में mitochondrial संरचना और समारोह के अध्ययन

Biology

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Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

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Abstract

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया प्रतिष्ठित, सेलुलर महाशक्ति के रूप में वर्णित के बाद से वे विभेदित कोशिकाओं में ऊर्जा उत्पादन का मुख्य सीटें हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय, गर्मी पीढ़ी, लिपिड संशोधन, कैल्शियम और redox homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका, सेल संकेत प्रक्रियाओं के आर्केस्ट्रा, आदि 1 खेलते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया भी कोशिका चक्र विनियमन 3 में कोशिका मृत्यु 2 की प्रेरण में एक सक्रिय भूमिका है, साथ ही खेलते हैं। ऐसे बहु-कार्यक्षमता निम्नलिखित मौलिक सवाल उठता है: क) माइटोकॉन्ड्रिया इन सभी कार्यों को एक साथ प्रदर्शन करते हैं और ख) विशिष्ट mitochondrial पूल या subzones कि अलग कार्यों के लिए विशेष कर रहे हैं देखते हैं? इस संदर्भ में, यह ध्यान दें कि multifunctional माइटोकॉन्ड्रिया उनके आकार, आकार, और व्यक्ति की कोशिकाओं के भीतर की संरचना में गतिशील हैं और माइटोकॉन्ड्रिया की स्थिर राज्य आकार प्रकार की कोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं कि महत्वपूर्ण है। विभिन्न प्रयोगशाला से अनुसंधान के दशकोंoratories सुझाव है कि mitochondrial आकार, आकार, और संरचना, सामूहिक रूप से कहा जाता है mitochondrial गतिशीलता के परिवर्तन, विभिन्न mitochondrial कार्यों 4,5,6 को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। इन निष्कर्षों संभावना है कि माइटोकॉन्ड्रिया उनकी संरचनात्मक गतिशीलता के आधार पर उनकी बहु कार्यक्षमता को पूरा कर सकते हैं बढ़ा।

व्यापक प्रयासों mitochondrial संरचना समारोह संबंधों को समझने के लिए चल रहे हैं। mitochondrial संरचना की गतिशीलता मुख्य रूप से एक दूसरे के साथ विखंडन और संलयन घटनाओं से गुजरना करने के लिए अपनी क्षमता से बनाए रखा है। बड़े माइटोकॉन्ड्रिया के विखंडन, छोटे mitochondrial तत्वों में उन्हें धर्मान्तरित जबकि दो छोटे माइटोकॉन्ड्रिया के बीच विलय के लिए उन्हें एक बड़ा mitochondrial तत्व 7 में विलीन हो जाती। इसके अलावा, दो माइटोकॉन्ड्रिया के क्षणिक संलयन उनकी सामग्री के मिश्रण की अनुमति के लिए हो सकता है। भीतरी और बाहरी mitochondrial झिल्ली के विखंडन और संलयन घटनाओं को ध्यान से कल्पना द्वारा नियंत्रित कर रहे हैंific प्रोटीन का सेट। कोर विखंडन मशीनरी dynamin से संबंधित प्रोटीन 1 (Drp1) है, जो निश्चित सदाशयी mitochondrial प्रोटीन (जैसे, Fis1 या Mff1) के साथ अपनी बातचीत से माइटोकॉन्ड्रिया के लिए cytosol से भर्ती है Drp1 समारोह भी द्वारा विनियमित किया जा सकता है, जबकि से बना है mitochondrial सतह 4 पर अन्य प्रोटीन। हालांकि Drp1 बाहरी झिल्ली पर चल रही है, इसके विखंडन क्षमताओं के रूप में अच्छी तरह से भीतर की झिल्ली को प्रभावित। बाहरी और भीतरी mitochondrial झिल्ली के विखंडन के आर्केस्ट्रा में अच्छी तरह से समझ नहीं है। दूसरी ओर, भीतर की झिल्ली के विलय, Opa1 की गतिविधियों से मूल में संचालित होता है, जबकि mitofusins बाहरी झिल्ली 5 के विलय को नियंत्रित। माइटोकॉन्ड्रिया के प्रतिकार विखंडन और संलयन घटनाओं के संतुलन के लिए एक सेल में स्थिर राज्य mitochondrial आकार नियंत्रित करती हैं। उदाहरण के लिए, mitochondrial विखंडन का दमन पूर्ण और निर्विरोध संलयन में नतीजा होगा, जबकि माइटोकॉन्ड्रिया की ओवर-गतिविधिएल विखंडन माइटोकॉन्ड्रिया 3 के विखंडन पर नतीजा होगा।

mitochondrial संरचना समारोह संबंध का अध्ययन मुख्य रूप से दो मानार्थ दृष्टिकोण शामिल है: एक) mitochondrial विखंडन / संलयन प्रोटीन की आनुवंशिक हेरफेर के बाद सेलुलर और जीवधारी phenotypes का विश्लेषण करती है और ख) mitochondrial संरचना और समारोह का सीधा आकलन। ऐसा नहीं है कि आनुवांशिक विश्लेषण हमेशा की तरह, प्रत्यक्ष (इस मामले में, mitochondrial विखंडन / संलयन प्रोटीन में) हाथ में अणु की कार्यक्षमता का खुलासा नहीं कर सकते हैं के रूप में phenotypes माध्यमिक प्रभाव के कारण उत्पन्न हो सकती है उल्लेखनीय है। इसलिए, यह विकसित और सीधे mitochondrial संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए उपकरण का उपयोग करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। mitochondrial संरचना के किसी भी मूल्यांकन के विभिन्न माइक्रोस्कोपी उपकरण शामिल है। जीवित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग बहुत, mitochondrial गतिशीलता के अध्ययन के बाद से उन्नत किया है mitochondrial गतिशीलता दोनों गुणात्मक और quantitat नजर रखी जा सकतीउचित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी उपकरणों और तकनीकों का उपयोग करते हुए 8 ively। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी आधारित उपकरण विवो 9 में mitochondrial गतिशीलता के महत्व का वर्णन रहते हैं और तय ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर ऊतकों में mitochondrial संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। ये और संबंधित विधियों यहाँ वर्णित हैं, ड्रोसोफिला अंडाशय में mitochondrial संरचना और समारोह के अध्ययन के लक्ष्य के साथ।

ड्रोसोफिला अंडाशय germline और दैहिक प्रजातियों, जो अपने संबंधित वयस्क स्टेम कोशिकाओं है कि germarium 10,11 में रहते से उठता के होते हैं। सोलह syncytial रोगाणु कोशिकाओं (जेंटलमैन कैडेट) व्यक्तिगत अंडा कक्षों कि germarium (चित्रा 1) के बाहर उभरने के लिए फार्म का दैहिक कूप कोशिकाओं (एफसीएस) द्वारा समझाया मिलता है। 16 जेंटलमैन कैडेट में से एक एक oocyte बनने के लिए प्रतिबद्ध है, और शेष 15 जेंटलमैन कैडेट नर्स कोशिकाओं है कि oocyte चैम्बर के विकास का समर्थन के रूप में विकसित, अंडे की परिपक्वता की सुविधा होने से पहले ही रखी है। एफसी के बहुमत mitotic डिवीजनों में से 9 दौर से गुजरना पहले वे mitotic कोशिका चक्र से बाहर निकलने टर्मिनली पूर्वकाल कूप कोशिकाओं (AFCs), पीछे कूप कोशिकाओं (PFCS और), और मुख्य शरीर की कोशिकाओं से मिलकर एक नमूनों उपकला सेल परत में अंतर करने के लिए (MBCs) । लगातार अंडे कक्षों डंठल कोशिकाओं है, जो कोशिकाओं को भी है कि प्रारंभिक विकास में एफसी से निकाली गई है भेदभाव कर रहे हैं से जुड़े हुए हैं। Mitochondrial आकार mitochondrial विखंडन प्रोटीन Drp1 द्वारा विनियमित सक्रिय रूप से ड्रोसोफिला डिम्बग्रंथि एफसी परत 9,12 के सामान्य विकास के दौरान भेदभाव करने की प्रक्रिया में शामिल है। ड्रोसोफिला कूप सेल परत विकास में Drp1 की भागीदारी की पहचान करने के लिए इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया तरीकों यहाँ वर्णित हैं।

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Protocol

1. ड्रोसोफिला की तैयारी (उपकरण की आवश्यकता चित्रा 2A में चित्रित कर रहे हैं)

  1. वर्णित प्रयोगों में से किसी के लिए, ड्रोसोफिला इकट्ठा eclosion के 5 दिनों के भीतर (कमरे के तापमान, या 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा) और 5 से भरा एक शीशी में उन्हें जगह - 7 एमएल ड्रोसोफिला के भोजन (देखें सामग्री तालिका) कोई 25 से अधिक के साथ प्रत्येक शीशी में मक्खियों; 2 के पुरुष अनुपात: एक महिला को बनाए रखने के 1।
  2. ड्रोसोफिला अंडा उत्पादन को प्रोत्साहित करने के लिए दानेदार खमीर की एक छोटी राशि छिड़क। 4 दिन - 2 के भीतर प्रयोगात्मक हेरफेर प्रदर्शन करना।

2. ड्रोसोफिला अंडाशय के विच्छेदन (उपकरण की आवश्यकता चित्रा 2A में चित्रित कर रहे हैं)

  1. गर्म कीट विदारक मध्यम कमरे के तापमान पर (देखें सामग्री तालिका), 25 डिग्री सेल्सियस। एक आठ अच्छी तरह से कांच विदारक पकवान के तीन कुओं भरें, प्रत्येक में मध्यम के 200 μL के साथ अच्छी तरह से।
  2. सीओ के साथ ड्रोसोफिला anesthetize ड्रोसोफिला संभाल जब लाइव माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन।
  3. विच्छेदन खुर्दबीन के ऐपिस के माध्यम से देख जबकि, पेट संदंश के दो जोड़े का उपयोग करने से छाती तोड़। संदंश का प्रयोग, ध्यान पकवान की दूसरी अच्छी तरह से करने के लिए पेट हस्तांतरण।
  4. पीछे अंत में पेट पकड़ के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें, और धीरे धीरे अंडाशय बाहर संदंश के अन्य जोड़ी के साथ धक्का (अन्य पेट की सामग्री के साथ)। इस प्रयास विफल करना चाहिए, ध्यान से पूर्वकाल अंत में संदंश डालने अंडाशय को रिहा करने से पेट की बहिःकंकाल को हटा दें।
  5. संदंश का प्रयोग, (यानी, जर्दी-भरा, देर चरण अंडे) अपारदर्शी पीछे अंत से एक व्यक्ति अंडाशय पकड़ और पकवान के तीसरे अच्छी तरह से करने के लिए सावधानी से इसे स्थानांतरितलाइव माइक्रोस्कोपी (चरण 3) के लिए यह प्रक्रिया चिढ़ा के लिए या immunostaining (7 कदम) प्रदर्शन करने के लिए तय करने के लिए।
  6. ध्यान से प्रत्येक अंडाशय के पूर्वकाल अंत करने के लिए पीछे से हल्के से एक चिढ़ा सुई व्यापक है, जबकि यह पीछे के अंत से पकड़े संदंश की एक जोड़ी के साथ अंडाशय से चारों ओर से सुरक्षा म्यान तंग।
    नोट: चिढ़ा के दौरान नुकसान को कम करने के लिए, सुई की नोक के आगे झुकना और माइक्रोस्कोप (2A चित्रा) की बढ़ाई बढ़ाने के द्वारा प्रत्येक अंडाशय पर ज़ूम। चिढ़ा म्यान तोड़ने के लिए पर्याप्त प्रभावी होना चाहिए, लेकिन यह भी ध्यान से ovarioles की अखंडता की रक्षा करने के लिए किया जाना चाहिए।

3. लाइव-ऊतक माइक्रोस्कोपी के लिए तैयारी

नोट: उपकरण की आवश्यकता चित्रा 2A में चित्रित कर रहे हैं।

  1. ड्रोसोफिला विच्छेदन से पहले, polyL lysine लेपित कक्षों तैयार करते हैं। यह अंत करने के लिए, covergl पर polyL lysine (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के दो 20 μL बूँदें जगहगधा आदेश बूंदों के विलय को रोकने के लिए (14 मिमी, नं 0) एक दूसरे से एक उचित दूरी पर एक गिलास तली पेट्री डिश (35 मिमी)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्लेटों हवा शुष्क और एक अमिट मार्कर के साथ प्लेट के नीचे पर सफेद polyL-लाइसिन फिल्म के किनारों निशान।
    नोट: polyL Lysine लेपित कक्षों एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। एक पहले से लेपित कक्ष का उपयोग करते हैं, ड्रोसोफिला विच्छेदन शुरू करने से पहले कमरे के तापमान के लिए इसे लाने।
  2. सुनिश्चित करें कि नमूना के रूप में नीचे विच्छेदन और बढ़ते के पूरा होने के बाद तुरंत imaged किया जा सकता, बनाने के लिए confocal खुर्दबीन पर स्कैनिंग मानकों को निर्धारित करें।
  3. एक विच्छेदित और अंडाशय छेड़ा (निम्न चरण 2 और दाग, अगर, आवश्यक कदम 5 के बाद) एक चिह्नित polyL Lysine लेपित क्षेत्र पर रखें और ovarioles अलग करने के लिए चिढ़ा सुई के साथ अंडाशय फैल गया। अंडाशय के शीर्ष पर कीट विदारक माध्यम की एक 10 μL बूंद रखें, टी कवर करने के लिए सुनिश्चित कर रही हैवह पूरे polyL Lysine लेपित क्षेत्र। पेट्री डिश को कवर किया।
  4. तुरंत कमरे के तापमान पर घुड़सवार नमूने की confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: केवल एक ड्रोसोफिला, विच्छेदित किया जाना चाहिए संसाधित, और एक समय में imaged। इसके अलावा, माइक्रोस्कोपी 37 डिग्री सेल्सियस, जो ड्रोसोफिला ऊतक के लिए एक गर्मी झटका पर्यावरण नकल करेंगे पर प्रदर्शन नहीं किया जाना चाहिए।

4. प्रतिदीप्ति घटाने photobleaching (फ्लिप) परख में आकलन करने के लिए mitochondrial मैट्रिक्स निरंतरता

नोट: एक दूसरे से जुड़ने mitochondrial संरचना में mitochondrial मैट्रिक्स निरंतरता मध्यवर्ती कदम के माध्यम से एक प्रगति निम्नलिखित mitochondrial भीतरी और बाहरी झिल्ली की पूरी संलयन के बाद स्थापित किया गया है। माइटोकॉन्ड्रिया के विखंडन एक ही चरणों का पालन करें, लेकिन विपरीत दिशा में (चित्रा 3 ए) हो सकती है। फ्लिप एक समय चूक माइक्रोस्कोपी आधारित अर्द्ध मात्रात्मक तरीका है कि में mitochondrial मैट्रिक्स निरंतरता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपूर्व vivo माइटोकॉन्ड्रिया के अंतिम जुड़े हुए राज्य (3 और 4 कदम चित्रा 3 ए में) लाइव ड्रोसोफिला अंडाशय 9 में। फ्लिप परख माइटोकॉन्ड्रिया mitochondrial मैट्रिक्स है कि नियमित अंतराल (चित्रा 3 ए में दूसरा आरओआई) पर photobleached है में एक फ्लोरोसेंट अणु व्यक्त करने का ब्याज (आरओआई) के एक छोटे से क्षेत्र के रूप में किया जाता है। नतीजतन, किसी भी आसपास के क्षेत्र mitochondrial कि फ्लिप रॉय (चित्रा 3 ए में प्रयोगात्मक आरओआई) के साथ निरंतर है निरंतर mitochondrial मैट्रिक्स में अणुओं के आदान-प्रदान के कारण संकेत खो देंगे। फ्लिप यहां प्रदर्शन प्रयोगों एक स्वतंत्र रूप से प्रसारण के रूप में mitochondrial मैट्रिक्स के लिए यह लक्ष्य करने के लिए mitoYFP है, जो मानव साइटोक्रोम oxidase आठवीं YFP के साथ टैग सबयूनिट के mitochondrial लक्ष्यीकरण अनुक्रम शामिल व्यक्त ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला पर प्रदर्शन कर रहे हैं। इसी तरह का एक प्रयोग के रूप में भी पहले से सूचना दी, मिटो pUASP-Mito-GFP ट्रांस्जीन के साथ किया जा सकता है <sup> 9। इसी तरह की एक फ्लिप प्रोटोकॉल एक जांच mitochondrial झिल्ली अंतर-अंतरिक्ष के लिए लक्षित के साथ प्रयोग किया जा सकता है निरंतरता बाहरी के विलय से उत्पन्न पता लगाने में सक्षम होना करने के लिए नहीं बल्कि भीतरी mitochondrial झिल्ली (चित्रा 3 ए में कदम 2)।

  1. Confocal खुर्दबीन पर छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें और "अधिग्रहण" टैब (तालिका 1) में उचित स्कैनिंग मानकों सेट। अलग-अलग टैब खोलने के लिए "समय श्रृंखला," "ब्लीचिंग," और "क्षेत्र" बक्से की जाँच करें। प्रत्येक टैब (तालिका 1) में उचित अधिग्रहण पैरामीटर मान रखो।
    नोट: पिनहोल, खुला छोड़ दिया जाना चाहिए क्योंकि इस प्रयोग व्यक्ति की कोशिकाओं में पूरे mitochondrial जनसंख्या से समग्र संकेत नजर रखने के लिए बनाया गया है।
  2. आईपीस का उपयोग जल्दी से मुहिम शुरू की जीवित ऊतक में रुचि के क्षेत्र का पता लगाने के लिए।
    ध्यान दें: ovarioles कि अच्छी तरह से कांच bottome पर फैले हुए हैं का चयन करेंडी पकवान, के बाद से confocal माइक्रोस्कोपी चल ovarioles पर नहीं किया जा सकता है।
  3. "जी" पर क्लिक ब्याज के चयनित क्षेत्र के एक जीवित छवि प्राप्त करने के लिए। "रोक" पर क्लिक करें लाइव स्कैनिंग रोकने के लिए।
  4. यदि आवश्यक हो, अधिग्रहण पैरामीटर है कि इस तरह का पता चला फ्लोरोसेंट संकेत संतृप्ति स्तर से नीचे है (लाल पिक्सल के अभाव ने संकेत दिया है जब "रेंज सूचक" विकल्प चुना जाता है), परिभाषित पृष्ठभूमि के साथ ऑफसेट मूल्यों का समायोजन करके सेट के रूप में समायोजित करें।
  5. "क्षेत्र" टैब से हैंडल ड्राइंग उपकरण का उपयोग कर छवि को लाइव स्कैनिंग द्वारा अधिग्रहीत पर photobleaching क्षेत्र हदबंदी के लिए एक छोटी सी रॉय ड्रा।
    नोट: रॉय का आकार लगभग 20 होना चाहिए - सेल के भीतर कुल फ्लोरोसेंट mitochondrial संकेत का 50%।
  6. पर क्लिक करके छवि अधिग्रहण प्रदर्शन करना "प्रयोग शुरू करते हैं।"
  7. प्रतिदीप्ति तीव्रता मालिकाना या खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर यों (सामग्री देखतालिका)। जहां दोहराव विरंजन लक्ष्य रखा गया है रॉय से मतलब संकेत (फ्लिप) रिकॉर्ड; ROIs जहां विरंजन एक ही सेल में प्रदर्शन नहीं किया गया है (प्रायोगिक); देखने का एक ही क्षेत्र में एक और सख़्त सेल से रॉय, प्रयोगात्मक अवधि (ब्लीचिंग) के दौरान कुल मिलाकर विरंजन आकलन करने के लिए; और पृष्ठभूमि क्षेत्र (पृष्ठभूमि) पर रॉय। अन्य ROIs में मतलब संकेत से प्राप्त मतलब पृष्ठभूमि संकेत घटाना। संबंधित सेल के लिए प्रारंभिक पूर्व ब्लीच संकेत के साथ फ्लोरोसेंट संकेत मानक के अनुसार।
  8. किसी भी मानक की साजिश रचने सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सामान्यीकृत डेटा प्लॉट।

5. फ्लोरोसेंट Mitochondrial रंगों के साथ लाइव धुंधला

नोट: स्थिर राज्य mitochondrial संरचना और क्षमता के रंगों कि विशेष रूप से जीवित कोशिकाओं और ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रिया में शामिल का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। लाइव ड्रोसोफिला अंडाशय पूर्व vivo कलंकित किया जा सकता फ्लोरोसेंट mitochondrial साथदाग माइटोकॉन्ड्रिया कल्पना करने के लिए, mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का आकलन करने के लिए (Mito-आरओएस) के उत्पादन, और यूनिट प्रति जन mitochondrial क्षमता का आकलन करने के लिए। इस mitochondrial potentiometric डाई tetramethylrhodamine एथिल एस्टर (TMRE) और एक संगत को लाइव mitochondrial दाग mitochondrial बड़े पैमाने पर प्रतिनिधित्व करने के साथ सह-धुंधला द्वारा पूरा किया जा सकता है (देखें विशिष्ट रंगों के लिए सामग्री तालिका)।

  1. गर्म कीट में दाग अंतिम काम सांद्रता के लिए मध्यम विदारक का जायजा पतला: mitochondrial दाग, 250 एनएम; TMRE, 50 एनएम; और Mito-आरओएस दाग, 5 माइक्रोन।
  2. विच्छेदन और चरण 2 के बाद अंडाशय चिढ़ा के बाद, एक विच्छेदन पकवान के एक कुएं में किसी विशेष धुंधला समाधान के 200 μL में अंडाशय जगह है। उन्हें एक उपयुक्त प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे बॉक्स द्वारा कवर पकवान के साथ 10 मिनट के लिए सेते हैं। उन्हें containin लगातार 3 कुओं में संदंश के साथ सावधानी से आगे बढ़ द्वारा दाग धो अंडाशयदाग के बिना जी मध्यम।
  3. TMRE और संगत समग्र mitochondrial दाग के साथ सह-धुंधला के लिए, समग्र mitochondrial दाग (बीच में किसी भी धोने कदम के बिना) के साथ तुरंत पहले TMRE के साथ और फिर दाग ऊपर प्रोटोकॉल का पालन करें।
  4. एक polyL lysine लेपित गिलास तली पकवान निम्न चरण 3 पर अंडाशय माउंट और उचित स्कैनिंग मानकों (तालिका 1) के साथ confocal माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार करते हैं, निम्नलिखित 4.2-4.4 कदम।
    नोट: शामिल रंगों से संकेत जब बढ़ते मध्यम में दाग नमूने माउंट करने का प्रयास तक नहीं किया।
  5. टैब खोलने के लिए जेड सेक्शनिंग बॉक्स को चेक करें। नमूना के नीचे की ओर ध्यान देने के पहिया बारी है, जबकि यह लिव-स्कैन किया जा रहा है और "पहला सेट" नीचा जेड-खंड को परिभाषित करने के लिए पर क्लिक करें। जबकि दूसरी दिशा की ओर ध्यान देने के पहिया चलती सर्वोच्च अनुभाग को परिभाषित करने के लिए एक ही मत करो।
  6. पर क्लिक करके छवि अधिग्रहण प्रदर्शन करना "प्रयोग शुरू करते हैं।"
  7. (कदम 4.7 के रूप में) पृष्ठभूमि संकेत के लिए ROIs और व्यक्ति की कोशिकाओं से पृष्ठभूमि को सही फ्लोरोसेंट तीव्रता यों और किसी भी साजिश रचने सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा साजिश है।

6. Drp1 अशक्त मोज़ाइक की पीढ़ी

नोट: प्रतिरूप यहां इस्तेमाल किया रणनीति एक GFP पॉजिटिव, phenotypically जंगली प्रकार पृष्ठभूमि Drp1 अशक्त उत्परिवर्तन 9 के लिए genotypically विषमयुग्मजी है कि की पृष्ठभूमि में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) -नकारात्मक Drp1 अशक्त क्लोन का परिचय। गर्मी झटका प्रेरित flippase-flippase मान्यता लक्ष्य (FLP-FRT) मध्यस्थता साइट विशेष mitotic पुनर्संयोजन कार्यात्मक अशक्त drpKG03815 एलील की homozygous क्लोन पैदा करता है। ड्रोसोफिला के जीनोटाइप Drp1 उत्परिवर्ती ले जाने, drpKG03815 FRT40A / CYO है गर्मी झटका प्रेरित FLP (hsFLP) और UbiGFP प्रतिरूप मार्कर hsflp है ले जाने के जीनोटाइप, जबकि; यूबीक्यूटिन एनएलएस-GFP (UbiGFP) FRT 40A / cyo। एसई के जीनोटाइपऊपर जीनोटाइप के बीच क्रॉस के lected संतानों hsFLP / + है; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A।

  1. उन्हें हर 2 से 3 दिन ताजा भोजन की नई शीशियों में ले जाकर कुंवारी संग्रह के लिए ड्रोसोफिला सिंक्रनाइज़ करें। आदेश में उभर कुंवारी महिलाओं को इकट्ठा करने में दैनिक pupariating शीशियों मॉनिटर।
  2. शाम में हर दिन Drp1 उत्परिवर्ती जीनोटाइप से लाल आंखों, घुंघराले दक्षिणपंथी कुंवारी महिलाओं लीजिए, सुबह में एक बार और एक बार, और उन्हें एक अलग शीशी में रख दें। समानांतर में, गहरे लाल आँखें और सीधे पंख eclosion के 5 दिनों के भीतर hsflp और UbiGFP ले जाने के साथ पुरुष ड्रोसोफिला इकट्ठा।
  3. 2 के पुरुष अनुपात: एक महिला के साथ कुंवारी महिलाओं को पुरुषों को जोड़कर एक क्रॉस को सेट करें 1।
  4. अंडा उत्पादन को प्रोत्साहित करने के लिए दानेदार खमीर की एक छोटी राशि छिड़क।
    नोट: ध्यान से संतान की राशि बढ़ाने के लिए हर 2 से 3 दिनों मीडिया के एक ताजा शीशी ड्रोसोफिला के लिए कदम और शीशी भीड़ को कम करने के लिए।
  5. एकesthetize, प्रकार, और इकट्ठा सीधे-पंखों वाला, eclosion के 5 दिनों के भीतर लाल आंखों महिला संतान।
  6. गर्मी झटका के लिए, दानेदार खमीर की एक छोटी राशि और एक छोटे से खाली शीशियों में एकत्र ड्रोसोफिला जगह नरम पोंछ (गर्मी झटका दौरान नमी को अवशोषित करने के लिए)। 1 घंटे के लिए 38 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ड्रोसोफिला के साथ शीशी की जगह, मुख्य रूप से कूप सेल क्लोन उत्पन्न करने के लिए, और दो बार 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के एक दिन में (अनुमति 2 गर्मी के झटके के बीच कम से कम 5 ज) लगातार 2 दिनों के लिए , दोनों germline और कूप सेल क्लोन पैदा करने के लिए।
    नोट: सुनिश्चित करें कि शीशी पूरी तरह से प्लग के स्तर तक पानी में डूबे हुए है बनाओ।
  7. गर्मी झटका ड्रोसोफिला स्थिर कर सकते हैं। गर्मी हैरान ड्रोसोफिला कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ठीक करने के लिए जब वे फिर से मोबाइल बनने की अनुमति दें।
  8. पुरुषों के पार के रूप में उसी अनुपात में महिलाओं के लिए वापस जोड़ें, और उन्हें mediu साथ नए सिरे से शीशियों के लिए कदमएम दानेदार खमीर की एक छोटी राशि के साथ छिड़का। कम से कम 5 दिनों के लिए ड्रोसोफिला बनाए रखें।
  9. एक जीवित या तय प्रयोग के लिए आवश्यक के रूप में अंडाशय काटना।
    नोट: पैतृक ड्रोसोफिला व्यक्त UbiGFP से अलग अंडाशय गर्मी सदमे से GFP नकारात्मक क्लोन की कुशल प्रेरण पुष्टि करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

Cyclin ई और माइटोकॉन्ड्रिया के लिए 7. सह-immunostaining

नोट: ड्रोसोफिला Cyclin ई (dCyclinE) का पता लगाने के लिए, हम विशेष रूप से dCyclinE 9 के खिलाफ उठाए गए एक व्यावसायिक रूप से प्राप्त एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है (देखें सामग्री तालिका)। एक mitochondrial मार्कर के रूप में, हम एटीपी-बी के खिलाफ एक एंटीबॉडी (mitochondrial एटीपी synthase परिसर का एक सबयूनिट) 9 इस्तेमाल किया।

  1. गर्म 4% paraformaldehyde (पीएफए) कमरे के तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस। सावधान! Paraformaldehyde विषैला होता है।
    नोट: उद्घाटन के बादampule, पीएफए ​​4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और 7 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए। इस ट्रेस मात्रा में मौजूद है क्योंकि पीएफए ​​के भंडारण मेथनॉल, जो नाटकीय रूप से निर्धारण के दौरान mitochondrial झिल्ली बदल जाएगा करने के लिए ऑक्सीकरण की अनुमति हो सकती है, भले ही।
  2. इसके तत्काल बाद विच्छेदन के बाद, (चिढ़ा के बिना) एक गिलास विदारक पकवान के एक कुएं में ताजा पीएफए ​​के 200 μL में उन्हें रखने के द्वारा विच्छेदित अंडाशय तय कर लो। 15 मिनट के लिए एक धूआं हुड में पकवान रखें। उन्हें ध्यान से, लगातार 3 कुओं में संदंश के साथ आगे बढ़ 1x फॉस्फेट बफर खारा के प्रत्येक युक्त 200 μL (पीबीएस) द्वारा तय अंडाशय धो लें।
    नोट: प्रयोग यहाँ रोका जा सकता है और नमूने 1 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ा जा सकता है।
  3. पीबीएस में अधिक अच्छी तरह से अंडाशय छेड़ो (कदम के समान 2.6) को ध्यान से सुरक्षात्मक रेशेदार म्यान कि एंटीबॉडी द्वारा प्रतिजन उपयोग में बाधा हो सकती हटा दें।
  4. उन्हें हौसले के 500 μL 0 बनाया के साथ एक microfuge ट्यूब में रखकर छेड़ा अंडाशय Permeabilize।5% पीबीएस ट्राइटन-X100 (पीबीएस-TX) और 30 मिनट के लिए सेते हैं, जबकि 25 rpm पर कमाल।
    नोट: कमाल के दौरान जगह नलियों कमाल आंदोलन के समानांतर, उन्हें लंबरूप रखने, ऊतक ट्यूब की टोपी के लिए लकड़ी की अनुमति हो सकती है इस प्रकार के ऊतकों को नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप।
  5. पीबीएस TX निकालने के लिए, एक रैक में microfuge ट्यूबों की जगह ऊतक ट्यूबों के नीचे में बसने के लिए अनुमति देने के लिए। उन्हें नेत्रहीन का निरीक्षण किया और ट्यूबों नल, यदि आवश्यक हो, नीचे करने के लिए नीचे किसी भी चल ऊतकों लाने के लिए। ऊपर से ध्यान समाधान Aspirate, यकीन है कि ट्यूब के नीचे ऊतक अबाधित रहता बना रही है।
  6. 0.5% पीबीएस टेक्सास में भंग (बीएसए) 2% गोजातीय सीरम albumin के 200 μL जोड़कर अंडाशय ब्लॉक, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर घुमाव पर यह सेते हैं। कदम 7.5 का पालन करके अवरुद्ध एजेंट निकालें।
  7. ताजा अवरुद्ध एजेंट के 200 μL में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें: विरोधी खरगोश dCyclinE एंटीबॉडी (1: 100) और विरोधी माउस एटीपी-बी एंटीबॉडी(1: 100)। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए घुमाव पर ऊतकों को सेते हैं।
  8. अंडाशय पीबीएस टेक्सास के साथ कदम 7.5 के बाद, 15 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धोएं।
  9. ताजा पीबीएस टेक्सास में उचित माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 μL जोड़ें: विरोधी माउस-CY3 (1: 1,000) और विरोधी खरगोश-Cy5 (1: 500)। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए घुमाव पर सेते हैं।
  10. अंडाशय पीबीएस टेक्सास के साथ कदम 7.5 के बाद, 15 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धोएं।
  11. अंतिम पीबीएस TX धोने के लिए: (1,000 कमजोर पड़ने 1) डीएनए दाग, Hoechst जोड़ें।
  12. अंत में, 1x पीबीएस के 500 μL में ऊतक छोड़ दें।
  13. एक 1 मिलीलीटर micropipette का उपयोग करना, एक गिलास विदारक पीबीएस के 200 μL युक्त पकवान की एक ताजा अच्छी तरह से में microfuge ट्यूब से immunostained अंडाशय को हटा दें।
  14. ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते मध्यम की एक बूंद एक गिलास स्लाइड में जोड़ें और बढ़ते मध्यम करने के लिए एक एक करके immunostained अंडाशय एक जोड़ें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अंडाशय वास्तव में बढ़ते मध्यम करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। एस करने के लिए असफलओ ऊतकों को नुकसान को बढ़ावा मिलेगा।
  15. विच्छेदन खुर्दबीन के माध्यम से देख रहे है, जबकि धीरे संदंश के साथ अंडाशय के अपारदर्शी भाग धारण करते हुए चिढ़ा सुई का उपयोग अपारदर्शी परिपक्व अंडे कक्षों से पारदर्शी ovarioles (छोटी चरणों) बांधना। बढ़ते मध्यम से परिपक्व अंडे कक्षों निकालें।
  16. स्लाइड और हल्के से प्रेस पर एक coverglass (22 मिमी, नंबर 1) जगह सुनिश्चित करने के लिए कि बढ़ते मध्यम समान रूप से नीचे फैला हुआ है।
    नोट: coverglass पर दबाने भी coverglass साथ ऊतक के उचित संरेखण सुनिश्चित करता है। इसलिए बेहतर करने के लिए असफल छोटे चरणों बढ़ते मध्यम में फ्लोट करने के लिए अनुमति दे सकता है, उन ऊतकों का इष्टतम माइक्रोस्कोपी को रोकने।
  17. 15 मिनट के लिए नमूने हवा शुष्क और ध्यान से नेल पॉलिश के साथ coverglass के किनारों को सील।
  18. प्रति प्रयोगात्मक जरूरत (तालिका 1) के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करना।

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Representative Results

वर्णित विधि रहते हैं और तय ड्रोसोफिला अंडाशय (चित्रा 2 बी) में mitochondrial संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परंतु वर्णित विधि के साथ प्राप्त प्रत्याशित परिणामों के कुछ उदाहरण हैं।

ड्रोसोफिला अंडाशय के विच्छेदन: जब आगे विच्छेदित, पूरे ड्रोसोफिला (चित्रा 3 ए) से कटे पेट (चित्रा 3 बी) प्रत्येक व्यक्ति ड्रोसोफिला से 2 अंडाशय सहित, पेट की सामग्री जारी करना चाहिए। बरकरार अंडाशय अंडाकार आकार, सफेद संरचनाओं (चित्रा 3 सी और डी में तीर) कि आदर्श oviductal डंठल के माध्यम से एक दूसरे से जुड़े रहना चाहिए जब तक दिखाई देते हैं। प्रत्येक अंडाशय में ovarioles रेशेदार म्यान, जो ख निकाल दिया जाता है (चित्रा -3 सी का बढ़ाया हिस्से में #) द्वारा एक साथ आयोजित किया जाना चाहिएY सावधान चिढ़ा (चित्रा 3 डी में मोटी तीर, * अलग ovarioles के साथ एक बुरी तरह छेड़ा अंडाशय का संकेत) धुंधला हो जाना और माइक्रोस्कोपी के लिए ovarioles बेनकाब करने के लिए। पेट सामग्री की रिहाई के दौरान फटे oviductal डंठल के साथ जारी अंडाशय भी इस्तेमाल किया जा सकता है बशर्ते कि वे अन्यथा क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं। किसी भी क्षतिग्रस्त अंडाशय (* चित्रा -3 सी में) और अन्य पेट की सामग्री (चित्रा -3 सी में नोक) खारिज किया जाना चाहिए।

ड्रोसोफिला अंडाशय का लाइव माइक्रोस्कोपी: यहाँ, हम फ्लिप तकनीक और ड्रोसोफिला अंडाशय में mitochondrial संरचनात्मक और कार्यात्मक रंगों की लोडिंग प्रदर्शित करता है।

फ्लिप तकनीक, पहले ड्रोसोफिला कूप कोशिकाओं 9 में mitochondrial निरंतरता का आकलन करने के लिए आवेदन किया है, ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला के डिम्बग्रंथि नर्स कोशिकाओं में यहां प्रदर्शन किया गया है (चित्रा -4 ए) के साथ निरंतरता में हैं फ्लिप रॉय में संकेत का एक नुकसान के लिए अनुमति देता है। फ्लिप लक्षित mitochondrial नर्स कोशिकाओं के साथ जुड़े बादलों में से एक 200 S (चित्रा 4 बी और सी) के भीतर लाल फ्लिप रॉय आसपास के नीले और सफेद ROIs से फ्लोरोसेंट संकेत के एक 50% से अधिक नुकसान होता है; हरी रॉय से संकेत पृष्ठभूमि सुधार के लिए प्रयोग किया जाता है। अन्य अलक्षित नर्स कोशिकाओं में पीले रॉय से फ्लोरोसेंट संकेत इस समय सीमा के दौरान स्थिर बनी हुई है, प्रयोग (चित्रा 4 बी, और सी) के समय पाठ्यक्रम के दौरान कम से कम समग्र विरंजन वाचक। इसके अलावा, वीडियो 1. यह नतीजा है कि माइटोकॉन्ड्रिया इंगित करता है वहाँनर्स में कोशिकाओं, उनके बाहरी और भीतरी झिल्ली, चरण 3 और 4 (चित्रा 4 ए) में उदाहरण जुड़े हुए हैं चरण 1 और 2 में माइटोकॉन्ड्रिया इस समय सीमा में प्रतिदीप्ति के किसी भी नुकसान दिखाने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं।

यह पहले से प्रदर्शन किया गया है कि प्रति यूनिट mitochondrial संभावित mitochondrial द्रव्यमान का एक अर्द्ध मात्रात्मक उपाय potentiometric डाई TMRE और समग्र mitochondrial दाग है कि बड़े पैमाने पर mitochondrial 13 दर्शाता है के साथ सह-धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इधर, उसी तकनीक को लाइव ड्रोसोफिला डिम्बग्रंथि के ऊतकों में इकाई द्रव्यमान प्रति mitochondrial क्षमता का आकलन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। लाइव ड्रोसोफिला TMRE के साथ दाग अंडाशय के Confocal माइक्रोस्कोपी ऊतक (चित्रा 5 ए) की गहराई के साथ संकेत में कमी को दर्शाता है। कारण अधिक से अधिक ऊतक गहराई में बिखराव बढ़ाने के लिए फ्लोरोसेंट संकेत का यह नुकसान fluorop के किसी भी प्रकार के साथ होने की उम्मीद हैउपयोग में उद्देश्य की दी काम दूरी के साथ लाहौर। इसलिए, यह ऊतक के भीतर जो fluorophore जीवित ऊतक इमेजिंग के दौरान पता लगाया जा सकता है की अधिक से अधिक गहराई से विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला अंडाशय समग्र mitochondrial दाग (Mito) के साथ दाग रहते वर्णित माइक्रोस्कोप सेटअप (तालिका 1) 20 माइक्रोन से coverslip की एक सीमा के भीतर का उपयोग imaged किया जा सकता है, जबकि अधिकतम चित्र वाले की गहराई (अंडा चैम्बर आकार में वृद्धि के साथ कम हो जाती है चित्रा 5 ब)। Mitochondrial दाग के लिए अनुकूलित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स, उचित का पता लगाने चैनलों में सकारात्मक संकेतों का पता लगाने, जबकि सेटिंग्स किसी भी अनुचित संकेत पार बात या fluorophore पार उत्तेजना उम्मीद कम से कम पता लगाया या कोई संकेत (चित्रा 6A) की जांच करने के लिए। समग्र mitochondrial दाग के साथ TMRE के सह-धुंधला दोनों गुणात्मक (चित्रा 6B) और मात्रात्मक (चित्रा 6C और डी <के लिए इस्तेमाल किया जा सकता/ strong>) लाइव ड्रोसोफिला अंडाशय में इकाई द्रव्यमान प्रति mitochondrial क्षमता का आकलन। उदाहरण के लिए, एक) एक गुणात्मक विश्लेषण दर्शाता है कि ड्रोसोफिला germarium चरण 2 बी जहां दैहिक कूप कोशिकाओं germline कोशिकाओं (चित्रा 6B में तीर सिर encapsulate करने के लिए पैदा हुई है में इकाई द्रव्यमान प्रति अधिक mitochondrial संभावित दर्शाती है) और ख) अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण का प्रदर्शन बीच (खंड) AFCs और MBCs, एक मंच 9 अंडा कक्ष (चित्रा 6C) से विश्लेषण के रूप में यूनिट प्रति जन mitochondrial क्षमता में अंतर है। ध्यान दें कि मात्रा का ठहराव, AFCs और MBCs के लिए 2 अलग ऑप्टिकल स्लाइस से प्रदर्शन किया गया है ध्यान केंद्रित करने के अपने विमान पर निर्भर करता है। गया है कि सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला 14 में इस्तेमाल किया गया Mito-आरओएस जांच के उपयोग को लाइव ड्रोसोफिला डिम्बग्रंथि उपकला कूप सेल परतों, जहां mitochondrial विखंडन प्रोटीन के कार्यात्मक अशक्त क्लोन Drp1were शुरू में प्रदर्शन किया है। अधिकांश, बूT सब नहीं, जीने GFP नकारात्मक Drp1 अशक्त कूप सेल क्लोन की Mito-आरओएस (चित्रा 7A और बी) के लिए ऊंचा धुंधला दिखा रहे हैं। ध्यान दें कि हालांकि एक अलग mitochondrial संकेत इस ऊतक में पता नहीं किया जा सकता है, Mito-आरओएस दाग की एकाग्रता उन्नत बाद mitotic कूप कोशिकाओं है, जो mitotic कूप कोशिकाओं की तुलना में काफी बड़े होते हैं में परमाणु क्षेत्र में पता लगाया जा सकता है (* चित्रा 7 में)। यह परमाणु डीएनए और Mito-आरओएस डाई, जो ethidium 15 के व्युत्पन्न है की फ्लोरोसेंट ऑक्सीकरण उत्पाद की बातचीत के कारण हो सकता है।

तय ड्रोसोफिला डिम्बग्रंथि कूप कोशिकाओं में mitochondrial Cyclin ई की जांच: हाल ही में यह दिखा दिया है कि माइटोकॉन्ड्रिया स्तनधारी कोशिकाओं में mitochondrial सतह और ड्रोसोफिला कूप सेल परत करने के लिए यह भर्ती द्वारा कोशिका चक्र अणु Cyclin ई नियंत्रित कर सकते हैं ड्रोसोफिला कूप सेल परत 12 में mitochondrial Cyclin ई पूल को बढ़ाता है। इधर, ड्रोसोफिला कूप कोशिकाओं में cyclin ई के mitochondrial स्थानीयकरण का एक उदाहरण के सह-immunostaining प्रोटोकॉल का वर्णन का उपयोग कर प्रदर्शन किया है। , GFP नकारात्मक Drp1 अशक्त क्लोन जहां dCyclinE संकेत germarium (चित्रा 8A) में mitochondrial एटीपी-बी संकेत के साथ कि overlaps में dCyclinE का ऊंचा स्तर नोट हालांकि संकेत सीमित संकल्प के साथ अलग mitochondrial तत्वों में नहीं सुलझाया जा सकता है confocal माइक्रोस्कोपी की। इसके अलावा, बाद mitotic MBCs में, GFP नकारात्मक Drp1 अशक्त क्लोन दोनों परमाणु और साइटोसोलिक dCyclinE संकेतों, बाद में काफी एटीपी-बी संकेत के साथ ओवरलैपिंग के साथ है, जबकि wildtype GFP पॉजिटिव कोशिकाओं केवल एक परमाणु dCyclinE संकेत है (चित्रा 8B)।


चित्रा 1. ड्रोसोफिला अंडे मंडलों का विकास। कार्टून विकासशील अंडा कक्षों की एक श्रृंखला है, प्रत्येक एक oocyte और नर्स कोशिकाओं (germline) कूप सेल परत (दैहिक) द्वारा समझाया की रचना से मिलकर एक ड्रोसोफिला ovariole चित्रण। अंडा कक्षों germarium से विकसित और चरणों जहां mitotic कूप कोशिकाओं बाद mitotic बनने के माध्यम से विकसित करना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 प्रायोगिक योजना और तैयारी। (ए) के तरीकों में प्रयुक्त उपकरण में वर्णित है: ए मक्खी शीशी; बी कीट मध्यम विदारक; सी Paraformaldehyde; डी फ्लाई ब्रश; ई पकवान विदारक; एफ कवर गिलास; जी microfuge ट्यूब। एच गिलास तली पकवान; मैं गिलास स्लाइड; जे 1000 μL micropipette; लालकृष्ण 200 μL micropipette; एल 2.5 μL micropipette; एम एक तुला टिप के साथ सुई चिढ़ा (टिप बढ़ाया है); एन मोटी संदंश; ओ पतला संदंश। (बी) के एक प्रवाह चार्ट योजनाबद्ध तरीकों वर्णित प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ड्रोसोफिला अंडाशय के विच्छेदन। (ए) Anesthetized पूरे ड्रोसोफिला। (बी) के कटे ड्रोसोफिला के साथ या बिना (*) पेट सामग्री पेट। (सी) ड्रोसोफिला पेट सामग्री का विमोचन, अंडाशय (तीर और *) और अन्य सामग्री सहित(तीर); पूर्वकाल (चींटी) और पीछे (पोस्ट) पर प्रकाश डाला सही पर बॉक्सिंग क्षेत्र की बढ़ाई oviductal डंठल, जहां ovarioles रेशेदार म्यान (#) द्वारा आयोजित कर रहे हैं द्वारा आयोजित अंडाशय की जोड़ी के समाप्त होता है। (डी) unteased अंडाशय (पतली तीर) की तुलना में छेड़ा ड्रोसोफिला अंडाशय (मोटी तीर उचित रूप से अंकन छेड़ा और * बुरी तरह छेड़ा अंकन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. लाइव-ऊतक फ्लिप परख। (ए) mitochondrial विखंडन / संलयन है, जो फ्लिप पद्धति का उपयोग करके एक उचित mitochondrial निरंतरता परख द्वारा assayed किया जा सकता करने के कदम का प्रतिनिधित्व योजनाबद्ध; इस मामले में, mitochondrial मैट्रिक्स में एक Mito-YFP जांच assessm के लिए अनुमति देता हैmitochondrial मैट्रिक्स निरंतरता के ईएनटी। (बी) के समय चूक पूर्व एक लाइव ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला अंडे चैम्बर व्यक्त Mito-YFP की विवो माइक्रोस्कोपी; केवल चुनिंदा समय अंक (टी) दिखाए जाते हैं। हर समय बिंदुओं के लिए वीडियो 1 देखें। (सी) (बी) में संबंधित रंग ROIs से फ्लोरोसेंट संकेत के quantitation पृष्ठभूमि सुधार और सामान्य बनाने के बाद व्यक्त कर रहे हैं। तीर, दुहरानेवाला photobleaching समय अंक से संकेत मिलता है जबकि लगातार दो विरंजन घटनाओं के बीच समय अंतराल वसूली समय है। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन। छवियों तालिका 1 में वर्णित मानकों के साथ हासिल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. लाइव माइटोकॉन्ड्रियाएल धुंधला और ड्रोसोफिला Ovariole की माइक्रोस्कोपी। (ए) एक जीवित ड्रोसोफिला ovariole TMRE के साथ दाग की व्यक्तिगत ऑप्टिकल स्लाइस; छवि की तालिका 1 में वर्णित मानकों के साथ अधिग्रहण कर लिया था। जेड माइक्रोन में coverslip से दूरी को दर्शाता है। (बी) के एक जीवित ड्रोसोफिला ovariole समग्र mitochondrial दाग (Mito) के साथ भरा हुआ है। XY छवि में लाल रेखा के XZ की छवि में दिखाया गया है, जहां बी नीचे है और टी अधिग्रहीत छवि के ऊपर है। ब्लू लाइन के नीचे से दूरी 20 माइक्रोन है। स्केल पट्टी: 20 माइक्रोन। Confocal छवियों तालिका 1 में वर्णित मानकों के साथ हासिल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
एफigure 6. TMRE के साथ लाइव ड्रोसोफिला Ovarioles और कुल मिलाकर Mitochondrial दाग के सह-धुंधला हो जाना। (ए) एक जीवित ड्रोसोफिला ovariole TMRE और समग्र mitochondrial दाग (Mito) के साथ सह दाग की एक ऑप्टिकल टुकड़ा; * एक प्रयोगात्मक विरूपण साक्ष्य चर्चा खंड में वर्णित इंगित करता है। (बी) (ए) में germarium का लगातार 3 ऑप्टिकल स्लाइस की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण; तीर क्षेत्र है जहां TMRE प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है का संकेत मिलता है। (सी) बाद mitotic अंडा कक्ष के एक ऑप्टिकल टुकड़ा TMRE और समग्र mitochondrial दाग के साथ सह दाग। ऊपर और नीचे के पैनल AFCs और MBCs के लिए ध्यान के विमान में क्रमश: दिखाने के लिए। (डी) बॉक्स साजिश TMRE का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता और समग्र mitochondrial दाग (सी) में बॉक्सिंग क्षेत्रों में अलग-अलग AFCs और MBCs से मात्रा निर्धारित दिखा। बॉक्स साजिश की मूंछ प्रत्येक समूह के लिए अधिकतम और न्यूनतम मूल्यों से संकेत मिलता है, outliers को छोड़कर। तालिका 1 में वर्णित मानकों के साथ हासिल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. Mito-आरओएस डाई के साथ लाइव Drp1 अशक्त मूसा की ड्रोसोफिला Ovarioles का धुंधला हो जाना। (ए) Mito-आरओएस डाई के साथ दाग ovarioles की एक ऑप्टिकल टुकड़ा। (बी) Mito में कूप कोशिकाओं के साथ एक व्यक्ति अंडे चैम्बर के 2 लगातार ऑप्टिकल स्लाइस की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपणटिक चरण Mito-आरओएस डाई के साथ दाग। (सी) Mito-आरओएस डाई के साथ दाग बाद mitotic चरण में कूप कोशिकाओं के साथ एक व्यक्ति अंडे चैम्बर के एक ऑप्टिकल टुकड़ा; * एक परमाणु संकेत इंगित करता है। UbiGFP की कमी Drp1 अशक्त क्लोन के निशान। स्केल पट्टी: 20 माइक्रोन। Confocal छवियों तालिका 1 में वर्णित मानकों के साथ हासिल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा dCyclinE और एटीपी-बी एंटीबॉडी के साथ फिक्स्ड Drp1 अशक्त मूसा की ड्रोसोफिला Ovarioles के सह-immunostaining। (ए) के सह-immunostained germarium का लगातार 3 ऑप्टिकल स्लाइस की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। (बी) के सह-immunos का लगातार 3 ऑप्टिकल स्लाइस की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपणबाद mitotic MBCs tained। रूपरेखा UbiGFP नकारात्मक Drp1 अशक्त क्लोन हदबंदी। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन। Confocal छवियों तालिका 1 में वर्णित मानकों के साथ हासिल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
9. संभावित नुकसान और कलाकृतियों के उदाहरण हैं चित्रा। (ए) के Germarium UbiGFP व्यक्त ovariole तय की और डीएनए डाई Hoechst अनुचित अंतराल (*) दिखाने के साथ दाग। (बी) UbiGFP व्यक्त ovariole तय की और डीएनए डाई Hoechst Nicks / आँसू (*) दिखाने के साथ दाग के अंडे चैंबर। (सी) UbiGFP नकारात्मक Drp1 अशक्त एक विकृत कक्ष (*) दिखा Mito-आरओएस डाई के साथ दाग क्लोन के साथ ovariole रहते हैं और एक क्षतिग्रस्त अंडे चैम्बर, आंशिक इजाजत दी germline (**) का धुंधला; # एक ही ovariole में एक undamaged अंडा चैंबर के एक संभवतः वास्तविक दाग को दर्शाता है। (डी) ovariole Mito-आरओएस के साथ दाग लाइव germline की तीव्र artifactual धुंधला के साथ एक समग्र क्षतिग्रस्त चैम्बर दिखा डाई। * इंगित करता है की क्षति प्रेरित UbiGFP संकेत के नुकसान के साथ ovarioles चपटा, इस प्रकार artifactual GFP नकारात्मक क्लोन को जन्म दे रही है। स्केल पट्टी: 20 माइक्रोन। Confocal छवियों तालिका 1 में वर्णित मानकों के साथ हासिल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1
वीडियो 1. लाइव-ऊतक फ्लिप परख। Photobleaching आधारित फ्लिप परख का पूरा समय पाठ्यक्रम चित्रा 5 में वर्णित है।.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

तालिका 1: प्रस्तुत प्रतिनिधि छवियाँ के अधिग्रहण के लिए confocal खुर्दबीन सेटिंग्स। देखने के लिए तालिका 1. कृपया यहाँ क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

Photobleaching: फ्लोरोसेंट नमूनों की अनुचित photobleaching की रोकथाम बिल्कुल कुशल confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। इसलिए, ऐपिस के माध्यम से नमूने का पता लगाने के लिए या लाइव स्कैनिंग मोड के माध्यम से छवि अधिग्रहण के मानकों को स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया समय photobleaching कम से कम करने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए।

ऊतकों को नुकसान: चूंकि माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर स्वास्थ्य के सेंसर माना जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि डेटा वर्णित विधियों का उपयोग कर प्राप्त physiologically प्रासंगिक हैं और अनुचित ड्रोसोफिला अंडाशय के प्रक्रियात्मक विच्छेदन की वजह से नुकसान को प्रतिबिंबित नहीं करते अत्यंत महत्वपूर्ण है। विच्छेदन के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए अत्यधिक सावधानी के साथ। विच्छेदन और 5 ड्रोसोफिला अंडाशय की चिढ़ा के लिए औसत समय (7 मिनट के लिए 5 है हमारे हाथ मेंs)। प्रयास क्षतिग्रस्त ऊतकों कि विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा दिखा अंडा कक्षों की पहचान करने के लिए लिया जाना चाहिए। ऊतक विच्छेदन की वजह से नुकसान अनुचित अंतराल शामिल हो सकते हैं (* चित्रा 9 ए में, के रूप में संकेत के अभाव के कारण पहचान), nicks / आँसू (* चित्रा 9B में, के रूप में संकेत के अभाव के कारण पहचान), या विरूपण अंडा कक्षों के (* चित्रा 9 में)। हालांकि, किसी भी सार्थक चैम्बर विरूपण प्रयोगात्मक हेरफेर से उत्पन्न होने वाली सावधानी से मूल्यांकन किया जाना चाहिए। हालांकि कोई coverslip, प्रोटोकॉल वर्णित में जीवित ऊतक के शीर्ष पर प्रयोग किया जाता है ovarioles की सपाट जबकि चिढ़ा या (चित्रा 9D में *) बढ़ते ऊतक के लिए लागू अनुचित दबाव के साथ हो सकता है। ovarioles के सपाट, तय नमूनों के साथ मनाया नहीं किया गया है के बाद से प्रोटोकॉल वर्णित चिढ़ा उसके बाद होने वाली के साथ, ऊतकों तुरंत विच्छेदन के बाद की फिक्सिंग में शामिल है। aforementione के किसी भी हस्ताक्षर के बिना किसी भी पृथक अंडा चैम्बरडी क्षति सामान्य माना जा सकता है। यांत्रिक क्षति संभावित विच्छेदन से उत्पन्न भी GFP की हानि हो सकती है, झूठी GFP नकारात्मक क्लोन 16 उपज है, और भी बढ़ाया डाई समावेश को जन्म दे सकते हैं। यह देखते हुए कि germline अंडा कक्षों के अंदर रहने वाले कोशिकाओं सामान्य रूप से रहते mitochondrial रंगों (आंकड़े 6 और 7), ड्रोसोफिला germline कोशिकाओं का बढ़ाया mitochondrial धुंधला क्षतिग्रस्त / मरने के ऊतकों की पारगम्यता में वृद्धि से हो सकता है के लिए पारगम्य नहीं कर रहे हैं; इस तरह के एक मूर्ति Mito-आरओएस डाई (चित्रा 9 में ** और चित्रा 9D में पूरे ovariole) के साथ होता है, साथ ही अन्य रहते mitochondrial दाग के साथ के रूप में (नहीं दिखाया गया है)। चित्रा 9D (*) में UbiGFP की हानि भी क्षति है कि अंडा कक्षों के सपाट वजह से हो सकता है। हालांकि क्षतिग्रस्त ovariole में अन्य अंडा कक्षों प्रामाणिक रहने और चित्रा 9 में artifact मुक्त (# सकता है

समय संवेदनशीलता: लाइव पूर्व vivo माइक्रोस्कोपी के मामले में, डेटा ऊतक बढ़ते के 15 मिनट के भीतर प्राप्त किया जाना चाहिए; अन्यथा, प्रयोगात्मक परिणामों के ऊतकों की आगामी मौत के कारण शरीर क्रिया विज्ञान के परिवर्तन से प्रभावित हो सकता है। कभी कभी, लेजर शक्ति और अन्य स्कैनिंग के मापदंडों पर निर्भर करता है, बढ़ते मध्यम के 10 μL जल्दी ही 15 मिनट से लुप्त हो सकती है। mitochondrial Cyclin ई पूल सह immunostaining द्वारा पता लगाने के mitochond के क्षणिक प्रकृति के कारण विच्छेदन समय (संभावना के न्यूनतम आवश्यकता हैरियाल Cyclin ई पूल है कि सक्रिय mitochondrial श्वसन 12 द्वारा बनाए रखा है)। एक प्रशंसनीय mitochondrial Cyclin ई पूल भी 30 मिनट से भी कम समय permeabilization समय के साथ नहीं मनाया गया।

फ्लिप: फ्लिप समय के दौरान परीक्षा के तहत किसी भी अंडा चैम्बर के आंदोलन artifactual विश्लेषण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और इस तरह बाहर रखा जाना चाहिए। किसी भी जीवित mitochondrial रंजक या TMRE का उपयोग एक फ्लिप प्रयोग में सिफारिश नहीं है, क्योंकि विदेशी डाई का समावेश mitochondrial निरंतरता को बदलने और इस तरह artifactual परिणामों को जन्म दे सकती।

ड्रोसोफिला पार करने की रणनीति: यहाँ वर्णित एक विषमयुग्मजी पुरुष माता-पिता में Drp1 दमन के एक अज्ञात प्रभाव के कारण (जहां Drp1 उत्परिवर्ती एलील ले जाने के पुरुषों के लिए इस्तेमाल किया जाता है) में कई वंश, संभावना उपज नहीं है पार पारस्परिक।

प्रतिरूप डेटा की व्याख्या: नियंत्रण अंडाशय में पता चला किसी भी GF-नकारात्मक क्लोनUbiGFP व्यक्त artifactual झूठी नकारात्मक क्लोन, संभावना विच्छेदन 16 के दौरान नुकसान की वजह से GFP कमी की वजह से उत्पन्न संकेत होगा पैतृक ड्रोसोफिला से अलग किया। बहरहाल, क्रूस की गर्मी हैरान संतान में GFP नकारात्मक क्लोन की संख्या नियंत्रण में देखा किसी भी झूठी नकारात्मक क्लोन की तुलना में काफी अधिक होना चाहिए। वर्णित mitotic पुनर्संयोजन आधारित रणनीति से ड्रोसोफिला कूप सेल परत में उत्पन्न क्लोन mitotic कूप स्टेम कोशिकाओं से पैदा कर सकते हैं (सेल क्लोन स्टेम) या mitotic गैर स्टेम कोशिकाओं कूप (क्षणिक क्लोन) से। स्टेम सेल क्लोन के लिए, प्रयोगात्मक विश्लेषण करती है, केवल 10 दिनों गर्मी के झटके के बाद किया जाना चाहिए जब क्षणिक क्लोन के साथ अंडा कक्षों पहले से ही निर्धारित किया गया है। क्षणिक क्लोन के लिए, विश्लेषण 6 दिनों के भीतर गर्मी सदमे के बाद, ovarioles के कूप सेल क्लोन के साथ germarium में किसी भी कूप सेल क्लोन के बिना किया जाना चाहिए।

संशोधन और समस्या निवारण

इकाई बड़े पैमाने पर प्रति mitochondrial क्षमता का आकलन करते हुए वर्णित विधि का उपयोग कर, एक माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी या mitochondrial डाई संयोजन से उत्पन्न संभावित कलाकृतियों के बारे में पता होना चाहिए। समग्र mitochondrial दाग से एक कमजोर संकेत और एक अपेक्षाकृत ऊंचा TMRE संकेत (चित्रा 5 ए, *) दिखा किसी भी क्षेत्र रंगों 8 या लाल के विभिन्न ऑप्टिकल गुणों के कारण बीच प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) की वजह से उत्पन्न हो सकती है (TMRE) और हरे रंग (समग्र mitochondrial डाई) फ्लोरोसेंट रोशनी, अधिग्रहण सेटअप में एक निश्चित पिनहोल आकार दिया। झल्लाहट संबंधित विरूपण साक्ष्य, डाई सांद्रता को कम करता है, तो संभव से बचा जा सकता है, जबकि मात्रात्मक विश्लेषण 2 के अनुमानों पर प्रदर्शन किया जा सकता है - लगातार 3 ऑप्टिकल स्लाइस ऑप्टिकल विरूपण साक्ष्य से बचने के लिए। इसके अलावा, एक फ्लोरोसेंट संकेत crosstalk और पार उत्तेजना में पता चला है कि अगरचैनल, लेजर डिटेक्टर और सेटिंग्स इन चैनलों, जो इष्टतम चैनलों में फ्लोरोसेंट संकेत को कम करने के रूप में अच्छी तरह से उम्मीद है में संकेत को कम करने के लिए पुनः समायोजन किया जाना चाहिए।

लेजर प्रेरित दुहरानेवाला photobleaching से क्षतिग्रस्त mitochondrial विखंडन का कारण हो सकता है और इस तरह mitochondrial अलगाव का कारण है, एक सफल फ्लिप रोकने। फ्लिप प्रोटोकॉल के निष्पादन के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया की संदिग्ध विखंडन उच्च संकल्प छवियों एक कम पिनहोल के साथ प्राप्त (और डिटेक्टर लाभ को बढ़ाने के) द्वारा की पहचान की जा सकती है। माइटोकॉन्ड्रिया के विखंडन दिख फ्लिप प्रोटोकॉल के निष्पादन के दौरान देखा जाता है, विरंजन लेजर की शक्ति कम किया जाना चाहिए और / या लगातार bleaches के बीच के अंतराल में वृद्धि की जानी चाहिए। अगर वहाँ फ्लिप प्रयोग (चित्रा 3 बी और सी में पीले रॉय से संकेत) के समय पाठ्यक्रम के दौरान कुल विरंजन है, लेजर स्कैनिंग एक स्तर को पुनः समायोजन किया जाना चाहिएकि कम से कम या कोई समग्र photobleaching अनुमति देता है।

GFP की क्षति प्रेरित हानि के कारण संभावित विरूपण साक्ष्य से बचने के लिए, GFP सकारात्मक क्लोन MARCM रणनीति, वर्णित गर्मी सदमे प्रोटोकॉल के बाद का उपयोग कर पेश किया जा सकता है। इधर, उचित ड्रोसोफिला पार करने के लिए प्रयोग की जाने वाली कुंवारी महिला drpKG03815 FRT40A / CYO एक्स पुरुष Gal80 FRT 40A / cyo है; टब-Gal4, यूएएस CD8GFP / TM6 9। सीधे दक्षिणपंथी संतान (6 चरण में वर्णित) क्लोन पीढ़ी गर्मी झटका प्रयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

तकनीक की सीमाएं

ए) लाइव ड्रोसोफिला अंडे कक्षों की सतह पर रहने वाले कूप कोशिकाओं mitochondrial धुंधला रंगों को शामिल करते हुए, अंडा कक्ष के अंदर germline कोशिकाओं ऐसा करने में विफल; युवा चरणों की germline कमजोर दाग (आंकड़े 5 और 6)। बी) को लाइव पूर्व vivo Tissuई माइक्रोस्कोपी एक समय में अलग-अलग ड्रोसोफिला, एक से अलग अंडाशय पर धुंधला के पूरा होने के 15 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए। प्रयोगात्मक समूहों संसाधित किया जाना चाहिए के बाद से और एक ही दिन में imaged, कुल समय विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों से जीना पूर्व vivo ऊतक माइक्रोस्कोपी से सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डेटा प्राप्त करने के लिए ले जाया यथोचित अब तय ऊतकों से प्राप्त उन लोगों की तुलना में है। सी) हम ने कहा कि Mito-आरओएस दाग आरओएस के क्षणिक प्रकृति analyte यह 17,15 का पता लगाता है, जो सभी Drp1 से संकेत का पता लगाने की कमी आबाद सकता है की वजह पूर्व vivo ड्रोसोफिला ऊतकों में बहुत स्थिर है, संभावना नहीं थी अशक्त क्लोन। हालांकि, Drp1 अशक्त कोशिकाओं में Mito-आरओएस धुंधला में परिवर्तनशीलता के किसी भी जैविक प्रासंगिकता / क्लोन की संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता है और आगे जांच की जानी चाहिए। ध्यान दें कि Mito-आरओएस दाग से सकारात्मक संकेत सिर्फ बढ़ाया सुपरऑक्साइड लेकिन यह भी बढ़ाया mitochondrial या Cellul प्रतिबिंबित नहीं कर सकतेएआर ऑक्सीडेटिव माहौल 15। डी) कुल मिलाकर mitochondrial दाग, GFP नकारात्मक या GFP पॉजिटिव प्रतिरूप प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, क्योंकि इस mitochondrial दाग और GFP के फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम अप्रभेद्य हैं। ई) फ्लिप प्रयोग mitochondrial मैट्रिक्स निरंतरता की परख के लिए एक खुला पिनहोल mitochondrial संरचनाओं का संकल्प शामिल है के साथ छवि अधिग्रहण की आवश्यकता होगी बनाया गया है।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

mitochondrial संरचना समारोह संबंधों का अध्ययन mitochondrial कार्यक्षमता की नियामक तंत्र की एक पूरी तरह से समझ के लिए महत्वपूर्ण है। क्योंकि mitochondrial दोष काफी मधुमेह, कैंसर, पार्किंसंस रोग, सहित विभिन्न रोगों के लिए योगदान mitochondrial काम करने का ढंग की एक विस्तृत समझ facilitati का वादा रखती हैमाइटोकॉन्ड्रिया निर्देशित चिकित्सीय रणनीतियों के विकास एनजी। लाइव सेल माइक्रोस्कोपी mitochondrial संरचना समारोह संबंध के अध्ययन के लिए एक अनिवार्य उपकरण है। हालांकि, इन अध्ययनों के सबसे अलग कक्षों के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है। Mitochondrial संरचना और समारोह के अध्ययन के एक पूर्व vivo सेटअप 9 में ड्रोसोफिला ऊतक रहने के लिए बढ़ा दिया गया है। इस और संबंधित अध्ययन के वर्णित प्रोटोकॉल लाइव ड्रोसोफिला अंडाशय, पूर्व vivo में mitochondrial संरचना और समारोह की समझ के लिए नेतृत्व, एक शारीरिक संदर्भ में माइटोकॉन्ड्रिया की एक समझ की इजाजत दी जाएगी। इस पूर्व vivo दृष्टिकोण, इन विट्रो अध्ययन से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है के बाद से चयापचय और एक दिया सेल में माइटोकॉन्ड्रिया के ऊर्जावान गुण के विनियमन काफी हद तक पोषक तत्वों की उपलब्धता और कोशिकाओं के शारीरिक संदर्भ में उचित सिगनल पर निर्भर है।

मील के आनुवंशिक हेरफेरmitochondrial विखंडन प्रोटीन Drp1 के दमन से tochondrial संरचना कोशिका चक्र न्यूनाधिक Cyclin ई deregulates और ड्रोसोफिला डिम्बग्रंथि कूप सेल परत 9,12 के विकास को प्रभावित करता है। इधर, प्रोटोकॉल कैसे mitochondrial संरचना समारोह संबंधों का अध्ययन करने के लिए ड्रोसोफिला अंडाशय में Drp1 के कार्यात्मक अशक्त क्लोन को पेश करने का एक विवरण भी शामिल है। स्तनधारी कोशिकाओं पर mitochondrial Cyclin ई के एक उपन्यास पूल, साथ ही ड्रोसोफिला कूप सेल परत 12, सफलतापूर्वक पता लगाया गया है, जो की संभावना माइटोकॉन्ड्रिया 18 द्वारा रिपोर्ट Cyclin ई विनियमन underlies। इधर, पांडुलिपि dCyclinE और एक mitochondrial मार्कर (एटीपी-बी) के लिए सह immunostaining तय ड्रोसोफिला अंडाशय द्वारा उपन्यास mitochondrial Cyclin ई पूल का पता लगाने के लिए एक विधि को दर्शाता है।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश इस तकनीक माहिर के बाद

यह देखते हुए टीटोपी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल प्रणाली है, हमारे वर्णित विधि स्वास्थ्य और रोग में mitochondrial संरचना समारोह रिश्ते के आनुवंशिक आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण योगदान करने के लिए प्रत्याशित हैं। ड्रोसोफिला व्यापक रूप से आनुवंशिक tumorigenesis 19 के लिए अग्रणी बातचीत बाहर तंग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ड्रोसोफिला उपकला कूप सेल परत में क्लोन की पीढ़ी की क्षमता विवो और पूर्व vivo सेटअप में एक में माइटोकॉन्ड्रिया और ओंकोजींस या व्यक्तिगत tumorigenic क्लोन में ट्यूमर शामक की बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है। वर्णित विधि उचित उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला से अलग अंडाशय पर mitochondrial संरचना समारोह संबंधों के नियमन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्णित विधि आगे exog के माध्यम से विभिन्न पोषक तत्व और वृद्धि कारक mitochondrial संरचना और समारोह पर संकेत के प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता हैउचित पोषक तत्वों और / या पूर्व vivo इमेजिंग माध्यम में वृद्धि कारकों की enous अलावा। वर्णित विधि उचित संशोधित और लार्वा imaginal डिस्क, जो व्यापक रूप से कैंसर जैसी बीमारियों 20,21 में संकेत पारगमन मार्ग का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जैसे अन्य पृथक ड्रोसोफिला ऊतकों में कार्यरत हैं, जा सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

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References

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