La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

Published 5/05/2017
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Biology

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Summary

Este manuscrito describe un método fácil de usar y criofijación bajo costo para la visualización de células en suspensión por microscopía electrónica de transmisión.

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Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

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Abstract

Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) es una herramienta extraordinaria para estudiar la ultraestructura celular, con el fin de localizar las proteínas y visualizar complejos macromoleculares a muy alta resolución. Sin embargo, para llegar lo más cerca posible al estado nativo, es necesaria conservación de la muestra perfecta. la fijación convencional microscopía electrónica (EM) con aldehídos, por ejemplo, no proporciona una buena conservación ultraestructural. La penetración lenta de fijadores induce reorganización celular y la pérdida de los diversos componentes de la célula. Por lo tanto, la fijación EM convencional no permite una estabilización instantánea y la preservación de las estructuras y antigenicidad. La mejor opción para el examen de eventos intracelulares es utilizar criofijación seguido por el método de fijación de congelación-sustitución que mantiene a las células en su estado nativo. congelación de alta presión / de congelación-sustitución, que conserva la integridad de la ultraestructura celular, es el método más comúnmente utilizado, pero requiere expensicinco equipos. Aquí, se presenta un método fácil de usar y fijación de congelación bajo costo seguido de congelación-sustitución de cultivos de células en suspensión.

Introduction

Preparación de la muestra es crítico para el éxito de cualquier estudio de microscopía electrónica. Convencional fijación EM era el principal método para la fijación de tejidos o células para microscopía electrónica de transmisión (TEM) 1. En primer lugar, aldehídos y tetróxido de osmio se utilizan para fijar químicamente el material a temperatura ambiente. Luego, el material se deshidrató con disolventes orgánicos, se infiltró, y se embebió en resina epoxi. Este método depende de la tasa de penetración de los fijadores en la célula. En consecuencia, los artefactos y la extracción de los contenidos celulares se observan generalmente 2.

Criofijación es claramente una mejor alternativa para la preservación de las estructuras celulares 3, manteniéndolos intactos. La más alta calidad de las imágenes de TEM 4 en las secciones de resina delgada se puede obtener usando el método de sustitución criofijación / congelación. El objetivo de esta técnica es obtener bi vitrificadomuestras ological sin formación de cristales de hielo o que contienen cristales de hielo lo suficientemente pequeñas como para no dañar la ultraestructura de las células. congelación de alta presión (HPF) y criofijación ultra-rápido, que también se llama paso de congelación (PF), dos métodos para cryofix muestras. HPF inmoviliza moléculas en la célula de forma instantánea y evita el daño causado por la fijación EM convencional. Existen varios tipos de máquinas de congelación y dispositivos de sustitución automáticos se han desarrollado 5. Las máquinas de congelación y consumibles (nitrógeno líquido, la muestra de los transportistas, etc.) son caros, pero que permiten para la producción de micrografías electrónicas de alta calidad 6, 7. PF es una técnica que se utilizó en la década de 1950 y que se describe en la literatura como simple y barato 8 .Durante el procedimiento de PF, la muestra preparada se congela a un ritmo rápido para obtener cristales de hielo tamaño de menos de 3 a 5 nm. Con este fin, la muestra essumergido en un criógeno líquido, tal como etano, propano, o una mezcla de etano-propano. Desde la década de 1950, las mejoras de PF se han hecho para hacer esta técnica a disposición de un mayor número de usuarios. Congelación de alta presión es actualmente la única forma viable para congelar una gran variedad de muestras más gruesa que 50 m (hasta un espesor de 200 micras para muestras en forma de disco) 5, mientras que PF es ampliamente utilizado para la imagen objetos pequeños (<100 nm ), tales como complejos macromoleculares suspendidas en una película fina de hielo amorfo 9. Muestras grandes, por ejemplo las células eucariotas, se pueden cryofixed por PF, pero requiere soportes para muestras, tales como tubos de cobre capilar o sistemas de sándwich 8, 10, 11.

Aquí, una rápida, fácil de usar y de inmersión tecnología de congelación / congelación-sustitución bajo costo utilizable para diferentes cultivos de células de suspensión se presenta.

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Protocol

1. Preparación de Formvar cuadrícula Film

NOTA: Realizar la manipulación cloroformo bajo una campana de extracción usando el equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, gafas). Utilice 400 rejillas de cobre de malla de microscopía electrónica. Con otros tipos de rejilla (otros tamaños de malla, de oro y de rejillas de níquel), la calidad de congelación es peor.

  1. Preparar una solución de 100 ml de 0,3% formvar en cloroformo. Deje que se disuelva durante la noche sin agitación.
  2. Ponga 400 de malla (número de agujeros por pulgada cuadrada) rejillas microscopycopper de electrones (diámetro 3,05 mm) en un vial de vidrio (altura de 3 cm y 2 cm de diámetro) que contiene acetona. Agitar el vial de vidrio con un movimiento circular de la mano. Eliminar la acetona con una pipeta de transferencia de plástico. Permitir que el disolvente se evapore durante 5 min. Transferencia de las rejillas mediante el vertido de ellos sobre un papel de filtro y dejar que se sequen durante 5 min.
  3. Polaco un portaobjetos de vidrio 76 x 26 mm 2 frotándolo con un paño sin pelusa hasta brillante / resbaladizo.
  4. Tomar un cristalizador (diámetro 15 cm, altura: 7 cm y la capacidad de 1.200 ml) y llenarlo hasta el borde con agua destilada. Limpiar la superficie del agua haciendo pasar una barra de vidrio sobre la superficie dos veces para eliminar el polvo.
  5. Mantenga el portaobjetos de vidrio entre dos dedos y la inmersión en la solución formvar durante unos segundos. Hold en posición vertical se seque bajo un vaso de precipitados al revés durante 5 min.
  6. Cuando la película está seca, la puntuación de los bordes de la lámina de vidrio con una hoja de afeitar afilada para definir los límites de la película a ser desalojados de la diapositiva.
  7. Tome una respiración profunda y exhalar fuertemente sobre el portaobjetos para obtener una capa de vapor de agua sobre y debajo de la película para hacer la película ligeramente opaca y aumentar su visibilidad.
    1. Inmediatamente flotar la película sobre la superficie del agua cristalizador por tocar el fondo de la corredera con un ángulo de aproximadamente 30 °. Deje que el lanzamiento de la película de la diapositiva y despegarlo sobre la superficie del agua cristalizador. Tire suavemente de la película con laPinzas, si es necesario.
  8. Coloque suavemente las rejillas boca abajo en la película flotando en la superficie del agua en las regiones que son del espesor adecuado (alrededor de 10 nm) y sin arrugas.
  9. Recoja la película cubriendo las rejillas con papel Joseph mientras flotan sobre la superficie del agua del cristalizador.
    1. Sosteniendo el papel de Joseph con una mano, toque un extremo del papel de Joseph en un extremo de la película. Espere hasta que el papel de Joseph esté completamente mojado. Retire el papel Joseph con las rejillas atascadas.
  10. Coloque las rejillas durante 24 h en una placa de Petri cubierta para su secado final y almacenamiento antes de su uso a temperatura ambiente.

2. Preparación del medio de sustitución de congelación

NOTA: El tetróxido de osmio (OsO 4 ) y el acetato de uranilo son productos químicos peligrosos. Manéjelos en la campana extractora de humos mientras esté usando el equipo de protección personal (EPP) apropiado, incluyendo una bata de laboratorio y guantes. Follow las advertencias de seguridad para el manejo (OSO 4) y acetato de uranilo. Utilice crioviales tóricas para evitar la fuga de OsO4.

  1. Los estudios ultraestructurales
    1. Ponga el vidrio OsO4 ampolla en un frasco de vidrio.
    2. Romper la ampolla agitando el matraz.
    3. Añadir un volumen apropiado de acetona 100% para obtener una concentración final del 4%.
    4. Agitar y dispensar alícuotas de 1,5 ml en 1,8 crioviales mL.
  2. immunolabeling proteínas
    1. Colocar 0,05 g de acetato de uranilo en un matraz de vidrio.
    2. Añadir 50 ml de acetona al 100%.
    3. Se agita la solución con un agitador magnético. Cuando la solución se vuelve clara, filtrarla utilizando un filtro de 0,2 micras.
    4. Dispensar alícuotas de 1,5 ml en 1,8 crioviales mL.
      NOTA: Preparar los crioviales que contienen medio de congelación-sustitución antes del proceso de congelación profunda y mantenerlos en -84 ° C congelador. Invertir el frasco de vidrio para tirar laOsO4 ampolla en los residuos peligrosos.

3. Preparación de células

NOTA: Este paso es fundamental para el éxito del método. Para todos los tipos de células, cultivar las células para obtener el número indicado de células. Centrifugar en el tubo indicado en el momento y la velocidad especificada.

  1. Para obtener la consistencia apropiada de los gránulos de diferentes tipos de células, cultivar las células como sigue:
    1. Para Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe, inocular la levadura en 5 ml de medio líquido mínimo o completo. Incubar durante la noche a 28 ° C, giratorio (180 rpm). Se mide la densidad óptica a 600 nm (OD 600) del cultivo durante la noche. Diluir las células de levadura a una DO 600 de 0,2 en 50 ml de medio selectivo fresco. Continuar incubar las células a 28 ° C, la rotación, para obtener 1 x 10 9 células de levadura 7.
    2. Para Leishmania flagelo, inoparásitos culate en 5 ml de AM medio con 7,5% de FCS (suero de ternera fetal). Incubar durante la noche a 24 ° C, giratorio (180 rpm). Medir la OD 600 del cultivo durante la noche. Diluir las células de parásitos a un OD 600 de 0,2 en 50 ml de medio selectivo fresco. Continuar incubar las células a 24 ° C, la rotación, para obtener 5 x 10 8 células de parásitos 12.
    3. Para Trypanosoma brucei, inocular parásitos en 5 ml de medio SDM-79 con 10% de FCS y 30 mg / ml de higromicina. Incubar durante la noche a 27 ° C, giratorio (180 rpm). Medir la OD 600 del cultivo durante la noche. Diluir las células de parásitos a un OD 600 de 0,2 en 50 ml de medio selectivo fresco. Continuar incubar las células a 27 ° C, la rotación, para obtener 5 x 10 8 células de parásitos 13.
    4. Para Escherichia coli, inocular bacterias en 5 ml de medio DYT con 100 g / ml de ampicilina. Incubar durante la noche a 37 ° C, giratorio (180rpm). Medir la OD 600 del cultivo durante la noche. Diluir células de las bacterias hasta una DO 600 de 0,2 en 50 ml de medio selectivo fresco. Continuar incubar las células a 37 ° C, la rotación, para obtener 5 x 10 10 células de las bacterias 14.
      NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células en cultivo puede estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario. Muy lento crecimiento cepas de células pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente.
  2. Para todos los tipos de células, transferir el medio de cultivo que contiene las células a 50 ml tubo de polipropileno y se centrifuga durante 3 minutos a 1500 x g.
  3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet de todos los tipos de células en 1 ml de medio de cultivo celular relevante.
  4. Centrifugar todos los tipos de células en un tubo de microcentrífuga durante 1 min a 3.900 x g. Eliminar completamente el sobrenadante.
  5. Mantener las células en hielo.

Nota: Manejar nitrógeno líquido con cuidado. Utilice equipo de protección personal, incluyendo cryogloves y gafas. El propano es potencialmente explosivo, por lo que realizar la licuefacción en una habitación bien ventilada o bajo una campana de humos. No se permiten llamas abiertas.

  1. Ponga aproximadamente 150 ml de nitrógeno líquido en una bandeja de poliestireno. Coloque una taza de latón (altura 3,6 cm, diámetro 2 cm y espesor 1,5 mm) en nitrógeno líquido para congelar ella. No deje que el nitrógeno líquido penetre en el vaso de latón.
  2. Espere hasta que las burbujas desaparezcan para asegurarse de que la copa de latón se congela.
  3. Ponga la manguera conectada al cilindro de propano en contacto con la pared de la copa de latón.
  4. abrir con cuidado la válvula de la botella de propano.
    NOTA: En este paso, el propano se licua en la taza de latón.
  5. Detener la licuefacción mediante el cierre de la válvula del cilindro de propano y rápidamente la eliminación de la manguera de gas.
  6. Llene la bandeja de poliestireno con Ni líquidoTROGEN hasta 5 mm desde la parte superior de la copa de latón. No deje que el nitrógeno líquido penetre en la taza de latón.

5. Plunge congelación de la muestra

  1. Ponga aproximadamente 200 ml de nitrógeno líquido en la bandeja de poliestireno. Congelar pequeñas tazas de latón (altura 1,5 cm de diámetro de 2,5 cm y el espesor de 1 mm) poniéndolos en nitrógeno líquido. Ponga una taza para una muestra de células en suspensión. Tenga cuidado de no mezclar las muestras. Con este fin, poner la muestra 1 en la copa 1, la muestra 2 en la copa 2, etc.
  2. Congelar las pinzas por el desplome de su punta en nitrógeno líquido.
  3. Sumérgete una aguja doble de disección de borde en el sedimento obtenido en 3.5.
  4. Usando pinzas, tomar una malla 400 de rejilla de microscopía de cobre recubierto con formvar preparado en el apartado 1.
  5. Uso de la aguja de disección, colocar una gota de la pella obtenida en 3.5 en la parrilla. Prueba diferentes tamaños de gota (por ejemplo, 2, 5 y 10! L).
  6. sumergirse Muy rápidamente la cuadrícula en poder de las pinzas en el gen de propano líquidopuntuación en la sección 4 y se agita la rejilla con movimiento circular durante unos segundos.
  7. Rápidamente transferir la rejilla congelado con las pinzas para la pequeña taza de latón congelado en la sección 5.1.
    NOTA: Para cada muestra, hacer por lo menos 3 rejillas. Siempre congelar las pinzas antes de tomar una rejilla de cobre.

6. Freeze-sustitución

NOTA: El tetróxido de osmio es potencialmente volátil, a fin de utilizar un respirador purificador de aire con cartuchos de vapor. Congelación de la fijador en nitrógeno líquido antes de la congelación de inmersión también es una solución.

  1. Para los estudios de ultraestructura, abrir los tubos de 1,8 ml criovial que contienen medio de congelación-sustitución preparado en la sección 2.1. Para los estudios de inmunolocalización, abrir los tubos de 1,8 ml criovial que contienen medio de congelación-sustitución preparado en el apartado 2.2. Coloque la tapa en los crioviales.
  2. Congelar las pinzas por el desplome de su punta en nitrógeno líquido.
  3. Rápidamente quite la tapa y la transferencia de las rejillas congeladas iONT los crioviales utilizando las pinzas.
  4. Ponga la tapa en los crioviales.
  5. Repita la operación para cada cuadrícula de cada muestra.
  6. Cierre todas las tapas y se agita la crioviales con un movimiento circular de la mano para asegurar que las muestras están en el medio de congelación-sustitución.
  7. Coloque los crioviales en una caja hermética durante 3 días en un congelador C -84 ° durante el proceso de congelación-sustitución.

Calentamiento 7. Muestra

  1. Los estudios ultraestructurales
    1. Llevar los crioviales en una bandeja de poliestireno (para evitar un aumento repentino de la temperatura) a una C congelador -30 °. Colocarlos en el congelador a -30ºC durante 1 h.
    2. Coloque los crioviales en un congelador C -15 ° durante 2 h. Colocar las muestras a 4 ° C durante 2 h y después durante 30 min a temperatura ambiente.
    3. Eliminar el medio de sustitución de congelación con una pipeta de transferencia de plástico. Añadir aproximadamente 500 l de acetona al 100%.
    4. Se agita la 1,8 ml criovialcon un movimiento circular de la mano y rápidamente se vierte la acetona (1,5 ml) que contiene las rejillas en un vial de vidrio (altura de 3 cm y el diámetro de 2 cm).
    5. Enjuague el mismo criovial con 1 ml de acetona al 100% para estar seguros de haber transferido todos las rejillas. Se agita la criovial con un movimiento circular de la mano y se vierte el contenido del criovial en un vial de vidrio.
    6. Enjuague cada vial de vidrio con 3 ml de acetona al 100% 3 veces durante 10 min.
    7. Siga los procedimientos de incrustación y de inclusión como se describe en la referencia 15. Impregnar la muestra con concentraciones crecientes de resina epoxi en acetona (25%, 50% y 75%) e incrustar la muestra con resina epoxi 100% en cápsulas de gelatina.
  2. immunolabeling estudios
    1. Llevar a los 1,8 crioviales ml en una bandeja de poliestireno (para evitar un aumento repentino de la temperatura) a la -30 ° C congelador.
    2. Coloque los crioviales durante 2 h en un congelador C -30 °.
    3. En unos -30 ° C congelador, se agita la criovial con un movimiento circular de la mano y rápidamente vierte el medio de sustitución de congelación en un vial de polipropileno (altura 5 cm y diámetro de 1,5 cm).
    4. Reemplazar el medio sustitución congelación con 2 ml de medio de congelación-sustitución fresco.
    5. Colocar el vial de polipropileno durante 2 h en un congelador C -30 °.
    6. Enjuague el vial de polipropileno durante 1 h con 2 ml de 100% de acetona y tres veces durante 1 h con 2 ml de etanol al 100%.
    7. Siga los procedimientos de incrustación y de inclusión como se describe en la referencia 15. Impregnar la muestra con concentraciones crecientes de resina acrílica (25%, 50%, y 75% en acetona) e incrustar la muestra con resina acrílica 100% en cápsulas de gelatina.

8. Visualización de muestras

  1. Después de la inserción, hacer 80 nm secciones ultra-delgadas de las muestras con un ultramicrotomo. Contraste las secciones con 2% de citrato de plomo a temperatura ambiente durante 1 minculo = "xref"> 15.
  2. Utilice un microscopio electrónico de 80 kV o 120 kV para observar las secciones 15.

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Representative Results

En este artículo, se presenta un método de congelación-fácil de usar y de inmersión de bajo costo para ultraestructurales (Figuras 1 y Figura 2) y immunolabeling (Figura 3) estudios. Se demuestra que no es necesario contar con un equipo especial para el procedimiento de congelación-sustitución y que el procedimiento de calentamiento tarda menos de 6 h en lugar de las 24 h utilizando un sistema dedicado.

Método / congelación-sustitución PF resultó en la conservación mejorada de las estructuras intracelulares de Saccharomyces cerevisiae (Figura 1A y 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (Figura 1B y C), flagelo Leishmania (Figura 2 A y B), Trypanosoma brucei (Figura 2 C y D), y Escherichia coli (Figura 2E). Las estructuras no son encogido y el citoplasma aparece denso. Por otra parte, las membranas son lisas, que es una prueba de conservación. Todos los orgánulos, como núcleo (Figura 1A, B D y la Figura 2A -D), las mitocondrias (Figura 1A -C, E y H), y vacuolas (Figura 1A, C, F y H), puede ser perfectamente identificado . En el núcleo, una membrana de doble formación de la envoltura nuclear, poro nuclear, el cuerpo polo del huso, y ribosomas unidos en la membrana externa de la envoltura nuclear son claramente visible (Figura 1D y la Figura 2B, 2D). En las mitocondrias, las invaginaciones de membrana internas, llamados crestas (Figura 1E), son claramente visibles. Las vacuolas son organelas críticos debido a que grandes cristales de hielo pueden desarrollar fácilmente dentro de ellos. Como se ilustra en la Figura 1, vacuolas se conservan perfectamente sin daño de cristales de hielo (Figura 1A, C, F y H). Por último, como la ultraestructura está bien conservado, diferentes eventos biológicos pueden ser observados y analizados, tales como la autofagia (Figura 1C, F y H), la morfología mitocondrial (Figura 1E), vesículas secretoras (Figura 1G), y la división nuclear (Figura 1A , la Figura 2 B, unand 2C).

En localización in situ de las proteínas con anticuerpos específicos es una de las técnicas más poderosas y populares en la biología celular. PF también se puede utilizar como un método para llevar a cabo la inmunolocalización de proteínas. Este procedimiento conserva la antigenicidad de proteínas y, como se mencionó anteriormente en esta memoria, la identidad orgánulo. Diferentes anticuerpos dirigidos a diferentes proteínas de levadura, tales como anti-ATP sintasa 7, 15 (Figura 3A, 3C y 3D), anti-GFP (Figura 3B), anti-porine 16 (figura 3 E), y anti-FOX2 17 (figura 3F), ya han sido probados. También es posible llevar a cabo estos experimentos en diferentes organismos, tales como Leishmania 12.


Figura 1: imágenes de TEM de los estudios ultraestructurales de las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe. (A) Descripción general de S. cerevisiae. (B) Descripción general de S. pombe. (C) Parte de S. pombe citoplasma. (D) Gran ampliación de un núcleo. (E) Detalle de una mitocondria con crestas claramente visible. Morfología (F) vacuolar durante la autofagia. (G) brote de levadura con vesículas de secreción en el interior. (H) Ejemplo de contactos íntimos entre vacuolas y mitocondrias durante el proceso de autofagia. N, núcleo; V, vacuola; m, mitocondria; SV, vesi secreciónculos; r, ribosomas. Barras de escala = 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: imágenes de TEM de los estudios ultraestructurales de Leishmania amazonesis, Trypanosoma brucei y E. coli. (A) Descripción general de Leishmania. (B) Detalle de Leishmania citoplasma con poro nuclear y el retículo endoplásmico. (C) Descripción general de T. brucei. (D) Gran ampliación del núcleo T. brucei. (E) Panorámica de célula de E. coli. N: núcleo; V, vacuola; m, mitochondrion; NP, poro nuclear; F, flagelo; FP, bolsillo flagelar; K, cinetoplasto; r, ribosomas. Barras de escala = 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Ejemplos de marcaje de proteínas utilizando el anticuerpo monoclonal y policlonal. (A) Descripción general de S. cerevisiae. (B) Immunolabeling de amiloide-β con anticuerpos anti-GFP. (CD) Ejemplo de etiquetado mitocondrias con anticuerpos anti-ATP sintasa. Localización (E) Porin en la membrana externa de una mitocondria. Proteína (F) Fox2 se detecta en mitocondria por inmunomarcaje. (G) La localización de Ld Flabarin enuna sección longitudinal de un flagelo de Leishmania amazonesis. Todos los anticuerpos se detectan usando 10 anticuerpos policlonales de oro nm. N, núcleo; V, vacuola; m, mitocondria. Barras de escala = 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

TEM es un método poderoso para la observación ultraestructural de los orgánulos, células y tejidos. Criofijación / congelación-sustitución es actualmente el mejor método para la conservación de ambos ultraestructura y la proteína de la antigenicidad. Fijadores químicos penetran y actúan muy lentamente permitiendo de este modo reordenamientos estructurales antes de la estabilización completa de la ultraestructura 2. A la inversa, criofijación / congelación-sustitución estabiliza instantáneamente estructuras celulares 4. Sin embargo, las técnicas de criofijación / congelación de sustitución incluyen una serie de limitaciones y dificultades que limita su campo de aplicación. Esto se refiere a la muestra, los artefactos de congelación, la realización de la técnica, el coste, y el equipo. La técnica de congelación / congelación-sustitución de alta presión ha permitido un alto grado de conservación de los detalles celulares 6, 7. En contraste, PF ya se utiliza para observing pequeños objetos suspendidos en películas delgadas de hielo amorfo 9. Aquí, el método / congelación-sustitución PF para estudios ultraestructurales y immunolabeling proporciona imágenes de alta calidad de levaduras, parásitos y ultraestructura bacteriana comparables a las imágenes de congelación de alta presión.

Calidad de fijación depende de velocidades de enfriamiento 18. A altas velocidades de enfriamiento, el agua está en el estado vítreo y no muestra estructura cristalina visible a nivel de microscopía electrónica. La vitrificación se produce únicamente en una capa superficial muy delgada (200 micras en general) y, por lo tanto, buena congelación espesor disminuirá gradualmente de la superficie de la muestra a las capas interiores 4. En las células vegetales, capa de cera o espacios llenos de gas pueden ralentizar las velocidades de enfriamiento. Con PF, sorprendentemente, no se observó disminución en la calidad del rendimiento de congelación. En todos los experimentos, el porcentaje de células bien congelados es g reater del 50%. Este porcentaje oscila entre el 50% a más del 90% y depende de diversos parámetros (medio de cultivo, el estado fisiológico de las células, la temperatura exterior, y nivel de humedad). Como se indicó anteriormente, la formación de cristales de hielo destruye la estructura celular y los cristales de hielo son particularmente visible en las vacuolas. En el proceso de sustitución / congelación PF, se debe prestar especial atención a la temperatura de congelación. La etapa de sustitución de congelación no debe realizarse por encima de -82 ° C, de lo contrario, el agua vítreo se transformará en agua cristalina. Para evitar la formación de daños de cristales de hielo, crioprotector se utiliza actualmente, pero que conduce a alteraciones en la ultraestructura de las células 19. Levaduras, bacterias, y de cultivo parásito medios pueden contener un componente que es un agente crioprotector. En este contexto, se decidió no utilizar crioprotector adicional con el fin de estar lo más cerca posible del estado celular real.

ve_content "> El éxito de PF sustitución / congelación depende de muchos pasos críticos durante la fase de desarrollo del método. En primer lugar, un punto crítico es obtener la consistencia adecuada de los gránulos. El sedimento obtenido después de la centrifugación debe ser lo suficientemente compacto como para ser enrollado hacia fuera en una rejilla de microscopía electrónica. Si el sedimento es demasiado compacto, la solución de congelación-sustitución no puede penetrar en la gota, y no será bien conservada la ultraestructura. a la inversa, si la pastilla no es lo suficientemente compacto, el medio de cultivo sobrante puede desarrollar cristales de hielo y perjudican la ultraestructura celular. para obtener la consistencia apropiada de los gránulos de los diferentes tipos de células, es necesario respetar las condiciones de cultivo para obtener el número indicado de células y parámetros de centrifugación que se indican en el protocolo (véase más arriba) para todos tipos de células. sin embargo, la cantidad del material puesto sobre la rejilla de cobre no es crítica. diferentes tamaños de gota pueden ser probados. en segundo lugar, el tipo de cuadrícula that se utiliza como apoyo es importante. Se ensayaron Varios oro, níquel, y cobre rejillas con diferentes tamaños de malla. Los mejores resultados se obtuvieron con una rejilla de cobre de malla 400 con barras delgadas. En tercer lugar, con respecto a la etapa de congelación, se prefiere una taza de latón para licuar el propano. El propano líquido en la copa de cobre tiende a congelar y, por lo tanto, complica el experimento. Por último, el manipulador debe trabajar con rapidez y en condiciones de frío para evitar muestra accidental de calentamiento. Si esto sucede, la muestra debe ser desechado. Por ejemplo, para prevenir el calentamiento de la muestra, las pinzas deben ser pre-enfriados antes de usarlos y el medio de sustitución de congelación se deben preparar muy por delante antes del procedimiento. pinzas refrigeradas también deben ser utilizados durante el proceso de congelación de inmersión becauseif la congelación de inmersión se realiza sin la congelación de las pinzas, una gran cantidad de formas de humo como las pinzas se sumergen en el propano (debido al intercambio de calor frío /). Esto tiene inevitablemente un impacto en las tasas de enfriamiento. Las pruebas con samplES congelados con pinzas no congeladas parecen no estar congelado correctamente.

Además, el uso de productos químicos peligrosos tales como O S O 4 y acetato de uranilo en el medio de congelación-sustitución requiere, durante la preparación de soluciones y congelar de sustitución de proceso, para trabajar bajo la campana de humos con PPE adecuado. Para evitar la fuga de OsO4 y la inhalación de vapores, crioviales deben tener una junta tórica duro para asegurar que los tubos permanecerán selladas durante el proceso de congelación-sustitución. Para evitar la exposición innecesaria a vapor de osmio durante la preparación del medio de congelación-sustitución, la ampolla OsO4 se puede dividir en un matraz de vidrio. La presencia de fragmentos de vidrio en el bloque de resina después de la inclusión se puede evitar mediante el uso de pipetas de transferencia de punta fina durante acetonas enjuagues y los pasos de incrustación. Realización de la etapa de inclusión en un bucle binocular y la realización de las secciones semi-delgadas también permite verificar que no hay fragmentos de vidrio.Cuando los experimentos no pueden llevarse a cabo bajo una campana de extracción (en particular en el primer paso del proceso de sustitución de congelación), utilizar un respirador purificador de aire con cartuchos de vapor. El manipulador también debe tener cuidado cuando se trabaja en condiciones de frío con nitrógeno líquido o durante etapas de congelación. Se recomienda el uso de guantes y gafas. Además, el propano es potencialmente explosivo, por lo que la licuefacción se debe realizar en una habitación bien ventilada o bajo una campana de humos y no se permiten las llamas abiertas.

Varios artículos mostraron que, en una amplia variedad de muestras tales como tejido cerebral, la hoja de hiedra, o puntas de las raíces de A. thaliana y N. benthamiana, la preservación de la ultraestructura se mejora con la técnica HPF en comparación con la fijación química 20, 21. Con PF, los experimentos se realizaron en células en suspensión. Por lo tanto, no hay ninguna indicación del éxito de esta técnica en larger especímenes como tejidos. Otros experimentos deben llevarse a cabo para hacer frente a este punto. Sin embargo, el método ha sido probado con éxito con hongo filamentoso Podospora anserina que no se aísla las células, pero es más bien de forma micelio 22.

El método presentado en este artículo representa una mejora significativa sobre los métodos actuales de fijación química o HPF. Por ejemplo, PF no requiere equipo costoso o consumibles en contraste con el 23 HPF. Care también deben tomarse porque la técnica de HPF utiliza una gran cantidad de nitrógeno líquido (aproximadamente 80 L por experimento). Con la técnica propuesta, una de las principales ventajas es que ningún equipo importante es necesario 23. Por lo tanto, el costo de un experimento es mucho más bajos (alrededor de un centenar de veces más barato). Otra ventaja es que no se necesita ninguna experiencia particular porque la técnica es fácil de usar. Además, el procesamiento de la muestra of PF / congelación-sustitución es mucho más corto que HPF / congelación-sustitución debido al proceso de calentamiento que tarda menos de 6 h en lugar de 24 h 24. No es más tiempo que la fijación química convencional. La ventaja es que la ultraestructura celular está perfectamente conservada con artefactos mínimos y está mucho más cerca a su estado original de las células. La aplicación de esta tecnología será sin duda de utilidad para estudiar diferentes eventos biológicos rápidos o para localizar proteínas en alta resolución para las células cultivadas en suspensión y para las muestras de un espesor de algunos micrómetros, tales como hifas fúngicas 22.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Acknowledgements

Expresamos nuestro agradecimiento a M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet y A. Devin por su ayuda y comentarios sobre el manuscrito. Estamos agradecidos con el poste de imagen electrónica del Centro de Imágenes de Burdeos donde se tomaron las imágenes. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de la Investigación Científica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

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References

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