Погружение Замораживание: Инструмент для ультраструктурных и иммунолокализации исследований в суспензии клеток в просвечивающей электронной микроскопии

Published 5/05/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Эта рукопись описывает простой в использовании и недорогой метод cryofixation для визуализации клеток суспензии с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Cite this Article

Copy Citation

Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) является экстраординарным инструментом для изучения ультраструктуры клеток, для того, чтобы локализовать белки и визуализации макромолекулярных комплексов с очень высоким разрешением. Однако, чтобы получить как можно ближе к родному государству, требуется совершенное сохранение образца. Обычная электронная микроскопия (ЭМ) фиксация с альдегидами, например, не обеспечивает хорошую сохранность ультраструктурной. Медленное проникновение фиксаторов вызывает реорганизацию клеток и потерю различных клеточных компонентов. Таким образом, обычные ЭМ фиксация не позволяет мгновенной стабилизации и сохранения структур и антигенности. Лучший выбор для изучения внутриклеточных событий является использование cryofixation с последующим методом фиксации сублимационной замещения, который держит клетки в нативном состоянии. Замораживание под высоким давлением / вымораживание замещение, которое сохраняет целостность клеточных ультраструктур, является наиболее часто используемым методом, но требует expensiве оборудования. Здесь, простой в использовании и недорогой способ фиксации замораживание с последующим вымораживанием замещения для суспензии культур клеток представлена.

Introduction

Подготовка образцов имеет решающее значение для успеха любого электронной микроскопии исследования. Обычные фиксации ЭМ был основным методом для фиксации ткани или клеток для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) 1. Во-первых, альдегиды и четырехокись осмия используют химически фиксировать материал при комнатной температуре. Затем материал обезвоживает с помощью органических растворителей, инфильтрации и заливал в эпоксидной смоле. Этот метод зависит от скорости проникновения фиксаторов в клетку. Следовательно, артефакты и добыча клеточного содержимого, как правило , наблюдаются 2.

Cryofixation явно лучшая альтернатива для сохранения клеточных структур 3, сохраняя их нетронутыми. Высокое качество изображений ПЭХ 4 в тонких срезах смол может быть получено с использованием методы замещения cryofixation / замерзания. Цель этого метода состоит в получении остеклованного битодические образцы без образования кристаллов льда или содержащих кристаллы льда, достаточно маленьких, чтобы не повредить ультраструктуры клеток. Замораживание высокого давления (ФВЧ) и сверхбыстрый cryofixation, который также называют врезанием замораживанием (PF), два метода cryofix образцов. ФВЧ удерживающую молекулы в клетке мгновенно и позволяет избежать повреждений, вызванных обычной фиксации EM. Несколько типов морозильных машин и устройств автоматического замещения были разработаны 5. Замораживание машины и расходные материалы (жидкий азот, образец носители и т.д.) являются дорогостоящими, но они позволяют производить высококачественные электронные микрофотографии 6, 7. ПФ представляет собой метод , который был использован в начале 1950 - х годов и описан в литературе , как простые и дешевые 8 .Во процедуру PF, приготовленный образец замораживали при быстром темпе , чтобы получить кристаллы льда размером менее 3 до 5 нм. С этой целью, образецпогрузился в жидкий криогенный, таких как этан, пропан, этан или пропан-смеси. С 1950-х годов, улучшения PF было сделано, чтобы сделать этот метод доступным для большего числа пользователей. Замораживание под высоким давлением , в настоящее время является единственным реальным способом заморозить большое разнообразие образцов толщины более 50 мкм (до толщины 200 мкм для дискообразных образцов) 5, в то время как ПФ широко используется для изображений малых объектов (<100 нм ), такой как макромолекулярные комплексы , взвешенных в виде тонкой пленки аморфного льда 9. Более крупные образцы, например , эукариотических клетках, может быть cryofixed ОФ, но требует держатели для образцов, таких как капиллярное медных трубок или систем сэндвич - 8, 10, 11.

Здесь, быстрый, простой в использовании и низкой стоимости погружной технологии замораживания / сублимационной замены используемой для различных культур клеток суспензии представлена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получение пленки формвар сетки

Примечание: Выполнение манипуляций хлороформ под вытяжкой с использованием средств индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат, очки). С помощью 400 меш электронной микроскопии медные сетки. С другими типами сетки (другие размеры сетки, золото и никель сетках), качество замораживания хуже.

  1. Готовят раствор 100 мл 0,3% формвар в хлороформе. Позвольте ему раствориться в течение ночи без перемешивания.
  2. Поместите 400 меш (число отверстий на квадратный дюйм) электронно-microscopycopper сетки (диаметр 3,05 мм) в стеклянный флакон (высота 3 см и диаметром 2 см), содержащей ацетон. Перемешать стеклянный пузырек с круговым движением руки. Удалите ацетон с пластиковой пипеткой передачи. Разрешить испарение растворителя в течение 5 мин. Передача сетки путем заливки их на фильтровальную бумагу и дать им высохнуть в течение 5 мин.
  3. Польский стеклянный слайд 76 х 26 мм 2, протерев его безворсовой тканью до блестящей / скользкой.
  4. Возьмет кристаллизатор (диаметр 15 см, высоту: 7 см и емкость 1200 мл) и заполнить его до краев дистиллированной воды. Очистить поверхность воды путем пропускания бар стекла по поверхности в два раза, чтобы удалить пыль.
  5. Держа предметное стекло между двумя пальцами и окуните его в формвар раствора в течение нескольких секунд. Держите его в вертикальном положении, чтобы высушить под мензурку перевернутой в течение 5 мин.
  6. Когда пленка сухая, оценка краев стекла с острым лезвием бритвы, чтобы определить пределы пленки, чтобы быть вытеснены из слайда.
  7. Сделайте глубокий вдох и выдох в значительной степени на слайд , чтобы получить слой паров воды на и под пленкой , чтобы вынести пленку немного непрозрачные и повысить его видимость.
    1. Сразу всплывает пленку на поверхность кристаллизатора воды, прикоснувшись к нижней части ползуна с углом около 30 °. Пусть выпуск пленки с горкой и очистить его на поверхность кристаллизатора воды. Аккуратно вытяните пленку с спинцет, если это необходимо.
  8. Осторожно положите сетки лицевой стороной вниз на пленке, плавающей на поверхности воды в областях, которые имеют соответствующую толщину (около 10 нм) и без морщин.
  9. Возьмите пленку покрытия сетки с Джозефом бумагой , как они плавают на поверхности кристаллизатора воды.
    1. Держа Джозеф бумагу с одной стороны, нажмите один конец Джозефа бумаги к одному концу фильма. Подождите, пока Джозеф бумага полностью мокрой. Удалите Джозеф бумагу с сетками, застрявших на.
  10. Поместите сетки в течение 24 ч в закрытой чашке Петри для окончательной сушки и хранения до использования при комнатной температуре.

2. Получение Замораживание-заместительной среды

Примечание: осмий осмий (OsO 4) и уранил ацетат являются опасными химическими веществами. Обращайтесь с ними в вытяжном шкафу при ношении средств индивидуальной защиты (СИЗ), в том числе лабораторный халат и перчатки. FollOW предупреждения безопасности при обращении (OSO 4) и уранил ацетат. С помощью уплотнительных колец криопробирки , чтобы избежать утечки OsO 4.

  1. ультраструктурные исследования
    1. Поместите стекла OSO 4 ампулы в стеклянной колбе.
    2. Перерыв ампулу, встряхивая колбу.
    3. Добавьте соответствующий объем ацетона 100%, чтобы получить конечную концентрацию 4%.
    4. Перемешать и обойтись 1,5 мл аликвоты в 1,8 мл криопробирки.
  2. Белок иммуномечение
    1. Поместите 0,05 г ацетата уранила в стеклянной колбе.
    2. Добавьте 50 мл 100% ацетона.
    3. Раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки. Когда раствор становится прозрачным, фильтровать через фильтр 0,2 мкм.
    4. Разлить 1,5 мл аликвоты 1,8 мл во криопробирок.
      Примечание: Подготовьте криопробирки, содержащие вымораживание заместительной среду перед процессом замораживания погружения и держать их в -84 ° C морозильника. Обратить стеклянную колбу выбрасывайтеOsO 4 ампулы в опасных отходах.

3. Подготовка клеток

Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для успеха этого метода. Для всех типов клеток, роста клеток, чтобы получить указанное количество клеток. Центрифуга в указанной трубе в определенное время и скорость.

  1. Для того, чтобы получить соответствующую консистенцию гранул из различных типов клеток, роста клеток следующим образом:
    1. Для Saccharomyces CEREVISIAE и Schizosaccharomyces pombe, инокуляции дрожжей в 5 мл минимальной или полной жидкой среде. Инкубируют в течение ночи при 28 ° C, вращая (180 оборотов в минуту). Измерьте оптическую плотность при 600 нм (OD 600) ночной культуры. Развести дрожжевые клетки на OD 600 0,2 в 50 мл свежей селективной среды. Продолжали инкубировать клетки при 28 ° С, вращение, чтобы получить 1 × 10 9 клеток дрожжей 7.
    2. Для Leishmania жгутика, иноculate паразиты в 5 мл среды с AM 7,5% FCS (фетальной сыворотки теленка). Инкубируют в течение ночи при 24 ° C, вращая (180 оборотов в минуту). Измерьте оптическую плотность 600 ночной культуры. Развести клетки паразита к OD 600 0,2 в 50 мл свежей селективной среды. Продолжали инкубировать клетки при 24 ° С, вращение, чтобы получить 5 × 10 8 клеток паразита 12.
    3. Для Trypanosoma brucei, инокуляции паразитов в 5 мл СОЙ-79 среды с добавлением 10% FCS и 30 мкг / мл гигромицином. Инкубируют в течение ночи при 27 ° C, вращая (180 оборотов в минуту). Измерьте оптическую плотность 600 ночной культуры. Развести клетки паразита к OD 600 0,2 в 50 мл свежей селективной среде. Продолжали инкубировать клетки при 27 ° С, вращение, чтобы получить 5 × 10 8 клеток паразита 13.
    4. Для кишечной палочки, инокуляции бактерий в 5 мл среды DYT с 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируют в течение ночи при 37 ° C, вращая (180оборотов в минуту). Измерьте оптическую плотность 600 ночной культуры. Развести клетки бактерий к OD 600 0,2 в 50 мл свежей селективной среды. Продолжали инкубировать клетки при 37 ° С, вращение, чтобы получить 5 × 10 10 бактериальных клеток 14.
      Примечание: После инкубации в течение ночи, клетки в культуре может быть либо логарифмической или стационарной фазе роста. Очень медленно растущие клеточные штаммы могут потребовать времени инкубации более чем на одну ночь, или прививки большего числа клеток, как определено эмпирически.
  2. Для всех типов клеток, передавать культуральную среду, содержащую клетки в 50 мл полипропиленовую пробирку и центрифугируют в течение 3 мин при 1500 х г.
  3. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок всех типов клеток в 1 мл соответствующей среды для культивирования клеток.
  4. Центрифуга всех типов клеток в микроцентрифужных трубках в течение 1 мин при 3,900 г х. Полностью удалить супернатант.
  5. Держите клетки на льду.

Примечание: Ручка жидкого азота с осторожностью. Используйте средства индивидуальной защиты, включая cryogloves и Googles. Пропан является потенциально взрывоопасным, поэтому выполнить разжижение в хорошо проветриваемом помещении или под вытяжкой. Нет открытого огня не допускается.

  1. Поместите около 150 мл жидкого азота в полистирола лоток. Поместите медную чашку (высота 3,6 см, диаметр 2 см и толщиной 1,5 мм) в жидком азоте, чтобы заморозить его. Не позволяйте жидкий азот проникает в медную чашку.
  2. Подождите, пока пузырьки не спадают, чтобы быть уверенным, что латунный чашка заморожен.
  3. Поместите шланг, соединенный с пропаном цилиндра в контакте с латунной стенкой чашки.
  4. Осторожно открыть вентиль баллона пропана.
    Примечание: На этом этапе, пропан сжижается в медной чашке.
  5. Остановить сжижение, закрыв вентиль баллона пропана и быстрое удаление газового шланга.
  6. Заполните полистирола лоток с жидким NiTrogen до 5 мм от верхней части латунной чашки. Не позволяйте жидкий азот проникает в латунную чашку.

5. Погружение Замораживание образца

  1. Поместите около 200 мл жидкого азота в полистирола лоток. Замораживание маленькие медные чашки (диаметр высота 1,5 см на 2,5 см и толщиной 1 мм), поместив их в жидком азоте. Положите одну чашку для одной пробы суспензии клеток. Будьте осторожны, чтобы не перепутать образцы. С этой целью, поставить образец 1 в чашке 1, образец 2 в чашке 2, и т.д..
  2. Замораживание пинцета, погружая их кончик в жидком азоте.
  3. Окунитесь двойным край рассекает иглу в осадке, полученной в 3.5.
  4. С помощью пинцета, возьмите меди микроскопии сетки 400 меша с покрытием формваром, полученным в разделе 1.
  5. Использование рассекает иглы, поместите каплю осадки, полученную в 3,5 на сетке. Попробуйте разные размеры капель (например , 2, 5 и 10 мкл).
  6. Очень быстро погрузить сетку, проводимый пинцет в ген жидкого пропанарейтинг в разделе 4 и движение сетки с круговым движением в течение нескольких секунд.
  7. Быстро передавайте замороженную сетку с помощью пинцета с маленькой латунной чашкой замороженной в разделе 5.1.
    Примечание: Для каждого образца, составит не менее 3-х элементов. Всегда замораживать пинцет, прежде чем принимать медную сетку.

6. Замораживание-замещение

Примечание: осмий осмий является потенциально нестабильным, поэтому используйте респиратор очистки воздуха с картриджами пара. Замораживание закрепителя в жидком азоте до погружения замораживания также является решением.

  1. Для исследования ультраструктуры, открыть 1,8 мл пробирки, содержащей криопробирку вымораживания замещения среды, полученную в разделе 2.1. Для исследований иммунолокализации, открыть 1,8 мл пробирки, содержащей криопробирку вымораживания замещения среды, полученную в разделе 2.2. Поместите крышку на криопробирках.
  2. Замораживание пинцета, погружая их кончик в жидком азоте.
  3. Быстро снять крышку и передачи замороженных Сетки IНТО в криопробирки с помощью пинцета.
  4. Наденьте крышку на криопробирках.
  5. Повторите эту операцию для каждой сетки каждого образца.
  6. Закройте все колпачки и перемешать криопробирки с круговым движением руки, чтобы обеспечить образцы в сублимационной заместительной среде.
  7. Поместите криопробирки в герметичном ящике в течение 3 дней в морозильной камере C -84 ° во время процесса замораживания-замещения.

7. Пример Warming

  1. исследования ультраструктуры
    1. Несите криопробирки в полистирола лоток (чтобы избежать внезапного повышения температуры) до C морозильнике -30 °. Поместите их в -30 ° C морозильнике в течение 1 ч.
    2. Поместите криопробирки в морозильной камере C -15 ° С в течение 2 ч. Поместите образцы при температуре 4 ° С в течение 2 ч и затем в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. Удалить замену сублимационной среду с пластиковой пипеткой передачи. Добавить приблизительно 500 мкл 100% ацетона.
    4. Перемешивайте 1,8 мл криопробиркус круговым движением руки и быстро залить ацетон (1,5 мл), содержащий сетку в стеклянную пробирку (высота 3 см и диаметром 2 см).
    5. Ополосните же криопробирку с 1 мл 100% ацетона, чтобы быть уверенным, что передал все сетки. Перемешать криопробирку с круговым движением руки и вылить содержимое из криопробирки в стеклянном флакон.
    6. Промыть каждый флакон стекла с 3 мл 100% ацетона в 3 раза в течение 10 мин.
    7. Выполните процедуры вложения и включения , как описано в ссылке 15. Пропитать образец с увеличением концентрации эпоксидной смолы в ацетоне (25%, 50% и 75%) и вставлять образец с 100% эпоксидной смолой в желатиновых капсулах.
  2. иммунноокрашивания исследования
    1. Провести в 1,8 мл криопробирки в полистирола лоток (чтобы избежать внезапного повышения температуры) до -30 ° C морозильнике.
    2. Поместите криопробирки в течение 2 ч в морозильной камере C -30 °.
    3. Через -30 ° С морозильной камерой, перемешать криопробирку с круговым движением руки и быстро влить замену сублимационной среды в полипропиленовую пробирку (высота 5 см и диаметром 1,5 см).
    4. Заменить замену сублимационной среду с 2 мл свежего вымораживания замещения среды.
    5. Поместите флакон полипропилена в течение 2 ч в морозильной камере C -30 °.
    6. Ополосните флакон полипропилена в течение 1 ч с 2 мл 100% ацетона и три раза в течение 1 ч с 2 мл 100% -ного этанола.
    7. Выполните процедуры вложения и включения , как описано в ссылке 15. Пропитать образец с возрастающими концентрациями акриловой смолы (25%, 50% и 75% в ацетоне), и вставлять образец с 100% акриловой смолой в желатиновых капсулах.

8. Визуализация образцов

  1. После того, как вложение, составят 80 нм ультра-тонких срезов образцов с ультрамикротомом. Контраст секций с 2% цитратом свинца при комнатной температуре в течение 1 минзадница = "Xref"> 15.
  2. Используйте 80 кВ или 120 кВ электронный микроскоп для наблюдения секции 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этой статье, простой в использовании и недорогой метод погружения замораживания ультраструктурных (фиг.1 и фиг.2) и иммунноокрашивания (рисунок 3) исследований представлена. Показано, что не нужно иметь специальное оборудование для процедуры замораживания-замещения и что процедура потепления занимает менее 6 ч вместо 24 ч, используя специальную систему.

ОФ / способ замораживания-замещение приводит к улучшению сохранения внутриклеточных структур Saccharomyces CEREVISIAE (фиг.1О и 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (фиг. и С), лейшманиоз жгутика (Рисунок 2 А и В), Trypanosoma brucei (Рисунок 2 С и D) и кишечной палочки (рис 2E). Структуры не сморщенные и цитоплазма кажется плотной. Кроме того, мембраны являются гладкими, что является доказательством хорошей сохранности. Все органеллы, такие как ядро (фиг.1А, Б и Д Фигура 2А -D), митохондрии (рис 1А -C, Е и Н) и вакуолей (рис 1А, С, F и Н), могут быть идентифицированы прекрасно , В ядре, двойная мембрана формирования ядерной оболочки, ядерная поры, шпиндель полюс тела, и рибосом , прикрепленные на внешней мембране ядерной оболочки отчетливо видна (рис 1D и фигура 2В, 2D). В митохондриях, внутренние мембранные инвагинации, называемые кристами (рис 1E), четко видны. Вакуоли являются критическими органеллы, так как крупные кристаллы льда могут легко развиваться внутри них. Как показано на рисунке 1, вакуоль прекрасно сохранились без повреждений кристаллов льда (рис 1А, С, F и Н). Наконец, как ультраструктуры хорошо сохранились, можно наблюдать и проанализированы различные биологические события, такие , как аутофагии (рис 1C, F и Н), митохондриальной морфологии (рис 1E), секреторные везикулы (рис 1g), и ядерного деления (рис 1А , Рисунок 2 В,й 2С).

В месте локализации белков со специфическими антителами является одним из самых мощных и популярных методов в области клеточной биологии. ПФ может быть также использован в качестве способа для выполнения белка иммунолокализации. Эта процедура сохраняет белка антигенные и, как упоминалось выше, органелл идентичность. Различные антитела , направленные на различные дрожжевые белки, такие как анти-АТФ - синтазы 7, 15 (фиг.3А, и 3D), анти-GFP (рис 3B), анти-porine 16 (рис 3 Е) и анти-fox2 17 (фиг 3F), уже были испытаны. Кроме того , можно выполнить эти эксперименты на различных организмов, таких как Leishmania 12.


Рисунок 1: ПЭМ изображения ультраструктурных исследований дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE и Schizosaccharomyces pombe. (А) Обзор S.cerevisiae , . (Б) Обзор S. pombe. (C) Часть S. pombe цитоплазмы. (D) , Высокое увеличение ядра. (Е) Деталь митохондрии с кристами четко видны. (F) , вакуоль морфология во аутофагии. (G) Дрожжи бутона с секрецией везикул внутри. (Н) Пример интимных контактов между вакуолей и митохондрий в процессе аутофагии. N, ядро; В, вакуоль; м, митохондрии; С.В., секреция весьCles; г, рибосомы. Шкала бар = 200 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: ПЭМ изображения ультраструктурных исследований Leishmania amazonesis, Trypanosoma brucei и E.coli. (А) Обзор Leishmania. (B) Деталь Leishmania цитоплазмы ядерной поры и эндоплазматического ретикулума. (С) Обзор Т. brucei. (D) Высокое увеличение Т. brucei ядра. (Е) Обзор кишечной палочки клетки. Н: ядро; В, вакуоль; м, митоchondrion; NP, ядерная пора; F, жгутик; FP, жгутиков карман; К, kinetoplast; г, рибосомы. Шкала бар = 200 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Примеры маркировки белка с использованием моноклональных и поликлональных антител. (А) Обзор S.cerevisiae , . (В) иммунноокрашивания амилоида-бета с анти-GFP антител. (CD) Пример маркировки митохондрий с анти-АТФ - синтазы антител. Локализация (Е) порин во внешней мембране митохондрии. (F) , Fox2 белок обнаружен в митохондрии с помощью иммунноокрашивания. (G) Локализация Ld Flabarin впродольный разрез жгутика Leishmania amazonesis. Все антитела определяются с использованием 10 нм золотых поликлональных антител. N, ядро; В, вакуоль; м, митохондрии. Шкала бар = 200 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ТЭМ является мощным методом для ультраструктурного наблюдения органелл, клеток и тканей. Криофиксация / замещение замораживания в настоящее время является лучшим методом для сохранения как ультраструктуры, так и белковой антигенности. Химические фиксаторы проникают и действуют очень медленно, что позволяет осуществить структурные перестройки до полной стабилизации ультраструктуры 2 . Наоборот, криофиксация / замещение замораживания мгновенно стабилизирует клеточные структуры 4 . Однако методы криофиксации / замораживания-замещения включают ряд ограничений и трудностей, ограничивая тем самым их область применения. Это касается проб, замораживания артефактов, реализации техники, стоимости и оборудования. Метод замораживания / замораживания-замещения высокого давления позволил обеспечить высокую степень сохранности ячеистых деталей 6 , 7 . Напротив, PF уже используется для obsErving мелких предметов , подвешенные на тонких пленках аморфного льда 9. Здесь, ОФ / способ замораживания-замещение для ультраструктурных и иммунноокрашивания исследований обеспечивает высокое качество изображения дрожжей, паразитов и бактерий ультраструктуры, сравнимых с морозильных изображений высокого давления.

Качество Фиксация зависит от ставок 18 охлаждения. При высоких скоростях охлаждения, вода находится в стеклообразном состоянии и не показывает видимую кристаллическую структуру на уровне электронной микроскопии. Стеклование происходит только в очень тонком поверхностном слое (200 мкм) в целом и, следовательно, хорошая толщина замерзание будет постепенно уменьшаться от поверхности образца до внутренних слоев 4. В растительных клетках, или восковое покрытие пространства заполнены газом может замедлить скорости охлаждения. С PF, как ни удивительно, не наблюдалось снижение качества замораживания производительности. Во всех экспериментах, процент хорошо замороженных клеток г ля большей, чем 50%. Этот процент варьируется в пределах от 50% до более чем 90% и зависит от различных параметров (культуральной среды, физиологического состояния клеток, наружная температура и уровень влажности). Как было указано выше, образование кристаллов льда разрушает структуру клеток и кристаллы льда особенно заметны в вакуоли. В процессе замены / замораживания PF, особое внимание должно быть уделено температуре замерзания. Шаг замены сублимационной не должен быть выполнен выше -82 ° С, в противном случае, стекловидный вод будет преобразован в кристаллическую воду. Для того, чтобы избежать образования кристаллов льда повреждения, криопротектор в настоящее время используется, но это приводит к изменениям в ультраструктурах клеток 19. Дрожжи, бактерий и паразиты культура среда может содержать компонент, который является криопротективным агентом. В связи с этим было принято решение не использовать дополнительный криопротектор для того, чтобы быть как можно ближе к фактическому ячеистого состоянию.

ve_content "> Успех PF / замещения замораживания зависит от многих важных шагов на этапе разработки метода. Во-первых, критическая точка должна получить соответствующую консистенцию гранул. Осадок, полученный после центрифугирования должен быть достаточно компактным, чтобы быть свернуты на электронно-микроскопической сетке. Если осадок слишком компактен, решение сублимационной замены не может проникнуть в каплях, и ультраструктура не будет хорошо сохранилась. с другой стороны, если осадок не достаточно компактен, оставшаяся питательная среда может развиваться кристаллы льда и ухудшают ультраструктуры клеток. для того, чтобы получить соответствующую консистенцию гранул из различных типов клеток, необходимо соблюдать условие культивирования для получения указанного количества клеток и параметров центрифугирования, указанных в протоколе (смотрите выше) для всех типы клеток. Однако, количество материала, поставить на медной сетке не имеет решающего значения. Различные размеры капель могут быть проверены. Во-вторых, тип сетки тхат используется как поддержка очень важна. Некоторые были испытаны золото, никель, медь и сетки с различными размерами ячеек. Наилучшие результаты были получены с медной сеткой 400 меша с тонкими стержнями. В-третьих, в отношении стадии замораживания, латунь чашки предпочтительно сжижения пропана. Жидкий пропан в медной чашке имеет тенденцию к замораживанию и, следовательно, усложняет эксперимент. Наконец, манипулятор должен работать быстро и в холодных условиях, чтобы избежать случайного образца разминки. Если это произойдет, то образец должен быть отброшен. Например, чтобы предотвратить нагревание образца, пинцет должен быть предварительно охлажден перед их использованием и замена среда замораживания должно быть подготовлена ​​задолго до процедуры. Охлажденный пинцет также должен быть использован в процессе замораживания врезного becauseif погружения замерзания осуществляется без замораживания пинцета, много дыма форм, как пинцет погружены в пропане (за счетом тепла / холода обмена). Это неизбежно оказывает влияние на скорости охлаждения. Тесты с SAMPLэс замороженное с размороженным пинцетом, кажется, не быть заморожено должным образом.

Кроме того, использование опасных химических веществ , такие как O S O 4 и уранил ацетат в сублимационном замещении среды требует, во время приготовления растворов и лиофильно замещение процесса, чтобы работать под вытяжкой с адекватной индивидуальной защитой. Для того, чтобы предотвратить утечку OsO 4 и вдыхание паров, криопробирки должны иметь жесткое уплотнительное кольцо , чтобы гарантировать , что трубы остаются запечатанными в процессе замораживания-замещении. Во избежание ненужного воздействие паров осмия в процессе подготовки вымораживания замещения среды, ИКС 4 ампула может быть разбита в стеклянной колбе. Наличие осколков стекла в блоке смолы после включения можно избежать с помощью пипетки передачи тонкого наконечника во время ацетоны полосканий и шагов внедрения. Выполнение шага включения под бинокулярным циклом и реализации пол-шлифы также позволяет проверить, что нет никаких стеклянных осколков.Когда эксперименты не могут проводиться в вытяжном шкафе (в частности, на первой стадии процесса замещения вымораживания), использовать респиратор очистки воздуха с патронами пара. Манипулятор также необходимо соблюдать осторожность при работе в холодных условиях с жидким азотом или в процессе замораживания шагов. Рекомендуется использование перчаток и очков. Кроме того, пропан является потенциально взрывоопасным, поэтому сжижение должны быть выполнены в хорошо вентилируемом помещении или в вытяжном шкафу и никаких открытого пламени не допускается.

Несколько статей показали , что на самом разнообразных образцы , такие как ткани мозга, плюща листьев, или кончики корней А. thaliana и Н. benthamiana, сохранение ультраструктуры улучшаются с техникой HPF по сравнению с химической фиксацией 20, 21. С PF, эксперименты проводились на клетках в суспензии. Таким образом, нет никаких признаков успеха этого метода на Лrger образцы, как ткань. Дальнейшие эксперименты должны быть проведены, чтобы решить эту точку. Однако этот метод был успешно испытан с нитчатых грибковой Podospora гусиной, не изолированные клетки , но это скорее форма 22 мицелия.

Метод, представленный в этой статье, представляет собой значительное улучшение по сравнению с существующими методами химической фиксации или ФВЧ. Например, PF не требует дорогостоящего оборудования или расходных материалов, в отличие от HPF 23. Кроме того, следует принимать, так как этот метод ФВЧ использует большое количество жидкого азота (около 80 л в эксперименте). С помощью техники , предложенной, один из главных преимуществ является то , что не важно оборудования не требуется 23. Таким образом, стоимость эксперимента значительно ниже (примерно в сто раз дешевле). Еще одним преимуществом является то, что никакой особой экспертизы не требуется, потому что техника проста в использовании. Кроме того, обработка образца ое PF / замораживание-замещение намного короче , чем HPF / сублимационное замещение в связи с процессом потепления , который занимает менее 6 ч вместо 24 ч 24. Это не больше времени, чем обычная химической фиксация. Преимущество заключается в том, что клеточная ультраструктуре прекрасно сохранилось с минимальными артефактами и гораздо ближе к исходному состоянию клеток. Применение этой технологии, безусловно , будет полезна для изучения различных быстрых биологических событий или локализовать белки с высоким разрешением для клеток , выращиваемых в суспензии и для образцов толщины несколько микрометров, таких как грибные гифы 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет никаких конфликтов интересов.

Acknowledgements

Мы выражаем благодарность М. Bouchecareilh, Е. Tétaud, С. Duvezin-Caubet и А. Девин за их помощь и замечания по рукописи. Мы благодарны электронной полюсу визуализации бордосской изображений центра, где были сняты изображения. Эта работа была поддержана Национальным центром научных исследований.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100, (6), 641-656 (1954).
  2. Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168, (Pt 2), 181-201 (1992).
  3. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130, (5), 877-889 (2008).
  4. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203, (Pt 3), 285-294 (2001).
  6. Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4, (12), 2311-2324 (2006).
  7. Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3, (4), 329-336 (2007).
  8. Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3, (2), 177-210 (1986).
  9. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58, (4), 677-689 (2015).
  10. Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
  11. Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235, (1), 25-35 (2009).
  12. Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8, (9), 1-12 (2013).
  13. Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
  14. Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48, (26), 4858-4860 (2009).
  15. Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, (18), 18386-18389 (2005).
  16. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21, (3), 221-230 (2002).
  17. Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9, (12), 1-27 (2014).
  18. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  19. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47, (5), 935-945 (2007).
  20. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
  21. Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
  22. Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
  23. Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51, (7), 931-940 (2003).
  24. Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195, (1), 41-48 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats