Studiare mitocondriale Struttura e funzione in

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Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

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Abstract

Introduction

I mitocondri sono classicamente descritti come la centrale elettrica cellulare, dal momento che sono le principali sedi di produzione di energia nelle cellule differenziate. Inoltre, i mitocondri hanno un ruolo fondamentale nel metabolismo, la generazione di calore, la modifica dei lipidi, calcio e redox omeostasi, l'orchestrazione dei processi di segnalazione cellulare, ecc 1. I mitocondri anche svolgere un ruolo attivo nella induzione della morte cellulare 2, nonché nella regolazione del ciclo cellulare 3. Tale multifunzionalità pone le seguenti domande fondamentali: a) come fanno i mitocondri svolgono tutte queste funzioni contemporaneamente e b) ci sono piscine mitocondriali specifici o sottozone che sono specializzati per funzioni distinte? In questo contesto, è importante notare che i mitocondri multifunzionali sono dinamici nella forma, dimensioni, e la struttura all'interno delle singole cellule e che la forma a regime di mitocondri possono variare tra i tipi di cellule. Decenni di ricerca provenienti da varie laboratoriooratori suggeriscono che l'alterazione della forma mitocondriale, le dimensioni e la struttura, chiamati collettivamente dinamiche mitocondriali, è fondamentale per mantenere le varie funzioni mitocondriali 4,5,6. Questi risultati sollevano la possibilità che i mitocondri possano compiere la loro multifunzionalità in virtù della loro dinamismo strutturale.

Ampi sforzi sono in corso per capire il rapporto struttura-funzione mitocondriale. La dinamicità della struttura mitocondriale viene mantenuta principalmente dalla loro capacità di subire eventi di fissione e fusione con l'altro. Fissione di grandi mitocondri li converte in elementi mitocondriali più piccoli, mentre la fusione tra due mitocondri piccoli li fonde in un elemento mitocondriale grande 7. Inoltre, può verificarsi la fusione transitorio di due mitocondri per consentire la miscelazione del loro contenuto. La fissione e fusione eventi delle membrane mitocondriali interne ed esterne sono attentamente regolate da specificheific imposta di proteine. Il macchinario nucleo fissione è composto dynamin-related protein 1 (DRP1), che viene assunto dal citosol ai mitocondri dalla sua interazione con certa bona proteine mitocondriali fide (ad esempio, Fis1 o Mff1), mentre la funzione DRP1 può anche essere regolata altre proteine sulla superficie mitocondriale 4. Anche se DRP1 opera sulla membrana esterna, la sua capacità di fissione impatto la membrana interna pure. L'orchestrazione della fissione delle membrane mitocondriali esterne ed interne non è ben compreso. D'altra parte, la fusione della membrana interna è regolata al centro dalle attività di OPA1, mentre mitofusins regolano la fusione della membrana esterna 5. Il saldo dei fissione e fusione di contrasto eventi di mitocondri dettare la forma mitocondriale stato stazionario in una cella. Ad esempio, la repressione di fissione mitocondriale comporterebbe fusione completa e senza opposizione, mentre l'eccessiva attività dei mitocondril fissione comporterebbe la frammentazione dei mitocondri 3.

Lo studio della relazione struttura-funzione mitocondriale coinvolge principalmente due approcci complementari: a) analisi dei fenotipi cellulari e organismal dopo la manipolazione genetica delle proteine ​​fissione / fusione mitocondriali e b) le valutazioni diretti di struttura e funzione mitocondriale. È interessante notare che le analisi genetiche non sempre rivelare la funzionalità diretta della molecola in questione (in questo caso, mitocondriale proteine ​​fissione / fusione), come i fenotipi possono sorgere a causa di effetti secondari. Pertanto, è di fondamentale importanza per sviluppare e utilizzare strumenti per studiare la struttura e la funzione mitocondriale direttamente. Qualsiasi valutazione della struttura dei mitocondri coinvolge vari strumenti di microscopia. L'uso della microscopia a fluorescenza delle cellule vive è notevolmente avanzato gli studi di dinamiche mitocondriali, dal momento che il dinamismo mitocondriale può essere controllato sia qualitativamente che Quantitätvamente utilizzando gli strumenti e le tecniche di microscopia a fluorescenza 8 appropriate. Strumenti microscopia a base di fluorescenza sono stati sviluppati per studiare la struttura e la funzione mitocondriale in tessuti Drosophila melanogaster vivi e fisse, chiarire il significato di dinamismo mitocondriale in vivo 9. Questi e metodi relativi sono descritti qui, con l'obiettivo di studiare la struttura e la funzione mitocondriale nelle ovaie Drosophila.

L'ovaio Drosophila è composto da germinali e somatiche lignaggi, che derivano dalle rispettive cellule staminali adulte che si trovano nel germarium 10,11. Sedici cellule germinali sinciziale (GCS) vengono incapsulati dalle cellule follicolari somatiche (FC) per formare singole camere d'uovo che emergono dalla germarium (Figura 1). Uno dei 16 CV ottenere impegna a diventare un ovocita, e il restante 15 CV svilupparsi in cellule infermiere che supportano la crescita della camera di ovociti, Facilitando la maturazione dell'uovo prima che venga deposto. La maggior parte degli FC subiscono 9 turni di divisioni mitotiche, prima di uscire dal ciclo cellulare mitotico a differenziarsi terminale in uno strato di cellule epiteliali modellato costituito da cellule anteriore follicolo (AFCS), cellule posteriore follicolo (PFC), e principali cellule del corpo (MBC) . Le camere di uova consecutivi sono collegati da cellule gambo, che si differenziano le cellule che sono anche derivati ​​da FC nelle prime fasi di sviluppo. Forma mitocondriale regolato dalla proteina DRP1 fissione mitocondriale è attivamente coinvolto nel processo di differenziazione durante il normale sviluppo del ovarico strato di FC Drosophila 9,12. I metodi utilizzati in questi studi per identificare il coinvolgimento di DRP1 in Drosophila sviluppo strato di cellule del follicolo sono descritte qui.

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Protocol

1. Preparazione di Drosophila (gli strumenti necessari sono descritte nella Figura 2A)

  1. Per qualsiasi degli esperimenti descritti, raccogliere Drosophila (mantenuta a temperatura ambiente, o 25 ° C) entro 5 giorni di eclosion e metterli in una fiala riempita di 5-7 ml di Drosophila cibo (vedi Materiali Tavolo), con non più di 25 mosche in ogni fiala; mantenere un rapporto femmine: maschi di 2: 1.
  2. Cospargere una piccola quantità di lievito granulato per stimolare la produzione di uova di Drosophila. Eseguire manipolazione sperimentale entro 2 - 4 giorni.

2. La dissezione di Drosophila ovaie (gli strumenti necessari sono descritte nella Figura 2A)

  1. Warm insetto dissezione di media (vedi Materiali tabella) a temperatura ambiente, 25 ° C. Riempire tre pozzi di un bambino di otto-ben piatto di vetro dissezione, con 200 ml di mezzo in ogni bene.
  2. Anestetizzare Drosophila con CO Drosophila in un momento in cui l'esecuzione di microscopia in tensione.
  3. Mentre guardando attraverso l'oculare del microscopio dissezione, separare il torace dall'addome con due coppie di pinze. Utilizzando le pinze, trasferire accuratamente l'addome al secondo pozzo del piatto.
  4. Utilizzare una coppia di pinze per tenere l'addome alla fine posteriore, e lentamente spingere le ovaie out (insieme agli altri contenuti addominali) con l'altra coppia di pinze. Se questo tentativo non riuscire, rimuovere con attenzione l'esoscheletro addominale inserendo la pinza nella estremità anteriore per rilasciare le ovaie.
  5. Utilizzando le pinze, tenere un ovaio individuo dalla fine posteriore opaca (vale a dire, le uova tuorlo-riempita, in fase avanzata) e spostarlo attentamente il terzo pozzo del piattoper giro ad elaborarlo per microscopia diretta (step 3) o per il fissaggio di eseguire immunostaining (passaggio 7).
  6. prendere in giro con cautela la guaina protettiva intorno alle ovaie da spazzare un ago presa in giro con leggerezza dal posteriore alla estremità anteriore di ciascun ovaio, mentre tenendolo per l'estremità posteriore con un paio di pinze.
    NOTA: per ridurre al minimo i danni durante il prendere in giro, piegare la punta dell'ago e zoomare su ciascun ovaio, aumentando l'ingrandimento del microscopio (Figura 2A). Teasing dovrebbe essere sufficiente a rompere la guaina efficace, ma deve anche essere fatto con attenzione per preservare l'integrità dei ovarioli.

3. Preparazione per microscopia Live-tessuto

NOTA: Gli strumenti necessari sono descritte nella Figura 2A.

  1. Prima di Drosophila dissezione, preparare polyl-Lisina camere rivestite. A tal fine, posizionare due gocce 20 microlitri di polyl-lisina (0,1 mg / mL) sul coverglass (14 mm, No. 0) di una piastra di Petri con fondo (35 mm) ad una ragionevole distanza l'uno dall'altro per evitare la fusione delle gocce. Far asciugare le piastre per 1 ora a 37 ° C e segnare i bordi della pellicola bianca polyl-lisina sul lato inferiore della piastra con un pennarello cancellabile.
    NOTA: Il polyl-lisina rivestite camere possono essere conservati a 4 ° C per una settimana. Se si utilizza una camera precedentemente rivestito, portarlo a temperatura ambiente prima di iniziare la dissezione Drosophila.
  2. Impostare i parametri di scansione sul microscopio confocale per assicurarsi che il campione può essere ripreso immediatamente dopo il completamento della dissezione e di montaggio, come sotto.
  3. Mettere una dissezionato e preso in giro dell'ovaio (dopo la fase 2 e macchiato, se necessario, seguendo passo 5) su una regione di polyl-lisina rivestite marcata e diffondere l'ovaio con l'ago presa in giro per separare i ovarioli. Mettere una goccia 10 ml di mezzo di dissezione insetto sulla parte superiore delle ovaie, avendo cura di coprire tha un'area complessiva di polyl-lisina-rivestito. Coprire la capsula di Petri.
  4. Subito effettuare microscopia confocale del campione montato a temperatura ambiente.
    NOTA: Solo un Drosophila dovrebbe essere sezionato, trasformato, e ripreso in un momento. Inoltre, la microscopia non deve essere eseguita a 37 ° C, che simulare un ambiente shock termico per il tessuto Drosophila.

4. Perdita Fluorescence In Photobleaching (FLIP) Assay per valutare mitocondriale Matrix Continuità

NOTA: mitocondriale continuità matrice in una struttura mitocondriale fusa viene stabilita dopo la fusione completa delle membrane interna ed esterna mitocondriale seguenti una progressione attraverso i passaggi intermedi. Fissione dei mitocondri può seguire la stessa procedura, ma in senso inverso (Figura 3A). FLIP è un metodo semi-quantitativa microscopia a base time-lapse che può essere utilizzato per valutare la continuità mitocondriale matrice neldef stato fuso di ex vivo mitocondri (punti 3 e 4 nella figura 3A) in vivo ovaie Drosophila 9. Il dosaggio FLIP viene eseguita come una piccola regione di interesse (ROI) dei mitocondri esprimono una molecola fluorescente nella matrice mitocondriale che viene fotodecolorate a intervalli regolari (FLIP ROI in Figura 3A). Come risultato, ogni regione circostante mitocondriale che è continua con la ROI FLIP (ROI sperimentale nella Figura 3A) perderà segnale dovuto allo scambio di molecole nella matrice mitocondriale continuo. Gli esperimenti FLIP dimostrato qui vengono eseguite su transgenici Drosophila esprimere mitoYFP, che contiene la sequenza di targeting mitocondriale del citocromo ossidasi subunità VIII umano contrassegnate con YFP di indirizzare alla matrice mitocondriale in una forma liberamente diffusibile. Un esperimento simile può anche essere eseguita con il transgene mito pUASP-mito-GFP, come riportato in precedenza <sup> 9. Un simile protocollo FLIP può essere utilizzato con una sonda mirato allo spazio inter-membrana mitocondriale per essere in grado di rilevare la continuità risultante dalla fusione del esterno, ma non le membrane mitocondriali interne (fase 2 nella Figura 3A).

  1. Aprire il software di acquisizione delle immagini sul microscopio confocale e impostare i parametri di scansione appropriati nella scheda "Acquisizione" (Tabella 1). Controllare la serie "Time", "imbianchimento", e "scatole Regioni" per aprire le singole schede. Mettere i valori dei parametri di acquisizione appropriati in ogni scheda (Tabella 1).
    NOTA: Il foro stenopeico dovrebbe essere lasciata aperta, in quanto questo esperimento è stato progettato per monitorare segnale complessivo da tutta la popolazione mitocondriale in singole cellule.
  2. Utilizzare l'oculare di individuare rapidamente il campo di interesse per il tessuto vivo montato.
    NOTA: Selezionare le ovarioli che sono ben distribuiti sul vetro-bottomed piatto, dal momento che la microscopia confocale non può essere eseguita su ovarioli galleggianti.
  3. Fare clic su "live" per acquisire una immagine dal vivo del campo selezionato di interesse. Fai clic su "stop" per interrompere la scansione diretta.
  4. Se necessario, regolare i parametri di acquisizione in modo tale che il segnale fluorescente rilevata è al di sotto dei livelli di saturazione (indicati per l'assenza di pixel rossi quando l'opzione "indicatore di gamma" è selezionata), con lo sfondo definito come stabilito regolando i valori di offset.
  5. Disegnare una piccola ROI utilizzando lo strumento di disegno Bézier dalla scheda "Regioni" per delimitare la zona di photobleaching sull'immagine acquisita attraverso la scansione diretta.
    NOTA: La dimensione della ROI dovrebbe essere di circa 20 - 50% del segnale di fluorescenza mitocondriale totale all'interno della cellula.
  6. Eseguire l'acquisizione delle immagini cliccando su "start esperimento."
  7. Quantificare l'intensità di fluorescenza utilizzando il proprietario o il software open-source (vedi MaterialiTabella). Registrare il segnale media del ROI in cui si rivolge lo sbiancamento ripetitivo (FLIP); la ROI dove sbiancamento non è stato eseguito nella stessa cella (Sperimentale); il ROI da un'altra cella greggio nello stesso campo di vista, per valutare lo sbiancamento generale durante il periodo di sperimentazione (sbianca); e il ROI sull'area sfondo (background). Sottrarre il segnale di fondo medio ottenuto dal segnale medio nell'altra ROI. Normalizzare il segnale fluorescente con il segnale iniziale pre-candeggina per la rispettiva cella.
  8. Tracciare i dati normalizzati utilizzando qualsiasi software di tracciato standard.

5. La colorazione fluorescente live con mitocondriale Coloranti

NOTA: la struttura dei mitocondri stabilizzati e delle potenzialità possono essere valutati utilizzando coloranti che incorporano nei mitocondri in particolare in cellule vive e tessuti. Live ovaie Drosophila possono essere colorati ex vivo con mitocondriale fluorescentemacchie di visualizzare i mitocondri, per valutare le specie reattive dell'ossigeno mitocondriali (mito-ROS), e per valutare il potenziale mitocondriale per unità di massa. Questo può essere ottenuto mediante co-colorazione con l'estere mitocondriale potenziometrico colorante tetramethylrhodamine etile (TMRE) e una macchia mitocondriale vivo compatibili che rappresenta la massa mitocondriale (vedi Materiali Tavolo per i coloranti specifici).

  1. Diluire lo stock delle macchie di insetto caldo sezionare medio alle concentrazioni di servizio definitivo: macchia mitocondriale, 250 Nm; TMRE, 50 Nm; e Mito-ROS macchia, 5 micron.
  2. Dopo la dissezione e prendere in giro le ovaie seguente punto 2, inserire le ovaie in 200 ml di una particolare soluzione colorante in un pozzo di un piatto dissezione. li Incubare per 10 minuti con il piatto coperto da una scatola adatta avvolto con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Lavare le ovaie colorati con spostandoli con cura con una pinza in 3 pozzi consecutivi contenentg mezzo senza macchia.
  3. Per la co-colorazione con TMRE e la macchia mitocondriale globale compatibile, seguire il protocollo di cui sopra a macchia prima con TMRE e poi subito con la macchia mitocondriale complessiva (senza fasi di lavaggio in mezzo).
  4. Montare le ovaie su un piatto fondo di vetro Polyl-lisina rivestito passo successivo 3 e prepararsi per la microscopia confocale con i parametri di scansione appropriati (Tabella 1), seguendo i passaggi 4,2-4,4.
    NOTA: Il segnale proveniente dai coloranti incorporati non durò quando si tenta di montare i campioni macchiati nel mezzo di montaggio.
  5. Selezionare la casella Z-sezionamento per aprire la scheda. Girare la ruota attenzione verso la parte inferiore del campione mentre è in fase live-scansione e cliccare su "set prima" per definire il più in basso Z-sezione. Fare lo stesso mentre si muove la ruota attenzione verso l'altra direzione per definire la sezione più in alto.
  6. Eseguire l'acquisizione delle immagini cliccando su "start esperimento."
  7. Quantificare l'intensità della fluorescenza di fondo corretta dai ROI per il segnale di fondo e le singole celle (come al punto 4.7) e tracciare i dati utilizzando qualsiasi software di tracciato.

6. Generazione di DRP1 Null Mosaici

NOTA: La strategia clonale utilizzato qui introduce verdi proteina fluorescente (GFP) -negativi DRP1 cloni nulli sullo sfondo di un GFP-positive, fenotipicamente wild-type sfondo che è eterozigote genotipicamente per l'DRP1 null mutazione 9. Da shock termico indotto bersaglio riconoscimento flippase-flippase (FLP-FRT) mediata site-specific mitotico ricombinazione crea cloni omozigoti dell'allele drpKG03815 funzionalmente nullo. Il genotipo di Drosophila portare il mutante DRP1 è drpKG03815 FRT40A / CYO, mentre il genotipo che porta la FLP shock termico indotto (hsFLP) e UbiGFP marcatore clonale è hsflp; NLS-GFP ubiquitina (UbiGFP) FRT 40A / cyo. Il genotipo della SEprole zionato della croce tra i genotipi di cui sopra è hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

  1. Sincronizzare la Drosophila per la raccolta vergine spostandoli in nuovi flaconi di cibo fresco ogni 2 o 3 giorni. Monitorare le fiale pupariating giornaliera al fine di raccogliere femmine vergini emergenti.
  2. Raccogliere, curly-ala femmine vergini dagli occhi rossi dal genotipo mutante DRP1 ogni giorno, una volta al mattino e una la sera, e metterli in un flacone separato. In parallelo, la raccolta di sesso maschile Drosophila con gli occhi rossi scuri e le ali diritte che trasportano hsflp e UbiGFP entro 5 giorni di eclosion.
  3. Impostare una croce aggiungendo i maschi alle femmine vergini con un rapporto femmine: maschi di 2: 1.
  4. Spruzzare una piccola quantità di lievito granulato per stimolare la produzione di uova.
    NOTA: spostare con cautela la Drosophila per una fiala fresca dei media ogni 2 o 3 giorni di tempo per aumentare la quantità di prole e per ridurre l'affollamento fiala.
  5. Unesthetize, ordinare e raccogliere direttamente dalle ali, progenie femminile occhi rossi entro 5 giorni di eclosion.
  6. Per lo shock termico, posizionare la Drosophila raccolto in fiale vuote con una piccola quantità di lievito granulata e un piccolo, morbido pulire (per assorbire l'umidità durante lo shock termico). Posizionare la fiala con il Drosophila in un bagno di acqua a 38 ° C per 1 h, per generare cloni principalmente follicolo, ea 37 ° C per 1 h due volte al giorno (in modo che almeno 5 h tra gli shock 2 calore) per 2 giorni consecutivi , per generare sia linea germinale e cloni di cellule del follicolo.
    NOTA: Assicurarsi che il flaconcino è completamente sommerso in acqua fino al livello della spina.
  7. Lo shock termico può rendere il immobile Drosophila. Lasciare che la Drosophila calore scioccato per recuperare per 1 ora a temperatura ambiente quando diventano di nuovo mobile.
  8. Aggiungere i maschi di nuovo alle femmine nella stessa proporzione, come nella croce, e spostarli fiale freschi con medium spruzzato con una piccola quantità di lievito granulato. Mantenere la Drosophila per almeno 5 giorni.
  9. Sezionare ovaie come necessario per un esperimento in tensione o fisso.
    NOTA: ovaie isolati dal parentale Drosophila esprimere UbiGFP dovrebbero essere utilizzati come controlli negativi per confermare l'induzione efficiente di cloni GFP-negativo dallo shock termico.

7. Co-immunocolorazione per ciclina E e I mitocondri

NOTA: Per rilevare Drosophila ciclina E (dCyclinE), abbiamo utilizzato un anticorpo commerciale ottenuto in rilievo in particolare contro dCyclinE 9 (vedi Materiali Tavolo). Come marcatore mitocondriale, abbiamo utilizzato un anticorpo contro ATP-B (una subunità del complesso mitocondriale ATP sintasi) 9.

  1. Warm 4% paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente, 25 ° C. Attenzione! Paraformaldeide è tossico.
    NOTA: Dopo l'aperturala fiala, PFA deve essere conservato a 4 ° C e utilizzata entro 7 giorni. Questo perché stoccaggio di PFA può consentire l'ossidazione di metanolo, che drammaticamente alterare membrane mitocondriali durante la fissazione, anche se presenti in tracce.
  2. Subito dopo la dissezione, fissare le ovaie sezionati mettendoli in 200 ml di fresca PFA in un pozzo di un piatto di vetro dissezione (senza prendere in giro). Tenere il piatto in una cappa aspirante per 15 min. Lavare le ovaie fissati spostandoli delicatamente con la pinza in 3 pozzetti consecutivi, ciascuna contenente 200 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS).
    NOTA: L'esperimento può essere fermato qui ed i campioni possono essere lasciati a 4 ° C per 1 giorno.
  3. Tease le ovaie più a fondo in PBS (simile al punto 2.6) per rimuovere con attenzione la guaina fibrosa protettivo che possono ostacolare l'accesso antigene dell'anticorpo.
  4. Permeabilize le ovaie presi in giro mettendoli in una provetta per microcentrifuga con 500 ml di appena fatte 0.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) e incubare per 30 min mentre a dondolo a 25 rpm.
    NOTA: Durante il dondolio, posizionare i tubi paralleli al movimento a dondolo; mettendoli perpendicolarmente può consentire al tessuto di aderire al tappo dei tubi, con conseguente perdita di tessuto.
  5. Per rimuovere il PBS-TX, posizionare i tubi microcentrifuga in un rack per consentire al tessuto di stabilirsi al fondo delle provette. li ispezionare visivamente e toccare i tubi, se necessario, per portare eventuali tessuti galleggiante verso il basso. Aspirare la soluzione attentamente dall'alto, assicurandosi che il tessuto nella parte inferiore dei tubi rimane indisturbata.
  6. Bloccare le ovaie aggiungendo 200 ml di 2% di albumina sierica bovina (BSA) sciolti in 0.5% PBS-TX, e incubare sul bilanciere a temperatura ambiente per 1 h. Rimuovere l'agente bloccante seguendo passo 7.5.
  7. Aggiungere anticorpi primari in 200 ml di agente bloccante fresco: anti-coniglio anticorpi dCyclinE (1: 100) e anti-topo ATP-B anticorpi(1: 100). Incubare i tessuti sul bilanciere per 2 ore a temperatura ambiente.
  8. Lavare le ovaie con PBS-TX 3 volte per 15 minuti ciascuno, seguendo passo 7.5.
  9. Aggiungere 200 ml di anticorpi secondari appropriate nella fresca PBS-TX: anti-topo-CY3 (1: 1.000) e anti-rabbit-CY5 (1: 500). Incubare sul bilanciere per 1 ha temperatura ambiente.
  10. Lavare le ovaie con PBS-TX 3 volte per 15 minuti ciascuno, seguendo passo 7.5.
  11. Per macchiare il DNA, aggiungere Hoechst (1: 1000 diluizione) alla finale di lavaggio PBS-TX.
  12. Infine, lasciare il tessuto in 500 ml di PBS 1x.
  13. Usando una micropipetta da 1 ml, togliere le ovaie immunostained dalla provetta da microcentrifuga in un pozzo fresco di un piatto di vetro dissezione contenente 200 ml di PBS.
  14. Aggiungere una goccia di soluzione di montaggio glicerolo basata su un vetrino e aggiungere ovaie immunostained uno ad uno per la soluzione di montaggio.
    NOTA: Assicurarsi che le ovaie sono infatti trasferiti al mezzo di montaggio. Non riuscendo a fare so porterà alla perdita di tessuto.
  15. Mentre guardando attraverso il microscopio dissezione, cogliere delicatamente le ovarioli trasparenti (stadi più giovani) dalle opache camere uovo maturo utilizzando l'ago presa in giro mentre si tiene la parte opaca delle ovaie con le pinze. Rimuovere le camere uovo maturo dal mezzo di montaggio.
  16. Inserire un coprioggetti (22 mm, No. 1) sulla slitta e premere leggermente per assicurare che il mezzo di montaggio si diffonde uniformemente sotto.
    NOTA: Premendo sul coprioggetti assicura anche il corretto allineamento del tessuto lungo il coprioggetti. Non riuscendo a farlo in modo ottimale può consentire le tappe più piccole di galleggiare nel mezzo di montaggio, impedendo la microscopia ottimale di tali tessuti.
  17. Asciugare i campioni per 15 minuti e sigillare i bordi del coprioggetti accuratamente con smalto.
  18. Eseguire microscopia confocale come per bisogno sperimentale (Tabella 1).

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Representative Results

I metodi descritti possono essere utilizzati per studiare la struttura e la funzione mitocondriale in ovaie Drosophila vivi e fissi (Figura 2B). A condizione sono alcuni esempi di risultati attesi ottenuti con i metodi descritti.

La dissezione delle ovaie Drosophila: Quando sezionato ulteriormente, gli addomi mozzate (Figura 3B) da tutta la Drosophila (figura 3A) dovrebbero rilasciare il contenuto addominale, di cui 2 ovaie da ogni singolo Drosophila. Le ovaie intatte appaiono come ovali, strutture bianche (frecce in Figura 3C e D) che idealmente dovrebbe rimanere attaccati l'uno all'altro attraverso il gambo tubarico. Le ovarioli in ogni ovaia devono essere tenute insieme dalla guaina fibrosa (# nella parte ingrandita di figura 3C), che viene eliminato by presa in giro attenta (freccia spessa nella figura 3D, * indica un ovario mal presi in giro con ovarioli staccati) per esporre le ovarioli per la colorazione e la microscopia. Le ovaie rilasciati con steli oviductal strappati durante il rilascio del contenuto addominale possono anche essere utilizzati, purché non siano altrimenti danneggiati. Qualsiasi ovaie danneggiate (* nella Figura 3C) e altri contenuti addominali (punta di freccia in Figura 3C) devono essere eliminati.

In diretta al microscopio delle ovaie Drosophila: Qui, dimostriamo la tecnica FLIP e il caricamento di coloranti strutturali e funzionali mitocondriali in ovaie di Drosophila.

La tecnica FLIP, precedentemente applicato per valutare la continuità mitocondriale nelle cellule del follicolo Drosophila 9, è stato dimostrato qui nelle cellule ovariche di infermiere transgenici Drosophila (Figura 4A). FLIP mirato ad una delle nuvole mitocondriali associati con le cellule infermiere porta ad una perdita superiore al 50% del segnale fluorescente dalla ROI blu e bianche che circondano la ROI FLIP rossa a 200 s (Figura 4B e C); il segnale del ROI verde è usato per la correzione del fondo. Il segnale fluorescente dalla ROI giallo nelle altre celle infermiere non mirati rimane costante durante questo intervallo di tempo, indicando imbianchimento complessiva minima durante il corso dell'esperimento, (Figura 4B, e C). Inoltre, vedere video 1. Questo risultato indica che i mitocondriin infermiere cellule sono fusi loro membrane esterne ed interne, esemplificati nelle fasi 3 e 4 (figura 4A), mentre i mitocondri nei passaggi 1 e 2 non dovrebbero mostrare alcuna perdita di fluorescenza in questo lasso di tempo.

È stato precedentemente dimostrato che una misura semi-quantitativa del potenziale mitocondriale per unità di massa mitocondriale può essere valutata mediante co-colorazione con il colorante potenziometrica TMRE e la macchia mitocondriale complessiva che riflette massa mitocondriale 13. Qui, la stessa tecnica è stata utilizzata per dimostrare la valutazione del potenziale mitocondriale per unità di massa nel tessuto ovarico Drosophila vivo. La microscopia confocale di vivo ovaie Drosophila colorati con TMRE dimostra una diminuzione del segnale con la profondità del tessuto (Figura 5A). Si prevede Questa perdita di segnale fluorescente a causa della crescente dispersione approfondire tessuto a verificarsi con qualsiasi tipo di fluoropHore con una data distanza di lavoro dell'obiettivo in uso. Pertanto, è importante discernere la profondità massima del tessuto entro cui il fluoroforo può essere rilevato durante l'imaging tessuto vivo. Ad esempio, vivere ovaie Drosophila colorati con la macchia mitocondriale complessiva (Mito) può essere ripreso utilizzando Impostazione del microscopio descritto (Tabella 1) in un intervallo di 20 micron dal vetrino, mentre la profondità massima stampabile decresce all'aumentare dimensioni camera delle uova (Figura 5B). Le impostazioni microscopio ottimizzate per le macchie mitocondriali rilevano segnali positivi nei canali di rilevamento appropriati, mentre le impostazioni di esaminare qualsiasi indebita del segnale di cross-talk o fluoroforo cross-eccitazione da aspettarsi rilevato minimo o nessun segnale (figura 6A). Co-colorazione TMRE con la macchia mitocondriale complessivo può essere utilizzato sia qualitativa (Figura 6B) e quantitativa (Figura 6C e D </ strong>) valutazioni del potenziale mitocondriale per unità di massa in tempo reale ovaie Drosophila. Ad esempio, a) una analisi qualitativa dimostra che la germarium Drosophila presenta maggiore potenziale mitocondriale per unità di massa in 2b fase in cui le cellule del follicolo somatiche sono sorti per incapsulare cellule germinali (teste di freccia in Figura 6B) e b) analisi semiquantitative dimostrano la differenza di potenziale mitocondriale per unità di massa tra AFC (estensibilità) e MBC, come analizzati da uno stadio 9 camera delle uova (figura 6C). Si noti che la quantificazione è stata eseguita da 2 diverse fette ottici per AFC e MBC, a seconda del loro piano di messa a fuoco. L'utilizzo della sonda mito-ROS che è stato usato con successo in Drosophila 14 è dimostrato in strati vivi Drosophila ovarici epiteliali cellule follicolo, dove funzionali cloni nulli della proteina mitocondriale fissione Drp1were introdotte. La maggior parte, buNon t tutte, le GFP-negativi DRP1 cloni di cellule del follicolo nullo dal vivo esibire elevata colorazione di mito-ROS (Figura 7A e B). Si noti che anche se un segnale mitocondriale distinti non poteva essere rilevato in questo tessuto, la concentrazione della macchia mito-ROS potrebbe essere rilevato nella regione nucleare nei avanzata cellule follicolari post-mitotici, che sono significativamente più grandi delle cellule follicolari mitotiche (* in Figura 7C). Ciò può verificarsi a causa dell'interazione del DNA nucleare e il prodotto di ossidazione fluorescenza del colorante mito-ROS, che è un derivato di etidio 15.

Rilevamento di mitocondriale ciclina E nelle cellule del follicolo ovarico fisse di Drosophila: E 'stato recentemente dimostrato che i mitocondri in grado di regolare la molecola ciclo cellulare ciclina E reclutando alla superficie mitocondriale in cellule di mammifero e lo strato di cellule del follicolo Drosophila di Drosophila follicolo 12. Qui, un esempio di localizzazione mitocondriale della ciclina E nelle cellule del follicolo di Drosophila è dimostrata utilizzando il protocollo di co-immunocolorazione descritto. Notare i livelli elevati di dCyclinE nelle DRP1 cloni nulli GFP-negativo in cui il segnale dCyclinE sovrappone con quella del segnale ATP-B mitocondriale nel germarium (Figura 8A), anche se il segnale non può essere risolto in elementi mitocondriali distinti con la risoluzione limitata di microscopia confocale. Inoltre, in MBC post-mitotici, le GFP-negativi DRP1 cloni nulli hanno entrambi i segnali dCyclinE nucleari e citosolici, con quest'ultimo significativamente sovrapposizione con il segnale ATP-B, mentre le cellule GFP-positive tipo selvatico hanno solo un segnale dCyclinE nucleare (Figura 8B).


Figura 1. Sviluppo delle Drosophila uovo Camere. Fumetto raffigurante un ovariole Drosophila costituito da una catena di sviluppo camere d'uovo, ciascuno composto da un oocita e le cellule germinali (infermiere) incapsulati dallo strato di cellule del follicolo (somatica). Le camere di uova si sviluppano dal germarium e si sviluppano attraverso le fasi in cui le cellule del follicolo mitotiche diventano post-mitotico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. piano sperimentale e preparazione. Strumenti (A) utilizzati nei metodi descritti: A. Fly fiala; B. insetti dissezione media; C. paraformaldeide; spazzola D. Fly; E. dissezione piatto; vetro F. copertina; tubo G. Microcentrifugare. piatto H. fondo di vetro; scivolo I. Vetro; J. 1000 microlitri micropipetta; K. 200 microlitri micropipetta; L. 2,5 microlitri micropipetta; M. Teasing ago con una punta piegata (punta è ingrandita); forcipe N. di spessore; forcipe O. sottili. (B) il flusso Un diagramma schematico che rappresenta i metodi descritti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. La dissezione di Drosophila ovaie. (A) anestetizzati intero Drosophila. (B) Severed Drosophila addomi con o senza (*) il contenuto addominale. (C) Rilasciato Drosophila contenuto addominale, tra cui le ovaie (frecce e *) e altri contenuti(punte di freccia); ingrandimento della regione scatola a destra evidenziando anteriore (formica) e posteriore (Post) estremità della coppia di ovaie ricoperti dal gambo tubarico, dove i ovarioli sono tenuti dalla guaina fibrosa (#). (D) Teased Drosophila dell'ovaio (marcatura freccia spessore opportunamente presi in giro e * marcatura mal presi in giro) rispetto a unteased dell'ovaio (freccia sottile). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Live-tessuto FLIP Assay. (A) Schema che rappresenta le fasi di mitocondriale fissione / fusione, che può essere valutata mediante un test di continuità mitocondriale appropriato utilizzando il metodo FLIP; in questo caso, una sonda mito-YFP nella matrice mitocondriale consente la assessmento di mitocondriale continuità della matrice. (B) Time-lapse ex vivo microscopia di un live transgenici Drosophila camera di uovo che esprime mito-YFP; solo punti di tempo selezionare (t) sono mostrati. Vedere Video 1 per tutti i punti di tempo. (C) Quantificazione del segnale fluorescente dal rispettivo ROI colorato in (B) sono espressi dopo la correzione di sfondo e la normalizzazione. Le frecce indicano i punti di tempo photobleaching reiterativi, mentre l'intervallo di tempo tra due eventi di sbiancamento consecutivi è il tempo di recupero. barra della scala: 10 micron. Le immagini sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. diretta mitocondril La colorazione e Microscopia della Drosophila Ovariole. (A) singole sezioni ottiche di un live ovariole Drosophila macchiato di TMRE; l'immagine è stata acquisita con i parametri descritti nella tabella 1. Z indica la distanza dal vetrino in micron. (B) Un live Drosophila ovariole caricato con la macchia mitocondriale complessiva (Mito). L'immagine XZ della linea rossa immagine XY in è visualizzato, dove B è la parte inferiore e T è la parte superiore dell'immagine acquisita. La distanza dal fondo alla linea blu è 20 micron. barra della scala: 20 micron. Le immagini confocali sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
FIGURA 6. Co-colorazione di vivere Drosophila ovarioli con TMRE e il mitocondriale complesso Stain. (A) fetta ottica singola di un live ovariole Drosophila co-macchiato con TMRE e la macchia mitocondriale complessiva (Mito); * Indica un manufatto sperimentale descritto nella sezione di discussione. (B) di proiezione massima intensità di 3 fette ottici consecutivi del germarium in (A); frecce indicano la regione dove la fluorescenza TMRE viene aumentata. (C) fetta ottica singola di post-mitotico camera di uovo co-macchiato con TMRE e la macchia mitocondriale generale. I pannelli superiore ed inferiore mostrano il piano di messa a fuoco per la AFC e MBC, rispettivamente. Plot (D) Box mostrando intensità della fluorescenza media di TMRE e la macchia mitocondriale complessiva quantificata dai singoli AFC e MBC nelle regioni in scatola in (C). I baffi del diagramma a riquadri indicano i valori massimi e minimi per ogni gruppo, escludendo i valori anomali. tabella 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. La colorazione a Live DRP1 Null Mosaico Drosophila ovarioli con il colorante Mito-ROS. (A) fetta ottica singola di ovarioli colorati con il colorante mito-ROS. (B) di proiezione massima intensità di 2 fette ottici consecutivi di una camera di uovo individuo con cellule del follicolo del Mitofase tic macchiato con il colorante mito-ROS. (C) fetta ottica singola di una camera di uovo individuo con cellule del follicolo nella fase post-mitotico macchiato con il colorante mito-ROS; * Indica un segnale nucleare. La mancanza di UbiGFP segna cloni nulli DRP1. barra della scala: 20 micron. Le immagini confocali sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8. Co-immunocolorazione di fisso DRP1 Null Mosaico Drosophila ovarioli con dCyclinE e anticorpi ATP-B. (A) proiezione di massima intensità di 3 fette ottici consecutivi di germarium co-immunostained. (B) di proiezione massima intensità di 3 fette ottici consecutivi di co-Immunosnuto MBC post-mitotico. I contorni delimitare le UbiGFP-negativi DRP1 cloni nulli. barra della scala: 10 micron. Le immagini confocali sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9
Figura 9. Esempi di eventuali danni e artefatti. (A) Germarium di UbiGFP esprimono ovariole fissate e colorate con il colorante Hoechst DNA che mostra le lacune non dovuti (*). (B) camera di uovo di UbiGFP esprimono ovariole fissate e colorate con il colorante DNA Hoechst mostrando nick / lacrime (*). (C) Live ovariole con DRP1 cloni nulli UbiGFP-negativi colorati con il colorante mito-ROS che mostra una camera deformata (*) e una camera di uova danneggiata, permettendo parziali colorazione della linea germinale (**); # Denota un vero e proprio forse macchia di una camera di uovo intatto nella stessa ovariole. (D) Live ovariole macchiato con il mito-ROS colorante che mostra una camera danneggiato generale con intensa colorazione artefatta della linea germinale. * Indica i danni indotti appiattito ovarioli con una perdita di segnale UbiGFP, dando così origine a cloni GFP-negativo artefatti. barra della scala: 20 micron. Le immagini confocali sono state acquisite con i parametri descritti nella tabella 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1. Live-tessuto FLIP Assay. L'andamento temporale completa del dosaggio FLIP photobleaching a base descritta nella figura 5..com / files / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere questo video. (tasto destro del mouse per scaricare).

Tabella 1: Impostazioni microscopio confocale per l'acquisizione delle immagini rappresentative presentate. Clicca qui per vedere Tabella 1. (tasto destro del mouse scaricare.)

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Discussion

I passaggi critici all'interno del protocollo

Photobleaching: Prevenire indebite photobleaching dei campioni fluorescenti è assolutamente necessario per l'esecuzione efficiente microscopia confocale. Pertanto, il tempo utilizzato per individuare i campioni attraverso l'oculare o per impostare i parametri di acquisizione di immagini attraverso la modalità di scansione dal vivo deve essere ridotto al minimo per ridurre al minimo photobleaching.

Il danno tissutale: Poiché i mitocondri sono considerati i sensori di salute cellulare, è estremamente importante assicurare che i dati ottenuti con i metodi descritti sono fisiologicamente rilevanti e non riflettono i danni indesiderati causati dal dissezione procedurale delle ovaie Drosophila. La dissezione deve essere effettuata il più rapidamente possibile, ma anche con estrema precauzione per minimizzare danni ai tessuti. Il tempo medio per la dissezione e la presa in giro di 5 Drosophila ovaie è 5-7 min (in nostra manoS). Sforzo deve essere presa per identificare camere di uova che mostrano il tessuto danneggiato che verrà esclusa dalle analisi. Il danno tissutale a causa di dissezione possono essere incompleti indebiti (* nella figura 9A, come individuati dalla mancanza di segnale), nick / lacrime (* in figura 9B, come individuati dalla mancanza di segnale), o deformazione delle camere d'uovo (* nella Figura 9C). Tuttavia, qualsiasi deformazione camera significativo derivante dalla manipolazione sperimentale deve essere attentamente valutato. Sebbene non coprioggetto è utilizzato sulla parte superiore del tessuto vivo nel protocollo descritto, appiattimento dei ovarioli possono verificarsi con indebita pressione applicata al tessuto mentre giro o montare (* in Figura 9D). L'appiattimento della ovarioli non è stato osservato con i campioni fissati, dal momento che il protocollo descritto comporta la fissazione di tessuti subito dopo la dissezione, con presa in giro che si verificano in seguito. Ogni camera di uovo isolato senza firme del aforementionedanni d può essere considerato normale. Danni meccanici potenzialmente derivanti da dissezione può anche portare alla perdita di GFP, producendo falsi cloni GFP-negativo di 16, e può anche dare luogo a una maggiore incorporazione colorante. Dato che le cellule germinali risiedono all'interno delle camere di uova non sono normalmente permeabili ai coloranti mitocondriali vivi (figure 6 e 7), la colorazione mitocondriale aumentata delle cellule germinali di Drosophila può risultare da un aumento della permeabilità del tessuto danneggiato / morte; tale manufatto si verifica con il colorante mito-ROS (** nella Figura 9C e tutta ovariole in figura 9D), nonché con altre macchie mitocondriali vivi (non mostrato). La perdita di UbiGFP nella Figura 9D (*) potrebbe anche derivare da danni che ha causato l'appiattimento delle camere uovo. Anche se altre camere d'uovo nel ovariole danneggiati possono rimanere autentico e artefatto libero (# nella Figura 9C

Sensibilità Tempo: Nel caso di vivo microscopia ex vivo, i dati devono essere ottenuti entro 15 minuti di montaggio dei tessuti; tuttavia, i risultati sperimentali possono essere influenzati da alterazioni della fisiologia causa della morte conseguente del tessuto. A volte, a seconda della potenza del laser e di altri parametri di scansione, i 10 ml di mezzo di montaggio possono evaporare prima di 15 min. La rilevazione della mitocondriale ciclina E piscina dal co-immunostaining richiede la minimizzazione del tempo dissezione (probabilmente a causa della natura transitoria del mitochondRial ciclina E piscina che è gestito da respirazione mitocondriale attivo 12). Una mitocondriale ciclina E piscina apprezzabile non è stato osservato anche con tempi di permeabilizzazione meno di 30 minuti.

FLIP: Il movimento di qualsiasi camera di uovo in esame nel corso tempo FLIP può portare ad analisi artefatti e, quindi, deve essere esclusa. L'uso di coloranti mitocondriali dal vivo o TMRE non è raccomandato in un esperimento di FLIP, dal momento che l'incorporazione del colorante straniero può alterare la continuità mitocondriale e portare a risultati artefatti così.

Drosophila strategia di attraversamento: Il reciproco croce a quello descritto qui (in cui vengono utilizzati i maschi che trasportano l'allele mutante DRP1) non produce molti figli, probabilmente a causa di un impatto non identificato di DRP1 repressione nei genitori maschi eterozigoti.

Interpretazione dei dati clonale: Qualsiasi cloni GF-negativi rilevati nelle ovaie di controlloisolato dal Drosophila genitori esprimendo UbiGFP indicherebbe artefatti falsi negativi cloni, probabilmente generate a causa della perdita GFP causato da danni durante la dissezione 16. Tuttavia, il numero di cloni GFP-negativo nella prole calore scioccata della croce dovrebbe essere significativamente superiore eventuali cloni falsi negativi osservati nei controlli. I cloni generati nello strato di cellule del follicolo Drosophila dalla strategia di ricombinazione basata mitotico descritto possono derivare da cellule staminali del follicolo mitotiche (staminali cloni cellulari) o dalle cellule del follicolo non-staminali mitosi (cloni transitori). Per i cloni di cellule staminali, le analisi sperimentali devono essere eseguite solo 10 giorni dopo lo shock termico, quando sono già state poste le camere d'uovo con i cloni transitori. Per i cloni transitori, le analisi devono essere eseguite entro 6 giorni dopo lo shock termico, con i cloni di cellule del follicolo dei ovarioli senza alcun clone di cellule del follicolo nella germarium.

Modifiche e risoluzione dei problemi

Mentre la valutazione del potenziale mitocondriale per unità di massa con il metodo descritto, si deve essere consapevoli dei potenziali manufatti derivanti dal ottica microscopio o combinazioni di tintura mitocondriali. Ogni regione che mostra un segnale indebolito dalla macchia mitocondriale complessiva e un segnale TMRE relativamente elevata (Figura 5A, *) può derivare fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) tra i coloranti 8 o dovuti a differenti proprietà ottiche del rosso (TMRE) luci fluorescenti e verde (colorante mitocondriale complessivo), data una dimensione foro stenopeico fisso nel setup di acquisizione. Il manufatto FRET correlati potrebbe essere evitato riducendo le concentrazioni di colorante, se possibile, mentre le analisi quantitative possono essere eseguite sulle proiezioni di 2 - 3 fette ottici consecutivi per evitare il manufatto ottica. Inoltre, se un segnale fluorescente viene rilevato nella diafonia e cross-eccitazionei canali, le impostazioni laser e rivelatore deve essere riadattato per ridurre al minimo il segnale in questi canali, che si prevede di ridurre il segnale fluorescente nei canali ottimali pure.

Indotta da laser danneggiato dal photobleaching reiterativo può causare la frammentazione mitocondriale e quindi causare discontinuità mitocondriale, impedendo un flip successo. frammentazione Sospettato di mitocondri durante l'esecuzione del protocollo FLIP può essere identificato con l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione con una pinhole ridotta (e migliorare il guadagno del rivelatore). Se la frammentazione dei mitocondri è visibilmente notato durante l'esecuzione del protocollo FLIP, la potenza del laser sbiancante deve essere ridotto e / o l'intervallo tra candeggianti consecutivi deve essere aumentata. Se c'è sbiancamento complessiva nel corso dell'esperimento, FLIP (segnale dal ROI giallo nella figura 3B e C), il laser a scansione deve essere regolato ad un livelloche permette minimo o nessun photobleaching generale.

Per evitare il potenziale artefatto dovuto alla perdita danni indotti di GFP, cloni GFP-positive possono essere introdotti utilizzando la strategia MARCM, seguendo il protocollo shock termico descritto. Qui, la Drosophila appropriato da utilizzare per la croce è femmina vergine drpKG03815 FRT40A / CYO X maschile Gal80 FRT 40A / cyo; vasca-GAL4, UAS-CD8GFP / TM6 9. La progenie dritto ala deve essere utilizzato per la generazione clone utilizzando scossa di calore (come descritto al punto 6).

LIMITI DELLA TECNICA

A) Mentre le cellule del follicolo che risiedono sulla superficie del live camere uovo di Drosophila incorporano i coloranti colorazione mitocondriale, le cellule germinali all'interno della camera di uova non riescono a farlo; linea germinale delle fasi più giovani macchia debolmente (figure 5 e 6). B) Il live ex vivo Tissue microscopia deve essere eseguita entro 15 min di completamento della colorazione sulle ovaie isolati da individuo Drosophila, uno alla volta. Dal momento che gruppi sperimentali devono essere elaborati e ripreso lo stesso giorno, il tempo totale impiegato per ottenere dati statisticamente significativi dal vivo ex vivo microscopia tessuto dai vari gruppi sperimentali è ragionevolmente più lungo di quelli ottenuti da tessuti fissati. C) Abbiamo notato che la macchia mito-ROS non era molto stabile nel tessuto ex vivo Drosophila, probabilmente a causa della natura transitoria del ROS analita rileva 17,15, che possono essere alla base della mancanza di rilevazione di segnale da tutti i DRP1 cloni nulli. Tuttavia, qualsiasi rilevanza biologica della variabilità a Mito-ROS colorazione nelle cellule nulle DRP1 / cloni non può essere esclusa e deve essere studiata ulteriormente. Si noti che il segnale positivo dalla macchia mito-ROS può non solo riflettere una maggiore superossido ma anche la maggiore mitocondriale o Cellular ambiente ossidativo 15. D) La macchia mitocondriale globale non può essere utilizzato per le GFP-negativo o GFP-positive esperimenti clonali, poiché lo spettro di fluorescenza questa macchia mitocondriale e GFP sono indistinguibili. E) L'esperimento FLIP progettato per saggiare mitocondriale continuità matrice richiederebbe l'acquisizione di immagini con una pinhole aperta che comprende la risoluzione delle strutture mitocondriali.

Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /

Lo studio della relazione struttura-funzione mitocondriale è fondamentale per una conoscenza approfondita dei meccanismi di regolazione della funzionalità mitocondriale. Perché difetti mitocondriali contribuiscono in modo significativo a varie malattie, tra cui il diabete, il cancro, il morbo di Parkinson, una conoscenza dettagliata del modus operandi mitocondriale mantiene la promessa di Facilităţing lo sviluppo di strategie terapeutiche mitocondri-diretto. microscopia Live-cell è uno strumento indispensabile per lo studio della relazione struttura-funzione mitocondriale. Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono stati limitati a cellule isolate. Lo studio della struttura e della funzione mitocondriale è stata estesa a vivere tessuti Drosophila in un setup ex vivo 9. Il protocollo descritto di questa e relativi studi porterà ad una comprensione della struttura e della funzione mitocondriale in vivo ovaie Drosophila, ex vivo, che consente di esaminare mitocondri in un contesto fisiologico. Questo approccio ex vivo ha vantaggi significativi rispetto studi in vitro, poiché la regolazione del metabolismo e proprietà energetiche di mitocondri in una data cellula dipende in gran parte dalla disponibilità di nutrienti e di segnalazione appropriata nel contesto fisiologico delle cellule.

La manipolazione genetica di miStruttura tochondrial reprimendo il mitocondriale DRP1 proteina fissione deregolamenta il modulatore ciclo cellulare ciclina E e colpisce lo sviluppo dello strato di cellule del follicolo ovarico Drosophila 9,12. Qui, il protocollo include una descrizione di come introdurre cloni funzionalmente nulli di DRP1 nelle ovaie Drosophila per studiare la relazione tra struttura e funzione mitocondriale. Un romanzo pool di mitocondriale ciclina E su cellule di mammifero, così come lo strato di cellule di Drosophila follicolo 12, è stato rilevato con successo, che probabilmente è alla base della regolazione ciclina E riportato da mitocondri 18. Qui, il manoscritto dimostra un metodo per rilevare il romanzo mitocondriale ciclina E piscina da co-immunocolorazione fisso ovaie Drosophila per dCyclinE e un marcatore mitocondriale (ATP-B).

Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica

t Datacappello Drosophila melanogaster è un potente sistema modello genetico, i nostri metodi descritti sono previsti per contribuire in modo significativo alla comprensione delle basi genetiche della relazione struttura-funzione mitocondriale in salute e malattia. Drosophila è stato ampiamente utilizzato per prendere in giro le interazioni genetiche che portano alla tumorigenesi 19. La capacità della generazione di cloni nello strato di cellule epiteliali del follicolo Drosophila permette lo studio dell'interazione di mitocondri e oncogeni o soppressori tumorali nei singoli cloni tumorali in un in vivo ed ex vivo configurazione. I metodi descritti possono essere utilizzati per studiare la regolazione del rapporto struttura-funzione mitocondriale sulle ovaie isolati da adeguata Drosophila mutante. I metodi descritti possono essere ulteriormente estesi per studiare l'impatto diretto di vari fattori nutrienti e la crescita di segnalazione sulla struttura e la funzione mitocondriale attraverso il exogendogeni aggiunta dei nutrienti appropriati e / o fattori di crescita nel medio vivo ex imaging. I metodi descritti possono essere opportunamente modificate ed impiegati in altri tessuti isolati Drosophila, come i dischi immaginali larvali, che sono stati ampiamente utilizzati per studiare trasduzione del segnale in malattie come il cancro 20,21.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

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References

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