Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Immunology and Infection

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Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (120), e54756, doi:10.3791/54756 (2017).

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Abstract

spectroscopie de fluorescence de corrélation (FCS) est une technique puissante pour étudier la diffusion des molécules dans les membranes biologiques avec une résolution spatiale et temporelle. FCS peut quantifier la concentration et le coefficient de diffusion moléculaire des molécules marquées par fluorescence dans la membrane cellulaire. Cette technique a la capacité d'explorer les caractéristiques de diffusion moléculaire de molécules dans la membrane plasmique des cellules immunitaires à l' état d' équilibre (ie, sans processus affectant le résultat pendant la durée de la mesure réelle). FCS est adapté à l'étude de la diffusion des protéines qui sont exprimées à des niveaux typiques pour la plupart des protéines endogènes. Ici, un procédé simple et robuste pour déterminer le taux de protéines de la membrane cellulaire sur les lymphocytes primaires de diffusion est démontrée. Un moyen efficace d'effectuer des mesures sur des cellules vivantes d'anticorps tachés et observations qui se produisent souvent après acquisition sont décrits. Les récents progrèsdans le développement des colorants fluorescents photo-stable peut être utilisé en conjugant les anticorps d'intérêt pour les colorants appropriés qui ne sont pas largement décolorent lors de la mesure. En outre, cela permet la détection d'entités à diffusion lente, ce qui est une caractéristique commune des protéines exprimées dans les membranes cellulaires. La procédure d'analyse pour extraire des paramètres de concentration et de diffusion moléculaire à partir des courbes d'auto-corrélation générée est mise en évidence. En résumé, un protocole de base pour la mesure FCS est fourni; elle peut être suivie par des immunologistes avec une compréhension de la microscopie confocale, mais sans autre expérience préalable des techniques de mesure des paramètres dynamiques, tels que les taux de diffusion moléculaire.

Introduction

De nombreuses fonctions des cellules immunitaires reposent sur la diffusion et les interactions au sein des membranes moléculaire. Les membranes biologiques sont complexes et nombreux facteurs qui peuvent être importants pour la fonction des cellules immunitaires peuvent influencer la vitesse de diffusion translationnelle des protéines dans les membranes cellulaires 1. Nous avons récemment montré que tueuses naturelles (cellules NK), les lymphocytes appartenant au système immunitaire inné, présentent la diffusion différentielle de deux protéines étudiées à la membrane cellulaire en fonction de l'état de l' activation des cellules NK 2.

La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique qui est capable de quantifier les vitesses de diffusion moléculaire dans les membranes biologiques. Il rend compte de la vitesse de diffusion moyenne de molécules marquées par fluorescence dans un volume fixe, généralement l'objet d'un microscope confocal. Elle est basée sur la mesure des fluctuations de fluorescence qui se produit lors d'un mouvement moléculaireun système dans l'état d'équilibre. FCS a été largement utilisé pour l'étude de la diffusion des colorants et des protéines fluorescentes, à la fois en solution et dans des membranes lipidiques. D' autres paramètres de sortie qui affectent la vitesse de diffusion peuvent également être étudiés indirectement de cette manière (par exemple, des changements de conformation des protéines ou des interactions des molécules sur les membranes cellulaires) 3, 4. FCS se distingue par rapport aux autres techniques en raison de sa haute sensibilité, ce qui permet la possibilité pour la détection de molécule unique. Cela fonctionne bien pour les concentrations moléculaires dans la gamme nanomolaire à millimolaire, ce qui est typique pour des niveaux d'expression endogènes de la plupart des protéines 5. En outre, FCS peut donner une approximation du nombre absolu de protéines dans le volume étudié, alors que la plupart des autres techniques donnent seulement des informations relatives au sujet des niveaux d'expression de protéine. D'autres méthodes pour mesurer les taux de diffusion moléculaire dans les membranes comprennent fluorécupération rescence après photoblanchiment (FRAP), seul le suivi des particules (SPT), multiple sténopé FCS, et l'image de corrélation méthodes. Méthodes de FRAP et de l' image de corrélation sont des techniques d' ensemble, qui généralement ne donnent pas d' informations sur le nombre absolu de molécules 10. Par rapport à SPT, le débit de FCS est plus élevé en ce qui concerne la caractérisation de la moyenne de la population. L'analyse est moins exigeant étant donné que la vitesse de diffusion moyenne des molécules présentes à l'intérieur de la focalisation du laser est mesurée, plutôt que le taux de molécules uniques. Aussi, à moins que des microscopes spécialisés sont disponibles 11, SPT ne peut donner aucune information sur les concentrations, puisque l' étiquetage SPT standard doit être très faible pour permettre l'identification de molécules simples. D'autre part, FCS exige que les molécules à l'étude pour être mobile. Il sera tout simplement pas détecter d'éventuelles fractions ou molécules immobiles putatifs se déplaçant très lentement. Le taux de molécules de diffusion quirésider dans le foyer plus longtemps que d' environ un dixième du temps d'acquisition ne sera pas correctement représentée dans les mesures de FCS 3, 12. Par conséquent, les coefficients de diffusion enregistrés par FCS ont tendance à être plus rapide que les vitesses de diffusion signalés par des techniques comme FRAP et SPT, où les fractions proches à immobile et très lents sont pris en compte. SPT donnera également une description plus détaillée de la variabilité des taux de diffusion au sein de la population moléculaire que FCS sera.

FCS quantifie la fluctuation d'intensité de fluorescence au fil du temps dans le volume excité. Dans le cas des mesures de la membrane, cela se traduit par la zone éclairée de la membrane. Dans cet article, nous utilisons le fait que de telles fluctuations sont induites par des molécules présentant la diffusion brownienne et se déplacent donc dans et hors du volume d'excitation. Il y a aussi plusieurs autres sources possibles pour la fluctuations du signal de fluorescence, comme clignotant ou la présence d'un état de triplet dans les fluorophores, des effets sur l'environnement, la liaison-déliaison du ligand, ou le déplacement de la membrane de la cellule entière. Ces sources d'erreur putatifs doivent être prises en considération lors de la conception d' une expérience FCS afin d'interpréter correctement les résultats 12, 13. En règle générale, les taux de diffusion latérale dans les membranes biologiques sont faibles en raison de l'encombrement et des interactions entre les deux protéines de membrane et entre les protéines et le cytosquelette. Historiquement, l'utilisation de FCS dans les membranes a ainsi été entravée par le manque de fluorophores photo-stable, qui sont nécessaires pour éviter le blanchiment pendant les temps de transit prolongés à travers la mise au point d'excitation 14. Cependant, aujourd'hui, il y a beaucoup d'options pour les colorants photo-stables appropriés. Des améliorations significatives dans les détecteurs et autres matériels permettent également la détection de prote fluorescentins et colorants de luminosité plus faible. Ici, un protocole de base pour l'application du FCS à l'aide de lymphocytes primaires murins, où la protéine d'intérêt est marqué avec un anticorps étiqueté par fluorescence, est décrite. Une approche pour adapter les courbes d'autocorrélation afin d'en extraire le coefficient de diffusion et la densité moléculaire est également représentée. Le protocole vise à être facilement suivie par immunologistes sans expérience préalable des techniques pour étudier la diffusion des molécules. Cependant, une compréhension de base de la microscopie confocale devrait (d'acquérir cette connaissance de base, voir la référence 15). Ce protocole peut assez facilement être adapté à d'autres cellules en suspension, les deux lignées cellulaires et des cellules primaires. Pour les utilisateurs plus expérimentés FCS, des méthodes d'analyse plus raffinées existent, dont certains sont décrits dans la discussion.

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Protocol

1. Coloration pour FCS

  1. Isoler les cellules NK murines à partir de lymphocytes de la rate à l' aide de marquage magnétique de perles, selon le protocole du fabricant 16. Utilisez 2-3 x 10 5 cellules par échantillon pour les étapes suivantes.
    REMARQUE: Utiliser une sélection négative pour enrichir la population de cellules cibles, en laissant intact, de sorte que les cellules peuvent être marquées en utilisant des anticorps primaires seuls. Voir référence 2 pour obtenir des informations plus détaillées sur l' isolement des cellules de souris 2.
  2. Pour des cellules de souris exprimant les récepteurs Fc, bloquer les récepteurs Fc avec l'anticorps clone 2.4G2 à 5 pg / ul dans 25 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 1% de sérum de fœtus bovin (FBS) par échantillon. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
  3. Préparation d' un mélange d'anticorps.
    1. Utilisez des anticorps directement conjugués à un fluorophore photo-stable. Si deux anticorps contre deux protéines différentessont utilisés, fluorophores d'utilisation qui ont des spectres d'émission bien séparés pour minimiser la diaphonie (par exemple, excité par les 488 et 633 lasers 2, plus tard dans le protocole dénommé les lasers et les fluorophores "verts" et "rouges", respectivement ).
      NOTE: Si les anticorps commerciaux marqués avec des fluorophores photo-stable ne sont pas disponibles pour les biomarqueurs choisis, conjugués anticorps non marqués aux fluorophores selon les instructions du fabricant. Voir le tableau des matériaux pour les anticorps utilisés dans cette étude.
    2. Préparer un mélange d'anticorps par dilution d'anticorps marqués par fluorescence contre la protéine ou des protéines d'intérêt dans du PBS + 1% de FBS. Ajouter le mélange d'anticorps de chaque échantillon à un volume final de 50 ul par échantillon. Incuber sur la glace pendant 45 min dans l'obscurité.
      REMARQUE: Optimisation de la concentration des anticorps à l'avance pour faire en sorte que l'anticorps est utilisé à une concentration saturante, typiquement1 à 10 pg / ml.
  4. Après incubation, laver les cellules en ajoutant 250 pi de PBS et centrifuger les à 150 g pendant 3 min. Jeter le surnageant.
  5. Répétez l'étape 1.4.
  6. Remettre en suspension les cellules dans 200 pi de PBS + 1% de FBS. Gardez sur la glace et dans l'obscurité jusqu'à l'acquisition.
    NOTE: les cellules NK murines peuvent être conservés sur la glace pendant jusqu'à 10 heures.

2. Préparation du microscope Chambered coverglass Diapositives

REMARQUE: Utilisez des diapositives ou des plats de lamelle chambré avec l'épaisseur du verre de couverture que le microscope a été optimisé pour, soit # 1 ou # 1.5. Si le microscope est pas aligné pour une certaine épaisseur, ou si elle est inconnue, l'anneau microscope collier doit être optimisé pour l'épaisseur de la lamelle 17 actuelle.

  1. Diluer la poly-L-lysine avec de l'eau distillée dans un rapport de 1:10. Ajouter 200 ul de dilution de poly-L-lysine dans les chambres et mettre à incuber pendant 20 min.
  2. Retirer lepoly-L-lysine par aspiration et laisser la chambre d'air sec en le laissant sans couvercle à la température ambiante pendant au moins 20-30 minutes.

3. Démarrage du système FCS

NOTE: Ce protocole se réfère à un système de microscope spécifique et logiciel (voir Matériaux / Réactifs Table), bien que d' autres configurations de microscopie et de logiciels peuvent également être utilisés.

  1. Allumer le microscope confocal à balayage laser avec le corrélateur de FCS. Ouvrez le logiciel en mode "Expert". Sélectionnez le 40X lentille d'immersion dans l'eau.
  2. Sous l'onglet "Acquisition", appuyez sur la "Config" et les boutons "Scan" pour ouvrir la "Configuration Control" et les fenêtres "Scan Control" (fenêtres A et B sur la figure 1, respectivement). Sous l'onglet "ConfoCor", appuyez sur "Mesure" pour ouvrir la fenêtre "Mesure" (fenêtre de C dans la figure 1).
  3. Créez un dossier pour enregistrer le FCSdes mesures. Démarrer une nouvelle base de données de l'image en cliquant sur "Nouveau" sous l'onglet "Fichier".
  4. En utilisant le bouton "Laser", allumer la lampe halogène et les lasers pertinents pour exciter les fluorophores (par exemple, 488 nm pour le laser d'excitation "vert" et 633 nm d'excitation pour le "rouge" laser d'excitation).
  5. Sélectionnez les filtres d'excitation et d' émission appropriés et activer les détecteurs correspondants.
    1. Spécifiez les paramètres pour la capture d'image, y compris les lasers d'excitation, d'excitation et d'émission des filtres, chemin de lumière et des détecteurs à utiliser, dans la fenêtre "Configuration Control".
    2. De même, spécifiez les paramètres correspondants pour les mesures FCS dans la fenêtre "Mesure", sous l'onglet "Configuration du système". Utiliser les paramètres aussi semblables que possible pour l'imagerie et FCS.
    3. Activer les canaux de détection pour les enregistrements de FCS en cochant la case "Ch1" pour la channe vertel et "Ch2" pour le canal rouge dans la fenêtre "Mesure".
      REMARQUE: Les paramètres doivent être optimisés pour le fluorophore (s) utilisé, comme dans une expérience d'imagerie confocale standard. Dans des expériences ultérieures, les mêmes paramètres FCS peut être réutilisé par l'ouverture d'un ancien fichier FCS, en utilisant le menu "ConfoCor" déroulant en haut de l'interface utilisateur, et en choisissant "Ouvrir le fichier." Appuyez sur "Réutilisation" dans la fenêtre émergente d'acquisition. De même, les paramètres d'acquisition d'image peuvent être chargés par l'ouverture d'une image enregistrée et en appuyant sur "Réutilisation."
  6. Attendez jusqu'à ce que le laser est stable avant d'effectuer des mesures FCS. Cela peut prendre jusqu'à 30 minutes pour les lasers à gaz, tandis que les diodes lasers stabilisent plus rapidement. Ajuster le sténopé en attendant.

4. sténopé Ajustement

  1. Préparer 0,2-0,5 uM solutions de fluorophores ou des colorants fluorescents correspondant à l'excitation et d'émission des spectres des étiquettes sur les anticorps. lefluorophores doivent avoir connu des coefficients de diffusion 18, 19.
  2. Mettre une goutte de 50 pi de solution avec le fluorophore excité par le laser vert dans le centre d'un puits dans une diapositive coverglass chambré. Mettre une goutte d'eau distillée sur l'objectif de l'eau 40X et positionner la glissière. Appuyez sur le bouton "Afficher" pour démarrer la lumière visible et utiliser l'oculaire de trouver et de mettre l'accent sur la chute de fluorophore.
    REMARQUE: Utilisez la même diapositive que pour les mesures de cellules plus tard, étant donné que de légères variations putatifs dans l'épaisseur du verre entre les diapositives peuvent affecter l'alignement du microscope.
  3. Placer l'accent bien à l'intérieur de la goutte de liquide (10-100 um à partir du bas).
  4. Dans la fenêtre "Mesure", sélectionnez l'onglet "Acquisition". Appuyez sur "Position actuelle" sous les "Positions" (fenêtre de C dans la figure 1).
  5. Retour à l'onglet "Configuration du système" dans la même fenêtre. Définir une haute peurs pour le laser vert.
    REMARQUE: un laser à haute puissance fait référence à la puissance de saturation ( à savoir, le signal fluorescent ne pas augmenter de façon linéaire si la puissance du laser est augmentée plus loin). Autour de 1 mW de réglages système de puissance, ou 5-10% de la puissance du laser max, est généralement suffisant.
  6. Tester la stabilité du signal en appuyant sur "Démarrer". Cela va ouvrir une fenêtre séparée affichant la trace du temps et de la courbe d'autocorrélation pour la mesure de courant. Vérifiez que le signal fluorescent est élevé, stable dans le temps, et montrant les fluctuations du kHz plutôt que la gamme de Hz.
  7. Sélectionnez le bouton "O Ajuster" dans la fenêtre "Mesure". Vérifiez si le canal de détection droite (Ch1 ou Ch2) est sélectionné. Appuyez sur "AutoAdjust X." Si la courbe résultante ne montre pas un maximum clair, ou le maximum est à la pointe, marquer l'option "grossier" et appuyez sur "AutoAdjust X" à nouveau. Lorsque l'écran résultant dans la direction x est terminé, procédez comme samoi Y en appuyant sur "AutoAdjust Y."
  8. De-sélectionner "grossier" et alterner entre le réglage X et Y en appuyant sur "AutoAdjust" jusqu'à ce que les deux ont des maxima clair et les valeurs ne changent pas entre les mesures.
  9. Si les cellules sont marquées avec deux fluorophores différents, passer à une chambre dans laquelle la solution de fluorochrome rouge a été ajouté. Sélectionnez une forte puissance de laser pour le laser rouge et répétez les étapes 4,6-4,8 pour le canal d'excitation et de détection rouge.
    NOTE: Si les valeurs X et Y dévient entre les canaux dans les systèmes où un seul sténopé est utilisé pour les deux canaux de détection, sélectionner des valeurs intermédiaires et appuyez sur OK pour accepter les modifications. Ici, pour le laser à 488 nm avec des maxima à X = 79 et Y = 189 et le laser de 633 nm avec des maxima à X = 80 et Y = 188, les valeurs X = 80 et Y = 189 ont été sélectionnés. La combinaison des 488 nm et 633 nm pour l'excitation des lasers des deux anticorps marqués avec des fluorophores excités par 488 nm ou 633 nm, est un bon choix car lerisque de diaphonie est réduite si les spectres d'émission ne se chevauchent pas 2.

5. Mesurer le temps de transit du fluorophore gratuit

REMARQUE: par la détermination du temps de transit à travers le foyer (taud) d'un fluorophore ayant un coefficient de diffusion connu, la taille du volume de détection, et par conséquent la surface de la membrane cellulaire qui est à l'intérieur du foyer, peuvent être calculés. Le calcul de taud est décrite à l'étape 7.2.

  1. En utilisant les mêmes solutions utilisées pour le réglage sténopé, régler le temps d'acquisition à 30 secondes x 2 répétitions sous l'onglet "Acquisition" dans la fenêtre "Mesure" (figure 1, la fenêtre C).
  2. Démarrer une mesure en cliquant sur "Démarrer" dans la fenêtre "Mesure" (figure 1, la fenêtre B).
    1. Effectuer une série de puissance laser pour chaque laser d'excitation et le fluorophore correspondant en solution, en commençant à ou près desaturant la puissance et la diminution de moitié pour chaque mesure. Changer la puissance du laser dans l'onglet "Configuration du système" de la fenêtre "Mesure" (figure 1, la fenêtre C). Appuyez sur le bouton "Démarrer" pour démarrer une mesure.
      NOTE: Inclure la puissance du laser pour les prochaines mesures de cellules dans la gamme inférieure (par exemple, mesurer à 16, puissance 8, 4 et 2 uW, avant l'objectif) 20. les paramètres du laser du système sont en général plus élevée que l'excitation de sortie et peut varier largement en fonction du microscope et la qualité de l'alignement. Dans ce système, la gamme de puissance ci-dessus correspond à environ 60-500 uW des paramètres du système électrique. Il est conseillé d'utiliser un wattmètre pour mesurer la puissance de sortie avant l'objectif pour la première fois un nouveau microscope est utilisé. La puissance maximale actuelle du laser se trouve sous le bouton "Info" de la fenêtre "Mesure".
    2. Notez les chiffres par molecule (CPM, unité: kHz) à partir de chaque mesure de puissance laser.
    3. Si deux canaux de détection sont utilisées, vérifiez la fenêtre affichant la courbe d'autocorrélation de diaphonie. Utiliser une solution ne contenant que des fluorophores verts pour mesurer détecté autocorrélation FCS dans le canal de détection et une solution rouge avec seulement des fluorophores rouges pour évaluer la détection dans le canal de détection vert. En règle générale, garder le CPM détecté à partir du fluorophore "mauvais" en dessous de 5% du signal spécifique du fluorophore approprié.
    4. Vérifier que les valeurs échelle linéairement avec la puissance du laser utilisé. Saturation du CPM à la puissance du laser le plus élevé (c. -à- valeurs légèrement inférieures que prévu à partir d' une relation linéaire) est acceptable.
      NOTE: CPM devrait être bien au-dessus de 10 pour la puissance du laser le plus élevé pour presque tous les systèmes de microscope et fluorophores communs et peut être significativement plus élevé pour les systèmes sensibles. La première fois un anticorps fluorescent nouvellement conjugué est utilisé, effectuer unemesure FCS de l'anticorps diffusant librement en solution pour quantifier le CPM attendu. Avant la mesure, le manteau de la chambre de mesure avec 200 ul d'acide poly-L-lysine greffées avec du polyéthylène glycol (dilué à 0,5 mg / ml dans du PBS) pendant 1 heure à température ambiante. Retirer le liquide avec une pipette et permettre à la chambre à air sec. Enregistrer la solution mère dans le réfrigérateur (jusqu'à 2 semaines) et la poudre disponible dans le congélateur. Au microscope, on dilue l'anticorps à 1-10 ug / ml dans du PBS. Suivez les étapes 4,2-4,4 et 6,7 dans ce protocole. Si la surface est pas revêtue d'une solution anti-adhésive, les anticorps vont interagir avec la surface du verre et être appauvri rapidement à partir de la solution.

6. Mesures cellulaires

  1. Ajouter 125 pi de cellules dans du PBS + 1% FCS de la suspension d'anticorps marqué cellule (étape 1.5) et 150 ul de milieu Roswell transparent Institut Memorial Park 1640 (RPMI) dans un puits d'une lame de lamelle 8 puits chambré. Leave les cellules dans l'obscurité à la température de mesure pendant au moins 20 min avant de commencer les mesures FCS.
    Remarque: il est de permettre aux cellules de se déposer et fixer sur le fond des puits et pour équilibrer les cellules et la solution à la température de mesure.
  2. Dans la fenêtre "Scan Control" (figure 1, la fenêtre B), réglez le zoom 1 et commencer un balayage XY rapide en appuyant sur le bouton "XY rapide". Modifier la puissance du laser de sorte qu'il soit aussi faible que possible alors que les cellules sont toujours bien visibles. Centrer l'image sur une cellule ronde de luminosité moyenne, où la membrane est clairement définie et il n'y a pas de signal fluorescent dans le cytoplasme. Zoom jusqu'à ce que la cellule couvre la majeure partie de l'image.
  3. Sélectionnez une nouvelle cellule si la cellule courante est en mouvement ou affiche vrilles, extrusions, ou des taches très lumineux. Garder le même zoom et la puissance du laser pour toutes les cellules capturées au cours de la même expérience.
    NOTE: Une membrane ébouriffé peut aussi être un signe de la prochaine apoptosis.
  4. Mettre l'accent sur le dessus de la membrane cellulaire. Dans l'onglet "Acquisition" de la "mesure" fenêtre (Figure 1, la fenêtre C), sélectionnez une position pour la mesure FCS en activant "Crosshair." Sinon, sélectionnez l'onglet "LSM de l'image", marquer le point de mesure voulu dans l'image de LSM, et appuyez sur "Ajouter la position."
    REMARQUE: La partie supérieure de la membrane cellulaire ne sera pas influencée par les anticorps fluorescents des fluorophores ou non spécifiquement liés à la poly-L-lysine. Cependant, il est important de vérifier que la cellule ne se déplacent pas au cours de la mesure (voir les résultats).
  5. Dans l'onglet "Acquisition" de la fenêtre "Mesure" (figure 1, la fenêtre C), définissez le nombre de répétitions à 6-10, avec le "temps de la mesure" fixé à 10 secondes par répétition.
  6. Retour à l'onglet "Configuration du système" de la fenêtre "Mesure". Régler la puissance du laser pour la mesure FCS sous le "Lbouton aser ". Avant l'objectif, utiliser une faible puissance pour les mesures de cellules, dans l'intervalle entre 1 et 10 uW 20.
    NOTE: Les valeurs recommandées sont un compromis entre la détection du signal et le photovieillissement aux cellules. Voir l'étape 5.2.1 Notez le pourcentage de la puissance du laser ces valeurs correspondent à.
  7. Lancer une mesure FCS en appuyant sur "Démarrer" dans la "mesure" fenêtre (fenêtre C). Si les agents de blanchiment de la cellule de façon notable au début de la mesure, détectée par une chute de la courbe d'intensité de plus de 30% au cours des 10 premières secondes (un exemple est représenté sur la figure 3A, panneau inférieur), se déplacer vers une autre cellule et inférieure la puissance du laser pour les mesures futures.
    1. Si le signal est perdu, la mise au point dans la direction Z. Après la mesure est terminée, utilisez la fenêtre "Scan Control" (figure 1, la fenêtre B) pour vérifier que la cellule est toujours centrée et que la membrane cellulaire a été mesurée. Si ee cellulaire est déplacé, défaussez la mesure.
    2. Dans la fenêtre d' auto-corrélation où la mesure est affichée, supprimer manuellement les répétitions individuelles qui contiennent des manœuvres de zoom, de blanchiment, de grandes grappes, ou d' autres objets (voir les exemples dans la figure 3). Pour ce faire, en les marquant, clic droit, et en choisissant "Supprimer". Enregistrez le fichier final au format .fcs. Faites au moins quatre répétitions par cellule.
  8. Le cas échéant, d'acquérir une image de la cellule à la section médiane (avec toute la circonférence de la membrane visible) en utilisant la fenêtre "Scan Control". Capturez l'image après la mesure FCS pour éviter le blanchiment. Appuyez sur le bouton "Single" pour lancer la capture d'image.
  9. Si vous utilisez "Ajouter position" pour la mise au point de positionnement FCS, cliquez sur "Supprimer position" avant de passer à la cellule suivante.
  10. Passez à une nouvelle aliquote de suspension cellulaire après un maximum de 2 heures de mesure pour maintenir les cellules throughou viablest l'expérience.

7. FCS Analyse

  1. Ouvrez les fichiers .fcs dans un logiciel avec courbe capacité d' adaptation (voir Matériaux / Réactifs Table pour le logiciel utilisé dans ce protocole).
    REMARQUE: Le logiciel FCS qui vient avec le microscope est un bon endroit pour se familiariser avec montage de base, mais un logiciel supplémentaire est nécessaire pour adapter la diffusion en deux dimensions membrane.
  2. Tout d'abord, déterminer la taille du volume d'excitation en analysant les mesures fluorophores libres. Mettre en place une courbe de diffusion libre en 3 dimensions aux courbes d'autocorrélation 21.
    Équation (Eq. 1)
    NOTE: Définition des paramètres: N: temps de corrélation, τ D (taud): nombre d'entités fluorescentes dans le volume focal, τ (Tau) signifie le temps de séjour moyen dans le volume focal, T 1: probabilité pour que les fluorophores à être en l'état triplet, τ <sub> T: temps de relaxation pour les transitions d'état singulet-triplet, S: rapport de la hauteur à la largeur de diamètre pour le volume focal.
    1. Extrait Taud, le temps de transit pour les molécules à transférer le focus.
    2. Utiliser les coefficients de diffusion observées taud et publiées (D) de fluorophores utilisés pour le calibrage 18, 19 pour calculer le rayon sténopé (ω).
      Équation (Eq. 2)
  3. L' analyse des courbes d'auto - corrélation sur les membranes cellulaires.
    1. Pour visualiser la partie de la courbe représentant la diffusion moléculaire, sélectionnez le délai de départ avant la pente la plus raide de la courbe d'autocorrélation et se terminant après la courbe des convergences à 1 (par exemple, de 0,001 à 5 s pour les récepteurs de surface murins; voir la figure 4).
    2. Générer une courbe d'autocorrélation moyenne des répétitions individuelles enregistrées in étape 6.7.2.
    3. Mettre en place une courbe de diffusion de la membrane 2 dimensions pour chaque courbe d'autocorrélation en utilisant l' équation 3 3 en moyenne.
      Équation (Eq. 3)
      REMARQUE: les paramètres de sortie importants sont les suivants: N est le nombre moyen de molécules résidant dans la zone de membrane excité. Recalculer à la densité (N / um 2). τ D (taud): temps de séjour moyen dans le domaine d' intervention, limitée par la bi-dimensionnalité de la membrane (s). Recalculer le temps de séjour moyen d'un coefficient de diffusion (2 pm / sec) par le rayon déterminé sténopé (ω) et l' équation 2. T1 est la probabilité pour que les fluorophores soient dans l'état triplet. La luminosité (CPM) est calculé en divisant l'intensité globale moyenne de la mesure par N.
    4. Si un bon ajustement est pas atteint à la première tentative, changer les valeurs de départ et / ou les limites supérieures et inférieures pour les variables jusqu'à this est atteint.
      REMARQUE: Les limites supérieures inférieurs typiques pour les taux de diffusion de protéines dans les membranes cellulaires primaires sont 10-500 msec pour Taud, 0-100% pour les T1 et 0,1-5 msec pour TauT1. Sélectionnez des valeurs pour la mise en place à partir du milieu de ces intervalles. La partie de la courbe représentant les variations de fluorescence provenant de la diffusion est typiquement situé entre 1 ms et 1 s (voir figure 4). Selon le fluorophore, il peut parfois être un second processus actuel, qui donne lieu à autocorrélation à des échelles de temps plus courtes que le paramètre de diffusion. Ceci est causé par un état sombre transitoire (triplet) ou clignote (comme se produit souvent pour des protéines fluorescentes). Un état triplet est pris en compte dans l'équation 3, et le modèle présenté devrait donc également fournir un bon ajustement dans ces situations.

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Representative Results

Un résultat typique va générer une courbe d'auto-corrélation avec un temps de transit dans la plage de 10 ms à 400 ms pour les protéines de membrane. Le nombre de molécules peut varier entre 0,5 et environ 200 um par 2 pour les protéines exprimées de manière endogène. Vérifiez soigneusement que le CPM est pas plus faible que prévu. Cela peut signifier qu'il ya une influence du signal d'arrière-plan. En règle générale, le signal de la RPC sur les cellules qui est accepté pour l'analyse ne doit pas être inférieure à 33% de la CMP pour diffuser librement des anticorps à la même puissance de laser. La CMP doit évoluer de façon linéaire avec la puissance du laser. On prévoit que la courbe d'auto-corrélation pour le système immunitaire des récepteurs de surface des cellules primaires pour être lisse, à la partie la plus pentue entre 0,001 et 1 seconde. Voir la figure 2 pour une courbe d'autocorrélation représentative et sa trace de temps.

Comme il est mentionné brièvement dans l'introduction,re ya plusieurs cas où FCS ne convient pas pour la mesure de la diffusion moléculaire en raison de l'influence d'autres sources de fluctuations de fluorescence, qui contribuent à confondre le signal. La figure 3 montre des exemples de cas dans lesquels une répétition de cellule ou mesure particulière doit être éliminé. Il a déjà été mentionné que un signal extrêmement faible (très faible CPM) est un motif de rejet de la cellule. Une autre raison pour rejeter la cellule individuelle est que la cellule est en mouvement (figure 3A). Dans le cas de blanchiment (figure 3B) ou si de grands groupes sont présents (figure 3C), les mesures doivent être jetées si l'effet est considérable ou présent dans toute la mesure. Si cette fonction est présente seulement dans une ou deux répétitions, ces répétitions individuelles peuvent être jetés, mais les répétitions restantes peuvent encore être utilisés.

Il est important à la fois utiliser le bonmodèle pour adapter les données et aussi de vérifier soigneusement que l'ajustement chevauche étroitement avec la courbe d'autocorrélation. Dans la figure 4, des exemples de bonnes et de mauvaises crises de courbe sont présentés. Portez une attention particulière à la partie de la courbe représentant la diffusion (la partie en pente la plus forte). Il est également important de vérifier que le début et la fin de la partie en pente de la courbe sont bien ajustées par le modèle. Si l'ajustement est mauvais, sans problèmes apparents, tels que mobiles, blanchiment, ou clusters, modifiez les valeurs de départ et / ou les limites supérieures et inférieures (dans une fourchette raisonnable) avant de prendre une décision finale de se défaire de la cellule.

Figure 1
Figure 1: interface logicielle FCS. Voici les principales fenêtres nécessaires pour faire fonctionner l'outil logiciel pour l'acquisition et l'imagerie FCS, comme décrit dans le protocole. Fenêtre A, le «Co Configurationntrol "fenêtre est la fenêtre de commande pour le trajet du faisceau, canaux laser, et des filtres pour l'imagerie. Fenêtre B est le" Scan Control "fenêtre pour l'imagerie et affiche les paramètres de numérisation. Fenêtre C est la« fenêtre de mesure ", la fenêtre pour la configuration des paramètres de mesure de FCS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: trace représentant et autocorrélation courbes de diffusion H-2D d classe majeure d'histocompatibilité I surface des molécules dans les cellules NK murines fraîchement isolées. Le panneau supérieur de la figure montre la variation de la fluorescence en fonction du temps durant toute trace de temps de 7x 10 mesures sec. Le panneau inférieur représentes la courbe d'autocorrélation moyenne de ces sept répétitions. La hauteur de la courbe d'auto - corrélation est inversement proportionnelle à la concentration de fluorescence marqué mobile H-2D d entités au sein du volume focal. La valeur de l' axe des x à la partie la plus raide de la pente de la courbe, la moitié de l'amplitude, représente le temps de séjour moyen de marquage fluorescent H-2D molécules d dans le volume focal. La mesure présentée est une partie de l'ensemble des données publiées dans la référence 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3: Exemples de traces de cellules problématiques. (A) Une cellule en mouvement, comme le montre la trace ne pas avoir un stable basale level. Le panneau supérieur montre un exemple où la cellule entière est passée de mise au point après environ 35 sec, tel que représenté par le signal très faible après ce point de temps. Dans le panneau inférieur, l'effet est plus subtil, avec des ondulations apparentes à un intervalle de quelques secondes. (B) Cell affichage blanchiment, la hauteur de la trace en diminuant avec le temps. Comparer la hauteur de la trace au début de la mesure pour qu'à la fin de la mesure. (C) La présence de grands groupes, représentés par des pics dans la trace. Dans le panneau supérieur, un grand groupe à 20-25 sec est présent. Dans le panneau inférieur, plusieurs groupes sont présents dans toute la mesure. Les mesures présentées sont une partie de l'ensemble des données publiées dans la référence 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 4: Courbes de autocorrélation représentatifs avec ajustement de la courbe et de résidus. Les lignes verticales rouges et bleues représentent les limites de la fenêtre temporelle utilisée pour le montage. (A) Exemple d'ajustement représentatif d'un modèle de diffusion en 2 dimensions à une courbe d'auto - corrélation échantillon. Dans le panneau supérieur, la courbe verte (le modèle) se superpose à la courbe bleue (l'autocorrélation acquise), ce qui indique un bon ajustement. Le panneau inférieur montre la valeur résiduelle de l'ajustement de la courbe. Les fluctuations autour de 1 sec, qui ne sont pas bien équipés, sont typiques pour des mesures de cellules et sont tolérables. (B) Exemple d'un mauvais ajustement de la diffusion à deux dimensions de la même courbe d'auto - corrélation. Modèle ajusté ne recouvre pas la courbe d'auto-corrélation, et il ne converge pas à 1. Les panneaux inférieurs de (A et B) montrent le résidu de l'ajustement de courbe. Les résidussont considérablement plus importants pour le mauvais ajustement, en particulier pour la partie de diffusion de la courbe. La mesure présentée est une partie de l'ensemble des données publiées dans la référence 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Ce protocole a pour FCS peut être utilisé pour l'évaluation de la dynamique moléculaire des molécules de surface sur tous les types de cellules immunitaires (murins, humains ou d'autres espèces). Mesures FCS dynamique moléculaire spatio-temporelles vers le bas à la résolution une seule molécule dans les cellules vivantes. La densité moléculaire, ainsi que la vitesse de diffusion et de regroupement dynamique des protéines d'intérêt, peuvent être extraits à partir des courbes d'auto-corrélation.

Le marquage fluorescent est d'une importance cruciale pour les expériences réussies de FCS. Des protéines d'intérêt sur la membrane cellulaire ont traditionnellement été marqués en utilisant des anticorps et des anticorps sont souvent plus commode pour une utilisation sur des protéines de surface dans les cellules immunitaires naïves. anticorps non marqués doivent être directement conjugués à des colorants fluorescents photo-stable avec une luminosité moléculaire élevée. Le choix du fluorophore pour la conjugaison d'anticorps est important pour la qualité des mesures. Etiquettes standard pour la cytométrie de flux,tels que la fluorescéine et des colorants à base phycoérythrine, ne sont pas recommandés en raison de blanchiment rapide. colorants photo-stable pour la conjugaison directe à des anticorps sont actuellement fournis par plusieurs entreprises. Les fabricants fournissent habituellement des protocoles satisfaisants pour la conjugaison et la purification de l'anticorps conjugué résultant, et cela peut être fait en quelques heures. Il est également possible d'effectuer FCS en utilisant des protéines fluorescentes, mais des précautions particulières doivent être prises pour réduire au minimum la puissance du laser, car les protéines fluorescentes sont en général plus sujettes au blanchiment de la plupart des fluorophores chimiques photo-stable. Selon l'expérience précédente, sur-expression de protéines conduit souvent à une diminution considérable du taux de diffusion en raison de l'encombrement, ce qui rend l'utilisation de protéines fluorescentes inadapté.

l'étalonnage sténopé avant les mesures est une étape critique. Les fluorophores utilisés pour déterminer la taille du volume focal doit avoir connu le coefficient de diffusions (voir équation 2). Utiliser des fluorophores libres correspondant étroitement aux spectres d'émission des marqueurs d'anticorps pour déterminer la taille du volume focal. Cela doit être fait pour assurer l'efficacité optimale du signal et la détection correcte des corrélations croisées potentielles entre les canaux de couleur. Effectuer une série de puissance laser FCS des fluorophores diffusant librement pour assurer que le système donne le signal de sortie attendu sur une plage de puissances. Comparez le CPM à la même puissance laser entre les expériences pour assurer la cohérence entre les expériences.

Dans l'étape d'analyse, il est essentiel de mettre des gammes raisonnables et les valeurs de départ pour les variables lors du montage des modèles. Utiliser les connaissances déjà publié des systèmes cellulaires similaires à trouver de bons points de départ. Théoriquement, FCS est une technique quantitative, mais étant donné que les conditions optimales sont rares, un certain degré de prudence doit être prise lors de l'interprétation des résultats. Tous les types de fluctuations seront enregistrées,quelle que soit l'origine de ces fluctuations. Par conséquent, il est utile d'avoir autant d'informations que possible sur le système expérimental afin d'exclure les sources d'erreurs possibles. Par exemple, le déplacement de la membrane de la cellule entière donne lieu à des fluctuations à long taud (figure 3A), alors que les contaminants putatifs des fluorophores libres dans la solution se diffuse à taud au moins dix fois plus courte.

Ce protocole de base peut être modifiée de plusieurs manières. Si deux protéines sont marquées avec des fluorophores différents, la co-diffusion (une mesure indirecte de l'interaction) peut être évaluée en élargissant la méthode pour détecter la corrélation croisée. La mesure dans laquelle ces protéines se lient les uns aux autres dans la membrane de la cellule est représentée par la hauteur de la courbe de corrélation croisée par rapport à la hauteur des courbes d'auto-corrélation des canaux de couleur individuels. Corrélation croisée est notée Ch1 Ch2-dans le logiciel de mesure. Le Preanalyse de cise de corrélation croisée nécessite des contrôles pour la diaphonie et est donc un peu plus compliqué que le protocole présenté ici. Une description détaillée de la façon de procéder, comme une extension de ce protocole de base, peut être trouvée dans Strömqvist et al. 13. Afin d' optimiser le positionnement dans la direction z, z-balayage FCS 22 peuvent être utilisés. Selon l'expérience précédente, il a été satisfaisant de le faire manuellement. Il est également possible d'adapter plusieurs coefficients de diffusion à une courbe d'autocorrélation FCS 23. Cela suppose une connaissance préalable du nombre de sous-populations ayant des vitesses de diffusion et des vitesses de diffusion approximatif d'au moins l'une des sous-populations. Sinon, il y aura trop de variables libres, qui rendront la fiabilité de montage. Un exemple typique serait une protéine de surface dont le taux de diffusion est considérablement ralenti par la liaison d'un ligand. Enfin, Cleaning la trace des valeurs aberrantes , sans tout à la suppression des répétitions est possible 24.

L'absence d'un signal fluorescent est un problème commun à résoudre. Pour diffuser librement fluorophores, utilisez la lampe halogène pour vérifier si la chute est fluorescent. Si la chute est pas fluorescent, mélanger un nouveau lot de fluorophores avec une concentration légèrement augmenté (dans la gamme nM) et essayez à nouveau. Vérifiez que la mise au point est à l'intérieur de la goutte fluorescente, les lasers sont activés dans le logiciel, la puissance du laser est suffisante, les filtres et les détecteurs d'émission appropriés sont choisis, et les bons canaux dans la fenêtre "FCS mesure" sont activés (voir étape 3.6). Démarrez le laser et regarder du côté de confirmer visuellement que la lumière laser atteint l'échantillon. Évitez de regarder directement dans la source laser. Si le filtre d'émission sélectionnée comprend la longueur d'onde du laser, un obturateur automatiquement bloquer la trajectoire de la lumière pour éviter d'endommager le détecteur. jef tous les paramètres sont bien, mais pas de lumière arrive, re-démarrage des lasers, le système FCS, et l'ordinateur. Demandez à un expert si l'absence d'un signal fluorescent persiste. Une procédure simplifiée si les cellules marquées ne présentent pas de fluorescence. Confirmer la présence de fluorescence avec la lampe halogène; allumer les lasers, sélectionnez les canaux laser, et d'ajuster la puissance du laser. Sélectionnez une position sur la membrane cellulaire, en utilisant soit l'option "Ajouter position" (voir étape 6.4) "Crosshair" ou. Passer à l'échantillon suivant si le signal est encore trop faible.

Un aspect important de la base de la technique de fluctuation est que les molécules doivent être relativement mobiles à détecter. fractions de molécules ou de molécules piégées dans des zones plus petites que la mise au point pendant tout le temps de mesure se déplaçant très lentement ne peut donc pas être mesurée. Ceci conduit à une sous-estimation possible de densités surfaciques et une surestimation de la vitesse de diffusion. Décolorationpeuvent également contribuer à une sous-estimation putatif de la densité et taud, puisque les molécules auront une plus grande probabilité d'être blanchi plus long temps qu'ils passent dans le volume focal laser lumineux. Influence de l'arrière-plan (fluorescence provenant de l'extérieur du plan focal) serait, d'autre part, d'augmenter artificiellement le nombre de molécules détectées et diminuer la CMP mesurée. Auparavant, l'erreur maximale totale dans la détermination de la densité absolue a été estimée à environ 40% 20. Cependant, il est généralement possible de comparer les différents échantillons biologiques à l'autre, étant donné que les sources d'erreurs sont, dans la plupart des cas, égale dans toutes les expériences. Une autre source potentielle d'erreur est que les anticorps sont bivalents, ce qui signifie que chaque anticorps peut potentiellement se lier à deux molécules cibles. Les auteurs ne ont observé ce phénomène, mais il ne peut être garanti que ceci est une caractéristique mondiale pour d'autres anticorps. L'influence potentielle de bivalence doitdonc être testés individuellement pour chaque anticorps. La combinaison d'anticorps primaires et secondaires marqués spécifiques ne doit jamais être utilisé en raison du risque élevé d'induire des grappes artificielles à partir de deux étiquettes bivalents successives. Si les cellules ont plutôt été transfectées avec des versions de la protéine fluorescente marquée de la protéine d'intérêt, chaque protéine aura une seule étiquette. Cependant, cela nécessite la transfection, ce qui est pas toujours souhaitable et peut même ne pas être possible (par exemple si l'on utilise directement les cellules immunitaires isolées du sang humain). Enfin, un seul point FCS ne comptabilise pas les images. Si les images sont nécessaires pour la publication ou d'autres fins, celles-ci doivent être capturés séparément à l'aide de la partie d'imagerie du logiciel. capturer des images toujours après les mesures de FCS afin d'éviter le blanchiment inutile de la surface cellulaire.

Contrairement à FCS, la microscopie confocale à base de traditionnels, tels que FRAP, et les méthodologies de corrélation d'images ne peut pas quantifier les fluctuations de fluorescenceau niveau d'une seule molécule 6. Méthodologies image de corrélation mesurent le nombre de molécules indirectement et avec une résolution inférieure, mais ils peuvent évaluer la variabilité de diffusion moléculaire et le regroupement sur l' ensemble de la zone imagée 25. SPT standard mesurée par microscopie confocale a un niveau idéal de l' étiquetage, des ordres de grandeur inférieure à 7 FCS. Par conséquent, la densité des protéines marquées ne peut pas être mesurée par la norme SPT. La combinaison de SPT avec d' autres techniques de microscopie (par exemple, la microscopie optique de reconstruction stochastique ou photoactivation localisation microscopie) permet la densité et le mouvement à évaluer, mais il requiert des colorants ou des protéines 11 très spécialisés. techniques Super-résolution, tels que des échantillons structuré microscopie illumination et émission stimulée microscopie épuisée, nécessitent souvent fixes et une combinaison de primaire et des anticorps secondaires pour Labeling 26. La localisation est donc très précise, alors que la dynamique du système ne peuvent pas souvent être évalués. En comparaison avec SPT et les techniques de super-résolution, FCS exige également beaucoup moins d'énergie et de temps ordinateur pour l'analyse et l'extraction des résultats. Cytométrie en flux est le cheval de bataille de l'immunologie et peut être avantageusement combiné avec FCS. Tri cellulaire peut, par exemple, être suivie par des mesures successives sur les populations cellulaires sélectionnées si des colorants photo-stables ont été utilisés avant le triage. FCS est donc une méthode qui peut être utilisée seule ou en combinaison avec d'autres méthodes établies.

Ce protocole peut être utilisé pour identifier les dispositifs actuellement inconnus de la dynamique et les interactions des cellules immunitaires à l'intérieur de la membrane cellulaire au niveau d'une seule molécule. En outre, les caractéristiques des populations entières par rapport à des sous-ensembles sélectionnés peuvent être comparés. Il a également un rôle potentiel comme une étape de sélection pour la thérapie cellulaire immunitaire. Étant donné que les mesures nepas consommer la cellule, contrairement à la plupart des autres méthodes pour étudier la fonctionnalité des cellules immunitaires, les cellules individuelles peuvent potentiellement être récupérés et mis en culture. Ainsi, après l'analyse des courbes de FCS, les cellules prometteuses peuvent être extraites et élargis pour d'autres applications, y compris les applications cliniques putatifs.

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Acknowledgements

Nous remercions le Dr Vladana Vukojevic, Centre de médecine moléculaire, Karolinska Institutet pour l'entretien de l'instrument Zeiss ConfoCor 3 et pour obtenir des conseils utiles concernant les mesures de cellules. Cette étude a été financée par des subventions de Vetenskapsrådet (numéro de subvention 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse et de Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II Miltenyi Biotec NordenAB 130-096-892 Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum Sigma-Adlrich F7524 Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline - - Made in house 
Roswell Park Memorial Institute medium 1640 PAA The Cell Culture Company  E15-848 Transparent medium
Antibody clone 2.4G2 Thermo Fischer Scientific 553140 For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody  Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody  BD Pharmingen 558915 Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488 Mobiotech MFP-A2181 Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920 Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) SuSoS AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride Sigma-Aldrich 432202 Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific  A20006 Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20
Confocal microscope  Zeiss LSM510
Software: Confocor 3 Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox Matlab Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo-scientific  155411 8 wells, 1.0 borosilicate bottom

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References

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