Estudiar mitocondrial Estructura y función en

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Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

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Abstract

Introduction

Las mitocondrias se describen clásicamente como el centro energético celular, ya que son los principales asientos de la producción de energía en las células diferenciadas. Por otra parte, las mitocondrias desempeñan un papel crítico en el metabolismo, la generación de calor, la modificación de los lípidos, calcio y homeostasis redox, la orquestación de los procesos de señalización celular, etc 1. Las mitocondrias juegan también un papel activo en la inducción de muerte celular 2, así como en la regulación del ciclo celular 3. Tal multifuncionalidad plantea las siguientes cuestiones fundamentales: a) ¿cómo mitocondrias realizan todas estas funciones simultáneamente y b) hay piscinas mitocondriales específicos o subzonas que están especializados para funciones distintas? En este contexto, es importante observar que las mitocondrias multifuncionales son dinámicas en su forma, tamaño, y la estructura dentro de las células individuales y que la forma de estado estacionario de las mitocondrias pueden variar entre los tipos de células. Décadas de investigación de diversos laboratoriosoratorios sugieren que la alteración de la forma mitocondrial, tamaño y estructura, colectivamente llamados dinámica mitocondrial, es crucial para el mantenimiento de varias funciones mitocondriales 4,5,6. Estos resultados plantean la posibilidad de que las mitocondrias pueden cumplir con su multifuncionalidad en virtud de su dinamismo estructural.

Extensas se están realizando esfuerzos para comprender la relación estructura-función mitocondrial. El dinamismo de la estructura mitocondrial se mantiene principalmente por su capacidad para someterse a eventos de fisión y de fusión entre sí. La fisión de grandes mitocondrias los convierte en elementos mitocondriales más pequeños, mientras que la fusión entre dos pequeñas mitocondrias y los integra en un elemento más grande mitocondrial 7. Por otra parte, la fusión transitoria de dos mitocondria puede ocurrir para permitir la mezcla de su contenido. Los sucesos de fisión y la fusión de las membranas mitocondriales interna y externa son cuidadosamente rigen por specIFIC conjuntos de proteínas. La maquinaria núcleo de fisión se compone de la proteína relacionada con dynamin-1 (Drp1), que se reclutó desde el citosol a las mitocondrias por su interacción con cierto bona proteínas mitocondriales fide (por ejemplo, fis1 o Mff1), mientras que la función Drp1 también puede ser regulada por otras proteínas en la superficie mitocondrial 4. Aunque Drp1 opera en la membrana externa, sus capacidades de fisión impacto de la membrana interna, así. La orquestación de la fisión de las membranas mitocondriales externas e internas no se entiende bien. Por otra parte, la fusión de la membrana interna se rige en el núcleo por las actividades de OPA1, mientras mitofusins gobiernan la fusión de la membrana externa 5. El resto de los eventos que contrarrestan de fisión y de fusión de mitocondrias dictan la forma mitocondrial de estado estable en una célula. Por ejemplo, la represión de la fisión mitocondrial daría lugar a una fusión completa y sin oposición, mientras que el exceso de actividad de las mitocondriasl fisión daría lugar a la fragmentación de las mitocondrias 3.

El estudio de la relación estructura-función mitocondrial implica principalmente dos enfoques complementarios: a) análisis de los fenotipos celulares de Organismos y después de la manipulación genética de las proteínas de la fisión / fusión mitocondrial y b) las evaluaciones directas de la estructura y la función mitocondrial. Es digno de mención que los análisis genéticos no siempre pueden revelar la funcionalidad directa de la molécula en cuestión (en este caso, las proteínas de fisión / fusión mitocondrial), como pueden surgir los fenotipos debido a los efectos secundarios. Por lo tanto, es de suma importancia para el desarrollo y el uso de herramientas para estudiar la estructura y la función mitocondrial directamente. Cualquier evaluación de la estructura mitocondrial implica varias herramientas de microscopía. El uso de microscopía de fluorescencia de células vivas ha avanzado mucho los estudios de dinámica mitocondrial, ya que el dinamismo mitocondrial se puede monitorizar tanto cualitativa como cuantitatIVELY utilizando las herramientas y técnicas de microscopía de fluorescencia 8 apropiadas. Herramientas basadas en la microscopía de fluorescencia se han desarrollado para estudiar la estructura y la función mitocondrial en los tejidos vivos melanogaster y Drosophila fijos, elucidar la importancia de dinamismo mitocondrial in vivo 9. Estos y métodos relacionados se describen aquí, con el objetivo de estudiar la estructura y la función mitocondrial en el ovario Drosophila.

El ovario de Drosophila consiste en la línea germinal y somática linajes, que surgen de sus respectivas células madre adultas que residen en el germarium 10,11. Dieciséis células germinales sincitial (GCS) quedan encapsulados por las células del folículo somáticas (FCS) para formar cámaras de huevos individuales que emergen de la germarium (Figura 1). Uno de los 16 GC se confirmen a convertirse en un ovocito, y los restantes 15 GC se desarrollan en células enfermeras que apoyan el crecimiento de la cámara de ovocitos, Facilitando la maduración del huevo antes de que sea puesto a nadie. La mayoría de las FCs se someten a 9 rondas de divisiones mitóticas antes de que salgan del ciclo celular mitótico para diferenciar terminales en una capa de células epiteliales modelado que consiste en células anterior del folículo (AFCS), las células del folículo posterior (PFC), y las células del cuerpo principal (MBC) . Las cámaras de huevos consecutivos están conectados por las células tallo, que son las células que también se derivan de los bloques FC temprano en el desarrollo diferenciados. Mitocondrial forma regulada por la proteína mitocondrial Drp1 fisión participa activamente en el proceso de diferenciación durante el desarrollo normal de la capa de FC ovario de Drosophila 9,12. Aquí se describen los métodos usados en estos estudios para identificar la participación de Drp1 en el desarrollo de la capa de células del folículo Drosophila.

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Protocol

1. Preparación de Drosophila (las herramientas necesarias se representan en la figura 2A)

  1. Para cualquiera de los experimentos descritos, recoger Drosophila (mantenida a temperatura ambiente, o 25 ° C) dentro de los 5 días de la eclosión y colocarlos en un vial lleno con 5-7 ml de Drosophila alimentos (ver Materiales Tabla), con no más de 25 moscas en cada vial; mantener una relación mujer: hombre de 2: 1.
  2. Se espolvorea con una pequeña cantidad de levadura granulada para estimular la producción de huevos de Drosophila. Realizar la manipulación experimental dentro de 2 - 4 días.

2. Disección de Drosophila ovarios (las herramientas necesarias se representan en la figura 2A)

  1. Insectos disección medio caliente (véase la Tabla de Materiales) a temperatura ambiente, 25 ° C. Llenar tres pozos de un plato de disección vaso de ocho pocillos, con 200 l de medio en cada pozo.
  2. Anestesiar Drosophila con CO de Drosophila en una época en la realización de la microscopía en vivo.
  3. Mientras mira por el ocular del microscopio de disección, cortar el tórax del abdomen usando dos pares de pinzas. Usando las pinzas, transferir cuidadosamente los abdómenes al segundo compartimiento del plato.
  4. Utilice un par de pinzas para sujetar el abdomen en el extremo posterior, y lentamente empujar los ovarios (junto con los otros contenidos abdominales) con el otro par de pinzas. Si este intento falla, retire con cuidado el exoesqueleto abdominal mediante la inserción de la pinza en el extremo anterior de liberar a los ovarios.
  5. Usando las pinzas, mantenga un ovario individuo por el extremo posterior opaco (es decir, los huevos rellenos de yema, de la última etapa) y mover con cuidado para el tercer compartimiento del platopara burlarse de procesarla para microscopia en directo (paso 3) o para la fijación de realizar la inmunotinción (paso 7).
  6. burlan con cuidado la vaina protectora alrededor de los ovarios mediante el barrido de una aguja burlas ligeramente desde la parte posterior hasta el extremo anterior de cada ovario mientras que lo sostiene por el extremo posterior con un par de fórceps.
    NOTA: Para reducir al mínimo los daños durante las burlas, doblar la punta de la aguja y un zoom en cada ovario al aumentar el aumento del microscopio (Figura 2A). Las burlas debería ser suficiente para romper la vaina eficaz, sino que también debe hacerse con cuidado para preservar la integridad de la ovarioles.

3. Preparación de Microscopía de tejido vivo

NOTA: Las herramientas necesarias se representan en la figura 2A.

  1. Antes de la disección de Drosophila, preparar cámaras recubiertas polyl-lisina. Con este fin, colocar dos gotas 20-l de polyl-lisina (0,1 mg / ml) en el coverglculo (14 mm, No. 0) de una placa de Petri con fondo de vidrio (35 mm) a una distancia razonable de la otra a fin de evitar la fusión de las gotas. El aire seco de las placas durante 1 hora a 37 ºC y marcar los bordes de la película en blanco polyl-lisina en la parte inferior de la placa con un marcador borrable.
    NOTA: El polyl-lisina cámaras se pueden almacenar a 4 ° C durante una semana. Si se utiliza una cámara previamente recubiertos, llevarlo a la temperatura ambiente antes de comenzar la disección Drosophila.
  2. Ajuste los parámetros de análisis bajo el microscopio confocal para asegurarse de que la muestra se pueden obtener imágenes inmediatamente después de la finalización de la disección y de montaje, como a continuación.
  3. El lugar de uno disecados y objeto de burlas ovario (siguiendo el paso 2 y se tiñeron, si es necesario, después del paso 5) en una región con recubrimiento de polyl-lisina marcada y se extendió el ovario con la aguja de las burlas de separar la ovarioles. Coloque una gota de 10 l de medio de disección de insectos en la parte superior del ovario, asegurándose de cubrir tél área completa polyl-lisina. Cubrir la placa de Petri.
  4. Inmediatamente realizar microscopía confocal de la muestra montada a temperatura ambiente.
    NOTA: Sólo uno de Drosophila debe ser disecado, procesa y la imagen a la vez. Además, la microscopía no debe realizarse a 37 ° C, que imitar un ambiente de choque térmico para el tejido de Drosophila.

4. Pérdida de fluorescencia En Photobleaching (FLIP) Ensayo para evaluar la matriz mitocondrial Continuidad

NOTA: la continuidad de la matriz mitocondrial en una estructura mitocondrial fusionado se establece después de la fusión completa de las membranas mitocondriales internas y externas después de una progresión a través de los pasos intermedios. La fisión de las mitocondrias puede seguir los mismos pasos, pero en la dirección inversa (Figura 3A). FLIP es un método semi-cuantitativo basado en microscopía de lapso de tiempo que se puede utilizar para evaluar la continuidad matriz mitocondrial en elestado fundido final del mitocondrias ex vivo (pasos 3 y 4 en la Figura 3A) en los ovarios de Drosophila vivas 9. El ensayo de FLIP se realiza como una pequeña región de interés (ROI) de las mitocondrias que expresan una molécula fluorescente en la matriz mitocondrial que se photobleached a intervalos regulares (ROI FLIP en la Figura 3A). Como resultado, cualquier región mitocondrial circundante que es continua con la ROI FLIP (ROI experimental en la Figura 3A) perderá la señal debido al intercambio de las moléculas en la matriz mitocondrial continua. Los experimentos FLIP demostrado aquí se realizan en Drosophila transgénica que expresa mitoYFP, que contiene la secuencia de direccionamiento mitocondrial de la citocromo oxidasa subunidad VIII humano etiquetado con YFP para apuntar a la matriz mitocondrial en una forma libremente difusible. Un experimento similar también se puede realizar con el transgén mito UPAEP-mito-GFP, como se informó anteriormente <sup> 9. Un protocolo FLIP similar puede utilizarse con una sonda específica para el espacio entre la membrana mitocondrial para ser capaz de detectar la continuidad resultante de la fusión de la exterior, pero no las membranas mitocondriales interna (paso 2 en la Figura 3A).

  1. Abra el software de adquisición de imágenes en el microscopio confocal y establecer los parámetros de análisis correspondientes en la pestaña "Adquisición" (Tabla 1). Compruebe la "Serie de tiempo", "Blanqueo" y "cajas" Regiones para abrir las pestañas individuales. Ponga los valores de los parámetros de adquisición apropiados en cada pestaña (Tabla 1).
    NOTA: El agujero de alfiler debe dejarse abierta, ya que este experimento está diseñado para monitorear la señal global del conjunto de la población mitocondrial en las células individuales.
  2. Utilice el ocular para localizar rápidamente el campo de interés en el tejido vivo montado.
    NOTA: Seleccionar la ovarioles que están bien distribuidos en el cristal-bottomed plato, ya que la microscopía confocal no se puede realizar en ovariolas flotantes.
  3. Haga clic en "vivo" para adquirir una imagen en directo del campo de interés seleccionada. Haga clic en "stop" para detener la exploración en vivo.
  4. Si es necesario, ajuste los parámetros de adquisición de tal manera que la señal fluorescente detectada está por debajo de los niveles de saturación (indicados por la ausencia de píxeles rojos cuando se encuentra activa la opción "indicador de rango"), con el fondo definido según lo establecido por el ajuste de los valores de desplazamiento.
  5. Dibuje un pequeño retorno de la inversión mediante la herramienta de dibujo de curva desde la pestaña "Regiones" para demarcar la zona photobleaching en la imagen adquirida por el escaneo en vivo.
    NOTA: El tamaño de la ROI debe estar alrededor de 20 - 50% de la señal fluorescente mitocondrial total dentro de la célula.
  6. Realizar la adquisición de la imagen haciendo clic en "iniciar el experimento."
  7. Cuantificar la intensidad de fluorescencia utilizando la propiedad o el software de código abierto (ver MaterialesTabla). Grabar la señal media desde el retorno de la inversión cuando el objetivo sea el blanqueo repetitivo (FLIP); el rendimiento de la inversión en el blanqueo no se ha realizado en la misma célula (Experimental); el retorno de la inversión de otra célula sin blanquear en el mismo campo de vista, para la evaluación de blanqueo global durante el período experimental (blanqueo); y el retorno de la inversión en el área de fondo (fondo). Restar la señal de fondo media obtenida a partir de la media de la señal en el otro ROI. Normalizar la señal fluorescente con la señal de pre-blanqueador inicial de la celda respectiva.
  8. Representar gráficamente los datos normalizados utilizando cualquier software de trazado estándar.

5. La tinción fluorescente mitocondrial Vivo con tintes

NOTA: estructura mitocondrial en estado estacionario y el potencial se pueden evaluar usando colorantes que incorporan específicamente en las mitocondrias en las células vivas y tejidos. Ovarios vivo Drosophila se pueden teñir ex vivo con mitocondrial fluorescentemanchas para visualizar la mitocondria, para evaluar especies reactivas del oxígeno mitocondrial (mito-ROS), y para evaluar el potencial mitocondrial por unidad de masa. Esto se puede lograr por la co-tinción con el éster mitocondrial potenciométrica colorante tetrametilrodamina de etilo (TMRE) y una mancha mitocondrial vivo compatible que representa la masa mitocondrial (véase Materiales Tabla para los colorantes específicos).

  1. Diluir el stock de las manchas de insectos caliente de disección medio a las concentraciones finales de trabajo: tinción mitocondrial, 250 nM; TMRE, 50 nM; y mito-ROS mancha, 5 mM.
  2. Después de la disección y las burlas los ovarios siguiente paso 2, coloque los ovarios en 200 l de cualquier solución de tinción particular en un pocillo de una placa de disección. Incubarlos durante 10 minutos con el plato cubierto por una caja adecuada envuelto con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Lavar los ovarios manchadas moviendo cuidadosamente con unas pinzas en 3 pozos consecutivos containinmedio g sin mancha.
  3. Para co-tinción con TMRE y la mancha mitocondrial global que sea compatible, siga el protocolo anterior para teñir primero con TMRE e inmediatamente con la tinción mitocondrial global (sin pasos de lavado en el medio).
  4. Montar los ovarios en un plato con fondo de cristal polyl-lisina recubierto tras el paso 3 y prepararse para la microscopía confocal de barrido con los parámetros apropiados (Tabla 1), siguiendo los pasos 4.2-4.4.
    NOTA: La señal de los colorantes incorporados no duró al intentar montar las muestras teñidas en medio de montaje.
  5. Marque la casilla seccionamiento Z para abrir la pestaña. Gire la rueda de enfoque hacia el fondo de la muestra mientras se está escaneando-vivo y hacer clic en "establecer en primer lugar" para definir la sección Z situado más abajo. Hacer lo mismo mientras se mueve la rueda de enfoque hacia la otra dirección para definir la sección superior.
  6. Realizar la adquisición de la imagen haciendo clic en "iniciar el experimento."
  7. Cuantificar la intensidad de fluorescencia de fondo con corrección de las regiones de interés para la señal de fondo y las células individuales (como en el paso 4.7) y representar los datos utilizando cualquier software de trazado.

6. Generación de Drp1 Null Mosaicos

NOTA: La estrategia clonal utilizado aquí introduce proteína fluorescente (GFP) clones negativos al nulos verdes Drp1 en el fondo de una, fenotípicamente fondo de tipo salvaje GFP-positivo que es heterocigoto para la mutación genotípicamente nula Drp1 9. Inducida por choque de calor diana reconocimiento flipasa-flipasa (FLP-FRT) mediada por sitio específico mitótico recombinación crea clones homocigotos del alelo nulo drpKG03815 funcionalmente. El genotipo de Drosophila que lleva el mutante Drp1 es drpKG03815 FRT40A / CYO, mientras que el genotipo que lleva el FLP inducida por choque térmico (hsFLP) y UbiGFP marcador clonal es hsflp; nls-GFP ubiquitina (UbiGFP) FRT 40A / CyO. El genotipo de la SEdescendencia seleccionada del cruce entre los genotipos anteriores es hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

  1. Sincronizar la Drosophila para la recolección virgen moviéndolos en nuevos frascos de alimentos frescos cada 2 a 3 días. Monitorear los viales pupariating diaria con el fin de recoger las hembras vírgenes emergentes.
  2. Recoger, rizado-ala hembras vírgenes con los ojos rojos del genotipo mutante Drp1 todos los días, una vez por la mañana y otra por la noche, y colocarlos en un vial separado. Al mismo tiempo, recoger macho de Drosophila con los ojos de color rojo oscuro y alas rectas que llevan hsflp y UbiGFP dentro de los 5 días de la eclosión.
  3. Configurar una cruz mediante la adición de los machos a las hembras vírgenes con una relación mujer: hombre de 2: 1.
  4. Se espolvorea con una pequeña cantidad de levadura granulada para estimular la producción de huevos.
    NOTA: mover con cuidado la Drosophila a un vial fresco de los medios cada 2 a 3 días para aumentar la cantidad de progenie y para reducir el hacinamiento vial.
  5. Unesthetize, ordenar y recoger directamente de alas, la progenie femenina de ojos rojos dentro de los 5 días de la eclosión.
  6. Para el choque térmico, coloque la Drosophila recogida en viales vacíos con una pequeña cantidad de levadura granulada y una pequeña, suave limpie (para absorber la humedad durante el choque térmico). Colocar el vial con la Drosophila en un baño de agua a 38 ºC durante 1 h, para generar clones de células principalmente del folículo, y a 37 ºC durante 1 h dos veces al día (que permite al menos 5 h entre los choques 2 de calor) durante 2 días consecutivos , para generar tanto los clones de células de la línea germinal del folículo y.
    NOTA: Asegúrese de que el vial está completamente sumergido en el agua hasta el nivel del tapón.
  7. El golpe de calor puede hacer que la inmovilidad de Drosophila. Deje que la Drosophila-shock de calor para recuperar durante 1 hora a temperatura ambiente cuando se convierten en móvil nuevo.
  8. Añadir los machos de nuevo a las hembras en la misma proporción que en la cruz, y moverlos a viales frescas con medium roció con una pequeña cantidad de levadura granulada. Mantener la Drosophila durante al menos 5 días.
  9. Diseccionar los ovarios, según sea necesario para un experimento en vivo o fijo.
    NOTA: Los ovarios aislados del parental Drosophila expresando UbiGFP deben utilizarse como controles negativos para confirmar la inducción eficiente de los clones GFP-negativos por el choque térmico.

7. Co-inmunotinción para ciclina E y mitocondrias

NOTA: Para detectar Drosophila Ciclina E (dCyclinE), hemos utilizado un anticuerpo obtenido comercialmente planteado específicamente contra dCyclinE 9 (ver Tabla de Materiales). Como marcador mitocondrial, se utilizó un anticuerpo contra ATP-B (una subunidad del complejo de ATP sintasa mitocondrial) 9.

  1. Cálido 4% de paraformaldehído (PFA) a temperatura ambiente, 25 ° C. ¡Precaución! Paraformaldehído es tóxico.
    NOTA: Después de la aperturala ampolla, PFA debe ser almacenado a 4 ° C y utilizarse dentro de los 7 días. Esto es porque el almacenamiento de PFA puede permitir la oxidación de metanol que pudieran alterar dramáticamente las membranas mitocondriales durante la fijación, incluso si está presente en cantidades traza.
  2. Inmediatamente después de la disección, fijar los ovarios disecados, colocándolos en 200 l de PFA fresco en un pocillo de una placa de disección de vidrio (sin broma). Mantener el plato en una campana de humos durante 15 minutos. Lavar los ovarios fijos moviendo con cuidado con las pinzas en 3 pozos consecutivos, cada uno con 200 l de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS).
    NOTA: El experimento se puede parar aquí y las muestras se puede dejar a 4 ºC durante 1 día.
  3. Tease los ovarios más a fondo en PBS (similar al paso 2.6) para quitar cuidadosamente la vaina fibrosa protectora que pueden dificultar el acceso del antígeno por el anticuerpo.
  4. Permeabilizar los ovarios molestado por su inclusión en un tubo de microfuga con 500 l de recién hechos 0.5% de PBS-Triton-X100 (PBS-TX) y se incuba durante 30 minutos mientras se balancea a 25 rpm.
    NOTA: Durante el balanceo, se colocan los tubos en paralelo al movimiento de balanceo; colocándolos perpendicularmente puede permitir que el tejido se pegue a la tapa de los tubos, lo que resulta en la pérdida de tejido.
  5. Para retirar el PBS-TX, coloque los tubos de microcentrífuga en un bastidor para permitir que el tejido se asiente en la parte inferior de los tubos. Inspeccionar visualmente y toque los tubos, si es necesario, para que cualquier tejido que flotan hacia la parte inferior. Aspirar la solución cuidadosamente de la parte superior, asegurándose de que el tejido en la parte inferior de los tubos permanece inalterado.
  6. Bloquear los ovarios mediante la adición de 200 l de 2% de albúmina de suero bovino (BSA) disuelto en 0,5% PBS-TX, y se incuba en el eje de balancín a temperatura ambiente durante 1 h. Quitar el agente de bloqueo siguiendo el paso 7.5.
  7. Añadir anticuerpos primarios en 200 l de agente de bloqueo fresco: anticuerpo anti-conejo dCyclinE (1: 100) y anti-ratón de anticuerpo ATP-B(1: 100). Incubar los tejidos en la mecedora durante 2 horas a temperatura ambiente.
  8. Lavar los ovarios con PBS-TX 3 veces durante 15 minutos cada uno, después del paso 7.5.
  9. Añadir 200 l de los anticuerpos secundarios apropiados en fresco PBS-TX: anti-ratón-CY3 (1: 1000) y anti-conejo con Cy5 (1: 500). Incubar en el eje de balancín por 1 h a temperatura ambiente.
  10. Lavar los ovarios con PBS-TX 3 veces durante 15 minutos cada uno, después del paso 7.5.
  11. Para teñir el ADN, añadir Hoechst (dilución 1: 1000) a la final de lavado PBS-TX.
  12. Por último, dejando los tejidos en 500 l de PBS 1x.
  13. Usando una micropipeta de 1 ml, quitar los ovarios immunostained desde el tubo de microcentrífuga en un pozo fresco de un plato de disección de vidrio que contiene 200 l de PBS.
  14. Añadir una gota de medio de montaje basado en glicerol a un portaobjetos de vidrio y añadir el ovarios inmunote~nido uno por uno para el medio de montaje.
    NOTA: Asegúrese de que los ovarios están efectivamente transferidos al medio de montaje. El no poder hacer so dará lugar a la pérdida de tejido.
  15. Mientras mira a través del microscopio de disección, arrancar suavemente la ovarioles transparentes (etapas más jóvenes) de los opacos cámaras de huevos maduros utilizando la aguja de las burlas mientras sujeta la parte opaca del ovario con las pinzas. Retire las cámaras de huevos maduros desde el medio de montaje.
  16. Colocar un cubreobjetos (22 mm, N ° 1) en la diapositiva y presione ligeramente para asegurarse de que el medio de montaje se extiende uniformemente por debajo.
    NOTA: Al pulsar sobre el cubre también asegura la alineación correcta del tejido a lo largo del cubreobjetos. Si no lo hace de manera óptima puede permitir que las etapas más pequeñas que flotan en el medio de montaje, evitando la microscopía óptimo de esos tejidos.
  17. El aire seco de las muestras durante 15 minutos y sellar los bordes del cubreobjetos con cuidado con esmalte de uñas.
  18. Realizar microscopía confocal según la necesidad experimental (Tabla 1).

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Representative Results

Los métodos descritos se pueden utilizar para estudiar la estructura y la función mitocondrial en los ovarios de Drosophila vivas y fijos (Figura 2B). Se proporcionan algunos ejemplos de los resultados anticipados obtenidos con los métodos descritos.

Disección del ovario Drosophila: Cuando diseccionado adicional, los abdómenes cortadas (Figura 3B) de la totalidad de Drosophila (Figura 3A) se deben liberar el contenido abdominal, incluyendo 2 ovarios de cada Drosophila individual. Los ovarios intactos aparecen como de forma ovalada, estructuras blancas (flechas en la Figura 3C y D) que idealmente deberían permanecer unidas entre sí a través del tallo del oviducto. Los ovarioles en cada ovario deben mantenerse juntos por la vaina fibrosa (# en parte ampliada de la Figura 3C), que se retira blas burlas y cuidado (flecha gruesa en la figura 3D; * indica un ovario mal tomado el pelo con ovariolas unifamiliares) para exponer la ovarioles para la tinción y microscopía. Los ovarios liberados con tallos rotos oviducto durante la liberación del contenido abdominal también se pueden utilizar, siempre que no estén dañados de otro modo. Cualquier ovarios dañados (* en la Figura 3C) y otros contenidos abdominales (punta de flecha en la figura 3C) deben ser desechados.

Microscopia en directo del ovario de Drosophila: Aquí, nos demuestran la técnica de la FLIP y la carga de tintes estructurales y funcionales mitocondriales en Drosophila ovarios.

La técnica de FLIP, aplicado anteriormente para evaluar la continuidad mitocondrial en las células del folículo Drosophila 9, se ha demostrado aquí en las células de la enfermera de ovario de Drosophila transgénica (Figura 4A). FLIP dirigidos a una de las nubes mitocondriales asociados con las células de la enfermera conduce a una pérdida de más del 50% de la señal fluorescente de las ROIs azules y blancas que rodean la ROI FLIP rojo dentro de 200 s (Figura 4B y C); la señal del retorno de la inversión verde se utiliza para la corrección de fondo. La señal fluorescente de la ROI de color amarillo en las otras células de la enfermera no orientados permanece constante durante todo este período de tiempo, lo que significa blanqueo global mínima durante el curso de tiempo del experimento (Figura 4B y C). También, ver video 1. Este resultado indica que la mitocondriaen enfermera células han fusionado sus membranas exterior e interior, ejemplificados en los pasos 3 y 4 (Figura 4A), mientras que no se espera que las mitocondrias en los pasos 1 y 2 para mostrar cualquier pérdida de fluorescencia en este marco de tiempo.

Se ha demostrado previamente que una medida semi-cuantitativa de potencial mitocondrial por unidad de masa mitocondrial puede ser evaluado por la co-tinción con el colorante potenciométrico TMRE y la mancha mitocondrial general que refleja la masa mitocondrial 13. Aquí, la misma técnica se utilizó para demostrar la evaluación del potencial mitocondrial por unidad de masa en el tejido de ovario en vivo Drosophila. La microscopía confocal de ovarios de Drosophila vivas teñidas con TMRE demuestra una disminución de la señal con la profundidad del tejido (Figura 5A). Se espera que esta pérdida de señal fluorescente debido al aumento de la dispersión en mayor profundidad del tejido a ocurrir con cualquier tipo de fluorophore con una distancia de trabajo dada del objetivo en uso. Por lo tanto, es importante para discernir la profundidad máxima del tejido dentro del cual el fluoróforo se puede detectar durante la formación de imágenes de tejido vivo. Por ejemplo, vivir ovarios Drosophila teñidas con la tinción mitocondrial general (Mito) pueden ser imágenes utilizando la configuración de microscopio descrito (tabla 1) a una distancia de 20 m desde el cubreobjetos, mientras que la profundidad capaz de formar imágenes máximo disminuye con el aumento de tamaño de la cámara de huevos (Figura 5B). Los ajustes del microscopio optimizados para las manchas mitocondriales detectan señales positivas en los canales de detección adecuados, mientras que los ajustes para examinar cualquier señal de diafonía indebida o fluoróforo cruzada de excitación era de esperar detectado una mínima o ninguna señal (Figura 6A). Co-tinción de TMRE con la tinción mitocondrial en general se puede utilizar tanto para cualitativo (Figura 6B) y cuantitativo (Figura 6C y D </ strong>) evaluaciones del potencial mitocondrial por unidad de masa en los ovarios de Drosophila vivas. Por ejemplo, a) un análisis cualitativo demuestra que el germarium Drosophila exhibe mayor potencial mitocondrial por unidad de masa en 2b etapa en la que se han producido las células del folículo somáticas para encapsular las células de la línea germinal (cabezas de flecha en la figura 6B) y b) análisis semi-cuantitativos demostrar la diferencia de potencial mitocondrial por unidad de masa entre el AFC (estiramiento) y los MBC, según el análisis de una cámara de huevos etapa 9 (Figura 6C). Tenga en cuenta que la cuantificación se ha realizado a partir de 2 rebanadas ópticos diferentes para los AFCs y MBC, dependiendo de su plano de enfoque. El uso de la sonda mito-ROS que se ha utilizado con éxito en Drosophila 14 se demuestra en las capas vivas de Drosophila epiteliales de ovario de células del folículo, donde clones nulos funcionales de la proteína de fisión mitocondrial Drp1were introducidos. La mayoría, but no todos, de los clones Drp1 nula de células folículo GFP-negativos en vivo mostrar tinción elevada durante mito-ROS (Figura 7A y B). Tenga en cuenta que aunque una señal mitocondrial distinta no se pudo detectar en este tejido, la concentración de la mancha mito-ROS puede ser detectada en la región nuclear en las células del folículo post-mitóticas avanzada, que son significativamente más grandes que las células del folículo mitóticas (* en la Figura 7C). Esto puede ocurrir debido a la interacción de ADN nuclear y el producto de oxidación del colorante fluorescente mito-ROS, que es un derivado de etidio 15.

La detección de ciclina E mitocondrial en las células del folículo ovárico Drosophila fijos: Se ha demostrado recientemente que las mitocondrias pueden regular la molécula del ciclo celular ciclina E mediante la contratación a la superficie mitocondrial en células de mamíferos y la capa de células del folículo Drosophila de Drosophila folículo 12. Aquí, un ejemplo de localización mitocondrial de la ciclina E en las células del folículo de Drosophila se demuestra utilizando el protocolo de co-inmunotinción descrito. Tenga en cuenta los niveles elevados de dCyclinE en los Drp1 clones nulos GFP-negativos donde la señal dCyclinE superpone con la de la señal de ATP-B mitocondrial en la germarium (Figura 8A), aunque la señal no puede ser resuelto en elementos mitocondriales distintos con la resolución limitada de la microscopía confocal. También, en CFDLM post-mitóticas, los clones nulos Drp1 GFP-negativas tienen ambas señales dCyclinE nucleares y citosólicas, con este último superposición significativa con la señal de ATP-B, mientras que las células positivas para GFP de tipo salvaje sólo tienen una señal dCyclinE nuclear (Figura 8B).


Figura 1. Desarrollo de las cámaras de huevos de Drosophila. Historieta que representa un ovariole Drosophila que consiste en una cadena de cámaras de huevos en desarrollo, cada uno compuesto de un ovocito y las células de la enfermera (línea germinal) encapsulada por la capa de células del folículo (somática). Las cámaras de huevos se desarrollan a partir del germarium y se desarrollan por etapas en las células de los folículos se convierten en mitosis post-mitótico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Plan de Preparación y Experimental. Herramientas (A) utilizados en los métodos descritos: A. vial mosca; B. insectos disección medio; C. El paraformaldehído; D. cepillo de mosca; E. La disección de plato; F. cubierta de vidrio; G. tubo de microcentrífuga. H. plato de vidrio de fondo; I. portaobjetos de vidrio; micropipeta J. 1000-l; micropipeta K. 200-l; micropipeta L. 2,5-l; M. Las burlas de aguja con una punta doblada (punta ha sido aumentada); fórceps N. espesor; fórceps O. delgadas. Gráfico (B) Un flujo esquemático que representa los métodos descritos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. La disección de Drosophila ovarios. (A) anestesiada toda Drosophila. (B) Severed Drosophila abdómenes con o sin (*) el contenido abdominal. (C) Lanzamiento de Drosophila contenido abdominal, incluyendo los ovarios (flechas y *) y otros contenidos(puntas de flecha); magnificación de la región en caja a la derecha destacando el anterior (Ant) y posterior (Post) extremos del par de ovarios en poder del tallo oviductal, donde los ovarioles se llevan a cabo por la vaina fibrosa (#). (D) Teased Drosophila ovario (flecha gruesa marcado apropiadamente objeto de burlas y * marcado mal tomado el pelo) en comparación con el ovario unteased (flecha fina). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Ensayo FLIP-tejido vivo. (A) Esquema que representa los pasos de la fisión mitocondrial / fusión, que puede ser ensayada mediante un ensayo de continuidad mitocondrial apropiado usando el método FLIP; en este caso, una sonda de mito-YFP en la matriz mitocondrial permite la assessmento de la continuidad de la matriz mitocondrial. (B) Time-lapse microscopía in vivo de una cámara de huevos de Drosophila transgénica que expresa vivo mito-YFP ex; solo seleccionar los puntos de tiempo (t) se muestran. Ver vídeo 1 para todos los puntos de tiempo. (C) Cuantificación de la señal fluorescente de la respectiva ROIs de color en (B) se expresan después de la corrección de fondo y normalización. Las puntas de flecha indican los puntos de tiempo photobleaching reiterativos, mientras que el intervalo de tiempo entre dos eventos consecutivos de blanqueo es el tiempo de recuperación. Barra de escala: 10 micras. Las imágenes fueron adquiridas con los parámetros descritos en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Las mitocondrias Vivol La tinción y microscopía de la Drosophila ovariole. (A) rebanadas ópticos individuales de un ovariola Drosophila vivo teñido con TMRE; la imagen fue adquirida con los parámetros descritos en la Tabla 1. Z indica la distancia desde el cubreobjetos en micras. (B) A Drosophila vivo ovariole cargado con la mancha mitocondrial general (Mito). La imagen XZ de la línea roja en la imagen XY se muestra, en la que B es la parte inferior y T es la parte superior de la imagen adquirida. La distancia desde la parte inferior a la línea azul es de 20 micras. Barra de escala: 20 micras. Las imágenes confocales se adquirieron con los parámetros descritos en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Co-tinción de vida de Drosophila ovarioles con TMRE y el total de la mancha mitocondrial. (A) rebanada óptica individual de un ovariola Drosophila vivo co-teñidas con TMRE y la mancha mitocondrial general (Mito); * Indica un artefacto experimental descrito en la sección de Discusión. (B) de proyección de máxima intensidad de 3 rebanadas ópticas consecutivas de la germarium en (A); puntas de flecha indican la región en la que se incrementa la fluorescencia TMRE. (C) rebanada óptica individual de post-mitótico cámara de huevos co-manchado de TMRE y la mancha mitocondrial en general. Los paneles superior e inferior muestran el plano de enfoque para los AFCs y MBC, respectivamente. Plot (D) Box muestra la intensidad de fluorescencia media de TMRE y la mancha mitocondrial global cuantificado desde el AFC y MBC individuales en las regiones encuadradas en (C). Las barbas del gráfico de caja indican los valores máximos y mínimos para cada grupo, con exclusión de los valores atípicos. Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. La tinción de Live Drp1 Null mosaico de Drosophila ovarioles con el colorante Mito-ROS. (A) rebanada óptica individual de ovarioles teñidos con el colorante mito-ROS. (B) de proyección de máxima intensidad de 2 rebanadas ópticos consecutivos de una cámara de huevos individuo con células de los folículos en el mitoetapa tic tiñe con el colorante mito-ROS. (C) rebanada óptica individual de una cámara de huevos individuo con células de los folículos en la fase de post-mitótico teñido con el colorante mito-ROS; * Indica una señal nuclear. La falta de UbiGFP marca los clones nulos Drp1. Barra de escala: 20 micras. Las imágenes confocales se adquirieron con los parámetros descritos en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8
Figura 8. Co-inmunotinción de fijo Drp1 Null mosaico de Drosophila ovarioles con dCyclinE y anticuerpos ATP-B. (A) de proyección de máxima intensidad de 3 rebanadas ópticos consecutivos de co-inmunotinción germarium. (B) de proyección de máxima intensidad de 3 rebanadas ópticos consecutivos de co-ImmunosLos MBC contenida post-mitótico. Los contornos demarcan los clones nulos Drp1 UbiGFP-negativos. Barra de escala: 10 micras. Las imágenes confocales se adquirieron con los parámetros descritos en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9
Figura 9. Ejemplos de posibles daños y artefactos. (A) germarium de UbiGFP que expresan ovariola fijadas y teñidas con el colorante Hoechst ADN que muestra las brechas indebidos (*). (B) de la cámara de huevos UbiGFP que expresan ovariola fijadas y teñidas con el colorante Hoechst ADN que muestra nicks / lágrimas (*). (C) Live ovariole con clones nulos Drp1 UbiGFP-negativos teñidas con el colorante mito-ROS que muestra una cámara deformada (*) y una cámara de huevos dañados, lo que permite parcial tinción de la línea germinal (**); # Indica una posible mancha real de una cámara de huevos sin daños en el mismo ovariola. (D) Vivo ovariola manchada con el mito-ROS tinte que muestra una cámara dañada general con una intensa tinción de artefactos de la línea germinal. * Indica daño inducido por aplanado ovarioles con una pérdida de señal UbiGFP, dando así origen a clones GFP-negativo de artefactos. Barra de escala: 20 micras. Las imágenes confocales se adquirieron con los parámetros descritos en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

video 1
1. Ensayo de vídeo Flip-tejido vivo. El curso de tiempo completo del ensayo FLIP basado en photobleaching describe en la Figura 5..com / archivos / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

Tabla 1: Ajustes microscopio confocal para la adquisición de las imágenes representativas presentada. Haga clic aquí para ver la Tabla 1. (Haga clic aquí para descargar.)

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Discussion

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Photobleaching: Prevención de photobleaching indebida de muestras fluorescentes es absolutamente necesario para la realización de la microscopía confocal eficiente. Por lo tanto, el tiempo utilizado para localizar muestras a través del ocular o para establecer los parámetros de adquisición de imágenes a través del modo de escaneado directo debe reducirse al mínimo para reducir al mínimo photobleaching.

El daño tisular: Dado que las mitocondrias son considerados como los sensores de la salud celular, es muy importante asegurarse de que los datos obtenidos mediante los métodos descritos son fisiológicamente relevantes y no reflejan el daño indebido causado por la disección procesal de los ovarios de Drosophila. La disección se debe realizar lo más rápidamente posible, pero también con extrema precaución para minimizar el daño tisular. El tiempo medio para la disección y las burlas de 5 Drosophila ovarios es de 5 a 7 minutos (en nuestras manoss). Esfuerzo debe ser el de identificar cámaras de huevos que muestran tejido dañado que serán excluidos de los análisis. Daño tisular debido a la disección puede incluir huecos indebidas (* en la Figura 9A, como se identifica por la falta de señal), muescas / lágrimas (* en la figura 9B, como se identifica por la falta de señal), o la deformación de las cámaras de huevos (* en la Figura 9C). Sin embargo, ninguna deformación significativa cámara de derivados de la manipulación experimental debe ser cuidadosamente evaluada. Aunque no cubreobjetos se utiliza en la parte superior del tejido vivo en el protocolo descrito, aplanamiento de la ovarioles puede ocurrir con una presión indebida aplicada al tejido, mientras que las burlas o de montaje (* en la Figura 9D). El aplanamiento de ovarioles no se ha observado con las muestras fijas, ya que el protocolo descrito implica la fijación de los tejidos inmediatamente después de la disección, con burlas que ocurre a partir de entonces. Cualquier cámara de huevos aislados sin ningún tipo de firmas del aforementioned daño puede ser considerado normal. Los daños mecánicos que podrían resultar de la disección también puede conducir a la pérdida de las buenas prácticas agrarias, produciendo clones falsos negativos GFP-16, y también puede dar lugar a la incorporación de tinte mejorada. Dado que las células de la línea germinal que residen dentro de las cámaras de huevo no son normalmente permeable a los colorantes mitocondriales en vivo (Figuras 6 y 7), la tinción mitocondrial mejorada de las células de la línea germinal de Drosophila puede ser consecuencia de un aumento en la permeabilidad del tejido dañado / morir; un artefacto tal se produce con el colorante mito-ROS (** en la figura 9C y todo el ovariole en la figura 9D), así como con otras manchas mitocondriales vivos (no se muestra). La pérdida de UbiGFP en la Figura 9D (*) también podría ser el resultado de daño que causó el aplanamiento de las cámaras de huevo. A pesar de que otras cámaras de huevos en la ovariola dañadas pueden permanecer auténtico y libre de impurezas (# en la figura 9C

Sensibilidad del tiempo: En el caso de la microscopía en vivo ex vivo, los datos deben ser obtenidos en los 15 minutos de montaje de tejidos; de lo contrario, los resultados experimentales pueden ser afectados por alteraciones de la fisiología debido a la muerte subsiguiente del tejido. A veces, dependiendo de la potencia del láser y otros parámetros de análisis, los 10 l de medio de montaje se pueden evaporar antes de lo 15 min. La detección de la piscina mitocondrial Ciclina E por co-inmunotinción requiere la minimización del tiempo de disección (probablemente debido a la naturaleza transitoria de la mitochondrial ciclina E piscina que se mantiene por la respiración mitocondrial activa 12). Un mitocondrial piscina apreciable ciclina E también no se observó con los tiempos de permeabilización de menos de 30 min.

FLIP: El movimiento de cualquier cámara de huevos bajo examen durante el curso temporal FLIP puede conducir a análisis de artefactos y por lo tanto deben ser excluidos. El uso de cualquier tinte mitocondrial en vivo o TMRE no se recomienda en un experimento de FLIP, desde la incorporación del colorante extranjera puede alterar la continuidad mitocondrial y por lo tanto dar lugar a resultados de artefactos.

Estrategia cruce Drosophila: El recíproco transversal a la descrita aquí (donde se utilizan los machos que llevan el alelo mutante Drp1) no produce muchos descendientes, probablemente debido a un impacto no identificado de Drp1 represión en los progenitores masculinos heterocigotos.

Interpretación de los datos clonal: Cualquier clones GF-negativos detectados en los ovarios de controlaislado de la Drosophila parental que expresa UbiGFP indicaría clones falsos negativos de artefactos, probablemente generadas debido a la pérdida de GFP causado por el daño durante la disección 16. No obstante, el número de clones GFP-negativos en la progenie a choque térmico de la cruz debe ser significativamente mayor que cualquier clones falsos negativos observados en los controles. Los clones generados en la capa de células del folículo Drosophila por la estrategia basada en la recombinación mitótica descrito pueden surgir de las células madre del folículo mitóticas (clones de células madre) o de las células del folículo no madre mitóticas (clones transitorios). Para los clones de células madre, los análisis experimentales deben realizarse tan sólo 10 días después del choque de calor, cuando ya se han sentado las cámaras de huevos con los clones transitorios. Para los clones transitorios, los análisis deben realizarse dentro de los 6 días después del choque térmico, con los clones de células del folículo de la ovarioles sin ningún clon de células del folículo en el germarium.

Modificaciones jove_content y solución de problemas

Si bien la determinación del potencial mitocondrial por unidad de masa utilizando el método descrito, uno tiene que ser consciente de los artefactos que pudieran derivarse de la óptica de microscopio o combinaciones de colorantes mitocondriales. Cualquier región que muestra una señal debilitada de la mancha mitocondrial global y una señal de TMRE comparativamente elevada (Figura 5A, *) puede surgir debido a la fluorescencia de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre los colorantes 8 o debido a las diferentes propiedades ópticas de la red (TMRE) y verde (colorante mitocondrial en general) las luces fluorescentes, dado un tamaño fijo del agujero de alfiler en la configuración de adquisición. El artefacto relacionado FRET-podría evitarse mediante la reducción de las concentraciones de colorante, si es posible, mientras que los análisis cuantitativos se pueden realizar en las proyecciones de 2 - 3 rebanadas ópticos consecutivos evitar el artefacto óptico. Además, si se detecta una señal fluorescente de la diafonía y transversal de excitacióncanales, los ajustes del láser y detectores deben reajustarse para minimizar la señal de estos canales, que se espera para reducir la señal de fluorescencia en los canales óptimos también.

Inducida por láser dañado a partir de la photobleaching reiterativo puede causar la fragmentación mitocondrial y por lo tanto causar discontinuidad mitocondrial, lo que impide un FLIP éxito. fragmentación Sospecha de las mitocondrias durante la ejecución del protocolo de FLIP se puede identificar mediante la adquisición de imágenes de mayor resolución con un agujero de alfiler reducida (y el aumento de la ganancia del detector). Si la fragmentación de las mitocondrias se observa visiblemente durante la ejecución del protocolo de FLIP, la potencia del láser de blanqueo debe reducirse y / o el intervalo entre blanqueadores consecutivos debe ser aumentada. Si hay blanqueo general durante el curso de tiempo del experimento FLIP (señal de la ROI amarillo en la Figura 3B y C), el láser de exploración debe reajustarse a un nivelque permite un mínimo o ningún photobleaching general.

Para evitar el artefacto potencial debido a la pérdida inducida por daño de GFP, los clones GFP-positivas pueden ser introducidos mediante la estrategia de MARCM, siguiendo el protocolo de choque térmico descrito. Aquí, la Drosophila apropiado para ser utilizado para la cruz es mujer virgen drpKG03815 FRT40A / CYO X masculina GAL80 FRT 40A / CyO; tina-Gal4, UAS-CD8GFP / TM6 9. La progenie de ala recta se debe utilizar para la generación de clones usando choque térmico (como se describe en el paso 6).

Limitaciones de la Técnica

A) Mientras que las células del folículo que residen en la superficie de las cámaras de huevos de Drosophila vivas incorporan los colorantes de tinción mitocondrial, las células de la línea germinal en el interior de la cámara de huevos no lo hacen; la línea germinal de las etapas más jóvenes mancha débilmente (figuras 5 y 6). B) La ex vivo en directo tissue microscopía debe realizarse dentro de 15 min de la finalización de la tinción en los ovarios aislados de individuo Drosophila, uno a la vez. Ya que los grupos experimentales deben ser procesados y la imagen en el mismo día, el tiempo total tomado para obtener datos estadísticamente significativa de microscopía vivo ex vivo de tejidos de varios grupos experimentales es razonablemente mayor que los obtenidos a partir de tejidos fijos. C) Hemos observado que la mancha mito-ROS no era muy estable en el tejido ex vivo Drosophila, probablemente debido a la naturaleza transitoria de la ROS analito detecta 17,15, lo que puede ser la base de la falta de detección de señal de toda la Drp1 clones nulos. Sin embargo, ninguna relevancia biológica de la variabilidad en la tinción mito-ROS en las células nulas Drp1 / clones no se puede descartar y debe investigarse más a fondo. Tenga en cuenta que la señal positiva de la mancha mito-ROS pueden reflejar no sólo una mayor dismutasa mitocondrial, sino también la mayor o Cellular entorno oxidativo 15. D) La mancha mitocondrial en general no se puede utilizar para los experimentos clonales GFP-negativas o positivas para GFP, ya que el espectro de fluorescencia de esta mancha mitocondrial y GFP son indistinguibles. E) El experimento FLIP diseñado para ensayar la continuidad de la matriz mitocondrial requeriría la adquisición de imágenes con un agujero de alfiler abierto que abarca la resolución de las estructuras mitocondriales.

Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes

El estudio de la relación estructura-función mitocondrial es crucial para una comprensión profunda de los mecanismos de regulación de la funcionalidad mitocondrial. Dado que los defectos mitocondriales contribuyen de manera significativa a varias enfermedades, incluyendo la diabetes, el cáncer, la enfermedad de Parkinson, una comprensión detallada de la forma de actuar mitocondrial mantiene la promesa de Hotel Instalacionesng el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas mitocondrias. La microscopía de células vivas es una herramienta indispensable para el estudio de la relación estructura-función mitocondrial. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se han restringido a células aisladas. El estudio de la estructura y la función mitocondrial se ha extendido al tejido vivo Drosophila en una configuración ex vivo 9. El protocolo descrito de este y otros estudios conducirá a una comprensión de la estructura y la función mitocondrial en Drosophila ovarios en vivo, ex vivo, lo que permite una comprensión de las mitocondrias en un contexto fisiológico. Este enfoque ex vivo tiene ventajas significativas sobre los estudios in vitro, ya que la regulación del metabolismo y propiedades energéticas de las mitocondrias en una célula dada depende en gran medida de la disponibilidad de nutrientes y la señalización apropiada en el contexto fisiológico de las células.

La manipulación genética de miestructura tochondrial por la represión de la proteína Drp1 fisión mitocondrial desregula el modulador del ciclo celular ciclina E y afecta el desarrollo del folículo ovárico capa de células Drosophila 9,12. Aquí, el protocolo incluye una descripción de la forma de introducir clones funcionalmente nulos de Drp1 en los ovarios de Drosophila para estudiar la relación estructura-función mitocondrial. Un nuevo grupo de mitocondrial ciclina E en células de mamíferos, así como la capa de células del folículo Drosophila 12, se ha detectado con éxito, lo que probablemente subyace en la regulación de ciclina E reportado por las mitocondrias 18. Aquí, el manuscrito demuestra un método para la detección de la novela piscina mitocondrial Ciclina E por fijo co-inmunotinción ovarios de Drosophila para dCyclinE y un marcador mitocondrial (ATP-B).

Las aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica

t Dadasombrero de Drosophila melanogaster es un potente sistema modelo genético, se prevé que nuestros métodos descritos para contribuir significativamente a la comprensión de la base genética de la relación estructura-función mitocondrial en la salud y la enfermedad. Drosophila ha sido ampliamente utilizado para desentrañar las interacciones genéticas que conducen a la tumorigénesis 19. La capacidad de la generación de clones en la capa de células epiteliales del folículo Drosophila permite el estudio de la interacción de las mitocondrias y los oncogenes o supresores tumorales en clones tumorigénicas individuales en un in vivo y ex vivo de configuración. Los métodos descritos se pueden utilizar para estudiar la regulación de la relación estructura-función mitocondrial en ovarios aisladas de mutante apropiado Drosophila. Los métodos descritos se pueden ampliar para estudiar el impacto directo de la señalización en la estructura y la función mitocondrial de nutrientes y el crecimiento de diversos factores a través de la exogAdemás endógeno de los nutrientes apropiados y / o factores de crecimiento en el medio de formación de imágenes ex vivo. Los métodos descritos pueden ser adecuadamente modificados y empleados en otros tejidos de Drosophila aislados, como los discos imaginales de larvas, que han sido ampliamente utilizados para estudiar las vías de transducción de señales en enfermedades como el cáncer 20,21.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

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References

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