Plunge Frysning: ett verktyg för Ultra och immunlokalisering Studier av suspensionsceller i transmissionselektronmikroskopi

Published 5/05/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Detta manuskript beskriver en enkel att använda och billig cryofixation metod för visualisering av suspensionsceller genom transmissionselektronmikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation

Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) är en extraordinär verktyg för att studera cellultrastruktur, för att lokalisera proteiner och visualisera makromolekylära komplex med mycket hög upplösning. Men för att komma så nära som möjligt till det nativa tillståndet är perfekt prov bevarande krävs. Konventionell elektronmikroskopi (EM) fixering med aldehyder, till exempel, inte ger bra ultrastrukturell konservering. Den långsamma penetreringen av fixativ inducerar cell omorganisation och förlust av olika cellkomponenter. Därför behöver konventionella EM fixering inte tillåta en momentan stabilisering och bevarande av strukturer och antigenicitet. Det bästa valet för att undersöka intracellulära händelser är att använda cryofixation följt av frys substitution fixeringsmetod som håller cellerna i sitt naturliga tillstånd. Högtrycks frysning / fryssubstitution, som bevarar integriteten för cellulära ultrastrukturen, är den vanligaste metoden, men kräver expensive utrustning. Här, är en enkel att använda och billig frysfixeringsmetod följt av frys-substitution för upphängning cellodlingar presenteras.

Introduction

Provberedning är avgörande för framgång för varje elektronmikroskopi studie. Konventionell EM fixering var den primära metoden för att fixera vävnad eller celler för transmissionselektronmikroskopi (TEM) 1. Först, är aldehyder och osmiumtetroxid användas för att kemiskt fixera materialet vid rumstemperatur. Sedan är materialet dehydratiseras med organiska lösningsmedel, infiltrerad, och inbäddades i epoxiharts. Denna metod är beroende av penetrationshastigheten för fixativ in i cellen. Följaktligen är de artefakter och extraktion av cellulära innehåll observeras vanligtvis 2.

Cryofixation är helt klart ett bättre alternativ för att bevara cellstrukturer 3, hålla dem intakta. Högsta kvalitet på TEM-bilder 4 i tunna hartssektioner kan erhållas med användning av cryofixation / fryssubstitutionsmetoden. Syftet med denna teknik är att få förglasat bimiologiska prover utan iskristaller bildning eller innehållande iskristaller små nog att inte skada ultrastruktur av cellerna. Högtrycksfrysning (HPF) och ultra-snabb cryofixation, som också kallas plunge frysning (PF), finns två metoder för att cryofix prover. HPF immobiliserar molekyler i cellen momentant och undviker skador orsakade av konventionell EM fixering. Flera typer av frysmaskiner och automatiska anordningar substitutions har utvecklats 5. Frysningsmaskiner och förbrukningsartiklar (flytande kväve, provbärare, etc.) är dyra, men de möjliggör framställning av högkvalitativa elektronmikrofotografier 6, 7. PF är en teknik som användes i början av 1950-talet och beskrivs i litteraturen som enkel och billig 8 .Under PF förfarandet, är det beredda provet frystes i snabb takt för att erhålla iskristaller storlek mindre än 3 och 5 nm. För detta ändamål är provplunged in i en flytande kryogen, såsom etan, propån, eller en etan-propanblandning. Sedan 1950-talet, har förbättringar av PF gjorts för att göra denna teknik tillgänglig för ett större antal användare. Högtrycks frysning är för närvarande det enda möjliga sättet att frysa en stor variation av prover tjockare än 50 pm (upp till en tjocklek av 200 | im för skivformade prover) 5, medan PF används ofta för att avbilda små föremål (<100 nm ), såsom makromolekylära komplex suspenderade i en tunn film av amorf is 9. Större prover, t ex eukaryota celler, kan cryofixed av PF, men kräver provhållare, såsom kapillär kopparrör eller sandwichsystem 8, 10, 11.

Här, en snabb, enkel att använda och billig dopp frysning / fryssubstitution teknik som kan användas för olika upphängningscellodlingar presenteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av Formvar Grid Film

OBS: Utför kloroform manipulation enligt ett dragskåp med hjälp av personlig skyddsutrustning (handskar, skyddsrock, glasögon). Använda 400 mesh elektronmikroskopi koppargaller. Med andra typer rutnät (andra maskstorlekar, guld och nickel galler), är kvaliteten på frysning värre.

  1. Bered en 100 ml lösning av 0,3% formvar i kloroform. Låt det lösa natten utan omrörning.
  2. Sätta 400 mesh (antal hål per kvadrattum) elektron microscopycopper galler (diameter 3,05 mm) i en glasflaska (höjd 3 cm och diameter 2 cm) innehållande aceton. Rör om glasflaska med en cirkulär rörelse av handen. Avlägsna aceton med en plast överföringspipett. Låt lösningsmedlet avdunsta under 5 min. Överföra gallren genom att hälla dem på ett filterpapper och låta dem torka i 5 minuter.
  3. Polera en 76 x 26 mm 2 glasskiva genom att torka den med en luddfri trasa tills glänsande / hala.
  4. Ta en kristallisator (diameter 15 cm, höjd: 7 cm och kapacitet 1200 ml) och fyll den till brädden med destillerat vatten. Rengöra vattenytan genom att en glasstång över ytan två gånger för att ta bort damm.
  5. Håll glasskiva mellan två fingrar och doppa den i Formvar lösning under några sekunder. Håll det upprätt för att torka under en upp och ner bägare i 5 minuter.
  6. När filmen är torr, poäng kanterna av glasskivan med ett vasst rakblad för att definiera gränserna för filmen som skall rubbas från objektglaset.
  7. Ta ett djupt andetag och andas ut kraftigt på objektglaset för att få ett skikt av vattenånga på och under filmen för att göra filmen något ogenomskinlig och öka dess synlighet.
    1. Omedelbart flyta filmen på kristallisatorn vattenytan genom att vidröra botten av bilden med en vinkel av ca 30 °. Låt filmen frisättning från sliden och skala bort det på kristallisatorn vattenytan. Dra försiktigt filmen av medpincett vid behov.
  8. Lägg försiktigt gallren nedåt på filmen flyter på vattenytan i de regioner som är av korrekt tjocklek (ca 10 nm) och utan rynkor.
  9. Plocka upp filmen genom att täcka gallren med Joseph papperet när de flyter på kristallisatorn vattenytan.
    1. Håll Joseph papper med ena handen trycker ena änden av Joseph papper till ena änden av filmen. Vänta tills Joseph papperet är helt blöt. Avlägsna Joseph papper med galler fastnat på.
  10. Placera gallren i 24 timmar i en täckt petriskål för slutlig torkning och lagring före användning vid rumstemperatur.

2. Framställning av Freeze-substitutions Medium

OBS: Osmiumtetroxid (OSO4) och uranylacetat är farliga kemikalier. Hantera dem i dragskåp iklädd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) med en skyddsrock och handskar. follow säkerhets varningar för hantering (OSO 4) och uranylacetat. Använda O-rings cryovials att undvika läckage av OSO4.

  1. ultra~~POS=TRUNC studier
    1. Sätta glas OSO4 ampull i en glaskolv.
    2. Bryta ampullen genom att skaka kolven.
    3. Lägga till en lämplig volym av aceton 100% för att erhålla en 4% slutlig koncentration.
    4. Rör om och dispensera 1,5 ml alikvoter i 1,8 ml kryokärl.
  2. protein immunomärkning
    1. Placera 0,05 g av uranylacetat i en glaskolv.
    2. Tillsätt 50 ml 100% aceton.
    3. Rör om lösningen med en magnetisk omrörare. När lösningen blir klar, filtrera den med användning av ett 0,2 pm filter.
    4. Dispensera 1,5 ml alikvoter i 1,8 ml kryokärl.
      OBS: Förbered kryokärl innefattande fryssubstitution mediet före steget frysprocessen och hålla dem i -84 ° C frys. Vänd glasflaska för att kasta bortOSO4 ampull i farligt avfall.

3. Beredning av celler

OBS: Detta steg är avgörande för att lyckas med metoden. För alla celltyper, odla celler för att erhålla det angivna antalet celler. Centrifug i den indikerade röret vid den angivna tiden och hastighet.

  1. För att erhålla den lämpliga konsistensen av pelletarna från olika celltyper, odla celler enligt följande:
    1. För Saccharomyces cerevisiae och Schizosaccharomyces pombe, inokulera jäst i 5 ml av minimalt eller komplett flytande medium. Inkubera över natten vid 28 ° C, att rotera (180 rpm). Mäta den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600) hos den över natten odlade kulturen. Späd jästceller till en OD 600 av 0,2 i 50 ml färskt selektivt medium. Fortsätta att inkubera celler vid 28 ° C, roterande, för att erhålla 1 x 10 9 jästceller 7.
    2. För Leishmania flagellum, inoculate parasiter i 5 ml AM-medium med 7,5% FCS (fetalt kalvserum). Inkubera över natten vid 24 ° C, att rotera (180 rpm). Mät OD 600 av natten kulturen. Späd parasitceller till en OD 600 av 0,2 i 50 ml färskt selektivt medium. Fortsätta att inkubera celler vid 24 ° C, roterande, för att erhålla 5 x 10 8 parasit cellerna 12.
    3. För Trypanosoma brucei, inokulera parasiter i 5 ml SDM-79-medium med 10% FCS och 30 | ig / ml hygromycin. Inkubera över natten vid 27 ° C, att rotera (180 rpm). Mät OD 600 av natten kulturen. Späd parasitceller till en OD 600 av 0,2 i 50 ml färskt selektivt medium. Fortsätta att inkubera celler vid 27 ° C, roterande, för att erhålla 5 x 10 8 parasitceller 13.
    4. För Escherichia coli, inokulera bakterier i 5 ml DYT-medium med 100 ug / ml ampicillin. Inkubera över natten vid 37 ° C, att rotera (180rpm). Mät OD 600 av natten kulturen. Späd bakterieceller till en OD 600 av 0,2 i 50 ml färskt selektivt medium. Fortsätta att inkubera cellerna vid 37 ° C, roterande, för att erhålla 5 x 10 10 bakterieceller 14.
      OBS: Efter inkubation över natten, kan celler i kultur vara i antingen logaritmisk eller stationär tillväxtfas. Mycket långsamt växande cellstammar kan kräva inkubationstider längre än en natt, eller inokulering av ett större antal celler, som bestämts empiriskt.
  2. För alla celltyper, överföra odlingsmediet innehållande cellerna till 50 ml polypropenrör och centrifugera i 3 min vid 1500 x g.
  3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i alla celltyper i 1 ml av den relevanta cellodlingsmediet.
  4. Centrifug alla celltyper i ett mikrocentrifugrör under en min vid 3900 x g. Helt avlägsna supernatanten.
  5. Håll celler på is.

Obs: Hantera flytande kväve med omsorg. Använd personlig skyddsutrustning inklusive cryogloves och googles. Propan är potentiellt explosiv, så utför kondense i ett väl ventilerat rum eller under ett dragskåp. Inga öppna lågor är tillåtna.

  1. Sätta ca 150 ml av flytande kväve i en polystyren bricka. Placera en mässingskopp (höjd 3,6 cm, diameter 2 cm och tjocklek 1,5 mm) i flytande kväve för att frysa den. Låt inte det flytande kvävet tränga in i mässings koppen.
  2. Vänta tills bubblorna avtar att vara säker på att mässings cup är frusen.
  3. Sätt slangen ansluten till gasolflaska i kontakt med mässings cup väggen.
  4. öppna försiktigt propan cylinderventilen.
    OBS: I detta steg, liquefies propan i mässing cup.
  5. Stoppa kondensering genom att stänga propan cylinderventilen och snabbt avlägsna gasslangen.
  6. Fylla polystyren facket med vätska niTrogen upp till 5 mm från toppen av mässings koppen. Låt inte det flytande kvävet tränga in mässing cup.

5. Plunge Frysning av Prov

  1. Sätta ca 200 ml av flytande kväve i polystyren facket. Frysa små mässingskoppar (höjd 1,5 cm diameter 2,5 cm och tjocklek 1 mm) genom att sätta dem i flytande kväve. Sätta en kopp för en upphängnings cellprov. Var noga med att inte blanda prover. I detta syfte lägger prov 1 i kopp 1, prov 2 i koppen 2, osv.
  2. Frysa pincetten genom plunging deras spets i flytande kväve.
  3. Störta en dubbel kant dissekera nål i pelleten som erhålls i 3,5.
  4. Med användning av pincett, ta ett 400 mesh koppar mikroskopi galler belagda med formvar framställd i avsnitt 1.
  5. Med hjälp av dissekera nålen, placera en droppe av pellets som erhållits i 3.5 på nätet. Prova olika droppstorlekar (t ex 2, 5 och 10 | il).
  6. Mycket snabbt störta gallret hålls av pincetten i gen flytande propånrankade i avsnitt 4 och rör rutnätet med cirkulär rörelse under några sekunder.
  7. Snabbt överföra den frusna rutnät med pincett till den lilla mässings cup fryst i avsnitt 5.1.
    OBS: För varje prov göra minst 3 galler. frysa alltid pincett innan en kopparnätet.

6. Freeze-substitution

OBS: Osmiumtetroxid är potentiellt instabil, så använd en luftrenande andningsskydd med ångor. Frysning av fixativ i flytande kväve före dopp frysning är också en lösning.

  1. För ultrastruktur studier öppnar 1,8 ml cryovial rör innehållande fryssubstitution medium framställt i avsnitt 2,1. För immunolokalisering studier öppnar 1,8 ml cryovial rör innehållande fryssubstitution medium framställt i avsnitt 2,2. Placera locket på cryovials.
  2. Frysa pincetten genom plunging deras spets i flytande kväve.
  3. Snabbt ta bort locket och överföra de frusna galler into cryovials med hjälp av pincett.
  4. Sätt tillbaka på cryovials locket.
  5. Upprepa proceduren för varje rutnät av varje prov.
  6. Stäng alla locken och rör de cryovials med en cirkulär rörelse av handen för att säkerställa proverna är i frystsubstitutionsmedium.
  7. Placera kryokärl i en lufttät låda 3 dagar i en -84 ° C frys under fryssubstitutionsprocessen.

7. Prov Warming

  1. ultrastruktur studier
    1. Bär de kryokärl i en polystyren-bricka (för att undvika en plötslig ökning av temperaturen) till en -30 ° C frys. Placera dem i -30 ° C frys under 1 h.
    2. Placera kryokärl i en -15 ° C frys under 2 timmar. Placera proverna vid 4 ° C under 2 h och därefter under 30 min vid rumstemperatur.
    3. Ta frys substitution medium med en plast överföringspipett. Tillsätt ca 500 mikroliter av 100% aceton.
    4. Rör om 1,8 ml kryokärlmed en cirkulär rörelse av handen och snabbt häll aceton (1,5 ml) innehållande gallren i en glasflaska (höjd 3 cm och diameter 2 cm).
    5. Skölj samma cryovial med 1 ml av 100% aceton för att vara säker på att ha överfört alla gallren. Rör om köldkärlet med en cirkulär rörelse av handen och häll innehållet i köldkärlet i en glasflaska.
    6. Skölj varje glasflaska med 3 ml av 100% aceton 3 gånger för 10 min.
    7. Följ inbäddningsrestriktioner och inneslutnings förfaranden som beskrivits i referens 15. Impregnera prov med ökande koncentrationer av epoxiharts i aceton (25%, 50%, och 75%) och bädda in provet med 100% epoxiharts i gelatinkapslar.
  2. immunomärkning studier
    1. Bär de 1,8 ml kryokärl i en polystyren-bricka (för att undvika en plötslig ökning av temperaturen) till -30 ° C frys.
    2. Placera kryokärl för 2 timmar i en -30 ° C frys.
    3. I en -30 ° C frys, rör köldkärlet med en cirkulär rörelse av handen och snabbt häll fryssubstitution medium i en polypropen flaska (höjd 5 cm och diameter 1,5 cm).
    4. Ersätta den frystsubstitutions medium med 2 ml färskt fryssubstitution medium.
    5. Placera polypropylenampull för 2 timmar i en -30 ° C frys.
    6. Skölja polypropylenampull för en timme med 2 ml 100% aceton och tre gånger för en timme med 2 ml 100% etanol.
    7. Följ inbäddningsrestriktioner och inneslutnings förfaranden som beskrivits i referens 15. Impregnera provet med ökande koncentrationer av akrylharts (25%, 50%, och 75% i aceton) och bädda in provet med 100% akrylharts i gelatinkapslar.

8. Visualisering av Prover

  1. Efter inbäddning, gör 80 nm ultratunna sektioner av proverna med en ultramikrotom. Kontrastera de sektioner med 2% blycitrat vid rumstemperatur under 1 minass = "xref"> 15.
  2. Använd en 80 kV eller 120 kV elektronmikroskop för att observera sektionerna 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna artikel, är en enkel att använda och billig plunge frysningsmetod för ultrastrukturella (fig 1 och fig 2) och immunomärkning (Figur 3) studier presenteras. Vi visar att det inte är nödvändigt att ha specialutrustning för proceduren frys substitution och att uppvärmningen proceduren tar mindre än 6 h istället för 24 h med en dedikerad system.

PF / frysSubstitutionsMetoden resulterade i förbättrad konservering av de intracellulära strukturer av Saccharomyces cerevisiae (Figur 1A och 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (Figur 1B och C), Leishmania flagellum (Figur 2 A och B), Trypanosoma brucei (fig 2 C och D), och Escherichia coli (Figur 2E). Strukturerna är inte krympta och cytoplasman verkar tät. Dessutom membranen är släta, vilket är bevis på god konservering. Alla de organeller, såsom kärnan (Figur 1A, B D och figur 2A -D), mitokondrier (Figur 1A -C, E och H) och vakuoler (figur 1 A, C, F och H), kan vara helt identifieras . I kärnan, ett dubbelt membranbildande kärnhölje, kärnpor, spindel polkroppen och ribosomer bundna på det yttre membranet av kärnhöljet är tydligt synbar (figur 1D och figur 2B, 2D). I mitokondrierna, de inre membran invaginationer, kallade crista (figur 1E), är tydligt synliga. De vakuoler är kritiska organ eftersom stora iskristaller lätt kan utvecklas inuti dem. Såsom illustreras i figur 1, är vakuoler perfekt bevarad utan iskristall skador (figur 1 A, C, F och H). Slutligen, såsom ultrastrukturen är väl bevarad, kan observeras och analyseras olika biologiska händelser, såsom autophagy (Figur 1C, F och H), mitokondriell morfologi (Figur 1E), sekretoriska vesiklar (Fig 1 g), och kärndelning (Figur 1A , fig 2 B, ettnd 2C).

In situ lokalisering av proteiner med specifika antikroppar är ett av de mest kraftfulla och populära tekniker i cellbiologi. PF kan också användas som en metod för att utföra proteinimmunlokalisering. Detta förfarande bevarar protein antigenicitet och, såsom nämnts ovan, organell identitet. Olika antikroppar riktade mot olika jästproteiner, såsom anti-ATP-syntas 7, 15 (figur 3A, 3C och 3D), anti-GFP (figur 3B), anti-porine 16 (fig 3 E), och anti-fox2 17 (figur 3F), har redan testats. Det är också möjligt att utföra dessa experiment på olika organismer, såsom Leishmania 12.


Figur 1: TEM-bilder av ultrastrukturella studier av jäst Saccharomyces cerevisiae och Schizosaccharomyces pombe. (A) Översikt av S. cerevisiae. (B) Överblick av S. pombe. (C) Del av S. pombe cytoplasma. (D) Hög förstoring av en kärna. (E) Detalj av en mitokondrie med crista klart synlig. (F) vakuolär morfologi under autophagy. (G) Jäst knopp med sekretions vesiklar inuti. (H) Exempel av intima kontakter mellan vakuoler och mitokondrier under autophagy processen. N, kärna; V, vakuolen; m, mitokondrien; SV, sekre vesilarna; r, ribosomer. Skalstrecken = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: TEM-bilder av ultrastrukturella studier av Leishmania amazonesis, Trypanosoma brucei och E. coli. (A) Översikt av Leishmania. (B) Specificera av Leishmania cytoplasma med kärnpor och endoplasmatiska retiklet. (C) Överblick av T. brucei. (D) Hög förstoring av T. brucei kärna. (E) Överblick av E. coli-cell. N: kärna; V, vakuolen; m, mitochondrion; NP, kärnpor; F, flagellum; FP, flagellar ficka; K, kinetoplast; r, ribosomer. Skalstrecken = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 3
Figur 3: Exempel på proteinmärkning med användning av monoklonala och polyklonala antikroppen. (A) Översikt av S. cerevisiae. (B) immunomärkning av amyloid-β med anti-GFP-antikroppar. (CD) Exempel på mitokondrier märkning med anti-ATP-syntas-antikroppar. (E) Porin lokalisering i yttre membran av ett mitokondrien. (F) Fox2 proteinet detekteras i mitokondrien genom immunomärkning. (G) Lokalisering av Ld Flabarin iett längdsnitt av en flagellum av Leishmania amazonesis. Alla de antikroppar detekteras med användning av 10 nm guld polyklonala antikroppar. N, kärna; V, vakuolen; m, mitokondrien. Skalstrecken = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TEM är en kraftfull metod för ultrastrukturella observation av organeller, celler och vävnader. Cryofixation / fryssubstitution är för närvarande den bästa metoden för konservering av både ultrastruktur och protein antigenicitet. Kemiska fixativ penetrera och agera mycket långsamt därigenom tillåta strukturella omlagringar före fullständig stabilisering av ultrastrukturen 2. Omvänt, cryofixation / fryssubstitution stabiliserar omedelbart cellulära strukturer 4. cryofixation / frystsubstitutionstekniker inkluderar emellertid ett antal begränsningar och svårigheter därigenom begränsar deras användningsområde. Detta gäller prov, frysning artefakter, förverkligandet av tekniken, kostnad och utrustning. Högtrycks frysning / fryssubstitutionsteknik har möjliggjort en hög grad av konservering av cellulära detaljer 6, 7. Däremot är PF redan används för obsErving små föremål upphängda på tunna filmer av amorft is 9. Här, PF / fryssubstitution metod för ultrastrukturella och immunomärkning studier ger bilder av jäst, parasiter och bakteriell ultrastruktur jämförbara med högtrycks frysning bilder av hög kvalité.

Fixering Kvaliteten beror på kylningshastigheter 18. Vid höga kylningshastigheter, är vatten i glaskroppen tillstånd och inte visar synliga kristallin struktur vid elektronmikroskopi nivån. Förglasningen sker enbart i ett mycket tunt ytskikt (200 | j, m i allmänhet), och därför kommer god tjocklek frysning gradvis minska från ytan av provet till de inre skikten 4. I växtceller, kan vaxartad beläggning eller utrymmen fyllda med gas sakta kylningshastigheterna. Med PF, överraskande, ingen minskning av kvaliteten på frys prestanda observerats. I alla experimenten, är procentandelen väl frusna celler g reater än 50%. Denna andel varierar mellan 50% till mer än 90% och är beroende av olika parametrar (odlingsmedium, fysiologisk status av cellerna, utomhustemperatur, och fuktnivå). Såsom angivits ovan, bildningen av iskristaller förstör cellstrukturen och iskristaller är särskilt synliga i vakuoler. I / frys substitutionsprocess PF måste särskild uppmärksamhet ägnas åt fryspunkten. Steget fryssubstitution får inte utföras över -82 ° C, i annat fall, den glasartade vatten kommer att omvandlas till kristallin vatten. För att undvika isbildning kristallskador är kryoskyddsmedel närvarande används, men som leder till förändringar i ultra av cellerna 19. Jäst, bakterier, och parasit odlingsmedier kan innehålla en komponent som är kryoskyddande medlet. I detta sammanhang beslutades att inte använda ytterligare kryoskyddsmedel för att vara så nära som möjligt till den verkliga cellulära tillstånd.

ve_content "> Framgången för PF / fryssubstitution beror på många kritiska steg under fasen för metodutvecklingen. För det första är en kritisk punkt för att erhålla den lämpliga konsistensen av pelletsen. Pelleten som erhölls efter centrifugering måste vara tillräckligt kompakt för att rullas ut på en elektronmikroskopi rutnät. Om pelleten är alltför kompakt, kan den frystersättningslösning inte penetrera droppe, och den ultrastruktur kommer inte att välbevarade. Omvänt, om pelleten inte är tillräckligt kompakt, kan den kvarvarande odlingsmedium utveckla iskristaller och försämra cellultrastrukturen. för att erhålla den lämpliga konsistensen av pelletarna från de olika celltyper, är det nödvändigt att respektera odlingsbetingelser för att erhålla det angivna antalet celler och centrifuge parametrarna som anges i protokollet (se ovan) för alla celltyper. emellertid är mängden av det material som släpps ut på koppargaller inte kritisk. Olika droppstorlekar kan testas. för det andra, typen galler that används som ett stöd är viktigt. Flera guld, nickel, och koppargaller med olika maskstorlek testades. De bästa resultaten erhölls med en 400 mesh koppargaller med tunna barer. Tredje, med avseende på frysningssteget, är en mässingskopp föredraget att kondensera propån. Flytande propån i koppar kopp tenderar att frysa och, därför, komplicerar experimentet. Slutligen måste roboten arbeta snabbt och under kalla förhållanden för att undvika oavsiktlig prov uppvärmning. Om det händer, måste provet kasseras. Till exempel, för att förhindra prov uppvärmningen, pincetten måste i förväg kyld innan du använder dem och fryssubstitution mediet måste beredas långt före innan förfarandet. Kylda pincett måste också användas under steget frysningsprocessen becauseif steget frysning realiseras utan frysning pincetten, en massa av rökaformer som pincetten är nedsänkt i propan (på grund av den värme / kyla-utbyte). Detta har oundvikligen en inverkan på kylningshastigheter. Tester med samples frysta med ofrysta pincett verkar inte vara korrekt frysas.

Dessutom användning av farliga kemikalier såsom O S O 4 och uranylacetat i frystsubstitutions mediet kräver, under framställningen av lösningar och fryssubstitution processen, för att arbeta under dragskåp med tillräckligt PPE. För att förhindra läckage av OSO4 och inandning av ångor, måste kryokärl har hård O-ring för att säkerställa att rören förblir förseglade under fryssubstitution processen. För att förhindra onödig exponering för osmium ånga under framställningen av frystsubstitutionsmediet kan OSO4 ampull brytas i en glaskolv. Närvaro av glasskärvor i hartsblocket efter införandet kan undvikas genom användning av fin spets överföringspipetter under acetones sköljningar och trappsteg av inbäddning. Utför inbegripandet steget under ett binokulärt slinga och förverkligandet av halv tunna sektioner tillåter också för att verifiera att det inte finns några glasskärvor.När experimenten inte kan utföras under ett dragskåp (i synnerhet i det första steget av det frystsubstitutionsprocessen), använda en luftrenande andningsskydd med ångor. Roboten måste också vara försiktig när du arbetar i kyla med flytande kväve eller under frysning steg. Användning av handskar och glasögon rekommenderas. Vidare är propån potentiellt explosiv, så förvätskningen måste utföras i ett välventilerat rum eller under ett dragskåp och inga öppna lågor är tillåtna.

Flera artiklar visade att, på en bred variation av prover, såsom hjärnvävnad, murgröna blad, eller rotspetsar av A. thaliana och N. benthamiana, är bevarandet av ultrastrukturen förbättras med HPF teknik jämfört med kemisk fixering 20, 21. Med PF, har experimenten utfördes på celler i suspension. Därför finns det ingen indikation på framgången för denna teknik på larger prover liknande vävnader. Ytterligare försök måste genomföras för att ta itu med denna punkt. Emellertid har metoden testats framgångsrikt med filamentös svamp Podospora anserina som inte isoleras celler utan är snarare av mycel formen 22.

Den metod som presenteras i denna artikel representerar en signifikant förbättring jämfört med de nuvarande metoderna för kemisk fixering eller HPF. Till exempel behöver PF inte kräver dyr utrustning eller förbrukningsvaror i motsats till HPF 23. Försiktighet måste även tas eftersom HPF tekniken använder en stor mängd av flytande kväve (omkring 80 L per experiment). Med den teknik som föreslås är en stor fördel att ingen viktig utrustning är nödvändig 23. Sålunda är kostnaden för ett experiment mycket lägre (omkring hundra gånger billigare). En annan fördel är att ingen särskild expertis behövs eftersom tekniken är enkel att använda. Dessutom provbearbetning of PF / fryssubstitution är mycket kortare än HPF / fryssubstitution på grund av uppvärmningen process som tar mindre än 6 h istället för 24 h 24. Det är inte mer tidskrävande än konventionell kemisk fixering. Fördelen är att det cellulära ultra är perfekt bevarad med minimi artefakter och är mycket närmare cellernas ursprungliga tillstånd. Tillämpningen av denna teknik kommer säkerligen vara till nytta för att studera olika snabba biologiska händelser eller för att lokalisera proteiner vid hög upplösning för celler odlade i suspension och för prover av ett fåtal mikrometer tjocklek, såsom svamphyfer 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgements

Vi uttrycker vår tacksamhet till M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet och A. Devin för deras hjälp och synpunkter på manuskriptet. Vi är tacksamma för den elektroniska bild pol Bordeaux Imaging Center där bilderna togs. Detta arbete stöddes av Centre National de la Recherche Scientifique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100, (6), 641-656 (1954).
  2. Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168, (Pt 2), 181-201 (1992).
  3. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130, (5), 877-889 (2008).
  4. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203, (Pt 3), 285-294 (2001).
  6. Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4, (12), 2311-2324 (2006).
  7. Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3, (4), 329-336 (2007).
  8. Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3, (2), 177-210 (1986).
  9. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58, (4), 677-689 (2015).
  10. Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
  11. Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235, (1), 25-35 (2009).
  12. Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8, (9), 1-12 (2013).
  13. Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
  14. Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48, (26), 4858-4860 (2009).
  15. Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, (18), 18386-18389 (2005).
  16. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21, (3), 221-230 (2002).
  17. Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9, (12), 1-27 (2014).
  18. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  19. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47, (5), 935-945 (2007).
  20. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
  21. Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
  22. Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
  23. Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51, (7), 931-940 (2003).
  24. Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195, (1), 41-48 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats