Studerer mitokondrie struktur og funksjon i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mitokondrier er klassisk beskrevet som den cellulære drivkraft, siden de er de viktigste seter av energiproduksjonen i differensierte celler. Videre mitokondrier spille en avgjørende rolle i metabolismen, varmeutvikling, lipid modifikasjon, kalsium og redoks-homeostase, leiing av cellesignaleringsprosesser, etc. 1. Mitokondrier også spille en aktiv rolle i induksjonen av celledød 2, så vel som i cellesyklusregulering 3. Slike multifunksjonalitet hever følgende grunnleggende spørsmål: a) hvordan mitokondrier utføre alle disse funksjonene samtidig, og b) er det spesifikke mitokondrielle bassenger eller undersoner som er spesialisert for ulike funksjoner? I denne sammenheng er det viktig å merke seg at de multifunksjonelle mitokondriene er dynamisk i sin form, størrelse og struktur innenfor individuelle celler, og at steady-state form av mitokondriene kan variere mellom celletyper. Tiår med forskning fra ulike laboratorier tyder på at endring av mitokondrie form, størrelse og struktur, kollektivt kalt mitokondrielle dynamikk, er avgjørende for å opprettholde ulike mitokondrielle funksjoner 4,5,6. Disse funnene øke muligheten for at mitokondriene kan utføre sin multifunksjonalitet i kraft av deres strukturelle dynamikk.

Omfattende tiltak er underveis for å forstå mitokondrie struktur-funksjon forholdet. Dynamikken i mitokondriestruktur er primært vedlikeholdt av deres evne til å gjennomgå fisjon og fusjon hendelser med hverandre. Fisjon av store mitokondrier konverterer dem i mindre mitokondrielle elementer, mens fusjon mellom to mindre mitokondriene fusjonerer dem inn i en større mitokondrie element 7. Videre kan forbigående fusjon av to mitokondrier forekomme for å tillate blanding av innholdet. De fisjon og fusjon hendelsene i de indre og ytre mitokondrielle membraner er nøye regulert av specific sett av proteiner. Kjernen fisjon maskiner består av dynamin relaterte protein 1 (Drp1), som er rekruttert fra cytosol til mitokondriene ved sin interaksjon med visse bona fide mitokondrielle proteiner (f.eks Fis1 eller Mff1), mens Drp1 funksjonen kan også være regulert av andre proteiner på overflaten mitokondrielle 4. Selv om Drp1 opererer på den ytre membran, dets fisjons egenskaper påvirke den indre membran i tillegg. Leiing av fisjon av ytre og indre mitokondrielle membraner er ikke godt forstått. På den annen side er fusjon av den indre membran styrt i kjernen av aktivitetene til Opa1, mens mitofusins styrer sammensmelting av den ytre-membran 5. Balansen av motvirkende fisjon og fusjon hendelsene i mitokondriene diktere steady-state mitokondrie form i en celle. For eksempel vil undertrykkelse av mitokondriell spalting resulterer i fullstendig og uten motstand fusjon, mens den over-aktivitet av mitokondrierl fisjon vil resultere i fragmentering av mitokondrier tre.

Studiet av mitokondrie struktur-funksjon forholdet innebærer først og fremst to gratis tilnærminger: a) analyser av de cellulære og organisme fenotyper etter genetisk manipulering av mitokondrie fisjon / fusjonsproteiner og b) direkte vurdering av mitokondrie struktur og funksjon. Det er bemerkelsesverdig at genetiske analyser ikke alltid avsløre den direkte funksjon av molekylet for hånden (i dette tilfellet, mitokondrielle fisjon / fusjonsproteiner), som fenotypene kan oppstå på grunn av sekundære effekter. Derfor er det av største betydning for å utvikle og bruke verktøy for å studere mitokondrie struktur og funksjon direkte. Enhver vurdering av mitokondriestruktur innebærer ulike mikroskopi verktøy. Bruk av fluorescens mikroskopi av levende celler har i stor grad avanserte studier av mitokondrie dynamikk, siden mitokondrie dynamikk kan overvåkes både kvalitativt og Quantitätively bruke de riktige fluorescens mikroskopi verktøy og teknikker 8. Fluorescens mikroskopi-basert verktøy har blitt utviklet for å studere mitokondrie struktur og funksjon i levende og faste Drosophila melanogaster vev, belyse betydningen av mitokondrie dynamikk in vivo 9. Disse og beslektede metoder er beskrevet her, med mål om å studere mitokondrie struktur og funksjon i Drosophila eggstokk.

Drosophila eggstokk består av germline og somatiske slektsnavn, som oppstår fra sine respektive voksne stamceller som bor i germarium 10,11. Seksten syncytial kjønnsceller (GCS) blir innkapslet av somatiske hårsekkceller (FCS) for å danne individuelle egg kamre som fremkommer ut fra den germarium (figur 1). En av de 16 GCer blir forpliktet seg til å bli en oocytt, og de resterende 15 GCer utvikle seg til sykepleier celler som understøtter veksten av eggcelle kammeret, Lette modning av egget før den legges. Flertallet av FCS gjennomgå 9 runder med mitotiske divisjoner før de kommer ut av mitotiske cellesyklus til terminalt differensiere i en mønstret epitelcellelaget bestående av fremre hårsekkceller (AFCS), posterior hårsekkceller (PFK), og hoved kroppens celler (MBCS) . De etterfølgende egg kamrene er forbundet med stilken celler, som differensierte celler som også er utledet fra FCS tidlig i utviklingen. Mitokondrie form regulert av mitokondrie fisjon protein Drp1 er aktivt involvert i prosessen med differensiering under normal utvikling av Drosophila eggstokkreft FC lag 9,12. Metodene som anvendes i disse studier for å identifisere involvering av Drp1 i Drosophila follikkel cellelaget utvikling er beskrevet her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Drosophila (verktøyene som kreves er avbildet i figur 2A)

  1. For en hvilken som helst av de beskrevne forsøk, samle Drosophila (opprettholdt ved romtemperatur eller 25 ° C) i løpet av 5 dager etter eklosjonshormon og plassere dem i en ampulle fylt med 5. - 7. mL Drosophila mat (se Materialer tabell), med ikke mer enn 25 fluer i hvert hetteglass; opprettholde en kvinnelig: Hann-forhold på 2: 1.
  2. Dryss en liten mengde av granulert gjær å stimulere Drosophila eggproduksjon. Utfør eksperimentell manipulasjon innen 2 - 4 dager.

2. Disseksjon av Drosophila Eggstokkene (verktøyene som kreves er avbildet i figur 2A)

  1. Varm insekt dissekere medium (se Materialer tabell) til romtemperatur, 25 ° C. Fylle tre brønner av en åtte-brønns glass dissekere tallerken, med 200 ul medium i hver brønn.
  2. Anesthetize Drosophila med CO Drosophila i en tid da opptre live mikroskopi.
  3. Mens du ser gjennom okularet av disseksjon mikroskop, kutte thorax fra magen ved hjelp av to par tang. Ved hjelp av pinsett, nøye overføre livet til den andre brønnen på fatet.
  4. Bruk en pinsett til å holde magen i bakre enden, og sakte presse eggstokkene ut (sammen med de andre mageinnholdet) med den andre pinsett. Skulle dette forsøket mislykkes, forsiktig fjerne mage exoskeleton ved å sette pinsett inn i den fremre enden for å slippe eggstokkene.
  5. Ved hjelp av pinsett, holder en individuell eggstokk med ugjennomsiktig bakre enden (dvs. eggeplomme fylte, sent stadium egg) og flytt den forsiktig til den tredje brønnen på fatetfor teasing å behandle den for live mikroskopi (trinn 3) eller for å feste å utføre farging (trinn 7).
  6. erte forsiktig beskyttelseskappe fra rundt eggstokkene ved å feie en ertende nål lett fra bakre til fremre enden av hver eggstokk mens du holder den ved bakre enden med en pinsett.
    MERK: For å minimere skade under erting, bøy nålespissen og zoome inn på hver eggstokk ved å øke forstørrelsen av mikroskopet (Figur 2A). Erte bør være effektiv nok til å bryte kappen, men det bør også være nøye gjort for å bevare integriteten til ovarioles.

3. Forberedelse for Live-vev Mikros

MERK: Verktøyene som kreves er avbildet i figur 2A.

  1. Før Drosophila disseksjon, forberede polyL-lysin belagt kamre. For å oppnå dette, plasserer du to 20-mL dråper polyL-lysin (0,1 mg / ml) på coverglass (14 mm, No. 0) av et glassbunn petriskål (35 mm) til en rimelig avstand fra hverandre for å hindre sammensmelting av de dråper. Luft-tørke platene i 1 time ved 37 ° C og markere kantene av hvite polyL-lysin film på undersiden av platen med en slettbare markør.
    MERK: polyL-lysin-belagte kamre kan lagres ved 4 ° C i en uke. Hvis du bruker en tidligere belagt kammer, bringe den til romtemperatur før du starter Drosophila disseksjon.
  2. Angi skanningsparametere på konfokal mikroskop for å sørge for at prøven kan avbildes umiddelbart etter ferdigstillelse av disseksjon og montering, som nedenfor.
  3. Plasser en dissekert og ertet eggstokk (etter trinn 2 og farget, om nødvendig, etterfølgende trinn 5) på en markert polyL-lysin-belagte område og spre eggstokk med erte nål for å skille ovarioles. Plasser en 10-mL dråpe insekt dissekere medium på toppen av eggstokken, og pass på å dekke than hele polyL-lysin-belagte område. Dekk petriskål.
  4. Umiddelbart utføre konfokal mikroskopi av den monterte prøven ved romtemperatur.
    MERK: Bare én Drosophila skal dissekert, behandlet, og avbildes på en gang. Dessuten mikros bør ikke utføres ved 37 ° C, noe som vil etterligne et varmesjokk miljø for Drosophila vev.

4. Fluorescens Loss I fotobleking (FLIP) analyse for å vurdere mitokondrie Matrix Kontinuitet

MERK: Mitokondrie matrix kontinuitet i en smeltet mitokondriestruktur er etablert etter at fullstendig fusjon av de mitokondrielle indre og ytre membraner etter en progresjon gjennom de mellomliggende trinnene. Fisjon av mitokondrier kan følge de samme trinnene, men i motsatt retning (figur 3A). FLIP er en time-lapse mikroskopi-baserte semi-kvantitativ metode som kan brukes til å vurdere mitokondrielle matriks kontinuitet iendelig smeltet tilstand av ex vivo mitokondrier (trinn 3 og 4 i figur 3A) i levende Drosophila eggstokkene 9. Den FLIP Analysen utføres som en liten region av interesse (ROI) av mitokondrier som uttrykker et fluoriserende molekyl i den mitokondrielle matriks som er photobleached med jevne mellomrom (FLIP ROI i figur 3A). Som et resultat, vil en hvilken som helst omgivende mitokondrielle region som er sammenhengende med den FLIP ROI (eksperimentelt ROI i figur 3A) mister signalet på grunn av utveksling av molekyler i den kontinuerlige mitokondrielle matriks. Flippen eksperimentene demonstrerte her blir utført på transgene Drosophila uttrykke mitoYFP, som inneholder den mitokondrielle målretting sekvensen til det humane cytokromoksydase VIII subenheten merket med YFP å målrette det til den mitokondrielle matriks i et fritt diffunderbart form. Et lignende eksperiment kan også utføres med mito pUASP-mito-GFP transgenet, som rapportert tidligere <sup> 9. En tilsvarende FLIP protokoll kan anvendes sammen med en sonde rettet mot den mitokondrielle inter-membran plass for å kunne detektere den kontinuitet som resulterer fra sammensmeltingen av de ytre men ikke de indre mitokondrielle membraner (trinn 2 på figur 3A).

  1. Åpne bildet oppkjøpet programvaren på konfokal mikroskop og stille de riktige skanningsparametere i "Acquisition" -kategorien (tabell 1). Sjekk "Tidsserier", "Bleking" og "regioner" boksene for å åpne de enkelte kategoriene. Sett de aktuelle oppkjøpsparameterverdier i hver kategori (tabell 1).
    MERK: pinhole bør stå åpen, da dette forsøket er utviklet for å overvåke samlet signal fra hele mitokondrie befolkningen i enkeltceller.
  2. Bruk okularet til raskt å finne interessefelt i den monterte levende vev.
    MERK: Velg ovarioles som er godt spredt på glass bottomed fatet, siden konfokalmikroskopi kan ikke utføres på flytende ovarioles.
  3. Klikk på "live" for å skaffe seg et levende bilde av det valgte interessefelt. Klikk "stopp" for å stoppe live-skanning.
  4. Om nødvendig, juster oppkjøpet parametere slik at oppdaget fluorescerende signal er under metningsnivåer (angitt ved fravær av røde piksler når "range indikatoren" alternativet er valgt), med den definerte bakgrunn som satt ved å justere offset verdier.
  5. Tegn en liten avkastning ved hjelp av Bezier tegneverktøy fra "regioner" -kategorien for å avgrense den fotobleking sone på bildet kjøpt av levende skanning.
    MERK: Størrelsen på ROI bør være rundt 20 - 50% av den totale fluorescerende mitokondrie signal i cellen.
  6. Utfør image oppkjøpet ved å klikke på "start eksperiment."
  7. Kvantifisere fluorescens intensitet bruker proprietær eller åpen kildekode-programvare (se MaterialerTabell). Spill middelverdien signal fra ROI der repetitive bleking er målrettet (FLIP); ROIs der bleking ikke er utført i samme celle (eksperimentell); avkastningen fra en annen ubleket celle i samme synsfelt, for å vurdere samlet bleking i løpet av forsøksperioden (Bleking); og avkastningen på bakgrunn området (Bakgrunn). Trekk fra den midlere bakgrunnssignal oppnås fra det midlere signal i den andre ROIs. Normaliser det fluorescente signalet med den innledende pre-blekemiddel signal for den respektive celle.
  8. Plotte normaliserte data ved hjelp av en hvilken som helst standard plotting programvare.

5. Levende Farging med Fluorescent mitokondrie Fargestoffer

MERK: Steady-state mitokondriestruktur og potensialet kan vurderes ved hjelp fargestoffer som spesifikt innlemme i mitokondriene i levende celler og vev. Levende Drosophila eggstokkene kan farges ex vivo med fluorescerende mitokondrieflekker for å visualisere mitokondriene, for å vurdere mitokondrielle reaktive oksygenarter (ROS mito-) produksjon, og for å vurdere potensiell mitokondrielle per masseenhet. Dette kan oppnås ved ko-farging med den mitokondrielle potensiometriske fargestoff tetramethylrhodamine etylester (TMRE) og en kompatibel levende mitokondriell flekk som representerer den mitokondrielle massen (se Materialer tabell for de spesifikke fargestoffer).

  1. Fortynne lager av flekker i varmt insekt dissekere medium til de endelige arbeidskonsentrasjoner: mitokondrie flekken, 250 nM; TMRE, 50 nM; og mito-ROS flekken, 5 mikrometer.
  2. Etter disseksjon og erting eggstokkene følgende trinn 2, plassere eggstokkene i 200 mL av en bestemt fargeløsning i en brønn i en disseksjon parabolen. Inkubere dem i 10 minutter med fatet er dekket av en egnet boks pakket med aluminiumsfolie for å beskytte det mot lys. Vask farget eggstokkene ved å flytte dem forsiktig med pinsett inn i 3 påfølgende brønner som ing medium uten flekk.
  3. For co-farging med TMRE og den kompatible generelle mitokondrie flekken, følger de ovennevnte protokoll for å flekke først med TMRE og deretter umiddelbart med den generelle mitokondrie flekken (uten vask trinnene i mellom).
  4. Monter eggstokkene på en polyL-lysin belagt med glassbunn fatet følgende trinn 3 og forberede konfokalmikroskopi med de riktige skanningsparametere (tabell 1), etter trinn 04.02 til 04.04.
    MERK: Signalet fra de inngående fargestoffer varte ikke når du forsøker å montere de fargede prøver i monteringsmedium.
  5. Sjekk Z-seksjonering boksen for å åpne kategorien. Vri fokuseringshjulet mot bunnen av prøven mens den blir live skannet og klikk på "set første" for å definere den nederste Z-delen. Gjør det samme mens du flytter fokushjulet mot den andre retningen for å definere den øverste delen.
  6. Utfør image oppkjøpet ved å klikke på "start eksperiment."
  7. Kvantifisere bakgrunnen korrigerte fluorescerende intensiteten fra Rois for bakgrunnssignalet og de enkelte cellene (som i trinn 4.7) og plotte data ved hjelp av en plotting programvare.

6. generasjon Drp1 Null Mosaics

MERK: klonal strategien brukes her innfører grønne fluorescerende protein (GFP) -negative Drp1 null kloner i bakgrunnen av en GFP-positive, fenotypisk villtype bakgrunn som er genotypisk heterozygot for Drp1 null mutasjon 9. Heat shock-indusert flippase-flippase target gjenkjenning (FLP-FRT) -mediert stedsspesifikke mitotisk rekombinasjon skaper homozygote kloner av funksjonelt null drpKG03815 allel. Genotypen av Drosophila bærer Drp1 mutant er drpKG03815 FRT40A / CYO, mens genotype bærer varmesjokk-indusert FLP (hsFLP) og UbiGFP klonal markør er hsflp; ubiquitin NLS-GFP (UbiGFP) FRT 40A / CYO. Genotypen av SEtes avkom av korset mellom de ovennevnte genotyper er hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

  1. Synkron Drosophila for jomfru samling ved å flytte dem inn i nye ampuller med fersk mat hver 2 til 3 dager. Overvåke pupariating ampuller daglig for å samle nye jomfruelige kvinner.
  2. Samle rød-eyed, krøllete vridde jomfruelige kvinner fra Drp1 mutant genotype hver dag, en gang om morgenen og en gang om kvelden, og plassere dem i en egen hetteglass. Parallelt samle mannlige Drosophila med mørke røde øyne og rette vinger bærer hsflp og UbiGFP innen 5 dager eklosjonshormon.
  3. Sett opp et kors ved å legge hannene til jomfru kvinner med en kvinnelig: mann forholdet 2: 1.
  4. Dryss en liten mengde av granulert gjær for å stimulere eggproduksjon.
    MERK: Flytt forsiktig Drosophila til en frisk ampulle med media hver 2 til 3 dager for å øke mengden av avkom og å redusere hette trengsel.
  5. enesthetize, sortere og samle rett-vinger, rød-eyed kvinnelig avkom innen 5 dager eklosjonshormon.
  6. For varmesjokk, plasserer den oppsamlede Drosophila inn i tomme ampuller med en liten mengde granulert gjær og en liten, myk tørke (for å absorbere fuktighet under varmesjokk). Plasser flasken med Drosophila i et vannbad ved 38 ° C i 1 time, for å generere hovedsakelig follicle-cellekloner, og ved 37 ° C i 1 time, to ganger om dagen (slik at minst 5 timer mellom de to varmesjokk) i 2 påfølgende dager for å generere både kimlinje og follikkel-cellekloner.
    MERK: Pass på at glasset er helt nedsenket i vann opp til nivået av pluggen.
  7. Varmen sjokk kan gjøre Drosophila immobile. Tillat den varmesjokkerte Drosophila å utvinne i 1 time ved romtemperatur når de blir mobil igjen.
  8. Legg hannene tilbake til hunnene i samme forhold som i korset, og flytte dem til nye flasker med medium drysset med en liten mengde av granulert gjær. Opprettholde Drosophila i minst 5 dager.
  9. Skjær eggstokkene som er nødvendig for en levende eller fast eksperiment.
    MERK: Eggstokkene isolert fra foreldre Drosophila uttrykke UbiGFP bør brukes som negative kontroller for å bekrefte effektiv induksjon av GFP-negative kloner av varmesjokk.

7. Co-farging for Cyclin E og Mitokondrier

MERK: For å oppdage Drosophila Cyclin E (dCyclinE), har vi brukt en kommersielt innhentet antistoff dannet spesielt mot dCyclinE 9 (se Materialer tabell). Som et mitokondrie markør, har vi brukt et antistoff mot ATP-B (en subenhet av mitokondriell ATP syntase kompleks) 9.

  1. Varm 4% paraformaldehyde (PFA) til romtemperatur, 25 ° C. Forsiktighet! Paraformaldehyde er giftig.
    MERK: Etter åpningampullen, PFA bør lagres ved 4 ° C og anvendt i løpet av 7 dager. Dette er fordi lagring av PFA kan tillate oksydasjon til metanol, som ville dramatisk endre mitokondrielle membraner under fiksering, selv dersom de er tilstede i spormengder.
  2. Umiddelbart etter disseksjon, fikse dissekert eggstokkene ved å plassere dem i 200 mL av frisk PFA i en brønn med et glass dissekere fatet (uten erting). Hold rett i en avtrekkshette i 15 min. Vask de faste eggstokkene ved å flytte dem forsiktig med pinsett i 3 påfølgende brønner, hver inneholdende 200 ul av 1 x fosfatbufret saltvann (PBS).
    MERK: Eksperimentet kan bli stoppet her og prøvene kan stå ved 4 ºC for en dag.
  3. Erte eggstokkene mer grundig i PBS (i likhet med trinn 2.6) for å fjerne den beskyttende fibrøs kappe som kan hindre antigen tilgang av antistoffet nøye.
  4. Permeabilize ertet eggstokkene ved å plassere dem i en mikro rør med 500 mL av rykende 0.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) og inkuberes det i 30 min mens gynging ved 25 rpm.
    MERK: Under rocking, plasserer rørene parallelt med rocking bevegelse; plassere dem vinkelrett kan tillate vevet å holde seg til hetten av rørene, noe som resulterer i vev tap.
  5. For å fjerne PBS-TX, plasserer mikrofugerør i et stativ slik at vevet å slå seg ned på bunnen av rørene. Inspiser dem visuelt og trykk rørene, om nødvendig, for å ta noen flytende vev ned til bunnen. Aspirer løsningen nøye fra toppen, noe som gjør at vevet i bunnen av rørene forblir uforstyrret.
  6. Blokkere eggstokkene ved å tilsette 200 ul av 2% bovint serumalbumin (BSA) oppløst i 0,5% PBS-TX, og inkuber det på vippe ved romtemperatur i 1 time. Fjerne den blokkerende middel ved å følge trinn 7.5.
  7. Legg primære antistoffer i 200 ul av frisk blokkeringsmiddel: anti-kanin dCyclinE-antistoff (1: 100) og anti-mus ATP-B antistoffet(1: 100). Inkuber vev på vippe i 2 timer ved romtemperatur.
  8. Vask eggstokkene med PBS-TX 3 ganger i 15 minutter hver, etterfølgende trinn 7.5.
  9. Tilsett 200 ul av de passende sekundære antistoffer i frisk PBS-TX: anti-mus-Cy3 (1: 1000) og anti-kanin-Cy5 (1: 500). Inkuber på vippe i 1 time ved romtemperatur.
  10. Vask eggstokkene med PBS-TX 3 ganger i 15 minutter hver, etterfølgende trinn 7.5.
  11. Å farge DNA, legge Hoechst (1: 1000 fortynning) til den endelige PBS-TX vask.
  12. Til slutt, la vevet i 500 mL av 1x PBS.
  13. Ved hjelp av en 1-ml mikropipette, fjerne De immun eggstokkene fra mikrosentrifugerør i en fersk godt av et glass dissekere fatet inneholder 200 mL PBS.
  14. Legg en dråpe glyserol-baserte montering medium til et glass slide og tilsett immunostained eggstokkene én etter én til montering medium.
    MERK: Pass på at eggstokkene blir faktisk overført til monteringsmedium. Unnlate å gjøre so vil føre til tap av vev.
  15. Mens du ser gjennom disseksjon mikroskop, forsiktig plukke de gjennomsiktige ovarioles (yngre stadier) fra ugjennomsiktig modne egg kamre ved hjelp av erting nålen mens du holder den ugjennomsiktige delen av eggstokk med pinsett. Fjern de modne egg kamre fra monteringsmedium.
  16. Plasser en dekkglass (22 mm, nr 1) på lysbildet og trykk lett for å sikre at monteringsmedium er spredt jevnt under.
    MERK: Ved å trykke på coverglass sikrer også riktig justering av vevet langs dekkglass. Unnlate å gjøre det optimalt kan tillate mindre etapper å flyte i monteringsmedium, og hindrer optimal mikroskopi av disse vev.
  17. Air-tørke prøvene i 15 min og forsegle kantene av dekkglass forsiktig med neglelakk.
  18. Utfør konfokalmikroskopi pr eksperimentelle behov (tabell 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De beskrevne fremgangsmåter kan brukes til å studere mitokondrie struktur og funksjon i levende og faste Drosophila eggstokkene (figur 2B). Forutsatt er noen eksempler på forventede resultater som ble oppnådd med de beskrevne metoder.

Disseksjon av Drosophila eggstokk: Når dissekert ytterligere, bør de avkuttede underlivet (figur 3B) fra hele Drosophila (figur 3A) frigi mageinnholdet, inkludert 2 ovarier fra hver enkelt Drosophila. De intakte eggstokker vises som ovalformede, hvite blandinger (pilene på figur 3C, og D) som ideelt sett bør forbli festet til hverandre via oviductal stilken. De ovarioles i hvert eggstokk bør holdes sammen av den fibrøse skjede (# i forstørret del av figur 3C), som fjernes by forsiktig erting (pil tykk i figur 3D, * indikerer en dårlig ertet eggstokk med frittliggende ovarioles) for å avsløre ovarioles for farging og mikroskopi. De frigitte eggstokkene med oviductal stilker revet under utgivelsen av mageinnholdet kan også brukes, forutsatt at de ikke skadet på annen måte. Eventuelle skadede eggstokkene (* i figur 3C) og andre mageinnhold (pilspiss i figur 3C) skal kastes.

Live-mikroskopi av Drosophila eggstokk: Her demonstrerer vi FLIP teknikk og lasting av mitokondrie strukturelle og funksjonelle fargestoffer i Drosophila eggstokkene.

Den FLIP teknikk, tidligere brukt for å vurdere mitokondrielle kontinuitet i Drosophila hårsekkceller 9, har vært vist her i eggstokkene sykepleier celler av transgene Drosophila (Figur 4A). FLIP rettet mot en av de mitokondrielle skyene forbundet med sykepleier celler fører til en mer enn 50% tap av det fluorescente signalet fra det blå og hvite ROIs omgir røde FLIP ROI mindre enn 200 s (figur 4B og C); signalet fra den grønne ROI brukes for bakgrunnskorrigering. Det fluorescente signalet fra det gule ROI i de andre ikke-målrettede sykepleier celler forblir konstant gjennom dette tidsrommet, som betyr minimal total bleking i løpet av tiden løpet av eksperimentet (figur 4B, og C). Se også video 1. Dette resultatet indikerer at mitokondrienei sykepleier celler har smeltet deres ytre og indre membraner, eksemplifisert i trinn 3 og 4 (figur 4A), mens mitokondriene i trinn 1 og 2 ikke er ventet å vise noen tap av fluorescens i dette tidsrommet.

Det er tidligere blitt vist at en semi-kvantitativt mål for mitokondriell potensial per enhet mitokondriell masse kan vurderes ved å ko-farging med den potensiometriske fargestoff TMRE og den samlede mitokondrielle flekk som reflekterer mitokondrie masse 13. Her ble den samme teknikk som brukes til å demonstrere vurderingen av mitokondriell potensial per masseenhet i levende Drosophila ovarievev. Konfokal mikroskopi av levende Drosophila eggstokker farget med TMRE viser en reduksjon i signal med dybden av vev (figur 5A). Dette tap av fluorescerende signal på grunn av økende spredning i større dybde vev forventes å skje med noen form for fluorophore med en gitt arbeidsavstand på objektivet i bruk. Derfor er det viktig å skjelne den maksimale dybden av vev innen hvilke fluoroforen kan påvises i løpet av levende vev avbildning. For eksempel, lever Drosophila eggstokker farget med den generelle mitokondrielle flekk (Mito) kan avbildes ved hjelp av den beskrevne mikroskop setup (tabell 1) innenfor et område på 20 um fra dekkglass, mens den maksimale avbildbar dybde avtar med økende egg kammer størrelse (figur 5B). Den optimaliserte mikroskop innstillingene for mitokondrie flekker oppdage positive signaler i de aktuelle deteksjons kanaler, mens innstillingene for å undersøke noen utilbørlig signal krysstale eller fluoroforen cross-eksitasjon Sprak oppdaget minimal eller ingen signal (Figur 6A). Co-farging av TMRE med den generelle mitokondrielle flekken kan brukes for både kvalitativ (figur 6B) og kvantitativ (figur 6C og D </ strong>) vurderinger av mitokondriepotensial per masseenhet i levende Drosophila eggstokkene. For eksempel, a) en kvalitativ analyse viser at Drosophila germarium oppviser høyere mitokondriell potensial per masseenhet i trinn 2b, hvor de somatiske hårsekkceller har oppstått for å innkapsle kimlinje-celler (piler i figur 6B) og b) semi-kvantitative analyser demonstrerer forskjellen i mitokondrie potensial per masseenhet mellom (strekk) AFCS og MBCS, som analysert fra en scene ni egg kammeret (figur 6C). Legg merke til at kvantifisering er utført fra 2 forskjellige optiske skiver for AFCS og MBCS, avhengig av deres fokusplanet. Bruken av Mito-ROS sonde som har blitt brukt i Drosophila 14 er vist i levende Drosophila ovarie follikkel epitel-cellelag, hvor funksjonelle null kloner av den mitokondrielle fisjons proteinet Drp1were innført. De fleste, but ikke alle, av de levende GFP-negative Drp1 null follikkel-cellekloner oppvise forhøyet farging for mito-ROS (Figur 7A og B). Legg merke til at selv om en distinkt mitokondriell signal ikke kunne påvises i dette vevet, kan konsentrasjonen av det Mito-ROS flekk påvises i atom regionen i de avanserte post-mitotiske hårsekkceller, som er betydelig større enn de mitotiske follicle celler (* i figur 7C). Dette kan skje på grunn av samspillet av kjerne-DNA og det fluorescerende oksidasjonsproduktet av Mito-ROS fargestoff, som er et derivat av etidium 15.

Påvisning av mitokondriell Cyclin E i faste Drosophila ovarial hårsekkceller: Det har nylig blitt vist at mitokondriene kan regulere cellesyklusen molekylet Cyclin E ved å rekruttere det til den mitokondrielle overflate i pattedyrceller og Drosophila follicle cellelaget Drosophila hårsekken celle laget 12. Her er et eksempel på mitokondriell lokalisering av Cyclin E i Drosophila hårsekkceller demonstrert ved hjelp av ko-farging protokoll beskrevet. Legg merke til forhøyede nivåer av dCyclinE de GFP-negative Drp1 null kloner der dCyclinE signalet overlapper med den av mitokondrie ATP-B-signalet i germarium (figur 8A), selv om signalet ikke kan oppløses i forskjellige mitokondrielle elementer med begrenset oppløsning av konfokalmikroskopi. Også i post-mitotiske MBCS de GFP-negative Drp1 null-klonene har både nukleære og cytosoliske dCyclinE signaler, med den sistnevnte betydelig overlappende med den ATP-B-signalet, mens villtype-GFP-positive celler som bare har en kjernefysisk dCyclinE signal (figur 8B).


Figur 1. Utvikling av Drosophila Egg Chambers. Tegneserie viser et Drosophila ovariole bestående av en kjede av utviklings egg kamre, hvert bestående av en oocytt og sykepleieren celler (germline) innkapslet av follikkelen cellelaget (somatisk). Egg kamre utvikles fra germarium og utvikle seg gjennom faser der mitotiske hårsekkceller blir post-mitotisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Forsøksplan og klargjøring. (A) Verktøy som brukes i fremgangsmåtene beskrevet: A. Fly ampulle; B. Insect dissekere medium; C. Paraformaldehyde; D. Fly pensel; E. Dissekere rett; F. Cover glass; G. mikrofuge tube. H. Glass bunn fatet; I. Glass lysbilde; J. 1000-mL mikropipette; K. 200 mL mikropipette; L. 2,5-mL mikropipette; M. Erting nål med bøyd spiss (tips er forstørret); N. Tykke tang; O. Tynne tang. (B) Et flytskjema som skjematisk representerer de metoder som er beskrevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Disseksjon av Drosophila eggstokkene. (A) bedøvet hele Drosophila. (B) Severed Drosophila livet med eller uten (*) mageinnholdet. (C) Utgitt Drosophila abdominal innholdet, inkludert eggstokkene (piler og *) og annet innhold(pilspisser); forstørrelse av eske regionen på høyre fremhever anterior (Ant) og bakre (Post) ender av paret av eggstokkene holdt av oviductal stilken, der ovarioles holdes av fiber skjede (#). (D) Ertet Drosophila eggstokk (tykk pilmarkeringen hensiktsmessig ertet og * merking dårlig ertet) i forhold til unteased eggstokk (tynn pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Levende vev FLIP analysen. (A) Skjematisk representerer trinnene med mitokondriell fisjon / fusjon, som kan bli analysert ved hjelp av en passende mitokondrie kontinuitet analyse ved hjelp av FLIP-metoden; i dette tilfellet, en mito-YFP sonde i den mitokondrielle matriks gjør det mulig for den assessment av mitokondrie matrise kontinuitet. (B) Time-lapse ex vivo mikroskopi av en live transgen Drosophila egg kammeret uttrykker mito-YFP; bare velg tidspunkter (t) er vist. Se Video 1 for alle tidspunkter. (C) Kvantifisering av det fluorescente signalet fra det respektive fargede ROIs i (B) er uttrykt etter bakgrunnskorreksjon og normalisering. Pilene angir reiterative fotobleking tidspunkter, mens tidsintervallet mellom to påfølgende bleking er restitusjonstiden. Skala: 10 mikrometer. Bildene ble kjøpt med parametrene beskrevet i tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Levende Mitokondrierl Farging og Mikroskopi av Drosophila Ovariole. (A) Individuelle optiske skiver av en levende Drosophila ovariole farget med TMRE; bildet ble kjøpt med parametrene beskrevet i tabell 1. Z betegner avstanden fra dekkglass i um. (B) En levende Drosophila ovariole lastet med den generelle mitokondrie flekken (Mito). XZ bildet av den røde linje i XY-bilde vises, hvor B er den nederste, og T er toppen av den ervervede bildet. Avstanden fra bunnen til den blå linjen er 20 mikrometer. Skala: 20 mikrometer. De confocal bilder ble kjøpt med parametrene beskrevet i tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Co-farging av levende Drosophila Ovarioles med TMRE og Overall mitokondrie Stain. (A) En optisk skive en levende Drosophila ovariole co-farget med TMRE og den totale mitokondrie flekken (Mito); * Viser en eksperimentell gjenstand beskrevet i diskusjonen delen. (B) Maksimal intensitet projeksjon av 3 påfølgende optiske skiver av germarium i (A); pilspisser angir det område hvor den TMRE fluorescens økes. (C) Enkelt optisk skive post-mitotisk egg kammer co-farget med TMRE og den generelle mitokondrie flekken. Topp- og bunnpanelene viser fokusplanet for AFCS og MBCS, respektivt. (D) Box plott som viser midlere fluorescensintensitet av TMRE og den samlede mitokondrie flekk kvantifiseres fra individuelle AFCS og MBCS i eske regioner (C). Linjene til boksplottet viser maksimums- og minimumsverdier for hver gruppe, med unntak av uteliggere. tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Farging av Levende Drp1 Null Mosaic Drosophila Ovarioles med Mito-ROS fargestoff. (A) En optisk skive ovarioles farget med mito-ROS fargestoff. (B) Maksimal intensitet projeksjon av 2 påfølgende optiske skiver av en individuell egg kammer med hårsekkceller i Mitotic scenen farget med mito-ROS fargestoff. (C) Enkelt optisk skive fra et egg kammer med hårsekkceller i post-mitotisk scenen farget med mito-ROS fargestoff; * Angir et atom signal. Mangelen på UbiGFP markerer Drp1 null kloner. Skala: 20 mikrometer. De confocal bilder ble kjøpt med parametrene beskrevet i tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Co-farging av Fast Drp1 Null Mosaic Drosophila Ovarioles med dCyclinE og ATP-B-antistoffer. (A) Maksimal intensitet projeksjon av 3 sammenhengende optiske skiver av co-immunostained germarium. (B) Maksimal intensitet projeksjon av 3 sammenhengende optiske skiver av co-immunosholdt post-mitotiske MBCS. Omrisset avgrense UbiGFP-negative Drp1 null kloner. Skala: 10 mikrometer. De confocal bilder ble kjøpt med parametrene beskrevet i tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9. Eksempler på mulig skade og gjenstander. (A) Germarium av UbiGFP-uttrykk ovariole fiksert og farget med DNA-fargestoff Hoechst viser utilbørlig brudd (*). (B) Egg kammer UbiGFP-uttrykke ovariole fiksert og farget med DNA-dye Hoechst viser nicks / tårer (*). (C) Live ovariole med UbiGFP-negative Drp1 null kloner farget med mito-ROS fargestoff viser en deformert kammer (*) og en skadet egg kammer, slik at delvis farging av kimlinje (**); # Betegner en eventuelt ekte flekk av en uskadet egg kammer i samme ovariole. (D) Live ovariole farget med mito-ROS fargestoff som viser en samlet skadet kammer med intens kunstig farging av germline. * Indikerer skader indusert flatet ovarioles med et tap på UbiGFP signal, og dermed gi opphav til kunstig GFP-negative kloner. Skala: 20 mikrometer. De confocal bilder ble kjøpt med parametrene beskrevet i tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

video 1
Video 1. Levende vev FLIP analysen. Den komplette Tidsforløpet for den fotobleking baserte FLIP-analysen beskrevet i figur 5..com / filer / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "target =" _ blank "> Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Tabell 1: konfokalmikroskop Innstillinger for erverv av de presenterte Representative Images. Klikk her for å se tabell 1. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen

Photobleaching: Forebygge unødig fotobleking av fluorescerende prøver er helt nødvendig for å utføre effektiv konfokalmikroskopi. Derfor bør tiden brukes til å finne eksempler gjennom okularet eller å sette bildeinnhentingsparametere via live skannemodus minimeres for å minimere photobleaching.

Vevsskade: Siden mitokondriene er ansett for å være sensorene av cellular helse, er det svært viktig å sikre at de data som oppnås ved hjelp av de beskrevne metoder er fysiologisk relevante og gjenspeiler ikke utilbørlig skader forårsaket av prosess disseksjon av Drosophila eggstokkene. Disseksjon bør utføres så raskt som mulig, men også med ekstrem forholdsregel for å minimere skade på vev. Den gjennomsnittlige tiden for disseksjon og erting av 5 Drosophila eggstokkene er 5-7 min (i vår hånds). Innsats må tas for å identifisere egg kamre viser skadet vev som vil bli ekskludert fra analysene. Vevsskade som følge av disseksjon kan omfatte unødig tomrom (* i figur 9A, som er identifisert ved mangel på signal), hakk / tårer (* i figur 9B, som er identifisert ved mangel på signal), eller deformering av egg kamre (* i figur 9C). Imidlertid bør enhver meningskammeret deformasjon som følge av den eksperimentelle manipulasjon vurderes nøye. Selv om ingen dekkglass benyttes på toppen av levende vev i protokollen beskrevet, utflating av de ovarioles kan oppstå med utilbørlig trykk påført vevet, mens erte eller monterings (* i figur 9D). Den utflating av ovarioles har ikke blitt observert med faste prøver, ettersom protokollen beskrevet innebærer fastsettelse av vev umiddelbart etter disseksjon, med teasing oppstår etterpå. Enhver isolert egg kammer uten skriftene til aforementioned skade kan betraktes som normale. Mekaniske skader potensielt følge av disseksjon kan også føre til tap av GFP, som gir falske GFP-negative kloner 16, og kan også gi opphav til økt fargestoff innlemmelse. Gitt at kimlinje-cellene som befinner seg på innsiden av egg kamre er vanligvis ikke gjennomtrengelige for de levende mitokondrie fargestoffer (figurene 6 og 7), kan den forbedrede mitokondrielle farging av Drosophila kimlinje-celler er et resultat av en økning i permeabiliteten av den skadede / døende vev; en slik gjenstand opptrer med mito-ROS fargestoff (** i figur 9C og hele ovariole på figur 9D), så vel som med andre levende mitokondrielle flekker (ikke vist). Tapet av UbiGFP i figur 9D (*) kan også skyldes skader som forårsaket utflating av egg kamre. Selv om andre egg kamre i den skadede ovariole kan forbli autentisk og artefakt gratis (# i figur 9C

Tid følsomhet: I tilfelle av levende ex vivo mikroskopi, bør data som opp- nås innen 15 minutter av vev montering; Ellers kan de eksperimentelle resultatene bli påvirket av endringer av fysiologi på grunn av den påfølgende død av vev. Noen ganger, avhengig av lasereffekten og andre søkeparametre, de 10 ul av monteringsmedium kan fordampe raskere enn 15 min. Påvisningen av den mitokondrielle Cyclin E basseng ved ko-immunfarging krever minimalisering av disseksjon tid (sannsynligvis på grunn av forbigående natur av mitochondrial Cyclin E basseng som blir vedlikeholdt av aktiv mitokondriell respirasjon 12). En vesentlig mitokondrie Cyclin E bassenget ble heller ikke observert med Permeabilization ganger mindre enn 30 min.

FLIP: Bevegelsen av noen egg kammer som undersøkes i løpet av FLIP tidsforløp kan føre til kunstig analyser og dermed må utelukkes. Bruk av levende mitokondrielle fargestoffer eller TMRE er ikke anbefalt i en FLIP eksperiment, siden innlemmelse av den utenlandske fargestoff kan endre mitokondrie kontinuitet og dermed føre til kunstig resultater.

Drosophila kryssing strategi: Tverr gjensidige den som er beskrevet her (hvor hanner bærer Drp1 mutant allel benyttes) ikke gir mange avkom, sannsynligvis på grunn av en uidentifisert virkningen av Drp1 undertrykkelse i heterozygot hann foreldre.

Tolkning av klonal data: Eventuelle GF-negative kloner påvist i kontroll eggstokkeneisolert fra foreldre Drosophila uttrykke UbiGFP skulle tilsi kunstig falske negative kloner, sannsynligvis generert på grunn av GFP tap som følge av skade under disseksjon 16. Ikke desto mindre bør antallet av GFP-negative kloner i varmesjokkerte avkom av et innlegg være betydelig høyere enn noen falske-negative kloner sett i kontrollene. Klonene som genereres i Drosophila follicle cellelaget ved den beskrevne mitotiske rekombinasjon baserte strategien kan oppstå fra den mitotiske follicle stamceller (stamcelle kloner) eller fra den mitotiske ikke-stammen hårsekkceller (forbigående kloner). For stilk cellekloner, bør de eksperimentelle analysene utføres bare 10 dager etter varmesjokk, når egget kamre med transient kloner har allerede blitt lagt. For transiente kloner, må analysene utføres innen 6 dager etter varmesjokk, med follicle-cellekloner av ovarioles uten follicle-celleklon i germarium.

Modifikasjoner og feilsøking

Mens vurdere mitokondrie potensial per masseenhet ved hjelp av den beskrevne metoden, må man være oppmerksom på mulige gjenstander som følge av mikroskopet optikk eller mitokondrielle fargestoff kombinasjoner. En region som viser et svekket signal fra den generelle mitokondrie flekk og en forholdsvis forhøyet TMRE signal (figur 5A, *), kan oppstå på grunn av fluorescens-resonans energioverføring (FRET) mellom fargestoffer 8, eller på grunn av forskjellige optiske egenskaper av det røde (TMRE) og grønn (totalt mitokondrie fargestoff) lysrør, gitt en fast pinhole størrelse i oppkjøpet oppsett. Den FRET-relaterte gjenstanden kan unngås ved å redusere fargestoffkonsentrasjonen, hvis mulig, mens kvantitative analyser kan utføres på fremspring på 2 - 3 påfølgende optiske skiver for å unngå den optiske gjenstanden. Også hvis en fluorescerende signal er oppdaget i crosstalk og cross-eksitasjonkanaler, må laseren og detektorinnstillingene justeres for å minimere signal i disse kanalene, noe som forventes å redusere fluorescerende signal i de optimale kanaler også.

Laser-indusert skadet fra reiterative fotobleking kan forårsake mitokondriell fragmentering og dermed forårsake mitokondriell diskontinuitet, hindrer en vellykket FLIP. Mistenkt fragmentering av mitokondrier under utførelsen av FLIP protokollen kan identifiseres ved å anskaffe høyere oppløsning med redusert pinhole (og styrke detektoren gevinst). Hvis fragmentering av mitokondrier er synlig merke under utførelsen av FLIP-protokollen, må strømmen til bleking laser reduseres og / eller intervallet mellom påfølgende blekemidler må økes. Hvis det er generell bleking i løpet av tidsforløpet av FLIP eksperimentet (signal fra den gule ROI i figur 3B og C), må den avsøkende laser justeres til et nivåsom gjør det mulig minimal eller ingen generell fotobleking.

For å unngå mulige gjenstanden på grunn av skade-indusert tap av GFP, kan GFP-positive kloner bli innført ved hjelp av MARCM strategi, etter den beskrevne varmesjokk-protokollen. Her, riktig Drosophila som skal brukes til korset er jomfru kvinnelige drpKG03815 FRT40A / CYO X mannlig Gal80 FRT 40A / CYO; kar-Gal4, UAS-CD8GFP / TM6 9. Den rette-vinge avkom skal brukes til klon generering ved hjelp av varme sjokk (som beskrevet i trinn 6).

Begrensninger av teknikken

A) Mens hårsekkceller som befinner seg på overflaten av de levende Drosophila egg kamre inkorporere de mitokondrielle fargestoffer, kimlinje cellene inne i egget kammeret unnlater å gjøre dette; kimlinje av de yngre stadier flekken svakt (figurene 5 og 6). B) Det levende ex vivo tissue mikroskopi må foretas innen 15 minutter for fullføring av flekker på eggstokkene isolert fra individ Drosophila, en av gangen. Siden eksperimentelle grupper skal behandles og avbildes på den samme dag, den totale tiden det tar for å oppnå statistisk signifikante data fra levende vev ex vivo-mikroskopi fra forskjellige forsøksgrupper er forholdsvis lengre enn de som oppnås fra faste vev. C) Vi bemerket at mito-ROS flekken var ikke veldig stabil i ex vivo Drosophila vev, sannsynligvis på grunn av forbigående art av ROS analytt den oppdager 17,15, som kan ligge til grunn for den manglende påvisning av signal fra alle Drp1 null kloner. Men noen biologisk relevans av variasjonen i mito-ROS flekker i Drp1 null celler / kloner kan ikke utelukkes, og må undersøkes nærmere. Legg merke til at den positive signalet fra mito-ROS flekken ikke kan bare reflektere økt superoksid men også den forbedrede mitokondrie eller cellular oksidativt miljø 15. D) Den samlede mitokondrielle flekken kan ikke brukes for de GFP-negativ eller positiv-GFP klonale eksperimenter, ettersom det fluorescerende spektrum av denne mitokondrielle flekken og GFP er utvisket. E) Den FLIP eksperiment designet for å analysere mitokondrie matrise kontinuitet ville kreve image oppkjøpet med en åpen pinhole som omfatter oppløsningen av mitokondrie strukturer.

Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder

Studerer mitokondrie struktur-funksjon forholdet er avgjørende for en grundig forståelse av de regulatoriske mekanismer for mitokondrie funksjonalitet. Fordi mitokondrie defekter bidra vesentlig til ulike sykdommer, blant annet diabetes, kreft, Parkinsons sykdom, en detaljert forståelse av mitokondrie modus operandi holder løftet om facilitating utvikling av mitokondrier-rettet terapeutiske strategier. Levende celle mikroskopi er et uunnværlig verktøy for å studere den mitokondrielle struktur-funksjon forholdet. Men de fleste av disse studiene har vært begrenset til isolerte celler. Studiet av mitokondrie struktur og funksjon har blitt utvidet til å leve Drosophila vev i en ex vivo oppsett 9. Den beskrevne protokoll fra denne og beslektede studier vil føre til en forståelse av mitokondriell struktur og funksjon i levende Drosophila eggstokker, ex vivo, slik at en forståelse av mitokondrier i en fysiologisk sammenheng. Denne eks vivo tilnærming har betydelige fordeler i forhold til in vitro studier, ettersom regulering av metabolske og energetiske egenskaper av mitokondrier i en gitt celle er i stor grad avhengig av næringsstoffer og passende signalering i fysiologisk sammenheng av cellene.

Genetisk manipulering av mitochondrial struktur ved å undertrykke den mitokondrielle fisjons proteinet Drp1 deregulates cellesyklusen modulatoren Cyclin E og påvirker utviklingen av Drosophila eggstokkfollikelen cellelaget 9,12. Her omfatter protokoll en beskrivelse av hvordan å innføre funksjonelt null kloner av Drp1 i Drosophila eggstokkene å studere mitokondrie struktur-funksjon forholdet. En ny pool av mitokondriell Cyclin E på pattedyrceller, så vel som Drosophila follicle cellelaget 12, har blitt påvist, noe som sannsynligvis ligger til grunn for den rapporterte Cyclin E regulering av mitokondrier 18. Her viser manuskriptet en fremgangsmåte for å påvise den nye mitokondrielle Cyclin E basseng ved ko-immunfarging fast Drosophila eggstokker for dCyclinE og en mitokondriell markør (ATP-B).

Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken

gitt tlue Drosophila melanogaster er en kraftig genetisk modellsystem, er våre beskrevne metoder antatt å bidra vesentlig til forståelsen av den genetiske basis av mitokondrielle struktur-funksjon relasjonen for helse og sykdom. Drosophila har vært mye brukt for å lokke ut de genetiske interaksjoner som fører til tumorigenesis 19. Evnen til generasjon av kloner i Drosophila epithelial hårsekken celle laget gjør studiet av samspillet mellom mitokondrier og onkogener eller tumor dempere i enkelte tumorigen kloner i en in vivo og ex vivo oppsett. De beskrevne fremgangsmåter kan anvendes for å studere reguleringen av mitokondriell struktur-funksjonsforholdet på eggstokkene isolert fra passende mutant Drosophila. De beskrevne metoder kan bli ytterligere utvidet til å studere den direkte effekten av ulike næringsstoffer og vekstfaktor signalering på mitokondriestruktur og funksjon gjennom exogenous tilsetning av egnede næringsstoffer og / eller vekstfaktorer i ex vivo avbildning medium. De beskrevne fremgangsmåter kan hensiktsmessig modifiseres og anvendes i andre isolerte Drosophila vev, som larve imaginal plater, som har vært mye brukt for å studere signaltransduksjonsveiene i sykdommer som kreft 20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  2. Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337, (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. (2013).
  4. Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23, (4), 427-434 (2011).
  5. Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
  6. Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17, (4), 491-506 (2013).
  7. Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
  8. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 21-21 (2010).
  9. Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197, (4), 487-497 (2012).
  10. Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33, (2), 124-134 (2011).
  11. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  12. Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128, (22), 4171-4182 (2015).
  13. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (29), 11960-11965 (2009).
  14. Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30, (34), 11369-11378 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, (8), 983-1001 (2010).
  16. Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2, (12), 1313-1320 (2013).
  17. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, (1), 1-13 (2009).
  18. Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9, (6), 843-854 (2005).
  19. Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229, (1), 27-33 (2014).
  20. Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
  21. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, (2), 411-436 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics