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 JoVE Biology

栽培

1, 1, 1

1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

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    Summary

    我们提出了一个简单的方法来构建三维线虫培养系统称为NGT-3D和NGB-3D。这些可以被用来研究在更类似于天然线虫栖息比标准2D实验室线虫培养板栖息线虫健身和行为。

    Date Published: 12/12/2016, Issue 118; doi: 10.3791/55048

    Cite this Article

    Lee, T. Y., Yoon, K. h., Lee, J. I. Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory. J. Vis. Exp. (118), e55048, doi:10.3791/55048 (2016).

    Protocol

    1.准备NGT-3D和NGB-3D解决方案

    1. 准备以下的无菌溶液:1升的0.1454摩尔NaCl溶液中,1升的1M的CaCl 2,1升的1M 硫酸镁的,LB培养基(LB),1升1M的KPO 4缓冲液(108.3克KH 2的PO 4和35.6克K 2的HPO 4,并填写H 2 O操作1升)。利用这些解决方案NGM的生产可以在先前的协议10被发现。
    2. 在121℃,15分钟的高压釜的解决方案。
    3. 准备为50ml灭菌的5毫克/毫升胆固醇溶液。在50毫升的锥形管,混合0.25克胆固醇和50毫升99.99%乙醇拌匀。 不要高压 。使用50毫升注射器用0.45μm针筒式滤器灭菌胆固醇溶液中。这也将消除任何不溶解胆固醇。
    4. (可选)准备的10ml 2'-脱氧-5-氟尿苷(的FUdR)股票150毫米的。在一个15毫升的锥形管,混合0.3693克的的FUdR和10ml蒸馏水。摇匀。

    2.准备细菌培养为NGT-3D和NGB-3D

    1. 接种10毫升LB培养基细菌。用于线虫喂食标准细菌大肠杆菌菌株OP50。
    2. 培养在37℃下在振荡培养箱中过夜的细菌接种。
    3. 在用于连续稀释制备,等分9毫升的NaCl溶液到无菌的15毫升锥形管中。例如,分装9毫升共打入7管做一个10-7稀释OP50应变大肠杆菌
    4. 使用无菌1000微升吸管,吸管将1ml细菌培养或稀释的细菌培养成育新管9毫升氯化钠溶液,涡旋10毫升混合好。重复,直到达到期望的细菌稀释。
      注意:所希望的细菌稀释取决于细菌的种类和条件以及确切的实验条件。例如,一个10 -6 - 10 -8稀释OP50菌株大肠杆菌的足以从1到生产-每6.5毫升NGT-3D管200的细菌菌落。蠕虫可靠发达国家和正常再生时的菌落数超过60,其在10 -6的稀释发生- 10-7。对于NGB-3D,使用10 -8稀释。

    3.使NGT-3D和NGB-3D(200ml)中

    1. 制备细菌培养后,混合0.6克氯化钠,1g的造粒琼脂,和在一个500ml烧瓶0.5克胨。插入一个磁性搅拌棒的烧瓶中。
    2. 添加195毫升蒸馏水和用铝箔覆盖该烧瓶的口。
    3. 高压釜121℃15分钟。
    4. 热高压灭菌烧瓶放置到一个搅拌盘,并以中等速度搅拌至少2小时。冷却烧瓶至40℃。一定要充分冷却从这里在高温下持续可能导致成品琼脂混浊。但是,较低的温度可能会导致在琼脂过早硬化。
      1. (可选)要加快冷却过程,将烧瓶在40℃水浴15分钟,放置在一个搅拌盘前。
    5. 当琼脂培养基的温度达到40℃时,加入200微升的1M的CaCl 2,200微升5毫克/毫升胆固醇溶液,200微升的1M MgSO 4上和5ml 1M的KPO 4缓冲液作为溶液继续搅拌至1mM的CaCl 2,5微克/毫升胆固醇,1mM的MgSO 4上,1mM的KPO 4的最终浓度。
      1. (可选)NGT-3D寿命测定添加80μl的150mM的的FUdR的到120微米12的最终浓度。
    6. 加6毫升10毫升稀释后直接从步骤2.4细菌培养成瓶的。
      1. (可选)对于NGT-3D,删除6毫升琼脂培养基步骤3.6之前保持温暖分开。此介质将用于细菌 - 自由顶层。
    7. 使用无菌的程序,分配所述媒体到无菌的培养室。确保盒盖紧紧关闭。
      1. (可选的)为了防止细菌菌落从琼脂的顶部表面上形成,从步骤媒体3.7完全硬化之前在顶部从步骤3.6.1使无菌琼脂培养基的层。这将在NGT-3D的顶部创建一个无菌区。
      2. 为NGT-3D,倾6.5毫升介质插入8ml上述透明塑料试管,使细菌琼脂层,并小心地分配在半硬化3D媒体的顶部200微升无菌介质,以使薄无细菌在上面自由层。
      3. 对于NGB-3D,倒65毫升媒体到25 平方厘米的透明塑料细胞培养瓶。这一数额应填写25 平方厘米的细胞培养瓶的瓶体。
    8. 离开垂直于室温室一周以允许细菌菌落生长到至少1毫米直径的具有相当规模。
      1. (可选)对于NGT-3D寿命试验,用铝箔盖室,以防止的FUdR的光降解。

    在NGT-3D(相对育雏面积测定)蠕虫人口4.测量健身

    1. 挑选使用铂丝的L4阶段蠕虫挑一个无细菌的NGM板转移。允许蠕虫自由走动几分钟,以去除附在它身上的细菌。
    2. 重复步骤4.1和确保该蠕虫病毒是从细菌免费的。一般来说,4.1两个重复就足够了。
    3. 小心地将清洁蜗杆与铂丝挑3D媒体的表面上。该蠕虫应最终进入琼脂进入3D琼脂矩阵。
    4. 关上盖子松松地让一些空气进入管道,但防止琼脂培养基的干燥。
    5. 在20℃孵育96小时。
    6. 4天之后,紧紧地关闭盖子和放置NGT-3D培养室分成一个88℃的水浴以熔化的琼脂。热杀死虫子,但他们的身体保持不变。
      注意:使用8个毫升管的NGT-3D,20 - 30分钟潜伏期通常是足够的。
    7. 用玻璃吸管,转移熔化的媒体到9厘米塑料培养皿。塑料吸管不建议,因为蠕虫病毒往往可以坚持给他们。
    8. 使用透射立体声解剖显微镜,计数在L3,L4蠕虫和成年阶段的数目。不要指望那些L2级和年轻的蠕虫,作为F1和F2代可以在这里混淆。因此,这个实验是一个相对的育雏规模试验,而不是总育雏规模试验。

    5.图像和NGB-3D记录蠕虫行为

    1. 使用铂丝挑L4期蠕虫挑选并通过转移到一个无菌NGM板并使其自由几分钟移动除去粘在表面上的任何细菌。
    2. 重复步骤5.1,以确保禾RM是细菌免费的。
    3. 小心地将清洁蠕虫到NGB-3D的瓶用铂丝拾取的颈部附近的琼脂表面的中心。该蠕虫应最终进入琼脂进入3D琼脂矩阵。
    4. 关上盖子松松地让一些空气进入管道,同时防止琼脂培养基的干燥。
    5. 图片或录制立体声传输解剖显微镜下的蠕虫病毒。调整焦距为蠕虫移动通过3D矩阵。

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    Representative Results

    NGT-3D的结构是一个简单的和直接的协议,其导致在整个琼脂( 图1A)间隔开小的细菌菌落在琼脂填充试管。蠕虫可通过琼脂矩阵自由移动,寻找和消费的细菌菌落。为了证实线虫是否可以复制和NGT-3D正常生长,我们比较土壤肥力与3D幼虫发育与标准的2D NGM板。在育雏相对大小分析,成年线虫在NGT-3D雌雄同体只是重现,以及在标准的2D NGM板雌雄同体当细菌菌落充足,至少60殖民地( 图1B)。此外,在NGT-3D幼虫发育也正常进行时有大量的与96小时( 图1C)后,在成人状态多数蠕虫细菌菌落。然而,如果细菌菌落是疏在3D矩阵,既相对育雏大小( 图1B,左边栏)和幼虫发育( 图1C,左边栏)的负面影响。

    为了测试在居住3D是否对蠕虫的长期生理任何影响,我们进行了实验寿命比较NGT-3D和NGM板。对NGT-3D蠕虫的平均寿命为15.6±3.6天相比,14.8±3.1天为标准NGM板。对于生活在NGT-3D和NGM的蠕虫的寿命曲线几乎是一样的。因此,似乎蠕虫在3D和2D条件下生存同样出色。

    制造NGB-3D也不难,应该产生一个明确的,琼脂填充培养瓶一样,在图2A可见。要轻松查看的细菌菌落,大家纷纷表示deoxyviolacein,暗紫色细菌的代谢物11,在OP50大肠杆菌菌株( 2A,2B;应变应要求提供)。活虫体可以传送立体声解剖显微镜( 图2B, 补充电影1)下进行成像。

    在室温下NGT-3D和NGB-3D的存储足以维持这两种培养室长达1个月。如果施加适合的管或瓶的插头型或螺旋型帽琼脂干燥不是任NGT-3D或NGB-3D关注。

    图1
    图1: 开发,生育率和寿命 在NGT-3D培养 线虫 是与标准的2D NGM的相媲美。 (A)在细菌的几个稀释NGT-3D图像。左,右侧包含一个5×10 -7稀释,中间是1×10 -7稀释。 (B)野生型蠕虫相对育雏大小NGT-3D到少于60 OP50殖民地(N = 24),大于或等于60殖民地(N = 14),或在2D NGM板(N = 29)。误差棒表示标准误差。 F1代的蠕虫(C)的百分比在L3,L4或成人发育阶段在NGT-3D少于60 OP50菌落,大于或等于60的菌落,或二维NGM板。在NGT-3D或NGM板野生型线虫 (D)的存活曲线。 NS表示不显著相差数秩检验计算。这个数字已经从李9修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图2 图2: 成像 线虫 在3D使用NGB-3D。 (A,B)NGB-3D图像;成年线虫 (C)图片近OP50 大肠杆菌菌株的殖民地表达暗紫色色素deoxyviolacein。比例尺为500微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图2
    补充电影1:成年线虫接近在NGB-3D殖民地的大肠杆菌 OP50-violace。 请点击这里下载此文件。

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    Discussion

    采用经典的线虫的生长介质板线虫的实验室培养是至关重要的该研究线虫提供了数百个重要的发现。在这里,我们提出新的方法来培养线虫中更准确地反映其三维天然栖息地的环境。尽管其它方法已被用于在3D 13观察线虫 ,这是第一个协议,它允许蠕虫培养在固体三维基质。这里展示的两种方法,NGT-3D和NGB-3D,让科学家问3D养身健体,发展壮大的问题,也是图像和3D录制蠕虫。虽然NGT-3D和NGB-3D有标准的2D NGM板一些差异,它们类似于这种原始的方法和仅调节到添加蠕虫培养在z轴。因此,我们发现,开发,生育和寿命在我们的条件下正常进行。该目标是创建一个任何实验室可以聘请为他们的研究的协议。这些方法是非常简单,容易再现的以非常低的成本,并允许协议的调整,以适应用户的特定的实验。

    虽然所有的在协议的步骤是重要的,在使NGT-3D和NGB-3D的关键步骤是在琼脂的冷却温度高压灭菌后在步骤3.4到协议3.6。如果温度冷却(40℃以下几度)过低,琼脂将开始硬化和添加的解决方案将不会适当地混合到琼脂。然而,如果冷却不充分(几度以上40℃),所添加的细菌可能死亡和增加的胆固醇溶液可云琼脂渲染琼脂无用实验。此外,谨慎的面积在步骤4.6。当融化在水浴中NGT-3D琼脂,请务必盖紧盖子在熔融帮助。然而,热可以引起帽危险“啪”掉,成为一个弹丸。为了安全的目的,最好是覆盖水浴中。该协议的许多部分是相当适合于该用户。例如,我们已经使用了NGT-3D透明塑料试管中,并有25 平方厘米透明细胞培养瓶(共持有65毫升)中的NGB-3D。其他类型的可用的用户明确管或瓶也应该工作。此外,细菌生长是可调的。 大肠杆菌菌株OP50通常需要大约一周增长到至少1毫米,这是优选用于我们的实验。根据我们的经验,似乎细菌略短,甚至更长的生长时间不会影响到蠕虫的增长或生育能力。琼脂浓度的调整,但是,将影响蠕虫运动。琼脂的浓度较低导致蠕虫呈现出游泳状运动,和较高的浓度能抑制整体的运动。

    在NGB-3D关注的一个领域是缩合的问题和水分积聚。作为暖液体琼脂变硬,难免有些缩合随时间发展,特别是在瓶子和琼脂的接口。这可能会造成对蜗杆,其示出在液体中的14游泳行为和细菌的生长,这可以通过将液体在整个瓶子蔓延的问题。缩合的预防是困难的。两种可能的补救措施这一存在。首先,我们确保蜗杆可以很容易地通过在瓶子的颈部放置在琼脂表面的中心进入琼脂。其次,我们有意保持细菌低NGB-3D的浓度,从而减少了一个集落生长在液体和琼脂界面的机会。

    另一个值得关注的是NGB-3D蠕虫的成像。为了增加在3D蠕虫图像的清晰度和质量,菌落应接近表面但仍完全嵌入琼脂。我们试图成长surfa附近唯一的嵌入式菌落CE由在表面将含有细菌的琼脂的薄层,以及剩余介质是无菌。然而,问题是没有充分利用该方法解决。相反,我们决定在一次产生许多NGB-3D瓶,并使用仅包含嵌入接近表面的菌落,从而增加蠕虫将会移动到表面附近的集落的可能性的那些。我们还没有探讨的一个选择是改变固体培养基比我们这里采用颗粒状琼脂等矩阵。在z轴方向上的成像蠕虫也可以是具有挑战性的。我们通过手动升降粗焦点,但是,如果一个自动跟踪程序存在针对此,它可以是相当有帮助的。

    人们希望,在这里提出了C.在3D 线虫的种植技术由线虫生物学家得到广泛的应用。许多问题仍然虫生物学,包括老龄化和行为,3D,和无论什么科学家观察2D是有关在3D蠕虫。事实上,利用NGT-3D此前的一项研究显示,对生殖健康的影响是3D栽培对在2D情况通常9再现感官突变。此外,一项研究显示,相比于2D 15 3D运动改变行为。最后,该系统可以用来开始回答的特定条件下,突变体或操作是否赋予健身优点向动物在其天然三维环境的问题。

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    Disclosures

    Acknowledgements

    这项工作是由支持的新研究员格兰特[2014R1A1A1005553]韩国国家研究基金会(NRF)为JIL;和延世大学未来之星挑战格兰特[2015-22-0133]为JIL

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    LB broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 224620
    Sodium chloride DAEJUNG 7548-4400 58.44 MW
    Agar, Granulated Difco 214530
    Peptone Bacto 211677
    Calcium chloride, dihydrate Bio Basic CD0050 2*H2O; 147.02 MW
    Cholesterol Bio Basic CD0122 386.67 MW
    Ethyl alcohol B&J RP090-1 99.99%; 46.07 MW
    Magnesium sulfate, anhydrous Bio Basic MN1988 120.37 MW
    Potassium phosphate, monobasic, anhydrous Bio Basic PB0445 136.09 MW
    2'-Deoxy-5-fluorouridine Tokyo Chemical Industry D2235 246.19 MW
    Potassium phosphate, dibasic, anhydrous Bio Basic PB0447 174.18 MW
    Multi-Purpose Test Tubes Stockwell Scientific ST.8570 8 ml
    Test Tube Closures Stockwell Scientific ST.8575
    Cell Culture Flask SPL Lifescience 70125 25 cm2
    Research Stereo Microscope Nikon SMZ18
    High-Definition Color Camera Head Nikon DS-Fi2
    PC-Based Control Unit Nikon DS-U3
    NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software Nikon MQS32000

    References

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