छवि निर्देशित, लेजर आधारित संवहनी व्युत्पन्न Microfluidic नेटवर्क का निर्माण

1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Houston, 3Delaware Biotechnology Institute
Bioengineering
 

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Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. J. Vis. Exp. (119), e55101, doi:10.3791/55101 (2017).

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Abstract

यह विस्तृत प्रोटोकॉल संवहनी व्युत्पन्न microfluidic PEGDA हाइड्रोजेल में एम्बेडेड नेटवर्क के निर्माण के लिए छवि निर्देशित, लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट के कार्यान्वयन की रूपरेखा। यहाँ, हम आभासी मास्क उस छवि को निर्देशित लेजर नियंत्रण के लिए अनुमति की रचना का वर्णन; एक micromolded PEGDA हाइड्रोजेल, microfluidic नेटवर्क के निर्माण और दबाव सिर संचालित प्रवाह के लिए उपयुक्त की photopolymerization; सेटअप और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर स्कैनिंग confocal एक femtosecond स्पंदित तिवारी के साथ रखा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें: एस लेजर हाइड्रोजेल गिरावट प्रेरित करने के लिए; और गढ़े microfluidic नेटवर्क की इमेजिंग फ्लोरोसेंट प्रजातियों और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग। प्रोटोकॉल के लिए बहुत, उचित स्थापना और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और माइक्रोस्कोप मैक्रो के कार्यान्वयन पर ध्यान केंद्रित किया है के रूप में इन microfluidic निर्माण प्रयोजनों कि जटिलताओं के एक नंबर के होते हैं के लिए एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। इस तकनीकों की छवि को निर्देशित घटकई जिससे रचनात्मक microfluidic डिजाइन के लिए और लगभग किसी भी विन्यास के जटिल सिस्टम microfluidic के निर्माण के लिए अनुमति देने के लिए, 3 डी छवि के ढेर या उपयोगकर्ता जनित 3 डी मॉडल के कार्यान्वयन के लिए अनुमति देता है। ऊतक इंजीनियरिंग में एक उम्मीद प्रभाव के साथ, तरीकों इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित अंग और मानव-ऑन-ए-चिप उपकरणों के लिए उन्नत biomimetic microtissue निर्माणों के निर्माण में सहायता कर सकता है। जटिल वास्तुकला, टेढ़ा-मेढ़ापन, आकार, और इन विवो वाहिका का घनत्व नकल उतार द्वारा, आवश्यक जैविक परिवहन प्रक्रियाओं इन निर्माणों में दोहराया जा सकता है, दवा फार्माकोकाइनेटिक्स और रोग का अधिक सटीक इन विट्रो मॉडलिंग के लिए अग्रणी।

Introduction

नाड़ी तंत्र, दोनों लसीका और cardiovasculature से मिलकर, रूपों अत्यधिक सघन नेटवर्क है कि पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के परिवहन के लिए और चयापचय अपशिष्ट को हटाने के लिए आवश्यक हैं। तदनुसार, vascularized ऊतकों की कोशिकाओं में रहने वाले कभी नहीं एक पोत 1 से अधिक से अधिक 50-100 माइक्रोन दूर हैं। इन विट्रो में इन विवो संवहनी वास्तुकला पुन: पेश करने की क्षमता सही इंजीनियर निर्माणों का उपयोग करने में विवो परिवहन प्रक्रियाओं मॉडल करने के लिए महत्वपूर्ण है। हाल ही में एक 3,4 और रोग मॉडलिंग 5,6 स्क्रीनिंग उच्च throughput दवा के लिए अंग-ऑन-ए-चिप उपकरणों 2 विकसित करने के लिए ड्राइव के साथ, तरीकों microfluidic नेटवर्क है कि पुनरावृत्ति सिंथेटिक या प्राकृतिक हाइड्रोजेल में इन विवो तरह परिवहन बैठक कर रहे हैं बनाने के लिए महत्वपूर्ण हित। इन उपकरणों में इस्तेमाल किया microtissues की biomimicry बढ़ाने के लिए, हम एक छवि निर्देशित, लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट तरीका है कि तीन-dimensiona का इस्तेमाल विकसितटेम्पलेट्स के रूप में देशी वाहिका के एल (3 डी) छवि के ढेर संवहनी व्युत्पन्न microfluidic PEGDA में एम्बेडेड हाइड्रोजेल 7 नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए। इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर स्कैनिंग confocal एक femtosecond स्पंदित लेजर छवि निर्देशित, लेजर आधारित गिरावट के माध्यम से PEGDA हाइड्रोजेल में संवहनी व्युत्पन्न, biomimetic microfluidic नेटवर्क के निर्माण के लिए के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के उपयोग की रूपरेखा।

हाइड्रोजेल fluidize करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण vasculogenic 8-10 या 10-12 एन्जियोजेनिक endothelial सेल आत्म विधानसभा और तकनीक microfabrication की प्रेरण endothelialization 13-16 के लिए पूर्व निर्धारित चैनल बनाने के लिए शामिल हैं। आत्म इकट्ठे नेटवर्क घनत्व और microvasculature की जटिल संरचना पुनरावृत्ति है, वे अक्सर इन विवो नेटवर्क 11,17,18, जो दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए मॉडलिंग परिवहन में समस्याग्रस्त किया जा सकता है और अधिक से अधिक प्रवेश के योग्य हैं। आत्म इकट्ठे नेटवर्क physiolog से मिलकर बनता हैically प्रासंगिक, केशिका आकार के जहाजों, लेकिन वे बड़े धमनिका आकार के जहाजों को पैदा करने में सीमाओं के कारण थोक तरल पदार्थ के प्रवाह के साथ एकीकृत करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इन नेटवर्कों का विधानसभा पर कोई सीधा नियंत्रण नहीं है अत: अंतिम वास्तुकला यह मुश्किल बना रही है बार बार एक ही द्रव का प्रवाह और परिवहन गुणों के साथ नेटवर्क के उत्पादन के लिए नमूने के लिए नमूना से भिन्न हो सकते हैं।

3 डी, repeatable ज्यामिति और अच्छी तरह से परिभाषित वास्तुकला के साथ हाइड्रोजेल एम्बेडेड microfluidic नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए, microfabrication तकनीकों का एक नंबर मॉड्यूलर विधानसभा 13, बलि सामग्री 16, प्रत्यक्ष लिखने विधानसभा 14, और सर्वदिशात्मक मुद्रण 15 के 3 डी मुद्रण सहित विकसित किया गया है। इन तरीकों, microfluidic वास्तुकला, और इसलिए द्रव का प्रवाह और परिवहन संपत्तियों को लागू करने, बार-बार कई निर्माणों भर में गढ़े जा सकता है। इन तरीकों में से एक प्रमुख सीमा है, तथापि, microf बनाने के लिए अक्षमता हैकेशिका आकार सुविधाओं के साथ luidic नेटवर्क, 4 से 10 माइक्रोन से 19। अधिकांश तकनीक microfabrication अक्सर व्यास 13,16 में 150 से 650 माइक्रोन से लेकर सुविधाओं तक सीमित हैं। कुछ मौजूदा तकनीक प्रत्यक्ष लिखने विधानसभा के लिए 14 एक विस्तृत व्यास रेंज भर में चैनलों के साथ श्रेणीबद्ध नेटवर्क पैदा करने, 10 से 300 माइक्रोन के लिए सक्षम हैं, और 18 के लिए सर्वदिशात्मक मुद्रण 15 के लिए 600 माइक्रोन, लेकिन वे घने नेटवर्क या उत्पन्न करने की क्षमता में सीमित कर रहे हैं एक भी निर्माण 7 भीतर करीब निकटता में कई microfluidic नेटवर्क का उत्पादन।

इन सीमाओं से कुछ दूर करने के लिए, हम एक छवि निर्देशित, लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट तकनीक है कि biomimetic की repeatable निर्माण, श्रेणीबद्ध microfluidic नेटवर्क है कि इन विवो microvasculature की वास्तुकला पुनरावृत्ति की अनुमति देता है विकसित की है। ऐसा करने के लिए, एक 790 एनएम, 140 femtosecond (एफएस) स्पंदित लेजर 80 मेगाहर्ट्ज पर काम कर रेखापुंज-स्कैन रहा हैn एक हाइड्रोजेल भीतर 3 डी स्थानों वांछित है, के रूप में विवो वाहिका की छवियों से परिभाषित किया। हम अटकलें के रूप में पानी फैलता 20 कि गिरावट प्रक्रिया लेजर प्रेरित ऑप्टिकल पानी के एवज में प्लाज्मा गठन पानी के बाद तेजी से विस्तार thermoelastic हाइड्रोजेल के स्थानीय गिरावट टूटने,,, और के माध्यम से चल रही है। इस तंत्र प्रोटीन आधारित हाइड्रोजेल 21-24 की लेजर आधारित गिरावट से थोड़ा भिन्न होता है। PEGDA है, जो एक कम multiphoton पार अनुभाग के विपरीत, प्रोटीन अक्सर एक बड़े multiphoton पार अनुभाग है और इसलिए एक multiphoton अवशोषण प्रेरित रासायनिक टूटना 23 के माध्यम से अपमानित कर रहे हैं। छवि निर्देशित microfluidic नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए, लेजर शटर की छवि व्युत्पन्न आभासी मास्क, जो ब्याज 9 के क्षेत्रों है कि microfluidic वास्तुकला को परिभाषित की पच्चीकारी से मिलकर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम 3 डी संवहनी व्युत्पन्न biomimetic microfluid के निर्माण की क्षमता का प्रदर्शन कियाआईसी नेटवर्क है, जो करने के लिए इन विवो वाहिका के घने और कपटपूर्ण वास्तुकला पुनरावृत्ति, क्रम में स्थानीय स्तर पर गिरावट के दौरान दिया ऊर्जा की मात्रा बदलकर हाइड्रोजेल के porosity नियंत्रित करते हैं। हम भी दो स्वतंत्र microfluidic नेटवर्क है कि करीब निकटता (15 माइक्रोन) में एक दूसरे से लिपटना लेकिन सीधे कनेक्ट कभी नहीं 7 उत्पन्न करने में सक्षम किया गया है। हम यह भी Arginine ग्लाइसिन Aspartic एसिड-सेरीन (RGDS), endothelial सेल आसंजन और लुमेन गठन 7 बढ़ावा देने के लिए इंटीग्रिन ligating पेप्टाइड अनुक्रम के साथ पोस्ट गिरावट functionalization के माध्यम से लेजर अपमानित microchannels endothelialize करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है।

इस प्रोटोकॉल के साथ, PEGDA हाइड्रोजेल में जटिल microfluidic नेटवर्क की पीढ़ी के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप कई विश्वविद्यालय परिसरों पर सुलभ का उपयोग कर छवि निर्देशित, लेजर आधारित गिरावट के माध्यम से संभव बनाया है। गिरावट प्रक्रिया डिजिटल, आभासी मास्क द्वारा निर्देशित है के रूप में, इस Fabrication तकनीक आवेदनों की एक विस्तृत विविधता में इसके उपयोग की अनुमति के microfluidic नेटवर्क के रचनात्मक डिजाइन के लिए उत्तरदायी है। हम आशा करते हैं कि यहाँ वर्णित विधि जैविक प्रक्रियाओं परिवहन मॉडलिंग दवा परिवहन 2 में महत्वपूर्ण नकल करने में सक्षम biomimetic अंग और मानव-ऑन-ए-चिप उपकरणों को डिजाइन करने में सबसे लाभप्रद होगा। इस निर्माण तकनीक को भी कैंसर मेटास्टेसिस 5,6 और रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल 25 सहित इन विट्रो रोग मॉडल, की पीढ़ी के लिए ब्याज की हो सकती है। लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट पहले से neuronal परिणाम 21-23 के मार्गदर्शन के लिए पटरियों बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इस तकनीक की छवि को निर्देशित विस्तार उपयोगकर्ता परिभाषित 3 डी स्थानिक व्यवस्था में कोशिकाओं की स्थिति के लिए उन्नत ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों में उपयोगी साबित हो सकता है।

Protocol

1. आभासी मास्क सृजन

नोट: माउस मस्तिष्क microvasculature के एक 3 डी छवि ढेर, इस प्रोटोकॉल के लिए microfluidic मॉडल के रूप में चुना गया था एक बहुत बड़ा एक पूरे माउस मस्तिष्क microvasculature की छवियों वाले डाटासेट से मारी गईं गया है। माईक्रवैस्कुलर छवियों चाकू की धार स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (KESM), 26, 2 के माध्यम से हासिल किया गया है; इसी तरह के microvascular डेटा KESM माउस ब्रेन एटलस 28 के माध्यम से खुले तौर पर उपलब्ध हैं।

  1. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर 29 ओपन और खुले और देशी वाहिका के 3 डी TIF छवि ढेर फसल ताकि वांछित microfluidic नेटवर्क, हाइड्रोजेल भीतर उत्पन्न करने के लिए, एक 450 माइक्रोन x 450 माइक्रोन x 1.5 मिमी में फिट बैठता है (Z से y द्वारा एक्स) खिड़की। ऐसा करने के लिए, वांछित क्षेत्र के चारों ओर एक वर्ग को आकर्षित और क्लिक करें "छवि" → "फसल"। एक वांछित टुकड़ा में "छवि" → "नकली" और प्रकार क्लिक करके जेड दिशा में स्लाइस हटायेसीमा होती है।
    नोट: यह है कि वांछित सुविधाओं को देखने के क्षेत्र के भीतर फिट (y द्वारा एक्स) (सुनिश्चित करता 531.2 x 531.2 माइक्रोन कब और 2884 x 2884 पिक्सल के एक फ्रेम का आकार 0.8 की एक ज़ूम के साथ एक 20X (NA1.0) पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग एक 20X (NA1.0) पानी विसर्जन उद्देश्य के लिए एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन) और काम दूरी (जेड) के साथ। अज्ञात हैं, तो अन्य प्रणालियों के लिए देखने के क्षेत्र वांछित उद्देश्य और सेटिंग्स के साथ एक छवि प्राप्त करने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
  2. छवि ढेर बारी बारी से इतना है कि सुविधाओं के लिए मुख्य रूप से, रेखापुंज स्कैनिंग की दिशा, या एक्स-दिशा के साथ गठबंधन कर रहे हैं "छवि" → क्लिक करके → "घुमाएँ" "परिणत"। इस बार निर्माण के लिए आवश्यक कम हो जाती है।
  3. फसली छवि ढेर पैमाने पर इतना है कि पिक्सेल आकार से मेल खाता या सेटिंग (0.184 माइक्रोन / पिक्सेल जब 2884 पिक्सल द्वारा एक 20X (NA1.0) पानी विसर्जन 2884 के एक फ्रेम आकार के साथ उद्देश्य का उपयोग confocal खुर्दबीन पर गिरावट के लिए प्रयोग किया जाता है से अधिक हैऔर 0.8 की एक ज़ूम)। ऐसा करने के लिए, "छवि" पर क्लिक करें → "समायोजित" → "आकार" और "चौड़ाई" (यानी, 450 माइक्रोन, या छवि से 0.184 माइक्रोन / पिक्सेल विभाजित के आकार के) के लिए "2446" में टाइप करें।
  4. थ्रेसहोल्ड / "Ctrl + Shift + टी" टाइप करके छवि ढेर binarize। अचयनित करें "डार्क पृष्ठभूमि", और "लागू" → "ठीक" पर क्लिक करें। "छवि" → "देखने सारणी" → "पलटना LUT" पर क्लिक करके प्रक्रिया समाप्त करें।
  5. एक कस्टम एल्गोरिथ्म का उपयोग प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर 9 में (स्रोत कोड संदर्भित पांडुलिपि के पूरक सामग्री में उपलब्ध है), binarized (सफेद) फिट एकल पिक्सेल उच्च quadrilaterals की पच्चीकारी के साथ सुविधाओं रेखापुंज स्कैनिंग की दिशा के समानांतर (x -direction) हित के क्षेत्रों (ROIs) है कि लेजर स्थिति और शटर 9, 7, 30, 31 मार्गदर्शन, उत्पन्न करने के लिए <sup> 32।
    नोट: कस्टम एल्गोरिथ्म 9 एक आरएलएस फाइल करने के लिए TIF छवि ढेर में प्रत्येक व्यक्ति के विमान धर्मान्तरित।
  6. गिरावट के दौरान इस्तेमाल के लिए .OVL को आरएलएस फाइलों की फाइल एक्सटेंशन बदलें।

2. लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का विन्यास

नोट: अन्य लेजर स्कैनिंग स्पंदित पराबैंगनीकिरण के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जा सकता है, सेटिंग्स और प्रोटोकॉल यहाँ अपने सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (एल एस एम) के उपयोग का वर्णन।

  1. पर लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के साथ, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर को खोलने, और क्लिक करें "आरंभ प्रणाली।" "बनाए रखने के" टैब में उद्देश्य "डब्ल्यू योजना Apochromat 20x / 1.0 डीआईसी तुलना आईआर M27 75mm" का चयन करें।
  2. "हाइड्रोजेल दृश्य" विन्यास सेटिंग
    1. "अधिग्रहण" टैब में, यह सुनिश्चित करें कि लेजर लाइन (514 एनएम आर्गन लेजर) का चयन किया जाता है और पर "लेजर" windo मेंडब्ल्यू। नोट: इस चैनल की छवि के लिए उन्मुखीकरण प्रयोजनों के लिए 7 eosin Y प्रतिदीप्ति के माध्यम से हाइड्रोजेल प्रयोग किया जाता है।
    2. "इमेजिंग सेटअप" विंडो में, "मोड" के लिए "चैनल मोड", "सेट स्विच हर ट्रैक करने के लिए" "फ्रेम", और "Track1" की स्थापना की।
    3. "प्रकाश पथ" विंडो में, 516 735 एनएम की एक सीमा के साथ ही Ch1 फ्लोरोसेंट डिटेक्टर का चयन करें; एक मुख्य बीम फाड़नेवाला (एमबीएस) दृश्य प्रकाश लाइन पर 458/514 फिल्टर; और अदृश्य प्रकाश लाइन में एक थाली। उज्ज्वल क्षेत्र photomultiplier ट्यूब डिटेक्टर, "टी-पीएमटी" अचयनित करें।
    4. "अधिग्रहण मोड" विंडो में, जाँच करें कि सही उद्देश्य चयनित है और सेट "स्कैन मोड" के लिए "फ्रेम", "फ्रेम आकार" के लिए एक्स में "2884" और वाई, "रेखा कदम" "1" "संख्या औसतन" "1", "औसतन मोड" "रेखा", "औसत विधि" "मीन" करने के लिए, "बिट गहराई "के लिए" 16 बिट ", और" दिशा "के लिए" - द्विदिश स्कैनिंग के लिए "<>।
    5. "अधिग्रहण मोड" विंडो में, "स्पीड" के रूप में वांछित और सेट "Corr एक्स" और "वाई" के लिए "0.05" या के लिए विशेष माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जा रहा है के रूप में आवश्यक समायोजित निर्धारित किया है। "एचडीआर" अचयनित करें।
    6. "अधिग्रहण मोड" विंडो में, यह सुनिश्चित करें कि "स्कैन क्षेत्र" प्रदर्शित करता है की "531.2 माइक्रोन x 531.2 माइक्रोन" एक "छवि का आकार" और "0.18" के एक "पिक्सेल आकार", एक "ज़ूम" सेट के साथ "0.8" ; शून्य करने के लिए अन्य सभी "स्कैन क्षेत्र" मूल्यों की स्थापना की।
    7. "चैनल" विंडो में, Ch1 फ्लोरोसेंट डिटेक्टर के रूप में "Track1" का चयन करें। लेजर लाइन का चयन करें "514", "10.0" का एक प्रतिशत शक्ति के साथ, एक "1AU" के "पिनहोल", एक प्रारंभिक "लाभ (मास्टर)" "800" की, एक की "0" "डिजिटल ऑफसेट", और एक "डिजिटल लाभ" की4; 1 "।
      नोट: विशिष्ट खुर्दबीन के लिए आवश्यक के रूप में इन सेटिंग्स को समायोजित इस्तेमाल किया जा रहा है।
    8. के रूप में "हाइड्रोजेल दृश्य" इस विन्यास को बचाओ।
  3. "चैनल गठन" विन्यास की स्थापना
    1. "लेजर" विंडो में चयन किया जाता है और पर: "अधिग्रहण" टैब में, यह सुनिश्चित करें कि लेजर लाइन (एस लेजर 790 एनएम 140 FS स्पंदित तिवारी)। 790 एनएम पर अधिकतम बिजली उत्पादन के लिए निर्धारित "4000" के लिए "GDD सुधार"।
    2. के रूप में कदम 2.2.2 में उल्लिखित "इमेजिंग सेटअप" खिड़की सेट करें।
    3. "प्रकाश पथ" विंडो में, यह सुनिश्चित करें कि कोई फ्लोरोसेंट डिटेक्टरों दृश्य प्रकाश लाइन पर एक एमबीएस 458/514/561/633 फिल्टर और एक एमबीएस 760+ अदृश्य प्रकाश लाइन पर फिल्टर के साथ, चुने गए हैं। उज्ज्वल क्षेत्र photomultiplier ट्यूब डिटेक्टर, "टी-पीएमटी" अचयनित करें।
    4. "अधिग्रहण मोड" विंडो में, जाँच करें कि सही उद्देश्य सूचीबद्ध है। "3" गति "सेट"और अन्य सभी सेटिंग्स कदम 2.2.4 में उल्लिखित के रूप में।
    5. "चैनल" विंडो में, टी-पीएमटी डिटेक्टर के रूप में "Track1" का चयन करें। , लेजर लाइन "790" का चयन करें "800" के "100.0" का एक प्रतिशत बिजली, एक प्रारंभिक "लाभ (मास्टर)" के साथ, एक "0" का "डिजिटल ऑफसेट", और "1" के एक "डिजिटल लाभ" ।
    6. "स्टेज" विंडो में, "शून्य" सेट पर क्लिक करके मंच शून्य। "मार्क" पर क्लिक करके स्थान चिह्नित। इस चरण 3 में माइक्रोस्कोप मैक्रो के लिए आभासी मास्क अपलोड करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    7. "टाइम सीरीज" विंडो में, के रूप में "1" और "अंतराल" के रूप में "0" "चक्र" की स्थापना की।
    8. "ब्लीच" विंडो में, बॉक्स "# स्कैन के बाद शुरू ब्लीचिंग" जाँच और '0 का 1 "एक मूल्य के लिए यह निर्धारित किया है। "3" (8.96 μs / पिक्सेल के एक पिक्सेल समय ध्यान केन्द्रित करने के लिए इसी) के एक मूल्य के साथ, "अलग स्कैन गति" का चयन करें। "सुरक्षित बीएल का चयन करेंGaAsP के लिए प्रत्येक "।
    9. "ब्लीच" खिड़की के लेजर लाइन खंड में, 790 लेजर लाइन का चयन करें और प्रतिशत सत्ता में "100.0" की स्थापना की। अचयनित ब्लीच विंडो में अन्य सभी बक्से को छोड़ दें। "ब्लीच" विंडो में ब्लीच सेटिंग्स सहेजें।
    10. के रूप में "चैनल गठन" इस विन्यास को बचाओ।
      नोट: "Z ढेर", "क्षेत्र", "फोकस", और "स्टेज" खिड़कियां भी इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन सेट या समायोजित करने की प्रारंभिक विन्यास के दौरान जरूरत नहीं है।

3. एक नुस्खा बनाने और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और मैक्रो को आभासी मास्क अपलोड कर रहा है

  1. "चैनल गठन" विन्यास में लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन अभी भी चल रहा है और अभी भी चल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर, चयन केवल "क्षेत्र" खिड़की (अगला "शुरू प्रयोग" बटन करने के लिए) के साथ।
  2. सुनिश्चित करने के लिए कि मास्क माइक्रोस्कोप मैक्रो सही करने के लिए लोडLY, "अधिग्रहण मोड" खिड़की करने के लिए "8" में "चैनल" खिड़की करने के लिए "0.2" और "स्पीड" में प्रतिशत सत्ता स्थापित करने, और स्क्रीन के ऊपरी बाएँ में "तस्वीर" पर क्लिक करें।
  3. , जाँच करें कि छवि का आकार अभी भी है "531.2 माइक्रोन x 531.2 माइक्रोन", "0.18" के एक पिक्सेल आकार के साथ छवि की "सूचना" टैब में। इन मूल्यों को सही नहीं हैं, तो फिर से जाँच "फ्रेम आकार" और "ज़ूम" मूल्यों।
  4. महत्वपूर्ण: जाँच करें कि "स्टेज" विंडो में एक्स और वाई स्थानों चुना जाता है और स्थिति माइक्रोस्कोप मैक्रो खोलने से पहले चिह्नित है कि। करने के लिए कदम 2.3.6 देखें।
  5. माइक्रोस्कोप मैक्रो, प्रकार "Alt + F8" खोलने के लिए, "लोड", क्लिक करें और सही संस्करण का चयन करें। विशिष्ट सामग्री / उपकरण की सूची में विवरण देखें। उप मैक्रोज़ की एक लंबी सूची "मैक्रो नियंत्रण" विंडो में खुलेगा।
  6. "मैक्रो नियंत्रण" विंडो में, माइकर खोलने के लिए "भागो" पर क्लिक करेंमैक्रो oscope, और फिर "मैक्रो नियंत्रण" विंडो बंद करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप मैक्रो के वैकल्पिक संस्करणों लेजर आधारित हाइड्रोजेल इस प्रोटोकॉल का उपयोग गिरावट के साथ संगत नहीं किया जा सकता है।
  7. माइक्रोस्कोप मैक्रो के "बचत" टैब में, उपलब्ध कराने के एक मनमाना "बेस फ़ाइल नाम" का चयन करें, "एकल फ़ाइल उत्पादन", और एक "अस्थायी फ़ाइल फ़ोल्डर" चुना है। , स्थान "1" के लिए "ओपन अस्थायी फ़ोल्डर" सेट का चयन करें "एकल अस्थायी छवि फ़ोल्डर", और "याद स्थानों की सूची" चयनित साथ "स्टोर / पकाने की विधि लागू करें" में नुस्खा नाम। शुरू में नुस्खा बनाने के लिए "स्टोर" पर क्लिक करें।
  8. माइक्रोस्कोप मैक्रो का "अधिग्रहण" टैब में, यह सुनिश्चित करें कि "स्कैन विन्यास" नाम 2.3 कदम में सेट माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर विन्यास को दिया मेल खाता है। एक "0" का "अंतराल" के साथ, "1" के लिए "ब्लॉक के भीतर कोई समय के अंक" सेट। सुनिश्चित करें कि "चिह्नित जेड - जेड Stac के शीर्षकश्मीर "हरे प्रकाश डाला है। अन्य सभी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के रूप में वे कर रहे हैं ठीक हैं।
  9. माइक्रोस्कोप मैक्रो का "समय" टैब में, यह सुनिश्चित करें कि "देरी रुको" हरी प्रकाश डाला, "प्रयोग Repetitions" और "समूह Repetitions" सेट "1" और "अंतराल ब्लॉक से पहले पहले स्थान पर केवल इंतजार करने के लिए" के लिए "0" है । अन्य सभी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के रूप में वे कर रहे हैं ठीक हैं।
    नोट: "समूह Repetitions" (और नहीं "प्रयोग Repetitions") बॉक्स है, जहां एक एक क्षेत्र से अधिक समय लेजर स्कैन की संख्या निर्धारित कर सकते हैं (यानी, नुस्खा के repetitions)।
  10. माइक्रोस्कोप मैक्रो की "Z सूची" टैब में, जेड दिशा में गिरावट विमानों निर्दिष्ट कर रहे हैं। "पदों की संख्या" आभासी मास्क की संख्या में इस्तेमाल किया जा करने के लिए मैच के लिए सेट के साथ जेड रिक्ति, "DZ", "1 माइक्रोन", सेट करें।
  11. "Z ढेर बनाएँ" बटन "Z सूची" बनाने के लिए लटकती में दिखाई देते हैं "ली क्लिक करेंखिड़की के नीचे की ओर स्थान "की ST। जाँच करें कि स्थानों और जेड रिक्ति की संख्या सही हैं और है कि एक्स और वाई स्थानों को चुना जाता है।
    नोट: यदि वे नहीं हैं, नुस्खा की दुकान नहीं है; माइक्रोस्कोप मैक्रो को बंद करने और माइक्रोस्कोप मैक्रो को फिर से खोलने और फिर नुस्खा स्थापित करने से पहले कदम 2.3.6 दोहराएँ।
    नोट: इसके बजाय 100 मास्क 1 माइक्रोन प्रत्येक से स्थान दिया गया होने के, उदाहरण के लिए, यह 50 मास्क के लिए फायदेमंद हो सकता है, प्रत्येक दो बार कार्यरत हैं और स्थान दिया गया है 1 माइक्रोन से, एक बराबर microfluidic संरचना पाने के लिए, माइक्रोस्कोप मैक्रो के लिए अलग-अलग मास्क लोड के रूप में कर सकते हैं समय लेने वाली हो।
  12. माइक्रोस्कोप मैक्रो के "ब्लीच" टैब में, मास्क के सभी भरी हुई है और "स्थानों की सूची" में एक विशिष्ट स्थान गिने साथ मिलान किया जाना चाहिए। प्रारंभ करने के लिए, "ब्लीच" बॉक्स का चयन करें और सुनिश्चित करें कि "विन्यास।" मैचों मुख्य माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर स्क्रीन में "ब्लीच" विंडो में ब्लीच सेटिंग्स के नाम (चरण 2 का उल्लेख.3.8)। , "0" के लिए "देरी ब्लीच के बाद प्रतीक्षा" सेट अचयनित "स्थान", और "रॉय" खाली छोड़ दें।
  13. "स्थान" में कुछ भी बदल नहीं है, "टाइल", "ग्रिड", "ऑटोफोकस", "ब्लाक", और डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स से "विकल्प" टैब।
  14. माइक्रोस्कोप मैक्रो के लिए मास्क लोड करने के लिए, केवल "क्षेत्र" माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में खिड़की का चयन करें और माइक्रोस्कोप मैक्रो के "ब्लीच" टैब खुला। "क्षेत्र" विंडो में, "लोड" पर क्लिक करें और अपमानित किया जा रहा जेड ढेर के नीचे मुखौटा के लिए .OVL फ़ाइल का चयन करें।
    नोट: "जेड" सूची में पहला स्थान जेड ढेर के नीचे है, और माइक्रोस्कोप मैक्रो Z ढेर, या हाइड्रोजेल के शीर्ष करने के लिए अपनी तरह से काम करता है।
  15. एक बार जब ROIs की सूची "क्षेत्र" विंडो में प्रकट होता है, देखने के क्षेत्र (पर छवि 3.2 चरण में बोले) के भीतर मुखौटा के ROIs देखने के लिए तीर बटन पर क्लिक करें। सत्यापित करें ROIs के भीतर फिट किदेखने के क्षेत्र।
  16. माइक्रोस्कोप मैक्रो में भरी हुई मुखौटा बचाने के लिए, "ब्लीच" टैब पर "रॉय सूची के लिए वर्तमान क्षेत्र जोड़ें" बॉक्स में मुखौटा एक नाम और नंबर देने के लिए, और फिर "रॉय सूची के लिए वर्तमान क्षेत्र जोड़ें" बटन पर क्लिक करें। नाम और नंबर (अन्य पूर्व में बने व्यंजनों से मास्क सहित) किसी अन्य मास्क के साथ "रॉय" लटकती सूची में दिखाई देगा। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में "क्षेत्र" विंडो में नकाब हटाना।
  17. दोहराएँ माइक्रोस्कोप मैक्रो के लिए सभी मास्क को अपलोड करने और बचाने के लिए कदम 3.14 और 3.16।
  18. प्रत्येक जेड स्थान पर अपलोड मास्क असाइन करने के लिए, लटकती "स्थानों की सूची" में स्थिति 1 पर प्रकाश डाला। "रॉय" लटकती सूची से उचित लागत पर लाभ का चयन करें। सुनिश्चित करें कि "ब्लीच" बॉक्स माइक्रोस्कोप मैक्रो में "ब्लीच" टैब के शीर्ष पर चयन किया जाता है।
  19. लटकती में "स्थानों की सूची" सभी पदों के लिए कदम दोहराएँ 3.18, और फिर & पर क्लिक करें "स्टोर"# 34; बचत "टैब अपने अंतिम रूप में नुस्खा बचाने के लिए।

4. एक PEGDA हाइड्रोजेल Photopolymerizing

  1. बनाना बाँझ HEPES खारा बफर triethanolamine के साथ (एचबीएस) (TEOA)
    1. एक 1-एल बीकर में, एक हलचल पट्टी के साथ 500 डि एमएल एच 2 ओ जोड़ने, सोडियम क्लोराइड की 2.922 जी, HEPES की 1.196 ग्राम, और एक धूआं हुड में TEOA के 7.5 एमएल में हलचल।
    2. पाश्चर विंदुक के साथ dropwise जोड़कर 1 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के साथ 8.3 पीएच को समायोजित करें।
    3. बाँझ फिल्टर एक 500 एमएल Autoclaved गिलास मीडिया बोतल में एक 0.2 माइक्रोन वैक्यूम निस्पंदन कप के माध्यम से समाधान। अशेष और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. नीचे से बाहर एक 20 मिमी छेद में कटौती के साथ एक विशेष 60 मिमी पेट्री डिश के लिए समर्थन के साथ दो तरफा चिपकने की एक अंगूठी संलग्न। चिपकने वाला अंगूठी पर समर्थन छोड़कर, पेट्री डिश और चिपकने के बीच से किसी भी हवाई बुलबुले बाहर दबाएँ।
  3. माल तैयार करें। संश्लेषित 33 3 लाओ।4 केडीए PEGDA -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर है और यह कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं। हाइड्रोजेल photopolymerizing से पहले सफेद प्रकाश स्रोत पर बारी में कम से कम 15 मिनट।
  4. एक धूआं हुड में, एचबीएस के 1 एमएल TEOA के साथ एक पन्नी से ढके, 2-एमएल एम्बर अपकेंद्रित्र ट्यूब (photoinitiator के प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए इस्तेमाल किया, वाई eosin) जोड़ें। Y Disodium नमक eosin 1 मिमी के 10 μL डि एच 2 ओ में जोड़े
  5. एक धूआं हुड में, एक पाश्चर विंदुक के साथ एक गिलास बीकर में 1-विनाइल-2-pyrrolidinone (एनवीपी) की एक छोटी मात्रा निकाल सकते हैं। इस मात्रा से, पिपेट 3.5 एनवीपी की μL HBS, TEOA साथ एम्बर अपकेंद्रित्र ट्यूब, और eosin वाई में
  6. एक दूसरे की पन्नी से ढके, 2-एमएल एम्बर अपकेंद्रित्र ट्यूब में, 3.4kDa PEGDA के 10 मिलीग्राम जोड़ने (prepolymer समाधान के गुमराह photoactivation को रोकने के लिए इस्तेमाल किया)। HBS, TEOA के 0.2 मिलीलीटर जोड़ने, वाई, w / वी PEGDA पूर्व बहुलक समाधान के लिए एक 5% के लिए एनवीपी समाधान eosin। PEGDA जब तक भंवर पूरी तरह से भंग कर रहा है। एक बिजली मीटर और डिटेक्टर की छड़ी का उपयोग करना, सफेद ली की तीव्रता को समायोजित95 मेगावाट GHT स्रोत है।
  7. एक पाली (dimethylsiloxane) बिल्डिंग मोल्ड (PDMS)
    1. से निपटने में आसानी के लिए एक बड़ा सतह (ग्लास, polystyrene टिशू कल्चर पकवान) पर एक PDMS मोल्ड 7 बनाएँ और इकट्ठा नए नए साँचे में इस तरह ढाला हाइड्रोजेल 20 मिमी व्यास सर्कल के भीतर फिट है।
    2. 500 माइक्रोन की मोटाई के साथ एक आयताकार के आकार का हाइड्रोजेल उत्पन्न करने के लिए, एक PDMS सतह दो परिभाषित हाइड्रोजेल किनारों बनाने के लिए पर दो 500 माइक्रोन मोटी PDMS स्पेसर जगह है।
    3. हाइड्रोजेल, जो तरल पदार्थ को शुरू करने के लिए उपयोगी है की सतह में एक 300 माइक्रोन गहरी अच्छी तरह से प्रदान करने के लिए एक 300 माइक्रोन PDMS स्पेसर शामिल करें।
  8. पिपेट 60 PDMS मोल्ड पर w / वी PEGDA पूर्व बहुलक समाधान में 5% की μL। सावधान नहीं pipetting के दौरान किसी भी बुलबुले परिचय हो।
  9. केंद्र और एक [3- (methacryloyloxy) propyl] जगह trimethoxysilane (TMPSA) समाधान के शीर्ष पर 7, 40 मिमी व्यास, # 1.5 गिलास coverslip क्रियाशील। सुनिश्चित करें कि coverslआईपी ​​500 माइक्रोन PDMS स्पेसर पर टिकी हुई है। हाइड्रोजेल methacrylated coverslip के लिए बांड और समाधान में तैर से हाइड्रोजेल पाएगा।
  10. PDMS, PEGDA पूर्व बहुलक समाधान की जगह और 3 मिनट के लिए सफेद प्रकाश स्रोत के तहत विधानसभा coverslip।
  11. प्रवाह डि एच 2 ढालना और coverslip PDMS से हाइड्रोजेल को अलग करने के बीच हे। डि एच 2के साथ हाइड्रोजेल कुल्ला प्रयोगशाला ऊतक के साथ coverslip के किनारों सूखी। हाइड्रोजेल से छूने या बाती पानी के लिए सावधान रहें।
  12. चिपकने से समर्थन हटाने के बाद, तैयार पेट्री डिश के लिए coverslip पालन करना और धीरे चिपकने वाला और कांच के बीच से हवा के बुलबुले को हटा दें। डि एच 2 ओ के साथ पेट्री डिश में डूब हाइड्रोजेल
    नोट: PDMS मोल्ड अतिरिक्त हाइड्रोजेल बनाने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है अगर डि एच 2 ओ, नाइट्रोजन के साथ सूखे के साथ rinsed, और धूल से मुक्त रखा।

5. Fabricating संवहनी व्युत्पन्न Microfluidic नेटवर्कलेजर आधारित गिरावट के माध्यम से रों

  1. लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन और माइक्रोस्कोप पर सॉफ्टवेयर के साथ, "बनाए रखने के" टैब में उद्देश्य "डब्ल्यू योजना Apochromat 20x / 1.0 डीआईसी तुलना आईआर M27 75mm" का चयन करें। पर हैं और गरम: "अधिग्रहण" टैब में, आवश्यक लेजर लाइनों (एस लेजर 514 एनएम आर्गन लेजर और 790 एनएम 140 FS स्पंदित तिवारी) सुनिश्चित करें।
  2. हाइड्रोजेल की स्थापना एक इनलेट चैनल पर्चा
    1. हाइड्रोजेल और मंच डालने पर पेट्री डिश फ़िट और खुर्दबीन मंच पर चरण डालने जगह है। डि एच 2 ओ में पानी विसर्जन उद्देश्य को कम करने से पहले आंखों से हाइड्रोजेल और अच्छी तरह से सुविधाओं में कम से कम 5 एमएल डि के एच 2 ओ केंद्र के साथ पेट्री डिश भरें
      नोट: उद्देश्य-दो स्पर्श नहीं करना चाहिए साथ हाइड्रोजेल कुचलने मत करो!
    2. हाइड्रोजेल खोजने के लिए, 2.2 कदम से "हाइड्रोजेल दृश्य" विन्यास के लिए स्विच। पर लेजर लाइन की बारी है और वें लाने के लिए "लाइव" क्लिक करेंई हाइड्रोजेल करने के उद्देश्य करीब हाइड्रोजेल के ऊपर से eosin Y संकेत (Ch1 फ्लोरोसेंट डिटेक्टर से पता चला) तक देखा जा सकता है।
      नोट: आसानी से हाइड्रोजेल खोजने के लिए, प्रतिशत बिजली या बढ़ाया जा सकता है पिनहोल खोला जा सकता है। एक बार उद्देश्य हाइड्रोजेल पर ध्यान केंद्रित किया है, तथापि, फ्लोरोसेंट डिटेक्टर की रक्षा और पिनहोल वापस 1AU कमी डिटेक्टर की oversaturation से बचने के लिए है और इसे सही हाइड्रोजेल सतह को खोजने के लिए प्रतिशत बिजली ड्रॉप।
    3. "स्टेज" विंडो में, शीर्ष और हाइड्रोजेल की और अच्छी तरह से नीचे के तल के स्थानों को चिह्नित।
      नोट: Z-मूल्यों यहां हाइड्रोजेल की मोटाई और अच्छी तरह से गहराई का पता लगाने में मदद मिलेगी।
    4. एक्स और वाई में स्थानांतरित करने के लिए एक अच्छी तरह से किनारे लगाने के लिए जॉयस्टिक का प्रयोग करें। बाएँ पर स्क्रीन के अधिकार पर हाइड्रोजेल रखें, अच्छी तरह से, या इसके विपरीत। हाइड्रोजेल देखने के क्षेत्र का कोई अधिक से अधिक दो तिहाई को भरने के लिए अनुमति दें।
    5. ड्रॉप plफोकस नीचे 150 माइक्रोन "फोकस" विंडो में करने के लिए "150" "कदम आकार" सेटिंग और नीचे तीर "जेड स्थिति" बॉक्स के आगे क्लिक करके हाइड्रोजेल में की ane। दोहराएँ कदम 5.2.4, यदि आवश्यक है।
      नोट: एक्स, वाई, जेड और प्रवेश की स्थिति को पूरी तरह से आभासी मास्क के डिजाइन पर निर्भर करता है।
    6. महत्वपूर्ण: शून्य एक्स और "स्टेज" विंडो में वाई स्थान, अन्य सभी चिह्नित स्थानों को नष्ट, और केवल इस स्थान को चिह्नित।
      नोट: यह कदम नहीं किया जाता है, तो माइक्रोस्कोप मैक्रो ठीक से पहले से बचाया नुस्खा में स्थानों बहाल नहीं होगा, और हाइड्रोजेल इच्छित स्थान में अपमानित नहीं किया जाएगा।
  3. एक इनलेट चैनल बनाने
    1. "तस्वीर" एक छवि और एक आयताकार क्षेत्र है कि "क्षेत्र" विंडो में आयत बटन का उपयोग संवहनी नेटवर्क के लिए प्रवेश हो जाएगा आकर्षित।
      नोट: सुनिश्चित क्षेत्र के बारे में सुनिश्चित हिस्से में अच्छी तरह से बाहर फैली सुनिश्चित करने के लिए कि वेंई इनलेट संवहनी नेटवर्क के लिए अच्छी तरह से जुड़ जाएगा।
    2. "क्षेत्र" खिड़की में उत्पन्न रॉय के आगे, "अधिग्रहण" का चयन करें और अचयनित "ब्लीच" और "विश्लेषण"।
    3. "हाइड्रोजेल दृश्य" विन्यास को बचाने, "क्षेत्र" अचयनित, और "चैनल गठन" विन्यास, 2.3 कदम में स्थापित करने के लिए बदल जाते हैं। "चैनल गठन" विन्यास में, चयन "क्षेत्र" फिर से।
      नोट: जब "हाइड्रोजेल दृश्य" और "चैनल गठन" विन्यास के बीच स्विच करने के लिए स्क्रीन के ऊपर छोड़ दिया में क्षेत्रों का चयन रद्द करने के लिए सुनिश्चित हो। कभी कभी क्षेत्रों की स्केलिंग अगर ऐसा नहीं किया जाता है विन्यास के बीच अप्रत्याशित रूप से बदल सकते हैं।
    4. "चैनल गठन" विन्यास में, सुनिश्चित करें कि केवल "क्षेत्र" और "Z ढेर" का चयन कर रहे हैं। "Z ढेर" विंडो में, शीर्ष और फिर "केन्द्र" बट पर "केन्द्र" बटन को क्लिक करेंऊपर पर "ऑफसेट" वर्तमान जेड स्थिति के रूप में जेड ढेर के केंद्र स्थापित करने के लिए। कैसे बड़े इनलेट होने की जरूरत पर निर्भर करता है, एक "1" के "अंतराल" के साथ "स्लाइस" की संख्या निर्धारित किया है। जेड ढेर के आकार के नीचे "रेंज" प्रदर्शित किया जाएगा।
    5. जाँच करें कि "स्पीड" "अधिग्रहण मोड" विंडो में "3" के लिए और कहा कि "प्रतिशत बिजली" "चैनल" विंडो में "100" करने के लिए सेट कर दिया जाता सेट है। विन्यास को बचाने और "शुरू प्रयोग" बटन पर क्लिक करें।
      नोट: यहां प्रदर्शन एक इनलेट चैनल उत्पन्न करने के लिए माइक्रोस्कोप मैक्रो, कई विमानों पर ही साधारण आकार अपमानजनक लिए आवश्यक नहीं है। जब प्रत्येक व्यक्ति के विमान पर अलग-अलग क्षेत्रों अपमानजनक मैक्रो केवल आवश्यक है, और यह एक नुस्खा के भीतर आभासी मास्क स्टोर करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    6. गिरावट के दौरान हाइड्रोजेल कल्पना करने के लिए, या तो "चैनल" विंडो में "लाभ (मास्टर)" में वृद्धि करता है, तो टी में क्षेत्रवह देखने के क्षेत्र काला है, या "लाभ (मास्टर)" को कम करता है, तो क्षेत्र सफेद है।
      नोट: बुलबुला गठन यहाँ लेजर प्रेरित हाइड्रोजेल गिरावट का एक संकेत है।
    7. इनलेट सिर्फ एक बार के बजाय कई बार नीचा करने के लिए, "समय सीरीज" विंडो में "चक्र" समायोजित।
    8. "हाइड्रोजेल दृश्य" विन्यास में, यह सुनिश्चित करें कि इनलेट गठन किया गया था "जी" पर क्लिक करें।
  4. Microfluidic नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए हाइड्रोजेल की स्थापना
    1. "क्षेत्र" विंडो में, आभासी मास्क की जेड ढेर से किसी भी .OVL फाइल लोड और देखने के क्षेत्र में ROIs देखने के लिए तीर बटन पर क्लिक करें।
    2. "हाइड्रोजेल दृश्य" विन्यास स्कैन रहते हैं और एक्स और वाई, ऐसा है कि इनलेट संवहनी नेटवर्क के भीतर सही स्थान से कनेक्ट में हाइड्रोजेल की स्थिति के लिए जॉयस्टिक या "चरण" विंडो का उपयोग करने के लिए "लाइव" पर क्लिक करें।
      नोट: सुनिश्चित करेंआभासी मुखौटा के ROIs पहले गठित प्रवेश के साथ थोड़ा ओवरलैप।
    3. पिछले केंद्रित जेड स्थान से 50 माइक्रोन, या हाइड्रोजेल की सतह से 200 मीटर नीचे ध्यान के विमान गिरा, "फोकस" विंडो में "कदम आकार 'का उपयोग कर और नीचे तीर" z- स्थिति के बगल में क्लिक " डिब्बा। इस खुर्दबीन मैक्रो में पहले स्थान पर होगा।
      नोट: वास्तविक दूरी जेड दिशा में ले जाने के लिए नेटवर्क डिजाइन पर निर्भर करता है। सुनिश्चित करें कि वांछित नेटवर्क जेड दिशा में हाइड्रोजेल के ऊपर या नीचे की सतह से परे का विस्तार नहीं है।
    4. महत्वपूर्ण: शून्य "स्टेज" विंडो में एक्स और वाई स्थानों, अन्य सभी चिह्नित स्थानों को नष्ट, और केवल इस स्थान को चिह्नित।
      नोट: इस माइक्रोस्कोप मैक्रो में शुरुआती बिंदु होगा। नुस्खा हाइड्रोजेल की सतह की ओर वापस अपनी तरह से काम करेंगे।
    5. "तस्वीर" "हाइड्रोजेल दृश्य" विन्यास में एक छवि, हटाने और deselecटी "क्षेत्र", और विन्यास को बचाने के।
  5. सृजन Microfluidic नेटवर्क
    1. "चैनल गठन" विन्यास को बदलने के लिए, और केवल "समय श्रृंखला" और "ब्लीचिंग" Windows का चयन करें। सत्यापित करें "समय श्रृंखला" और "ब्लीचिंग" Windows के लिए सेटिंग्स हैं कि के रूप में वे शुरू में कदम 2.3.7 और 2.3.8 में स्थापित किए गए थे।
    2. "8" के लिए "स्पीड" "अधिग्रहण मोड" विंडो में और "चैनल" विंडो में लेजर लाइन के लिए "0.2" का प्रतिशत बिजली सेट करें। विन्यास को बचाओ।
    3. 3.5 चरण निम्नलिखित माइक्रोस्कोप मैक्रो खोलें। मैक्रो के "बचत" टैब पर, चरण 3 से पहले किए गए नुस्खा का चयन करें और "लागू करें" पर क्लिक करें।
      नोट: क्लिक न करें "स्टोर" या नुस्खा ओवरराइट किया जाएगा!
    4. सभी टैब पर सेटिंग्स की जाँच करें और सत्यापित करें कि आभासी मास्क (.OVL फ़ाइलें) अभी भी सही ढंग टी के साथ जुड़े रहे हैंवह लटकती सूची में जेड स्थानों। यह भी जाँच है कि पहले जेड स्थान माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर की "चरण" विंडो में चिह्नित स्थान मेल खाता है।
      नोट: इसके अनुसार, लटकती सूची में दूसरे स्थान शारीरिक रूप से पहले स्थान ऊपर, (सब से अधिक दूर उद्देश्य से दूर) हाइड्रोजेल के शीर्ष करने के लिए किया जाएगा के रूप में माइक्रोस्कोप मैक्रो हाइड्रोजेल के नीचे से अपना रास्ता काम करेंगे (करने के लिए करीब उद्देश्य)।
    5. "चैनल गठन" विन्यास फिर से बचाने के लिए, और फिर क्लिक करें "अद्यतन" माइक्रोस्कोप मैक्रो में। "नहीं" "अधिलेखन वर्तमान स्थान सूची?" पर क्लिक करें और फिर माइक्रोस्कोप मैक्रो में "शुरू" पर क्लिक नुस्खा शुरू करने के लिए।

6. Microfluidic नेटवर्क Visualizing

  1. हाइड्रोजेल और गिरावट के बाद गठित microfluidic नेटवर्क को देखने के लिए माइक्रोस्कोप मैक्रो को बंद करें। eosin Y Si देखने के लिए "हाइड्रोजेल दृश्य" विन्यास करने के लिए स्विचहाइड्रोजेल की gnal; अपमानित नेटवर्क अंधेरा दिखाई देगा।
    नोट: हाइड्रोजेल गिरावट है, जबकि माइक्रोस्कोप मैक्रो चल रहा है कल्पना नहीं की जा सकती है।
  2. विशेष रूप से microfluidic नेटवर्क को देखने के लिए शुरू की fluorescein (FITC) -labeled dextran, जो हाइड्रोजेल के देशी eosin वाई संकेत तुलना में एक उज्जवल संकेत है की इमेजिंग सक्षम करने के लिए एक कम लेजर शक्ति पर "हाइड्रोजेल दृश्य" विन्यास का उपयोग करें।
  3. fluorescently लेबल dextran शुरू करने से पहले, प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग हाइड्रोजेल में अच्छी तरह से पानी बाती। 5 मिलीग्राम के 10 μL में पिपेट / एमएल 2,000 केडीए डि में FITC लेबल dextran एच 2 ओ (एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पूर्व फ़िल्टर)।
    नोट: किसी भी dextran जेल में प्रसार को रोकने के लिए 2,000 केडीए या बड़ा आकार। इमेजिंग अब से 30 मिनट के लिए, FITC लेबल dextran समाधान से हाइड्रोजेल सुखाने और पानी के वाष्पीकरण को रोकने के लिए 60% आर्द्रता (या अधिक) के साथ एक incubated मंच का उपयोग करते हैं।
  4. हाइड्रोजेल एक हटायेएन डी मंच से पेट्री डिश और बाद में प्रयोग के दौरान गठित संवहनी नेटवर्क के आसान स्थान सक्षम करने के लिए पेट्री डिश के निशान।

Representative Results

एक 3 डी, नाड़ी व्युत्पन्न microfluidic नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए छवि निर्देशित, लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट के कार्यान्वयन को प्रदर्शित करने के लिए, हम माउस मस्तिष्क vasculature की एक 3 डी छवि ढेर चाकू की धार स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (KESM), 26, 27 के माध्यम से अधिग्रहण कर लिया था कि उपयोग किया । जैसा कि ऊपर वर्णित बड़ा microvascular डाटासेट के एक चयनित क्षेत्र के लिए 3 डी, छवि निर्देशित microfluidic नेटवर्क के गठन के लिए आभासी मास्क की एक श्रृंखला में परिवर्तित कर दिया गया। निर्माण के बाद, जिसके परिणामस्वरूप microfluidic नेटवर्क FITC लेबल, 2,000 केडीए dextran के एक समाधान के साथ भरकर रखा और confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ली गई है। इन विवो वाहिका है कि नेटवर्क वास्तुकला (चित्रा 1 ए और सी) और गढ़े microfluidic नेटवर्क (चित्रा 1 बी और डी) में परिभाषित की छवि ढेर जेड अनुमानों (चित्रा 1 ए और बी) और 3 डी renderings (चित्रा 1C उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया और डी इन विवो वाहिका की जटिल संरचना पुनरावृत्ति के निर्माण के लिए सक्षम बनाता है। तकनीक व्यास की एक विस्तृत श्रृंखला से युक्त नेटवर्क के निर्माण के लिए उत्तरदायी है; चित्रा 1 के भीतर, 3.3 से व्यास में 28.8 माइक्रोन से लेकर चैनलों उत्पन्न किया गया। ध्यान दें कि चित्रा 1 बी के शीर्ष बाएँ में और चित्रा -1 के बाएं कोने में बड़ा आयताकार संरचना नेटवर्क में प्रवाह शुरू करने की इनलेट चैनल है।

आकृति 1
चित्रा 1: नाड़ी-व्युत्पन्न Microfluidic नेटवर्क। आभासी मास्क की एक श्रृंखला है, माउस मस्तिष्क वाहिका (ए और सी) की एक छवि ढेर से निकाली गई, Fabrica करने के लिए इस्तेमाल किया गयाएक PEGDA हाइड्रोजेल (बी और डी) छवि निर्देशित, लेजर आधारित गिरावट के माध्यम से एम्बेडेड में एक 3 डी biomimetic microfluidic नेटवर्क ते। microfluidic नेटवर्क 2,000 केडीए FITC लेबल dextran साथ भरकर रखा और confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ली गई है। जेड अनुमानों (ए और बी) और दो नेटवर्क की 3 डी renderings (सी और डी) microfluidic नेटवर्क है कि घनत्व, संगठन, और इन विवो वाहिका के समग्र वास्तुकला पुनरावृत्ति उत्पन्न करने की क्षमता प्रदर्शित करता है। तीर (डी) dextran लागू करने के लिए बनाया आयताकार प्रवेश के निशान। पैमाने बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हम दो तरीकों, दबाव सिर और सिरिंज पंप, आरंभ करने के लिए तरल पदार्थ च लागू किया हैइन एम्बेडेड microfluidic नेटवर्क में कम। उदाहरण के लिए, एक माइक्रोन 30 30 से आयताकार चैनल, (2A चित्रा) एक micromolded PEGDA हाइड्रोजेल में दो कुओं कनेक्ट करने के लिए एक दबाव सिर 7 के माध्यम से संचालित द्रव का प्रवाह के साथ निर्मित किया गया था। अच्छी तरह से छोड़ दिया है में उत्पन्न, दबाव सिर microchannel के माध्यम से और अच्छी तरह से सही पर प्रेरित प्रवाह। में चित्रा 2A, tetramethylrhodamine (TRITC) की एक प्रारंभिक सामने -labeled, 70 केडीए dextran समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग चैनल के माध्यम से चलती मनाया गया। बाद में, चित्रा 2 बी में, एक 10 मीटर व्यास फ्लोरोसेंट polystyrene क्षेत्र प्रवाहित सही पर अच्छी तरह से छोड़ दिया, चैनल के माध्यम से, अच्छी तरह से करने के लिए। अच्छी तरह आउटलेट प्रवाह की अवधि के प्रवेश पर अच्छी तरह से micromolded में तरल पदार्थ वर्तमान की मात्रा से नियंत्रित है, और प्रवाह दर इनलेट के बीच उत्पन्न हीड्रास्टाटिक ढाल द्वारा नियंत्रित और के साथ, micromolded हाइड्रोजेल में दबाव सिर संचालित प्रवाह एक सरल तरीका प्रदान करता है में प्रवाह के लिएduction, एक बाहरी आवास या एक सिरिंज पंप के लिए आवश्यकता के बिना।

चित्र 2
चित्रा 2: एक Micromolded PEGDA हाइड्रोजेल में दबाव सिर संचालित प्रवाह। PEGDA एक हाइड्रोजेल एक एम्बेडेड microchannel से जुड़े दो कुओं से युक्त फार्म के लिए micromolded था। एक दबाव सिर को अच्छी तरह से एक से एक 30 माइक्रोन 30 से आयताकार चैनल के माध्यम से अच्छी तरह से छोड़ दिया है के प्रवाह को आरंभ करने के लिए TRITC लेबल, 70 केडीए dextran (A1-ए 3) और एक 10 माइक्रोन polystyrene क्षेत्र (बी 1-बी 3) में उत्पन्न किया गया अन्य। पैमाने बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वैकल्पिक रूप से, microfluidic नेटवर्क के भीतर लगातार द्रव का प्रवाह उत्पन्न करने के लिए, सिरिंज पंप संचालित चकम सिरिंज पंप interfacing के लिए इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों के साथ एक माध्यमिक microfluidic युक्ति के अंदर हाइड्रोजेल photopolymerizing द्वारा शुरू किया जा सकता है। चित्रा 3 ए में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, पूर्व निर्मित microfluidic युक्ति हाइड्रोजेल की एक 1 मिमी बैंड डिवाइस 7 की चौड़ाई में photopolymerized के साथ दिखाया गया है। लेजर आधारित गिरावट microfluidic चैनलों और रखे हाइड्रोजेल में नेटवर्क ही प्रोटोकॉल यहाँ हाइड्रोजेल freestanding के लिए वर्णित का उपयोग कर निर्माण करने के लिए लागू किया गया था। सिरिंज पंप उत्पन्न प्रवाह चित्रा 3 बी, जहां एक 20 माइक्रोन व्यास बेलनाकार चैनल एक हाइड्रोजेल एक microfluidic युक्ति में रखे में निर्मित किया गया था के रूप में देखा जा सकता है। इस 20 माइक्रोन व्यास चैनल में, अलग-अलग 2-माइक्रोन फ्लोरोसेंट polystyrene क्षेत्रों आसानी से द्रव का प्रवाह के बिना (चित्रा 3B1), के रूप में streaking इसका सबूत हल कर रहे हैं, जबकि जब एक 5 μL / एस प्रवाह लागू किया जाता है, क्षेत्रों को देखने के क्षेत्र के माध्यम से स्थानांतरित (चित्रा 3B2 </ Strong>)। , नेटवर्क और आसपास के हाइड्रोजेल (चित्रा -3 सी) में प्रसार के माध्यम से 65 केडीए dextran इसी दृष्टिकोण के TRITC लेबल प्रवाह की निगरानी के लिए एक 2 डी, नाड़ी व्युत्पन्न नेटवर्क के माध्यम से प्रवाह के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

चित्र तीन
चित्रा 3: Microfluidic housings में PEGDA Hydrogels Polymerized में सिरिंज पंप संचालित प्रवाह। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, पूर्व निर्मित microfluidic युक्ति (ए) एक 17 x 3.8 x 0.53 मिमी (एक्स, वाई, जेड) microchannel के साथ एक photopolymerized 1 x 3.8 x 0.53 मिमी (एक्स, वाई, जेड) PEGDA हाइड्रोजेल, ने संकेत घरों काला तीर। एक 20 मीटर व्यास बेलनाकार चैनल हाइड्रोजेल के माध्यम से अपमानित किया गया था, और 2-माइक्रोन polystyrene क्षेत्रों डिवाइस (बी) के माध्यम से पंप थे। क्षेत्रों स्पष्ट रूप से द्रव का प्रवाह (बी 1) के बिना हल कर रहे हैं, लेकिन वे 5 μL / एस के प्रवाह पर धारियाँ के रूप में प्रकट(B2)। एक और रखे हाइड्रोजेल में, एक 2 डी संवहनी व्युत्पन्न नेटवर्क निर्मित किया गया था और TRITC लेबल, 65 केडीए dextran नेटवर्क (सी) के माध्यम से लगाया गया था। समय चूक माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट dextran पर नजर रखने के रूप में यह चैनलों भरा और आसपास के हाइड्रोजेल में दूर तक फैला हुआ इस्तेमाल किया गया था। (बी) और (सी) में व्हाइट तीर द्रव का प्रवाह की दिशा का संकेत। (सी) में अंशांकन बार फ्लोरोसेंट dextran की तीव्रता को इंगित करता है। स्केल सलाखों प्रतिनिधित्व में (सी) में (बी 1) 20 माइक्रोन और (बी 2) और 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के मानक कार्यों अधिभावी छवि निर्देशित, लेजर आधारित गिरावट के लिए आभासी मास्क के उपयोग को सक्षम करने के लिए गंभीर, माइक्रोस्कोप मैक्रो सेटअप और ध्यान से चालाकी से किया जाना चाहिए। कैसे माइक्रोस्कोप मैक्रो के साथ खुर्दबीन सॉफ्टवेयर इंटरफेस कभी कभी counterintuitive हो सकता है, और बहुत प्रयास के दोनों कार्यक्रमों में इष्टतम सेटिंग्स का निर्धारण करने के लिए इस विधि को विकसित करने में निवेश किया गया था। बुनियादी लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन उपयोग की एक सामान्य समझ की सिफारिश की है, विशेष रूप से "स्टेज" और लग रहा है और सही ढंग से हाइड्रोजेल स्थिति एक्स, वाई, जेड और आयामों में, लेजर आधारित गिरावट प्रयास करने से पहले के लिए "फोकस" खिड़कियों के साथ। इसके अतिरिक्त, एक इनलेट चैनल के निर्माण के प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है; निलंबित फ्लोरोसेंट प्रजातियों सफल इमेजिंग और नेटवर्क लक्षण वर्णन के लिए सिस्टम microfluidic प्रवेश करने में सक्षम होना चाहिए। यह ध्यान रखें कि इस प्रोटोकॉल एक विशिष्ट करने के लिए लागू होता है महत्वपूर्ण है लेजरconfocal खुर्दबीन स्कैनिंग एक विशिष्ट femtosecond स्पंदित लेजर के साथ विन्यस्त, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के विशिष्ट संस्करणों और माइक्रोस्कोप मैक्रो (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की सूची में विवरण देखें) चल रहा है। हमें पता चला है कि माइक्रोस्कोप मैक्रो के नए संस्करणों के लिए आवश्यक नियंत्रण और कार्यक्षमता की छवि निर्देशित लेजर नियंत्रण के लिए आवश्यक की कमी है। अन्य माइक्रोस्कोप प्लेटफार्मों और स्पंदित लेजर स्रोतों का इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल इस प्रणाली के लिए विशेष रूप से लागू होता है और मंच, लेजर स्रोत है, और सॉफ्टवेयर लागू के अनुसार संशोधन की आवश्यकता होगी। इस प्रोटोकॉल भर सिद्धांतों अभी भी लागू है, लेकिन।

इस प्रोटोकॉल के लिए एक संभावित संशोधन हाइड्रोजेल संरचना को बदलने शामिल है। यहाँ, हम 5 डब्ल्यूटी%, 3.4 केडीए PEGDA हाइड्रोजेल, उपयोग किया लेकिन (microfluidic नेटवर्क पीढ़ी से अलग उद्देश्यों के लिए) लेजर आधारित गिरावट लागू किया गया है PEGylated आतंच सहित दोनों कृत्रिम और प्राकृतिक हाइड्रोजेल, नीचा करने के लिएogen 21,22, रेशम प्रोटीन 23 हाइड्रोजेल, और कोलेजन 24। लेजर शक्ति, गति स्कैन, जेड स्लाइस के बीच रिक्ति, और repetitions की संख्या का समायोजन इष्टतम मापदंडों का निर्धारण अन्य हाइड्रोजेल योगों में microfluidic नेटवर्क के निर्माण के लिए में सहायता करेगा।

तकनीक का एक वर्तमान सीमा हाइड्रोजेल उस समय के एक व्यवहार्य राशि में अपमानित किया जा सकता की कुल मात्रा है। खुले रिक्तियों या हाइड्रोजेल भीतर microfluidic सुविधाओं बनाने के लिए, लेजर समय ध्यान केन्द्रित होना चाहिए या इसके बाद के संस्करण 8.96 μs / पिक्सेल (या 0.021 माइक्रोन के एक लेजर स्कैन गति / μs) जब 37.7 न्यू जर्सी / माइक्रोन 2 के एक लेजर प्रभाव का उपयोग कर। इन सेटिंग्स के साथ, यह 1.4 एच (चित्र 1 में देखा है) लेता है एक 0.014 मिमी 3 मात्रा के भीतर जहाजों नीचा करने के लिए। 4.48 μs / पिक्सेल या नीचे के एक लेजर ध्यान केन्द्रित करना समय का उपयोग, ऊर्जा को जन्म दिया हाइड्रोजेल यहां इस्तेमाल तैयार करने का पूरा गिरावट के लिए पर्याप्त नहीं है। एक अलग हाइड्रोजेल को लागूरचना इस सीमा को पार कर सकता है। Photolabile जैल कि प्रकाश के प्रति संवेदनशील घटकों 34-36 या हाइड्रोजेल है कि बड़े multiphoton पार वर्गों 21-24 में होते हैं के उपयोग के लिए अच्छा विकल्प है कि कम ऊर्जा के उपयोग को सक्षम होता है और तेजी से गिरावट में परिणाम होता है। आयामी सीमाओं के संबंध में, सुविधाओं 1.5 मिमी हाइड्रोजेल 7 में गहरी करने के लिए निर्मित किया गया है। गहराई प्राप्त उद्देश्य के काम दूरी के एक समारोह है और अल्ट्रा लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्यों में vivo इमेजिंग के लिए अनुकूलित का उपयोग कर बढ़ाया जा सकता है। छोटी से छोटी मापा चैनल 7 का उपयोग कर एक 20X (NA1.0) पानी विसर्जन उद्देश्य 3.3 माइक्रोन की चौड़ाई और 8.9 माइक्रोन की गहराई है, जो चित्रा 1 में उत्पन्न सबसे छोटे चैनलों के आकार के साथ बराबर है था बनाया। दूसरी प्रयोगशालाओं के निचले NA उद्देश्यों 21,23,24 का इस्तेमाल किया है, हम आशा करते हैं कि छोटे सुविधाओं के साथ microfluidic नेटवर्क का उपयोग कर उच्च उत्पन्न किया जा सकताएक कम दूरी काम की कीमत पर एर NA उद्देश्यों। अंत में, हालांकि, तकनीक का संकल्प लेजर बीम ध्यान केंद्रित की बात फैल समारोह के एक समारोह है, लेजर स्कैनिंग गुण, ऊर्जा की राशि लेजर द्वारा दिया, और सामग्री की लेजर अवशोषण गुण अपमानित किया जा रहा।

इसके अलावा, लेजर गुण (गति, प्रभाव, आभासी मास्क, और repetitions की संख्या के बीच अंतर) हाइड्रोजेल गुणों के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए (Crosslink घनत्व, macromer / मोनोमर आणविक वजन, वजन प्रतिशत, और हाइड्रोजेल के प्रकार: प्रोटीन आधारित बनाम सिंथेटिक ), इन स्वाभाविक लेजर और इस तरह की प्रक्रिया के अंतिम संकल्प के साथ बातचीत बदल जाएगा। के रूप में दिया ऊर्जा का भी इस्तेमाल किया उद्देश्य से प्रभावित होता है, जब अतिरिक्त अनुकूलन के उद्देश्यों के बीच स्विच करने की आवश्यकता है। लागत शामिल करने के लिए सम्मान के साथ, एक स्पंदित लेजर के साथ एक खुर्दबीन के लिए उपयोग की आवश्यकता है, और जबकि कई अलग अलग ओर्बtives इस्तेमाल किया जा सकता है, एक उच्च एनए और लंबे समय तक काम दूरी (vivo इमेजिंग के लिए) के साथ उन लोगों के लिए महंगा हो सकता है।

ऊपर और प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत परे है, इस तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न microfluidic नेटवर्क भी endothelial सेल आसंजन और लुमेन गठन 7 प्रेरित करने के लिए सेल चिपकने वाला पेप्टाइड्स के बाद चैनल के निर्माण के साथ क्रियाशील किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, थोक माल 9 पूर्व में सेल सड़ सकने पेप्टाइड दृश्यों का समावेश गिरावट चैनल करने में और हाइड्रोजेल के माध्यम से सेल प्रवास के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकता है। हाइड्रोजेल भीतर microfluidic नेटवर्क के निरंतर तरलीकरण के लिए, हाइड्रोजेल, बड़ा fluidic उपकरणों या housings में photopolymerized जा सकती है के रूप में आंकड़े 2 और 3 से 7 में प्रदर्शन किया।

Vasculogenic या एन्जियोजेनिक आत्म विधानसभा 8-12 के माध्यम से संवहनी नेटवर्क की पीढ़ी VA प्रेरित करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता हैएक अपेक्षाकृत बड़े हाइड्रोजेल मात्रा भर scularization। इस दृष्टिकोण perfusable fluidic नेटवर्क में यह परिणाम है, यह सीधे आकार, टेढ़ा-मेढ़ापन, घनत्व, और समग्र नेटवर्क वास्तुकला नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है। इस सीमा के कारण, प्रवाह प्रोफ़ाइल और वाहिका में कतरनी दरों प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, तकनीक microfabrication 13-16 नेटवर्क वास्तुकला पर सीधा नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन अक्सर छोटे, केशिका आकार चैनलों या घने नेटवर्क है कि इन विवो संवहनी वास्तुकला में नकल के निर्माण उत्पन्न करने के लिए अपनी असमर्थता द्वारा सीमित हैं। लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट यहाँ रेखांकित तकनीक नव microfluidic पीढ़ी के लिए repurposed किया गया है, इसके साथ ही, दोनों वास्तु नियंत्रण और 3 डी biomimetic microfluidic नेटवर्क है कि घनत्व, टेढ़ा-मेढ़ापन पुनरावृत्ति के सृजन को सक्षम करने से मौजूदा microfabrication के तरीकों के आकार के आधार पर सीमाओं पर काबू आकार सीमा है, और समग्र architecturइन विवो वाहिका के ई। इसके अलावा, कई fluidic नेटवर्क के लिए एक एकल हाइड्रोजेल में उत्पन्न किया जा सकता है, अंतर-नेटवर्क परिवहन 7 के अध्ययन की अनुमति। ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों है कि और अधिक बारीकी से इन विट्रो में विवो परिवहन प्रक्रियाओं में दोहराने के लिए प्रयास करते हैं के लिए, अत्यधिक सुलझाया हाइड्रोजेल एम्बेडेड microfluidic यहाँ रेखांकित नेटवर्क अच्छी तरह से अनुकूल हैं। हम आशा करते हैं कि इस प्रोटोकॉल ऊतक निर्माणों को विकसित करने में उपयोगी हो जाएगा कि दवा स्क्रीनिंग उपकरणों के रूप में और इन विट्रो रोग मॉडल में उपयोग के लिए और अधिक सही नकल विवो परिवहन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATLAB Mathworks R2015a named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH version 1.51a named "image processing software" in protocol
LSM 780 Confocal Microscope Zeiss named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation
Zen 2010B SP1 Zeiss release version 6.0 named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780
Multitime, 2010 Zeiss v16.0 named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen)
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm Zeiss 421452-9880-000 for use on Zeiss LSM-780
Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser Coherent named "high-powered pulsed laser" in protocol
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Triethanolamine (TEOA) Sigma-Aldrich 90279-100ML flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G
150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane VWR 10040-460
PEGDA synthesized in house refer to source 33 for synthesis methods; store under argon
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E6003-25G
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood
3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil Thomas Goldkamp 37728
Flexmark 90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 backing for handling of double coated tape
Model SC Plotter (adhesive cutter) USCutter SC631E used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes
60 mm Petri Dish with 20 mm Hole MatTek Corporation P60-20-F-NON
High Intensity Illuminator (white light source) Fiber-Lite 4715MS-12WB10
Power Meter Newport 1916-R detect power at 524 nm when using white light source
Slim Profile Wand Detector Newport 918D-ST for use with power meter
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round synthesized in house refer to source 7 for methods
Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Life Technologies D7137 can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel
1 mL Syringe, Luer-Lok BD 309628
Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602
sticky-Slide VI0.4  Ibidi 80601 microfluidic devices that can be used to house hydrogels

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References

  1. Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, (5), 1799-1803 (2011).
  2. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32, (8), 760-772 (2014).
  3. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14, (4), 248-260 (2015).
  4. Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17, (3-4), 173-181 (2012).
  5. Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, (1), 214-219 (2015).
  6. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7, (5), 525-533 (2015).
  7. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. (2016).
  8. Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22, (21), 4511-4518 (2012).
  9. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24, (17), 2344-2348 (2012).
  10. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, (8), 1489 (2013).
  11. Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12, (7), 2715-2722 (2011).
  12. Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. (2003).
  13. He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25, (11), 2491-2500 (2014).
  14. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2, (4), 265-271 (2003).
  15. Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23, (24), H178-H183 (2011).
  16. Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26, (19), 3124-3130 (2014).
  17. Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (34), 13515-13520 (2012).
  18. Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. (2015).
  19. Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270, (1516), 755-763 (2003).
  20. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81, (8), 1015-1047 (2005).
  21. Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96, (11), 4743-4752 (2009).
  22. Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, 116-119 (2009).
  23. Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, (39), 12052-12057 (2015).
  24. Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8, (2), (2011).
  25. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101, (4), 1337-1354 (2012).
  26. Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
  27. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2, (10), 2888-2896 (2011).
  28. Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
  29. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  30. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. (2015).
  31. Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9, (6), 6128-6138 (2015).
  32. Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
  33. DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109, (1-3), 139-148 (2005).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3, (12), 925-931 (2011).
  35. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324, (5923), 59-63 (2009).
  36. Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6, (20), 5100-5108 (2010).

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