, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l'image

Bioengineering
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. J. Vis. Exp. (119), e55101, doi:10.3791/55101 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ce protocole décrit en détail la mise en oeuvre guidée par l'image, la dégradation d'hydrogel à base de laser pour la fabrication de réseaux vasculaires microfluidiques dérivé incorporés dans les hydrogels PEGDA. Ici, nous décrivons la création de masques virtuels qui permettent un contrôle laser guidée par l'image; la photopolymérisation d'un hydrogel PEGDA micromolded, propres à la fabrication de réseau microfluidique et le flux de tête commandé par la pression; la configuration et l'utilisation d'un microscope à balayage laser confocal disponible dans le commerce associé à un pulsé Ti femtoseconde: laser S pour induire la dégradation d'hydrogel; et l'imagerie des réseaux microfluidiques fabriqués en utilisant des espèces fluorescentes et la microscopie confocale. Une grande partie du protocole est axé sur la bonne configuration et la mise en œuvre du logiciel de microscope et microscope macro, car ce sont des étapes cruciales dans l'aide d'un microscope commercial à des fins de fabrication microfluidiques qui contiennent un certain nombre de subtilités. La composante guidée par l'image de cette technique permet la mise en œuvre de 3D piles d'images ou de modèles 3D générés par les utilisateurs, ce qui permet pour la conception créative et microfluidique pour la fabrication de systèmes microfluidiques complexes de pratiquement toutes les configurations. Avec un impact attendu dans l'ingénierie tissulaire, les méthodes décrites dans ce protocole pourraient aider à la fabrication de pointe constructions Microbroyeur biomimétiques pour les appareils nisations et humains-on-a-chip. En mimant le complexe l' architecture, la tortuosité, la taille et la densité de la vascularisation in vivo, des processus de transport biologiques essentiels peuvent être reproduits dans ces constructions, ce qui conduit à une modélisation plus précise in vitro des propriétés pharmacocinétiques de la drogue et des maladies.

Introduction

Le système vasculaire, comprenant à la fois lymphatique et cardiovasculature, formes de réseaux très denses qui sont essentiels pour le transport des nutriments et de l'oxygène et pour l'élimination des déchets métaboliques. En conséquence, les cellules résidant dans les tissus vascularisés ne sont jamais plus de 50-100 um loin d'un récipient 1. La capacité de se reproduire in vivo dans l' architecture vasculaire in vitro est critique pour modéliser avec précision les processus de transport in vivo en utilisant des constructions artificielles. Avec un entraînement récent pour développer des dispositifs d' organes sur une puce 2 pour haut débit médicament dépistage 3,4 et la modélisation des maladies 5,6, les méthodes pour créer des réseaux microfluidiques qui récapitulent le transport in vivo -comme dans des hydrogels synthétiques ou naturels sont le dessin un intérêt significatif. Pour améliorer la biomimétisme de microtissues utilisés dans ces dispositifs, nous avons développé une méthode de dégradation d'hydrogel à base de laser guidée par l'image qui utilise trois dimensional ' image (3D) des piles de vascularisation native en tant que modèles pour générer des réseaux microfluidiques vasculaires dérivés intégrés dans PEGDA hydrogels 7. Ce protocole décrit l'utilisation d'un laser à balayage confocal microscope disponibles dans le commerce équipé d'un laser à impulsions femtoseconde pour fabriquer des réseaux microfluidiques biomimétiques vasculaires dérivées dans des hydrogels PEGDA par dégradation à base de laser guidée par l'image.

Les approches actuelles pour fluidiser hydrogels comprennent l'induction de vasculogenic 8-10 ou 10-12 techniques cellules endothéliales d' auto-assemblage et de microfabrication angiogéniques pour créer des canaux pré-définis pour endothélialisation 13-16. Bien que les réseaux auto-assemblées récapitulent la densité et de l' architecture complexe du système microvasculaire, ils sont souvent plus perméables que les réseaux 11,17,18 in vivo, ce qui peut être problématique dans le transport de modélisation pour des applications de criblage de médicaments. Réseaux auto-assemblés sont constitués de physiologie dematiquement pertinentes, les vaisseaux capillaires de taille, mais ils peuvent être difficiles à intégrer à l'écoulement du fluide en vrac en raison des limitations de générer de plus grands navires de artériole taille. Comme il n'y a pas de contrôle direct sur l'ensemble de ces réseaux, l'architecture finale peut varier d'un échantillon à, ce qui rend difficile de produire de façon répétée des réseaux avec les mêmes propriétés d'écoulement et de transport de fluides.

Pour générer 3D, réseaux microfluidiques hydrogel embarqué à géométrie répétitive et une architecture bien définie, un certain nombre de techniques de microfabrication ont été développées, y compris l' assemblage modulaire 13, l' impression 3D de matériaux sacrificiels 16, assemblage écriture directe 14, et l' impression omnidirectionnelle 15. L'application de ces méthodes, l'architecture microfluidique, et les propriétés d'écoulement et de transport de fluide donc, peut être fabriqué de façon répétée à travers de nombreuses constructions. Une limitation importante de ces méthodes, cependant, est l'incapacité de créer microfréseaux luidic avec des caractéristiques capillaires moyenne, 4 à 10 um 19. La plupart des techniques de microfabrication sont souvent limitées à des fonctionnalités allant de 150 à 650 um de diamètre 13,16. Certaines techniques existantes sont capables de générer des réseaux hiérarchiques avec des canaux à travers une large plage de diamètres de 10 à 300 um pour le montage direct-écriture 14, et 18 à 600 um pour l' impression omnidirectionnelle 15, mais ils sont limités dans leur capacité à générer des réseaux denses ou pour produire de multiples réseaux microfluidiques à proximité dans un seul construction 7.

Pour surmonter certaines de ces limitations, nous avons développé une technique de dégradation d'hydrogel à base de laser guidée par l' image qui permet la fabrication reproductible de biomimétique, réseaux microfluidiques hiérarchiques qui récapitulent l'architecture microvasculaire in vivo. Pour ce faire, un 790 nm, 140 femtoseconde (fs) laser pulsé fonctionnant à 80 MHz est raster scannée in emplacements 3D désirée à l' intérieur d' un hydrogel tel que défini par les images de la vascularisation in vivo. Nous pensons que le processus de dégradation fonctionne grâce à la décomposition induite par laser optique de l' eau, la formation du plasma qui en résulte, l'expansion rapide thermoélastique subséquente de l' eau et de la dégradation locale de l'hydrogel que l'eau se dilate 20. Ce mécanisme varie légèrement d' une dégradation à base de laser d'hydrogels à base de protéines 21-24. A la différence PEGDA, qui a une section transversale multiphotonique bas, les protéines ont souvent une grande section transversale multiphotonique et sont donc dégradées par l' intermédiaire d' une absorption multiphotonique induite par bris chimique 23. Pour générer des réseaux microfluidiques guidée par l' image, l'obturateur laser est contrôlé par des masques virtuels images dérivées, qui sont constitués d'une mosaïque de régions d'intérêt 9 qui définissent l'architecture microfluidique. En utilisant cette approche, nous avons démontré la capacité de fabriquer des microfluidique biomimétique 3D vasculaire dérivéles réseaux de circuits intégrés, ce qui récapitulent l'architecture dense et tortueuse du système vasculaire in vivo, afin de contrôler localement la porosité des hydrogels en modifiant la quantité d'énergie délivrée au cours de la dégradation. Nous avons également été en mesure de générer deux réseaux microfluidiques indépendants qui entrelacent à proximité (15 um) , mais ne se connectent jamais directement 7. Nous avons également démontré la capacité de endothélialiser microcanaux laser dégradé par la poste dégradation fonctionnalisation avec la séquence peptidique de l' intégrine ligaturer, Arginine-glycine-acide aspartique-sérine (RGDS) pour favoriser l' adhérence des cellules endotheliales et la formation de la lumière 7.

Avec ce protocole, la génération de réseaux microfluidiques complexes hydrogels PEGDA est rendue possible par l'intermédiaire, la dégradation à base de laser guidée par l'image à l'aide d'un microscope disponible dans le commerce accessible sur de nombreux campus universitaires. Comme le processus de dégradation est guidé par des masques virtuels numériques, ce fabricaTechnique tion se prête à la conception des réseaux de création microfluidique, permettant son utilisation dans une large variété d'applications. Nous prévoyons que la méthode décrite ici sera la plus avantageuse dans la conception de dispositifs nisations et humains-on-a-chip biomimétiques capables de reproduire les processus de transport biologiques importants dans la modélisation drogues transport 2. Cette technique de fabrication peut également être intéressant pour la génération des modèles in vitro de maladies, y compris les métastases du cancer et des modèles de 5,6 barrière hémato-encéphalique 25. Comme la dégradation d'hydrogel à base de laser a déjà été utilisé pour créer des pistes pour la direction de l' excroissance neuronale 21-23, l'extension de cette technique guidée par l' image pourrait se révéler utile dans les stratégies d'ingénierie tissulaire avancées pour positionner les cellules dans des arrangements spatiaux 3D définis par l' utilisateur.

Protocol

1. Génération Masques virtuels

NOTE: Une pile d'images 3D du cerveau de souris microvasculaire a été choisi comme modèle microfluidique pour ce protocole, ayant été abattus à partir d'un ensemble de données beaucoup plus contenant des images de toute une microvascularisation de cerveau de souris. Images microvasculaires ont été acquises par l' intermédiaire de microscopie à balayage de couteau tranchant (KESM) 26, 2; données microvasculaires similaires sont ouvertement disponibles à travers l'Atlas KESM de cerveau de souris 28.

  1. Ouvrez le logiciel de traitement d'image 29 et ouverte et recadrer l'image 3D TIF pile de vascularisation native de sorte que le réseau microfluidique désiré, à générer au sein de l'hydrogel, tient dans un 450 um x 450 um x 1,5 mm (x par y par z) fenêtre. Pour ce faire, dessiner un carré autour de la région désirée et cliquez sur "Image" → "Crop". Retirez les tranches dans la direction z en cliquant sur "Image" → "Duplicate" et tapez dans une tranche désiréegamme.
    NOTE: Cela garantit que les caractéristiques souhaitées inscrivent dans le champ de vision (x par y) (531,2 x 531,2 um en utilisant un 20X (NA1.0) objectif à immersion d'eau avec une taille d'image de 2.884 x 2.884 pixels et un zoom de 0,8 avec un laser à balayage confocal) et la distance de travail (z) d'un 20X (NA1.0) l'objectif d'immersion dans l'eau. Si inconnu, le champ de vision d'autres systèmes peut être déterminée par l'acquisition d'une image avec l'objectif et les paramètres souhaité.
  2. Tournez la pile d'images de sorte que les fonctionnalités sont principalement alignés avec la direction de balayage de trame, ou la direction x, en cliquant sur "Image" → "Transform" → "Rotation". Cela diminue le temps nécessaire à la fabrication.
  3. Échelle la pile d'image recadrée afin que les matchs de taille de pixel ou dépasse les paramètres utilisés pour la dégradation sur le microscope confocal (0,184 um / pixel lors de l'utilisation d'un 20X (NA1.0) objectif à immersion d'eau avec une taille d'image de 2884 par 2.884 pixelset un zoom de 0,8). Pour ce faire, cliquez sur "Image" → "Ajuster" → "Taille" et tapez "2446" pour "largeur" (ie, 450 um, ou la taille de l'image divisée par 0,184 um / pixel).
  4. Seuil / Binariser la pile d'image en tapant "Ctrl + Maj + T". Décochez "Fond noir", et cliquez sur "appliquer" → "ok". Terminer le processus en cliquant sur "Image" → "Tables de recherche" → "Invert LUT".
  5. En utilisant un algorithme personnalisé (code source est disponible dans le matériau supplémentaire du manuscrit référencé) dans le logiciel de programmation 9, correspondent à la binarisée (blanc) dispose d'une mosaïque de quadrilatères de pixels à haute simples parallèles à la direction de balayage de trame (x -direction) pour générer des régions d'intérêt (ROI) qui guident la position du laser et de l' obturateur 9, 7, 30, 31, <sup> 32.
    NOTE: L'algorithme personnalisé 9 convertit chaque plan individuel dans l'image pile TIF vers un fichier RLS.
  6. Changez l'extension du fichier des fichiers RLS à .OVL pour une utilisation lors de la dégradation.

2. Configuration du laser microscope confocal à balayage

REMARQUE: Alors que d'autres microscopes à balayage laser équipés de lasers à impulsions peuvent être utilisés, les paramètres et le protocole ci-dessous décrivent l'utilisation d'un microscope à balayage laser (LSM) en conjonction avec son logiciel.

  1. Avec le balayage laser microscope confocal, ouvrez le logiciel de microscope, et cliquez sur "Start System." Sélectionnez l'objectif "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" dans l'onglet "Maintenir".
  2. Réglage de la configuration "Hydrogel Visualisation"
    1. Dans l'onglet "Acquisition", veiller à ce que la ligne laser (514 nm laser Argon) est sélectionné et dans le "Laser" window. NOTE: Ce canal est utilisé pour l' image de l'hydrogel via éosine Y fluorescence à des fins d'orientation 7.
    2. Dans la fenêtre "Setup Imaging", réglez le "Mode" pour "Mode Channel", réglez "Switch suivre tous les" pour "Frame", et sélectionnez "Track1".
    3. Dans la fenêtre "Light Path", sélectionnez uniquement le détecteur fluorescent Ch1, avec une gamme de 516-735 nm; un diviseur de faisceau principal (MBS) 458/514 filtre sur la ligne de lumière visible; et une plaque dans la ligne de lumière invisible. Décochez la champ lumineux détecteur de tube photomultiplicateur, "T-PMT".
    4. Dans la fenêtre "Mode d'acquisition", vérifier que l'objectif est sélectionné et définir le "Mode de numérisation" à "Frame", la "taille d'image" à "2884" en X et Y, la "Ligne Step" à "1" , le «numéro moyenne» à «1», le «mode moyenne» à «ligne», le «calcul de la moyenne Méthode" à "moyenne", le "Bit Depth "à" 16 bits ", et la" Direction "à" <-> "pour la numérisation bidirectionnelle.
    5. Dans la fenêtre "Mode d'acquisition", réglez le "Speed" comme souhaité et régler "Corr X" et "Y" à "0,05" ou ajuster si nécessaire pour le microscope spécifique utilisé. Décochez "HDR".
    6. Dans la fenêtre "Mode d'acquisition», assurez-vous que la «zone de numérisation" affiche un "Taille de l'image" de "531,2 um x 531,2 um» et un «Taille de Pixel" de "0,18", avec un "Zoom" réglé sur "0,8" ; définir toutes les autres valeurs "Scan Area" à zéro.
    7. Dans la fenêtre "Chaînes", sélectionnez "Track1" comme détecteur de fluorescence Ch1. Sélectionnez la ligne de laser "514", avec une puissance de pour cent de "10,0", un "sténopé" de "1AU", un premier «Gain (Master)" de "800", un "Digital Offset" de "0", et un "Gain numérique" de4; 1 ".
      REMARQUE: Réglez ces paramètres au besoin pour le microscope spécifique utilisé.
    8. Enregistrer cette configuration "hydrogels Visualisation".
  3. Réglage de la configuration "Formation Channel"
    1. Dans l'onglet "Acquisition", veiller à ce que la ligne laser (790 nm 140 fs pulsées Ti: S laser) est sélectionné et dans la fenêtre "Laser". Réglez "Correction GDD" à "4000" pour la puissance de sortie maximale à 790 nm.
    2. Réglez la fenêtre "Setup Imaging", comme indiqué à l'étape 2.2.2.
    3. Dans la fenêtre "Light Path", veiller à ce qu'aucun des détecteurs fluorescents sont sélectionnés, avec un filtre 458/514/561/633 MBS sur la ligne de lumière visible et un MBS 760+ filtre sur la ligne de lumière invisible. Décochez la champ lumineux détecteur de tube photomultiplicateur, "T-PMT".
    4. Dans la fenêtre "Mode d'acquisition", vérifier que l'objectif correct est répertorié. Réglez le "Speed" à "3»Et tous les autres paramètres tels que décrits à l'étape 2.2.4.
    5. Dans la fenêtre "Chaînes", sélectionnez "Track1" comme détecteur T-PMT. Sélectionnez la ligne de laser "790", avec une puissance de pour cent de "100,0", un premier «Gain (Master)" de "800", un "Digital Offset" de "0", et un "Gain numérique" de "1" .
    6. Dans la fenêtre "Stage", zéro la scène en cliquant sur "mettre à zéro". Marquez l'emplacement en cliquant sur "Mark". Cela est essentiel pour le téléchargement de masques virtuels à la macro de microscope à l'étape 3.
    7. Dans la fenêtre "Time Series", réglez "Cycles" que "1" et "Intervalle" à "0".
    8. Dans la fenêtre "Bleach", cochez la case "Démarrer blanchissement après # scans" boîte et le mettre à une valeur de "0 de 1". Sélectionnez la "vitesse de balayage différent", avec une valeur de "3" (correspondant à un temps de séjour de pixels de 8,96 ps / pixel). Sélectionnez le "bl Safepour chaque GaAsP ».
    9. Dans la section de ligne laser de la fenêtre "Bleach", sélectionnez la ligne laser 790 et régler la puissance de pour cent à "100,0". Laissez toutes les autres cases dans la fenêtre de l'eau de Javel décochée. Enregistrer les paramètres de blanchiment dans la fenêtre "Bleach".
    10. Enregistrer cette configuration comme "Formation Channel".
      NOTE: Le "Z-Stack", "Régions", "Focus", et les fenêtres «étape» sont également importants à ce protocole, mais ne doit pas être fixé ou ajusté lors de la configuration initiale.

3. Création d'une recette et Transfert de masques virtuels au Logiciel Microscope et Macro

  1. Avec le laser microscope confocal à balayage encore en cours d'exécution et le logiciel de microscope encore, sélectionnez uniquement la fenêtre "Régions" (à côté du bouton "Démarrer Experiment") dans la configuration "Formation Channel".
  2. Pour veiller à ce que les masques se chargent à la macro correcte de microscopely, régler la puissance pour cent dans le "Chaînes" fenêtre "0,2" et le "Speed" dans la fenêtre "Mode d'acquisition" à "8", et cliquez sur "Snap" en haut à gauche de l'écran.
  3. Vérifiez que la taille de l'image est encore "531,2 um x 531,2 um", avec une taille de pixel de "0,18", dans l'onglet "Information" de l'image. Si ces valeurs ne sont pas correctes, vérifiez à nouveau la «Taille du cadre" et les valeurs "Zoom".
  4. CRITIQUE: Vérifiez que les emplacements X et Y dans la fenêtre "Stage" sont mis à zéro et que la position est marquée avant d'ouvrir la macro microscope. Reportez-vous à l'étape 2.3.6.
  5. Pour ouvrir la macro de microscope, de type "Alt + F8", cliquez sur "Load", et sélectionnez la version correcte. Voir détails dans la liste des matières spécifiques / équipement. Une longue liste de sous-macros est ouvert dans la fenêtre "Control Macro".
  6. Dans la fenêtre "Control Macro", cliquez sur "Exécuter" pour ouvrir le microscope macro, puis fermez la fenêtre "Control Macro".
    REMARQUE: les versions alternatives de la macro microscope peuvent ne pas être compatibles avec la dégradation d'hydrogel à base de laser en utilisant ce protocole.
  7. Dans l'onglet "Enregistrement" de la macro microscope, fournir un arbitraire "Nom de fichier de base", sélectionnez "File Single Output", et a choisi un dossier "Fichier temporaire". Réglez "Temp Ouvrir le dossier" à l'emplacement "1", sélectionnez "Image unique dossier temporaire", et nommez la recette dans "Store / Appliquer la recette" par "Liste de rappel Emplacements" sélectionné. Cliquez sur "Store" pour créer d'abord la recette.
  8. Dans l'onglet "Acquisition" de la macro microscope, veiller à ce que la "configuration de numérisation" correspond au nom donné à la configuration du logiciel de microscope défini à l'étape 2.3. Définir les «No of Time Points dans le bloc" à "1", avec un "intervalle" de "0". Assurez-vous que "Z Marked - Haut de Z Stack "est en surbrillance verte. Tous les autres paramètres par défaut sont très bien comme ils sont.
  9. Dans l'onglet "Timing" de la macro microscope, veiller à ce que "Wait Delay" est en surbrillance verte, réglez "Répétitions Experiment" et "Groupe Répétitions" à "1" et "Attendre Intervalle Avant bloc au premier emplacement seulement" à "0" . Tous les autres paramètres par défaut sont très bien comme ils sont.
    NOTE: Le "Groupe Répétitions" (et non les «Répétitions Experiment») boîte est où l' on peut définir le nombre de fois les balayages laser sur une région (ie, les répétitions de la recette).
  10. Dans l'onglet "Z Liste" de la macro microscope, les plans de dégradation dans la direction z sont spécifiées. Réglez le z-spacing, "dZ", à "1 um", avec le "Nombre de positions" réglé pour correspondre le nombre de masques virtuels à utiliser.
  11. Cliquez sur le bouton "Créer Z Stack" pour faire de la "Liste de Z" apparaissent dans le menu déroulant "List des emplacements "vers le bas de la fenêtre. Vérifiez que le nombre d'emplacements et z-espacement sont corrects et que les emplacements X et Y sont mis à zéro.
    NOTE: Si elles ne sont pas, ne stockez pas la recette; fermer la macro microscope et répétez l'étape 2.3.6 avant la réouverture de la macro microscope et mise en place de la recette à nouveau.
    NOTE: Au lieu d'avoir 100 masques espacés de 1 um chacun, par exemple, il peut être avantageux d'avoir 50 masques, chaque employé deux fois et espacées de 1 um, pour obtenir une structure microfluidique équivalente, que le chargement des masques individuels à la macro de microscope peut prendre du temps.
  12. Dans l'onglet "Bleach" de la macro microscope, tous les masques doivent être chargés et jumelés à un emplacement numéroté spécifique dans la «Liste des emplacements". Pour commencer, sélectionnez la case "Bleach" et veiller à ce que "Config." correspond au nom des paramètres de blanchiment dans la fenêtre "Bleach" dans l'écran principal du logiciel de microscope (voir l'étape 2.3.8 Il doit exister). Set "Attendre Retard Après Bleach" à "0", décochez "spot", et laisser le "ROI" vide.
  13. Ne pas modifier quoi que ce soit dans le "Lieu", "Tile", "Grid", "Autofocus", "blocs", et les onglets "Options" à partir des paramètres par défaut.
  14. Pour charger des masques à la macro microscope, sélectionner uniquement les "régions" fenêtre dans le logiciel de microscope et ouvrez l'onglet "Bleach" de la macro microscope. Dans la fenêtre "Régions", cliquez sur "Load" et sélectionnez le fichier .OVL pour le masque au bas de la pile z-être dégradé.
    NOTE: Le premier emplacement dans la "liste Z" est le fond de la z-stack, et la macro microscope fonctionne son chemin vers le haut de la z-stack, ou hydrogel.
  15. Une fois la liste des ROIs apparaît dans la fenêtre "Régions", cliquez sur le bouton fléché pour afficher les ROIs du masque dans le champ de vision (sur l'image cassé à l'étape 3.2). Vérifiez que les ROIs cadrentle champ de vision.
  16. Pour enregistrer le masque chargé dans la macro microscope, donner le masque d'un nom et un numéro dans la case "Ajouter Région actuelle à la liste ROI" sur l'onglet "Bleach", puis cliquez sur le bouton "Ajouter Région actuelle à la liste de retour sur investissement". Le nom et le numéro apparaissent dans le "ROI" liste déroulante avec d'autres masques (y compris les masques d'autres recettes créées précédemment). Supprimer le masque dans le "Régions" fenêtre dans le logiciel de microscope.
  17. Répétez les étapes 3.14 et 3.16 pour télécharger et enregistrer tous les masques à la macro de microscope.
  18. Pour attribuer des masques téléchargés à chaque Z-localisation, la position 1 dans la liste déroulante "Liste des emplacements" mettre en évidence. Sélectionnez le ROI approprié dans la liste déroulante "ROI". Assurez-vous que la case "Bleach" est sélectionné dans la partie supérieure de l'onglet "Bleach" dans la macro microscope.
  19. Répétez l'étape 3.18 pour toutes les positions dans la liste déroulante "Liste des emplacements", puis cliquez sur "Store" sur le &# 34; économie d'énergie "onglet pour enregistrer la recette dans sa forme finale.

4. photopolymérisation un PEGDA Hydrogel

  1. Rendre stérile HEPES solution saline tamponnée (HBS) avec Triéthanolamine (TEOA)
    1. Dans un 1-L bécher, ajouter 500 ml de DI H 2 O. Avec une barre d'agitation, ajouter 2,922 g de chlorure de sodium, 1,196 g de HEPES, et 7,5 ml de TEOA dans une hotte aspirante.
    2. Ajuster le pH à 8,3 avec une solution d'hydroxyde de sodium 1 N par l'addition goutte à goutte avec une pipette Pasteur.
    3. Filtre stérile la solution à travers un 0,2-um filtration sous vide coupe dans 500 ml de verre autoclavée bouteille médias. Aliquoter et stocker à 4 ° C.
  2. Fixer un anneau d'adhésif double-face avec le soutien d'un plat spécialisé de 60 mm de Pétri avec une coupe de trou de 20 mm sur le fond. Laissant l'appui sur la bague adhésive, appuyez sur les bulles d'air se trouvant entre la boîte de Pétri et l'adhésif.
  3. Préparer le matériel. Apportez la synthèse 33 3.4 kDa PEGDA de -80 ° C congélateur et le laisser atteindre la température ambiante. Allumez la source de lumière blanche au moins 15 min avant photopolymérisation hydrogels.
  4. Dans une hotte, ajouter 1 ml de HBS avec TEOA à un, 2 ml Tube ambre centrifugeuse recouvert de papier aluminium (utilisé pour prévenir exposition à la lumière du photoinitiateur, éosine Y). Ajouter 10 pi de 1 mM éosine Y sel disodique DI H 2 O.
  5. Dans une hotte, d'extraire un petit volume de 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) dans un récipient en verre avec une pipette Pasteur. De ce volume, pipette 3,5 pi de NVP dans le tube ambre centrifugeuse avec le HBS, TEOA et éosine Y.
  6. Dans un second tube de 2 ml ambre centrifugeuse de papier d'aluminium (utilisé pour empêcher la photoactivation errante de la solution de prépolymère), ajouter 10 mg de 3.4kDa PEGDA. Ajouter 0,2 mL de la HBS, TEOA, éosine Y, solution NVP pour un 5% p / v solution de pré-polymère PEGDA. Vortex jusqu'à ce que le PEGDA est complètement dissous. L'utilisation d'un appareil de mesure de puissance et d'un détecteur baguette, ajuster l'intensité de la li blancheSource GHT à 95 mW.
  7. Construction d' un poly (diméthylsiloxane) (PDMS) Mold
    1. Construire un moule PDMS 7 sur une plus grande surface (verre, boîte de culture tissulaire en polystyrène) pour faciliter la manipulation et l' assemblage des moules tels que les hydrogels moulés inscrivent dans un cercle de 20 mm de diamètre.
    2. Pour produire un hydrogel de forme rectangulaire avec une épaisseur de 500 um, de placer deux PDMS 500 um d'épaisseur des entretoises sur une surface de PDMS pour créer deux bords hydrogel définis.
    3. Inclure un 300-um PDMS entretoise pour conférer un puits de 300 um de profondeur dans la surface de l'hydrogel, qui est utile pour introduire des fluides.
  8. Introduire à la pipette 60 ul de 5% p / v de solution de pré-polymère PEGDA sur le moule PDMS. Veillez à ne pas introduire de bulles pendant le pipetage.
  9. Et placer un centre [3- (méthacryloyloxy) propyl] triméthoxysilane (TMPSA) fonctionnalisés 7, diamètre 40 mm, # 1,5 lamelle de verre sur le dessus de la solution. Assurez-vous que le coverslIP repose sur les entretoises de PDMS 500 um. L'hydrogel adhère à la lamelle couvre-objet méthacrylé et d'empêcher l'hydrogel de flotter dans la solution.
  10. Placez les PDMS, solution pré-polymère PEGDA et Coverslip l'assemblage sous la source de lumière blanche pendant 3 min.
  11. DI flux de H 2 O entre le moule et la lamelle couvre -objet pour séparer l'hydrogel de PDMS. Rincer l'hydrogel avec DI H 2 O. On sèche les bords de la lamelle couvre -objet avec le tissu de laboratoire. Faites attention à ne pas toucher l'eau ou de la mèche de l'hydrogel.
  12. Après avoir retiré le support de l'adhésif, adhérer la lamelle à la boîte de Pétri préparée et retirez délicatement les bulles d'air entre l'adhésif et le verre. Immerger l'hydrogel dans la boîte de Pétri avec DI H 2 O.
    NOTE: Le moule de PDMS peut être réutilisé pour faire des hydrogels supplémentaires si rincé avec DI H 2 O, séché avec de l' azote, et maintenu exempt de poussière.

5. Réseau microfluidique Fabricating vasculaire dérivés via la dégradation basée au laser

  1. Avec le laser microscope confocal à balayage et le logiciel de microscope sur, sélectionnez l'objectif "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" dans l'onglet "Maintenir". Dans l'onglet "Acquisition", assurez-vous que les lignes nécessaires au laser (514 nm laser à argon et 790 nm 140 fs pulsées Ti: S laser) sont allumés et réchauffés.
  2. Configuration du Hydrogel pour former un canal d' entrée
    1. Monter l'hydrogel et de boîte de Pétri sur l'insert de scène et placer l'insert d'étape sur la platine du microscope. Remplissez la boîte de Pétri avec au moins 5 ml de DI H 2 O. Centre hydrogel et ainsi les caractéristiques de l' oeil avant d' abaisser l'objectif d'immersion dans l'eau dans la DI H 2 O.
      NOTE: Ne pas écraser l'hydrogel avec l'objectif-deux ne devrait jamais toucher!
    2. Pour trouver l'hydrogel, passer à la configuration "Hydrogel visualisation" de l'étape 2.2. Cliquez sur "Live" pour activer la ligne laser, rapprochez ee rapproche objectif de l'hydrogel jusqu'à ce que le signal d'éosine Y (détectée par le détecteur de fluorescence CH1) de la partie supérieure de l'hydrogel peut être vu.
      REMARQUE: Pour trouver l'hydrogel facilement, la puissance pour cent peut être augmentée ou le sténopé peut être ouvert. Une fois que l'objectif se concentre sur l'hydrogel, cependant, laisser tomber la puissance pour cent pour protéger le détecteur de fluorescence et de diminuer le sténopé retour à 1AU pour éviter la sursaturation du détecteur et de trouver avec précision la surface d'hydrogel.
    3. Dans la fenêtre "Stage", marquer les emplacements de haut et en bas de l'hydrogel et du fond du puits.
      REMARQUE: Les valeurs z ici vous aideront à déterminer l'épaisseur de l'hydrogel et de la profondeur du puits.
    4. Utilisez le joystick pour se déplacer dans X et Y pour trouver le bord d'un puits. Placez l'hydrogel à la droite de l'écran, avec le puits à gauche, ou vice versa. Permettre à l'hydrogel pour remplir pas plus de deux tiers du champ de vision.
    5. Déposez le plane de mise au point bas de 150 um dans l'hydrogel en définissant la "Taille de l'étape" à "150" dans la fenêtre "Focus" et en cliquant sur la flèche vers le bas à côté de la case "Z-Position". Répétez l'étape 5.2.4, si nécessaire.
      REMARQUE: La x, y et z de la position de l'orifice d'entrée dépend uniquement de la conception des masques virtuels.
    6. CRITIQUE: Zero X et l'emplacement Y dans la fenêtre "Stage", supprimer tous les autres emplacements marqués, et marquer seulement cet endroit.
      NOTE: Si cette étape est pas effectuée, la macro microscope ne sera pas restaurer correctement les emplacements dans la recette enregistrée précédemment, et l'hydrogel ne sera pas dégradé à l'endroit désiré.
  3. Formant un canal d' entrée
    1. "Snap" une image et dessiner une zone rectangulaire qui sera l'entrée du réseau vasculaire en utilisant le bouton rectangle dans la fenêtre "Régions".
      REMARQUE: Assurez-vous partie de la région se prolonge dans le puits pour veiller à ce que ee entrée reliera le puits au réseau vasculaire.
    2. À côté du ROI généré dans la fenêtre "Régions", sélectionnez "Acquisition" et décochez "Bleach" et "Analyse".
    3. Enregistrer la configuration "Hydrogel Visualisation", décochez "Régions", et modifier la configuration "Formation Channel", mis en place à l'étape 2.3. Dans la configuration "Formation Channel", sélectionnez "Régions" à nouveau.
      NOTE: Lors de la commutation entre le "Hydrogel Visualisation" et les configurations "Formation Canal", assurez-vous de désélectionner les régions en haut à gauche de l'écran. Parfois, la mise à l'échelle des régions peut changer de façon inattendue entre configurations si cela ne se fait pas.
    4. Dans la configuration "Formation Channel", assurez-vous que seuls les «régions» et «Z-Stack" sont sélectionnés. Dans la fenêtre "Z-Stack", cliquez sur le bouton "Center" en haut, puis le cul "Center"sur-dessus "Offset" pour définir le centre de la z-pile comme Z-position actuelle. Selon la taille de l'entrée doit être, définir le nombre de "tranches" avec un "intervalle" de "1". La taille de la Z-stack sera affichée sous "Range".
    5. Vérifier que "Speed" dans la fenêtre "Mode d'acquisition" est réglé sur "3" et que le "pourcentage de puissance" dans la fenêtre "Chaînes" est réglé sur "100". Enregistrez la configuration et cliquez sur le bouton "Démarrer Experiment".
      NOTE: La macro microscope est pas nécessaire pour dégrader la même forme simple sur plusieurs plans, interprété ici pour générer un canal d'entrée. La macro est utilisée uniquement lorsqu'une dégradation de régions différentes sur chaque plan individuel, et il est utilisé pour stocker les masques virtuels au sein d'une recette.
    6. Pour visualiser l'hydrogel lors de la dégradation, soit augmenter le «Gain (Master)" dans la fenêtre "Canaux" si la région en til champ de vision est noir, ou diminuer le «Gain (Master)" si la région est blanche.
      REMARQUE: La formation de bulles ici est une indication de la dégradation d'hydrogel induite par laser.
    7. Pour dégrader l'entrée plusieurs fois au lieu d'une seule fois, ajuster les "Cycles" dans la fenêtre "Time Series".
    8. Dans la configuration "Hydrogel Visualisation", cliquez sur "live" pour veiller à ce que l'entrée a été formé.
  4. Configuration de l'Hydrogel pour générer le réseau microfluidique
    1. Dans la fenêtre "Régions", charger un fichier .OVL de la z-pile de masques virtuels et cliquez sur le bouton fléché pour voir les ROIs dans le domaine de la vue.
    2. Cliquez sur "Live" pour vivre analyser la configuration "Hydrogel Visualisation" et utilisez le joystick ou la fenêtre "Stage" pour positionner l'hydrogel en X et Y, de telle sorte que l'entrée se connecte à l'emplacement correct dans le réseau vasculaire.
      REMARQUE: Assurez-vous que leROIs du masque virtuel se chevauchent légèrement avec l'entrée formée précédemment.
    3. Déposez le plan de mise au point bas de 50 um à partir du Z-emplacement centré précédent, ou 200 um de la surface de l'hydrogel, en utilisant la "Taille de l'étape" dans la fenêtre "Focus" et en cliquant sur la flèche vers le bas à côté de la "Z-Position " boîte. Ce sera la première position dans la macro de microscope.
      REMARQUE: La distance réelle de se déplacer dans la direction z dépend de la conception du réseau. Assurez-vous que le réseau désiré ne se prolonge pas au-delà de la surface supérieure ou inférieure de l'hydrogel dans la direction z.
    4. CRITIQUE: Zero les Les emplacements X et Y dans la fenêtre "Stage", supprimer tous les autres emplacements marqués, et marquer seulement cet endroit.
      NOTE: Ce sera le point de départ dans la macro microscope. La recette travaillera son chemin de retour vers la surface de l'hydrogel.
    5. "Snap" une image dans la configuration "Hydrogel Visualisation", supprimer et deselect "Régions", et enregistrer la configuration.
  5. Génération du réseau microfluidique
    1. Modification de la configuration "Formation Channel", et sélectionnez seulement le "Time Series" et les fenêtres "blanchissants". Vérifiez que les paramètres de la "série Time" et les fenêtres "blanchissement" sont comme ils ont été initialement fixées dans les étapes 2.3.7 et 2.3.8.
    2. Réglez le "Speed" dans la fenêtre "Mode d'acquisition" à "8" et le pouvoir de pour cent de la ligne laser à "0,2" dans la fenêtre "Chaînes". Enregistrez la configuration.
    3. Ouvrez la macro microscope suite à l'étape 3.5. Dans l'onglet "Enregistrement" de la macro, sélectionnez la recette préalablement fabriqué à partir de l'étape 3, puis cliquez sur "Appliquer".
      REMARQUE: Ne cliquez pas sur "Store" ou la recette sera écrasé!
    4. Vérifiez les paramètres sur tous les onglets et vérifiez que les masques virtuels (fichiers .OVL) sont toujours correctement associés à til Z emplacements dans la liste déroulante. Vérifiez également que le premier Z-emplacement correspond à l'emplacement marqué dans la fenêtre "Stage" du logiciel de microscope.
      REMARQUE: Contre toute attente intuitive, le deuxième emplacement dans la liste déroulante sera physiquement au-dessus du premier emplacement, en tant que macro microscope va faire son chemin à partir du bas de l'hydrogel (la plus éloignée de l'objectif) au sommet de l'hydrogel (la plus proche du objectif).
    5. Enregistrer la configuration "Formation Channel" à nouveau, puis cliquez sur "Mise à jour" dans la macro microscope. Cliquez sur "Non" à "Ecraser actuelle Liste de localisation?", Puis cliquez sur "Démarrer" dans la macro microscope pour commencer la recette.

6. Visualisation du réseau microfluidique

  1. Pour voir l'hydrogel et le réseau microfluidique formé après la dégradation, fermez la macro microscope. Passer à la configuration "Hydrogel visualisation" pour voir le si éosine Ygnal de l'hydrogel; le réseau dégradé apparaît sombre.
    NOTE: La dégradation d'hydrogel ne peut pas être visualisé tandis que la macro de microscope est en cours d'exécution.
  2. Pour afficher le réseau microfluidique spécifiquement, utilisez la configuration "Hydrogel Visualisation" à une puissance laser inférieure pour permettre l'imagerie de fluorescéine introduit (FITC) dextran marqué au, qui a un signal lumineux que le signal éosine Y natif de l'hydrogel.
  3. Avant l'introduction de dextran marqué par fluorescence, mèche eau du puits dans l'hydrogel en utilisant des tissus de laboratoire. Introduire à la pipette dans 10 ul de 5 mg / ml 2,000 kDa dextrane marqué au FITC DI H 2 O (pré-filtré à travers un filtre à seringue de 0,2 um).
    REMARQUE: Utilisez un dextran dimensionné 2.000 kDa ou plus pour empêcher la diffusion dans le gel. Si l'imagerie pendant plus de 30 minutes, utiliser un stade incubé avec 60% d'humidité (ou supérieur) pour éviter le dessèchement d'hydrogel et de l'évaporation de l'eau de la solution de dextrane marqué au FITC.
  4. Retirer l'hydrogel ae boîte de Petri de la scène et marquer la boîte de Pétri pour permettre la localisation aisée du réseau vasculaire formé au cours de l'expérimentation plus tard.

Representative Results

Pour démontrer la mise en œuvre guidée par l' image, la dégradation d'hydrogel à base de laser pour générer un réseau microfluidique 3D, dérivé vasculaire, nous avons utilisé une pile d'images 3D du cerveau de souris vasculature qui a été acquis par l' intermédiaire de microscopie à balayage de couteau tranchant (KESM) 26, 27 . Une région sélectionnée en 3D de la grande microvasculaire ensemble de données a été convertie en une série de masques virtuels pour la formation d'un réseau microfluidique guidée par l'image, comme décrit ci-dessus. Après la fabrication, le réseau microfluidique résultant a été perfusé avec une solution de FITC, 2000 kDa dextrane et imagée par microscopie confocale. La pile d'images du système vasculaire in vivo qui définit l'architecture de réseau (figure 1A et C) et le réseau microfluidique fabriqué (Figure 1 B et D) ont été utilisés pour générer Z-projections (figures 1A et B) et rendus 3D (figure 1c et ré in vivo. La technique se prête à la fabrication de réseaux contenant une large gamme de diamètres; au sein de la figure 1, les canaux allant de 3,3 à 28,8 um de diamètre ont été générés. Notez que la structure rectangulaire plus grande dans la partie supérieure gauche de la figure 1B et dans le coin gauche de la figure 1D est le canal d'entrée pour introduire le flux dans le réseau.

Figure 1
Figure 1: Vascular-Derived microfluidique réseau. Une série de masques virtuels, provenant d'une pile d'images du système vasculaire du cerveau de souris (A et C), ont été utilisés pour fabricate un réseau microfluidique biomimétique 3D incorporé dans un hydrogel PEGDA (B et D) par l' intermédiaire de la dégradation à base de laser guidée par l' image. Le réseau microfluidique a été perfusée avec du dextrane 2000 kDa marquée par FITC et imagée par microscopie confocale. Z-projections (A et B) et des rendus 3D (C et D) des deux réseaux démontrent la capacité de générer des réseaux microfluidiques qui récapitulent la densité, l' organisation et l' architecture globale de la vascularisation in vivo. La flèche (D) marque l'entrée rectangulaire créé pour introduire le dextran. La barre d'échelle représente 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nous avons mis en œuvre deux méthodes, des têtes de pression et des pompes à seringues, pour lancer le fluide ffaible dans ces réseaux microfluidiques embarqués. Par exemple, un canal rectangulaire 30 de 30 um a été fabriqué pour connecter deux puits dans un hydrogel PEGDA micromolded (figure 2A), avec l' écoulement du fluide entraîné par l' intermédiaire d' une tête de pression 7. Généré dans le puits à gauche, la tête de pression induite écoulement à travers le canal et dans le puits sur la droite. Dans la figure 2A, un front initial de tétraméthylrhodamine (TRITC) marqué à 70 kDa dextran a été observée en mouvement à travers le canal en utilisant la microscopie time-lapse. Plus tard, dans la figure 2B, un diamètre de 10 um polystyrène fluorescent sphère coulait du puits à gauche, à travers le canal, pour le bien sur la droite. Avec la durée du débit contrôlé par le volume de fluide présent dans le puits micromolded à l'entrée, et le débit contrôlé par le gradient hydrostatique généré entre l'entrée et de sortie ainsi, le flux de tête commandé par la pression dans hydrogels micromolded fournit une méthode simple pour l'écoulement dansla production, sans la nécessité d'un boîtier externe ou une pompe à seringue.

Figure 2
Figure 2: Pression Débit de Head-Driven dans un Micromolded PEGDA Hydrogel. PEGDA a été micromolded pour former un hydrogel contenant deux puits reliés par un micro-canal intégré. Une tête de pression a été générée dans le puits à gauche pour amorcer l' écoulement du TRITC marqué, 70 kDa dextran (A1-A3) et un polystyrène sphère de 10 pm (B1-B3) à travers un canal rectangulaire 30 de 30 um d'un puits à la autre. La barre d'échelle représente 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Sinon, pour générer un flux constant de fluide au sein des réseaux microfluidiques, pompe à seringue fbas peut être initiée par photopolymérisation l'hydrogel à l'intérieur d'un dispositif microfluidique secondaire avec des orifices d'entrée et de sortie pour la pompe de seringue interfaçage. Sur la figure 3A, un dispositif microfluidique disponible dans le commerce, pré-fabriqué est représenté avec une bande de 1 mm d'hydrogel photopolymérisé sur toute la largeur du dispositif 7. la dégradation basée au laser a été mis en œuvre pour fabriquer des réseaux et canaux microfluidiques en hydrogels logés en utilisant le même protocole décrit ici pour autoportant hydrogels. Débit de la pompe générée par la seringue peut être vu sur la figure 3B, où un canal cylindrique de diamètre de 20 um a été fabriqué dans un hydrogel logé dans un dispositif microfluidique. Dans ce canal 20 um de diamètre, individuellement 2 um fluorescentes sphères de polystyrène sont facilement résolus sans écoulement de fluide (figure 3B1), alors que lorsqu'une 5 pi / s , le débit est appliquée, les sphères se déplacent dans le champ de vision, comme en témoignent les stries (figure 3B2 </ Strong>). Cette même approche a été utilisée pour induire l' écoulement à travers un réseau vasculaire dérivée 2D pour surveiller l' écoulement du TRITC marqué, 65 kDa dextran à travers le réseau et la diffusion dans l'hydrogel environnant (figure 3C).

Figure 3
Figure 3: Flow Syringe Pump-Driven dans PEGDA hydrogels polymérisé dans Caissons microfluidiques. Un dispositif disponible dans le commerce, préfabriqué microfluidique (A) avec un 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) microcanal loge un photopolymérisée 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA hydrogel, indiqué par le flèche noire. Un canal cylindrique de diamètre de 20 um a été dégradé par l'hydrogel et 2 um sphères de polystyrène ont été pompés à travers le dispositif (B). Les sphères sont clairement résolues sans écoulement de fluide (B1), mais ils apparaissent sous forme de stries à un débit de 5 pl / s(B2). Dans un autre hydrogel logé un réseau 2D vasculaire dérivé a été fabriqué et TRITC marqué au 65 kDa dextran a été pompée à travers le réseau (C). La microscopie time-lapse a été utilisé pour surveiller le dextran fluorescent tel qu'il remplit les canaux et diffuse dans l'hydrogel environnants. Les flèches blanches dans (B) et (C) indiquent le sens d'écoulement du fluide. La barre d'étalonnage (C) indique l'intensité du dextran fluorescent. Les barres d'échelle représentent 20 um (B1) et (B2) et 50 um (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Critique en remplaçant les fonctions standard du logiciel de microscope pour permettre l'utilisation de masques virtuels pour, la dégradation à base de laser guidée par l'image, la macro microscope doit être installé et manipulé avec précaution. Comment les interfaces logicielles de microscope avec la macro microscope peuvent parfois être contre-intuitif, et beaucoup d'efforts ont été investis dans la détermination des paramètres optimaux dans les deux programmes pour développer cette méthode. Une compréhension générale de balayage laser de base l'utilisation du microscope confocal est recommandé, en particulier avec le "Stage" et les fenêtres "Focus" pour trouver et correctement le positionnement de l'hydrogel dans les x, y et z dimensions, avant de tenter la dégradation à base de laser. En outre, la fabrication d'un canal d'entrée est critique pour le protocole; espèces fluorescentes suspendues doivent être en mesure d'entrer dans les systèmes microfluidiques pour l'imagerie et la caractérisation réussie du réseau. Il est important de noter que ce protocole applique à un particulier au lasermicroscope confocal à balayage configuré avec un laser à impulsions femtoseconde spécifique, exécutant des versions spécifiques du logiciel de microscope et la macro microscope (voir les détails dans la liste des matières spécifiques / Équipement). Nous avons découvert que les nouvelles versions de la macro microscope manque le contrôle et la fonctionnalité nécessaire nécessaire pour le contrôle de laser guidée par l'image. Alors que d'autres plates-formes de microscope et des sources laser à impulsions peuvent être utilisés, ce protocole spécifiquement applicable à ce système et devra être modifiée en fonction de la plate-forme, une source laser, et le logiciel mis en oeuvre. Les principes sous-jacents à travers ce protocole appliquent toujours, cependant.

Une modification possible à ce protocole implique la modification de la composition d'hydrogel. Ici, nous avons utilisé 5% en poids, 3,4 hydrogels kDa PEGDA, mais la dégradation à base de laser (à des fins en dehors de la génération du réseau microfluidique) a été mis en œuvre pour dégrader les deux hydrogels synthétiques et naturelles, y compris pégylé fibrine21,22 plasmine, protéine de soie hydrogels 23 et 24 du collagène. Réglage de la puissance du laser, la vitesse de balayage, l'espacement entre les Z-tranches, et le nombre de répétitions aidera à déterminer les paramètres optimaux pour fabriquer des réseaux microfluidiques dans d'autres formulations d'hydrogel.

Une limitation du courant de la technique est le volume global d'hydrogel qui peut être dégradé dans une quantité de temps possible. Pour créer des vides ouverts ou des caractéristiques microfluidiques au sein de l'hydrogel, le laser temps de séjour doit être égale ou supérieure à 8,96 ps / pixel (ou une vitesse de balayage laser de 0,021 um / uS) lorsque vous utilisez une fluence laser de 37,7 nJ / um 2. Avec ces paramètres, il faut 1,4 heures pour dégrader les vaisseaux dans un volume de 0,014 mm 3 (comme on le voit sur la figure 1). En utilisant un temps d'arrêt du laser de 4,48 ps / pixel ou au-dessous, l'énergie fournie ne suffit pas pour la dégradation totale de la formulation d'hydrogel utilisé ici. La mise en œuvre d'un hydrogel différentcomposition pourrait surmonter cette limitation. L'utilisation de gels photolabiles qui contiennent des composants sensibles à la lumière 34-36 ou hydrogels qui ont un grand multiphotonique sections 21-24 sont de bonnes options qui permettraient d'utiliser moins d' énergie et se traduirait par une dégradation plus rapide. En ce qui concerne les limitations dimensionnelles, les caractéristiques ont été fabriquées jusqu'à 1,5 mm de profondeur dans l'hydrogel 7. L'atteinte de la profondeur est fonction de la distance de travail de l'objectif et peut être augmentée en utilisant des objectifs de la distance de travail ultra-longues optimisés pour l' imagerie in vivo. Le canal le plus petit mesuré 7 créé en utilisant un 20X (NA1.0) objectif d'immersion de l' eau avait une largeur de 3,3 um et une profondeur de 8,9 um, ce qui est comparable à la taille des plus petits canaux générés dans la figure 1. Alors que d' autres laboratoires ont utilisé des objectifs NA inférieurs 21,23,24, nous prévoyons que les réseaux microfluidiques avec de petites fonctionnalités peuvent être générées à l' aide de hautobjectifs er NA au détriment d'une distance de travail réduite. En fin de compte, cependant, la résolution de la technique est une fonction de la fonction d'étalement de point du faisceau laser focalisé, les propriétés de balayage laser, la quantité d'énergie délivrée par le laser, et les propriétés d'absorption laser du matériau se dégradent.

En outre, les propriétés laser (vitesse, fluence, l'espacement entre les masques virtuels, et le nombre de répétitions) doivent être optimisées en fonction des propriétés d'hydrogel (densité de réticulation, macromère / poids de monomère moléculaire, pour cent en poids, et le type d'hydrogel: à base de protéines par rapport synthétique ), car ceux-ci intrinsèquement modifier les interactions avec le laser et donc la résolution ultime du processus. En tant que l'énergie fournie est également influencée par l'objectif utilisé, une optimisation supplémentaire est nécessaire lors de la commutation entre les objectifs. En ce qui concerne les coûts, l'accès à un microscope avec un laser pulsé est nécessaire, et tandis que de nombreux différents objectives peuvent être utilisés, ceux qui ont une haute NA et longue distance de travail (pour l' imagerie in vivo) peut être coûteux.

Au- dessus et au - delà du protocole détaillé ici, les réseaux microfluidiques générés en utilisant cette technique peuvent également être fonctionnalisés avec des peptides de cellules-adhésif post-canal fabrication pour induire l' adhérence des cellules endothéliales et la formation de lumière 7. En outre, l'incorporation de séquences de peptides cellulaires dégradable dans le matériau en vrac avant 9 pour canaliser la dégradation pourrait permettre l'étude de la migration des cellules dans et à travers l'hydrogel. Pour la fluidification continue du réseau microfluidique au sein de l'hydrogel, les hydrogels peuvent être photopolymérisées dans des dispositifs fluidiques ou des boîtiers plus importants, comme le montrent les figures 2 et 3 7.

La génération de réseaux vasculaires par auto-assemblage vasculogenic ou angiogénique 8-12 fournit une approche simple pour induire vascularization à travers un volume relativement important d'hydrogel. Bien que cette approche se traduit par des réseaux fluidiques irrigables, il est difficile de contrôler directement la taille, la tortuosité, la densité et l'architecture globale du réseau. En raison de cette limitation, le profil d'écoulement et les vitesses de cisaillement dans le système vasculaire peuvent varier entre les expériences. Alternativement, des techniques de microfabrication 13-16 permettent un contrôle direct sur l' architecture du réseau , mais sont souvent limités par leur incapacité à générer des petits canaux, capillaires de taille ou la fabrication de réseaux denses qui imitent l'architecture vasculaire in vivo. Alors que l'hydrogel technique de dégradation à base de laser décrite ici a été récemment reconverti pour la génération microfluidique, il surmonte simultanément le contrôle architectural et les limites fondées sur la taille des méthodes de microfabrication existantes en permettant la création de réseaux microfluidiques biomimétiques 3D qui récapitulent la densité, la tortuosité, gamme de taille et architectur globalee du système vasculaire in vivo. En outre, de multiples réseaux fluidiques peuvent être générés dans un seul hydrogel, permettant l'étude du transport inter-réseau 7. Pour les applications d'ingénierie tissulaire qui cherchent à répliquer plus étroitement dans les processus de transport in vivo in vitro, les réseaux microfluidiques hydrogel intégré à haute résolution présentées ici sont bien adaptés. Nous prévoyons que ce protocole sera utile dans le développement de constructions de tissu que le transport plus précisément mimique in vivo pour une utilisation en tant que dispositifs de dépistage de drogues et dans les modèles de la maladie in vitro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATLAB Mathworks R2015a named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH version 1.51a named "image processing software" in protocol
LSM 780 Confocal Microscope Zeiss named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation
Zen 2010B SP1 Zeiss release version 6.0 named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780
Multitime, 2010 Zeiss v16.0 named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen)
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm Zeiss 421452-9880-000 for use on Zeiss LSM-780
Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser Coherent named "high-powered pulsed laser" in protocol
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Triethanolamine (TEOA) Sigma-Aldrich 90279-100ML flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G
150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane VWR 10040-460
PEGDA synthesized in house refer to source 33 for synthesis methods; store under argon
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E6003-25G
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood
3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil Thomas Goldkamp 37728
Flexmark 90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 backing for handling of double coated tape
Model SC Plotter (adhesive cutter) USCutter SC631E used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes
60 mm Petri Dish with 20 mm Hole MatTek Corporation P60-20-F-NON
High Intensity Illuminator (white light source) Fiber-Lite 4715MS-12WB10
Power Meter Newport 1916-R detect power at 524 nm when using white light source
Slim Profile Wand Detector Newport 918D-ST for use with power meter
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round synthesized in house refer to source 7 for methods
Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Life Technologies D7137 can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel
1 mL Syringe, Luer-Lok BD 309628
Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602
sticky-Slide VI0.4  Ibidi 80601 microfluidic devices that can be used to house hydrogels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, (5), 1799-1803 (2011).
  2. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32, (8), 760-772 (2014).
  3. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14, (4), 248-260 (2015).
  4. Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17, (3-4), 173-181 (2012).
  5. Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, (1), 214-219 (2015).
  6. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7, (5), 525-533 (2015).
  7. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. (2016).
  8. Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22, (21), 4511-4518 (2012).
  9. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24, (17), 2344-2348 (2012).
  10. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, (8), 1489 (2013).
  11. Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12, (7), 2715-2722 (2011).
  12. Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. (2003).
  13. He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25, (11), 2491-2500 (2014).
  14. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2, (4), 265-271 (2003).
  15. Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23, (24), H178-H183 (2011).
  16. Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26, (19), 3124-3130 (2014).
  17. Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (34), 13515-13520 (2012).
  18. Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. (2015).
  19. Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270, (1516), 755-763 (2003).
  20. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81, (8), 1015-1047 (2005).
  21. Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96, (11), 4743-4752 (2009).
  22. Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, 116-119 (2009).
  23. Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, (39), 12052-12057 (2015).
  24. Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8, (2), (2011).
  25. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101, (4), 1337-1354 (2012).
  26. Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
  27. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2, (10), 2888-2896 (2011).
  28. Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
  29. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  30. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. (2015).
  31. Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9, (6), 6128-6138 (2015).
  32. Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
  33. DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109, (1-3), 139-148 (2005).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3, (12), 925-931 (2011).
  35. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324, (5923), 59-63 (2009).
  36. Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6, (20), 5100-5108 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics