação é desnecessária (Passo 4.3). Enquanto as placas são na incubadora, a porta da incubadora deve ser aberta e fechada suavemente para evitar que as ASC semeados de mover-se, para que eles possam difundir Abs segregadas que se deslocam ao longo das faixas, gerando pontoscom caudas (os chamados pontos "cometa") (passo 5.11). O período de incubação em placas ELISpot é determinada pelo tempo necessário para as células para segregar quantidades detectáveis ​​de Abs, sem permitir que as células se dividir, o que iria criar dificuldades na contagem de manchas. Assim, as células são geralmente cultivadas na gama de 8 horas até durante a noite (5,11 passo).

O ensaio ELISpot é o método mais utilizado para quantificar as respostas das células B de memória. Tornou-se popular, uma leitura, independente da resposta imune humoral e memória imunológica. Na prática, a cultura mitogénica anterior é necessário para activar as células B de memória para diferenciação na ASC (Passo 4.3). No entanto, a frequência à qual as células B de memória expanda e se diferenciam em ASC varia em diferentes meios de cultura, como descrito acima. Embora sem consenso, a maioria dos pesquisadores adotam a condição de indução que pode maximizar a produção de ASC. Em termos de o agente utilizado para detectio pontoN, um solúvel biotinilado Ag pode substituir a detecção Ab insatisfatória sem comprometer a sensibilidade 37. Isto é de particular importância quando a disponibilidade de Ag é limitada, porque é necessária uma quantidade muito menor de Ag para a detecção do que para o revestimento das placas. Por último, ELISpot não permite a análise fenotípica de heterogeneidade celular, e desse modo exige fraccionamento antes de subpopulações de células. Recentemente, um ensaio ELISpot multicolor, no qual a detecção de ABS são marcados com diferentes fluoróforos, foi desenvolvido para detectar múltiplos tipos de células secretoras de citocinas num único poço 38-39. Esta nova tecnologia será de particular interesse para a detecção de células de baixa frequência em PBMC e para uma análise em larga escala de respostas de células B induzidos pela vacina.

Uma vez que o ensaio ELISpot é rápido e eficiente na quantificação ASC e células secretoras de citocinas, que foi alargado para medir a funcionalidade de não só circulando linfócitos, mas também as células do sistema imunológico do tecido tais como leucócitos intra-hepáticas 40. Devido à sua sensibilidade atingindo o nível de detectar até mesmo um único ASC, o ensaio ELISpot tem sido cada vez mais usado para medir respostas imunológicas humanas a eficácias de vacinas contra patógenos existentes e emergentes. Embora o desempenho de alto rendimento e a robustez do ensaio ELISpot são excelentes para avaliações em larga escala de respostas imunológicas utilizando PBMC, os resultados dos ensaios podem ser influenciadas por vários factores, tais como o atraso de processamento de amostras, se as células estão frescos ou congelados , componentes do soro no meio de cultura, e o número de células adicionadas à placa 41 ELISpot. Assim, os procedimentos de normalização devem ser incluídos no protocolo ELISpot para minimizar variações intra- e inter-ensaio em grande escala e estudos de acompanhamento longitudinal (por exemplo, ensaios de vacinas). O método de normalização da leitura da placa também é fundamental para a linearidade, precisão e contrasistency no ensaio resulta 41-42. Uma maneira de realizar a normalização de leitura de placas é de alargar o procedimento da diluição em série de células cultivadas em placas ELISpot (passo 5.10). Através da criação de uma placa de referência, mais diluições em série deve demonstrar uma relação linear entre os números de células plaqueadas por cavidade e as contagens no local por poço. exames repetidos de ELISpot a placa pode ser usado para validar o modelo de contagem de manchas, tanto manualmente e automaticamente. Minimal variabilidade intra-bem na contagem de ponto é antecipado após estes procedimentos de normalização 43. Por último, a aplicação de ELISpot pode ser alargado, em muitos aspectos, tais como a monitorização das respostas ao tratamento de pacientes com infecções e tendo imunoterapias do cancro, bem como para a avaliação de imunotoxicidade (por exemplo, imunossupressão e auto-imunidade induzida por drogas).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer K2E BD Biosciences 367525 10 mL tube
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02 endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution Biological Industries 03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set BD Biosciences 558007
Biotinylated CD27 mAb Biolegend 302804 clone O323
Streptavidin magnetic microbeads BD Biosciences 9000810
15 mL Falcon tubes BD Falcon 352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm BD Falcon 352340
Anti-human CD19-APC Biolegend 302212 clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450 eBioscience 48-0279-42 clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7 Biolegend 303516 clone HIT2 
Anti-human CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 clone HIT2 
Anti-human CD45-FITC Biolegend 304006 clone HI30
Anti-human CD45-FITC BD Biosciences 555482 clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 Biolegend 124213 clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 clone L128
Anti-human CD19-FITC Miltenyi Biotec 130-098-064 clone LT19
Anti-human CD19-FITC GeneTex GTX75599 clone LT19
Anti-human CD20-FITC BD Biosciences 555622 clone 2H7
biotinylated anti-human CD27 Biolegend 302804 clone O323
biotinylated anti-human CD27 eBioscience 13-0279-80 clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Biosciences 559925
CpG (ODN 2006)  InvivoGen tlrl-2006 type B CpG
Recombinant human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant human IL-10 PeproTech 200-10
Recombinant human IL-21 PeproTech 200-21
Recombinant human sCD40L PeproTech 310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC) Sigma-Aldrich 82526
Pokeweed mitogen (PWM) Sigma-Aldrich L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size Merck Millipore MSIPS4510 sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution Sigma-Aldrich B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate Merck Millipore ES006
Human IgG Jackson ImmunoResearch 009-000-003
Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) Jackson ImmunoResearch 109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-043
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit BD Biosciences 551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer C.T.L.

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