Murine tutto spessore trapianto della pelle

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Immunology and Infection

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Summary

Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello consolidato per studiare il rifiuto in un ambiente alloimmune. Qui, mettiamo a disposizione un tutorial di ogni passo coinvolti in esecuzione di un BALB / c -> C57BL / 6 a tutto spessore trapianto di pelle.

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Cheng, C. H., Lee, C. F., Fryer, M., Furtmüller, G. J., Oh, B., Powell, J. D., Brandacher, G. Murine Full-thickness Skin Transplantation. J. Vis. Exp. (119), e55105, doi:10.3791/55105 (2017).

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Abstract

Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello in vivo consolidata per studiare alloimmune risposta e rigetto del trapianto. Nonostante la sua limitata applicazione per gli esseri umani, il trapianto di pelle nei topi è stato ampiamente impiegato per la ricerca sui trapianti. La procedura è facile da imparare ed eseguire, e non richiede tecniche microchirurgiche delicate né una formazione completa. Inoltre, il rigetto in questo modello si verifica in una reazione immunologica molto riproducibili ed è facilmente monitorato mediante ispezione diretta e palpazione. Inoltre, il trapianto di pelle secondario con innesti donatore corrispondenza o pelle di terze parti può essere eseguita su più modelli di trapianto complessi come un metodo alternativo e semplice per valutare la tolleranza specifici per donatore. Le complicazioni sono bassi e sono in genere limitati a overdose anestesia o distress respiratorio dopo la procedura. fallimento Graft, invece, si verifica comunemente come a causa della scarsa preparazione del gra poppa, errato posizionamento nel letto trapianto, o il posizionamento inadeguato del bendaggio. In questo articolo, vi presentiamo un protocollo per il trapianto di pelle a tutto spessore nei topi e descrivere i passi importanti necessari per una procedura di successo.

Introduction

Il trapianto di organi è il trattamento di scelta per i pazienti con insufficienza terminale d'organo, ed i risultati hanno migliorato notevolmente con i progressi nelle procedure chirurgiche e protocolli immunosoppressione. Tuttavia, immunosoppressione a lungo termine è associato ad effetti collaterali significativi, e lo sviluppo di nuove strategie che promuovano la tolleranza rimane l'obiettivo della ricerca trapianti moderna.

Numerosi modelli animali sono stati sviluppati per la ricerca di base nel trapianto, per studiare i meccanismi di rigetto e per testare immunosoppressione approcci per prevenire il rigetto del trapianto e per promuovere la tolleranza a lungo termine 1-3. modelli di topo sono diventati il ​​cardine della ricerca immunologica grazie alla disponibilità esclusiva e vasta di anticorpi diagnostici e terapeutici e ceppi inbred e transgenici ben definiti. Il trapianto della pelle è una procedura semplice che non richiede particolari competenze di microchirurgia e puòessere facilmente monitorati dopo l'intervento. Nel loro insieme, il trapianto di pelle del mouse è stato uno strumento eccezionale per studiare molti aspetti coinvolti nella risposta alloimmune, tra cui la consegna antigene, il traffico delle cellule, e la distruzione dei tessuti durante rigetto del trapianto 4,5.

Qui, vi mostriamo la procedura passo-passo per il trapianto a tutto spessore della pelle utilizzando il modello di topo, e descriviamo i passi importanti necessari per un attecchimento di successo della pelle trapiantata.

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Protocol

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institute of Health (NIH) e sono stati approvati dal Comitato Johns Hopkins University Animal Care e Usa (JHUACUC). Le procedure specifiche sono state eseguite sotto la protocolli ACUC approvato MO13M292 e MO13M370.

1. donatore Harvest pelle

  1. Anestetizzare il mouse donatore con isoflurano (vaporizzatore induzione a 4%, manutenzione a 1 - 2% attraverso il cono del mouse). Utilizzare la punta pizzico di ritiro reflex per monitorare la profondità dell'anestesia.
  2. Usando un rasoio elettrico, radere dorso dell'animale e disinfettare con 10% di iodio povidone (ad esempio, Betadine).
  3. Utilizzando forbici sterili, guanti e tecnica asettica, pelle di nuovo raccolto donatore dal fianco al collo, con scollamento a livello del tessuto connettivo areolare.
  4. Eutanasia dell'animale da dislocazione cervicale dopo la raccolta delinnesto di pelle.
  5. Sotto un microscopio, separare il tessuto connettivo, tessuto adiposo, e pannicolo carnosus dalla pelle indietro con le forbici tenotomy sottili. Il carnosus pannicolo è un sottile, trasparente muscoli responsabili dei movimenti contrazioni della pelle.
  6. Usando una tecnica strumenti sterili, tagliare innesti 15 mm x 15 mm dalla pelle indietro per un 10 mm x 10 mm per 15 mm letto trapianto x 15 mm.
  7. Conservare gli innesti su garze imbevute con sterile tampone fosfato salino (PBS) in una capsula di Petri sul ghiaccio.
    NOTA: 8 - 10 innesti può essere ottenuta da un topo donatore.

2. trapianto di pelle

  1. Anestetizzare il mouse destinatario con isoflurano (vaporizzatore induzione a 4%, manutenzione a 1 - 2% attraverso il cono del mouse). Utilizzare la punta pizzico di ritiro reflex per monitorare la profondità dell'anestesia.
  2. Somministrare 0,02 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per alleviare il dolore post-operatorio.
  3. Shave lato del dorso dell'animale in cui l'innesto will essere inserito e disinfettare con il 10% di iodio povidone.
  4. Utilizzando le forbici, tagliare un 10 mm x 10 mm per 15 mm x 15 mm quadrato di pelle. La dimensione difetti dovrebbe essere leggermente più grande (10%) rispetto al trapianto. Tagliare come superficialmente possibile. Fare attenzione a preservare la carnosus pannicolo e vasi. La carnosus pannicolo può essere distinto dal fascia sottostante per la sua mobilità e dei vasi sanguigni che corrono superficiale ad esso.
  5. Posizionare l'innesto sul letto graft, evitando pieghe lungo i bordi.
  6. Mettere 8 punti di sutura sugli angoli e sul centro di ciascun bordo. Per ciascuna di sutura, passare l'ago attraverso l'innesto e poi attraverso la carnosus pannicolo dell'innesto letto sotto la pelle del destinatario circostante.
  7. Rimuovere la maschera anestetico e lasciare che l'animale recupera parzialmente da anestesia prima di applicare il cerotto.
  8. Avvolgere il mouse destinatario in un bendaggio adesivo con garza piegata sopra l'innesto. Effettuare la benda dalla combinazione di due bende, tagliola parte adesiva di uno e posizionare i due tamponi assorbenti insieme.
  9. Monitorare il mouse da vicino durante il recupero per garantire che il bendaggio non sta limitando torace escursione e la respirazione. Togliere la benda se la frequenza respiratoria diminuisce o l'animale comincia a boccheggiare o alito superficialmente.

3. Cura postoperatoria

  1. Somministrare enrofloxacina 5 mg / kg dopo l'intervento chirurgico per la profilassi delle infezioni.
  2. Posizionare il mouse trapiantato in una gabbia pulita su una piastra elettrica per microonde fino a quando non recupera completamente dall'anestesia.
  3. Osservare il mouse per 1 ora dopo l'intervento prima di ritornare alla struttura alloggiativa.
  4. Sette giorni dopo l'intervento, anestetizzare il mouse come al punto 2.1. Rimuovere il bendaggio tagliando solo attraverso il lato ventrale della benda.
  5. Osservare e palpare il trapianto il giorno successivo per i segni di formazione di croste, la contrazione, o la durezza. Se presente, l'innesto può non aver raggiunto la corretta vascularizazione e deve essere considerato un guasto tecnico.
  6. Daily Monitor per i segni di rigetto. Considerare innesti respinto quando ≥90% del tessuto trapianto diventa necrotico.
  7. Eutanasia gli animali rifiutati e li raccolto per l'analisi.

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Representative Results

Il posizionamento del bendaggio sul mouse destinatario è un importante passo della procedura. L'innesto di pelle è posizionato sul tronco destinatario, tra la spalla, anca e colonna vertebrale (Figura 1). La benda è realizzata con garza piegata e la combinazione di due bende adesive plastica. Il mouse destinatario è posizionato con l'innesto giù sopra la garza sul centro della benda. Utilizzando due micro pinze curve, l'estremità inferiore della benda è tirato prima, e poi la parte superiore della benda è avvolto sopra il mouse per l'addome.

Nei modelli di mismatch completi, tutto spessore innesti cutanei sono di solito respinte 8 a 12 giorni. Nei modelli disallineamento minori, risposte di rigetto sono più lenti, più variabile, e la comparsa innesto di pelle è caratterizzata da cambiamenti distinti meno, come contrazione o la perdita di capelli (Figura 2). trapianto rigetto acuto generilly inizia con gonfiore ed eritema del trapianto. Questi eventi sono seguiti da trapianto essiccazione, restringimento, e formazione di crosta (Figura 2B e C). A seconda del grado di MHC disadattamento e il protocollo immunosoppressione, rifiuto può avvenire mediante un processo subacuto, caratterizzato da cambiamenti sottili come la perdita di capelli, pigmentazione, creste dermiche, e il volume dell'innesto. In questi casi, un innesto respinto appare lucido, bianco, e senza peli, con bordi irregolari (Figura 2F) 14.

Utilizzando questo modello di trapianto di pelle, abbiamo studiato un nuovo approccio mira il metabolismo delle cellule T per evitare rigetto del trapianto 15. E 'ben noto che la segnalazione di percorsi metabolici giocano un ruolo critico nel dettare i risultati delle risposte delle cellule T 16. cellule T naive basano su fosforilazione ossidativa mitocondriale per generare l'energia necessaria per la sorveglianza immunitaria base. Però,dopo l'attivazione, le cellule T effettrici metabolicamente riprogrammare per glicolisi aerobica e mostrano un aumento del metabolismo della glutammina 16,17. Utilizzando Balb / c come donatori e C57BL / 6 come destinatari, abbiamo osservato che l'inibizione glicolisi e fosforilazione ossidativa metabolismo (2DG + metformina) o glutammina da sola (DON) prolungato con la pelle del trapianto di sopravvivenza, ma bloccando i tre percorsi contemporaneamente ha portato in modo significativo, aumento del trapianto sopravvivenza (Figura 3C). Inoltre, la terapia metabolica tripla era più efficace di ciclosporina convenzionale o rapamicina (Figura 3A e B). accettazione permanente non è stato raggiunto, e ulteriori strategie, tra cui la terapia esaurimento, costimulation blocco, o nuove terapie metabolici, può favorire una migliore induzione della tolleranza del trapianto. Tuttavia, lo studio ha fornito due nuovi approfondimenti: l'uso di inibitori non specifici per colpire le cellule immunitarie selettive con aumentate richieste metaboliche, nonché il requisito t o bloccare i tre percorsi metabolici contemporaneamente per ottenere immunosoppressione più robusto nel rigetto del trapianto.

inibitori della calcineurina e bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR inibitori) costituiscono la maggior parte della terapia immunosoppressiva convenzionale utilizzato nei trapianti clinica. i tassi di sopravvivenza del trapianto mediani dei Balb / c per C57BL / 6 trapianti di pelle trattati con ciclosporina e rapamicina sono stati 17 e 16 giorni, rispettivamente. In confronto, i destinatari trattati con inibitori metabolici che inibiscono la glicolisi delle cellule T, fosforilazione ossidativa mitocondriale e metabolismo della glutammina avevano prolungato la sopravvivenza: la sopravvivenza del trapianto mediana è stata di 29 giorni. Inoltre, l'istologia di innesti cutanei del gruppo di terapia metabolica esposto allineamento dei tessuti più intatti e meno infiltrato infiammatorio linfocitica (Figura 4).

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Figura 1: Il rivestimento della Graft con il bendaggio. Graft (A) Pelle posizionato sul tronco destra. (B) fasciatura fornito con una garza piegato e due strisce bende plastica. Mouse (C) Destinatario posta sulla garza. (DF) Bandage avvolto intorno al mouse. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Skin Graft Aspetto durante acuta e rigetto cronico. (A) Balb / c per C57BL / 6 (mancata corrispondenza completa) il trapianto a tutto spessore della pelle, senza evidenza di rifiuto (giorno 8). (B) Balb / c per C57BL / 6 trapianto di pelle a tutto spessore con il 50% rigetto del trapianto (giorno 13). (C) Balb / c per C57BL / 6 trapianto a tutto spessore della pelle con il rigetto del trapianto completo (giorno 18). (D) il trapianto di pelle a tutto spessore Singenico (giorno 8). Il trapianto (E) Singenico a tutto spessore della pelle (giorno 30). (F) C57BL / 10 a C57BL / 6 (mancata corrispondenza minore) il trapianto a tutto spessore della pelle con rigetto cronico (giorno 100). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Balb / c per C57BL / 6 Pelle sopravvivenza del trapianto. (A) Il trattamento con ciclosporina (25 mg / kg QD). (B) Il trattamento con rapamicina (3 mg / kg QD). (C) Il trattamento con inibitori metabolici, 2-deossi-D-glucosio (2DG) 500mg / kg QD, metformina 150 mg / kg QD, e 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON) 1,6 mg / kg QOD. Tutti i trattamenti sono stati somministrati dal giorno del trapianto fino a rifiuto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: ematossilina e eosina (a destra, X100, sinistra, X200) di pelle innesta con metabolica terapia postoperatoria al 7 ° giorno. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Dalla sua introduzione da Medawar, prima in studi sull'uomo e poi nei conigli e topi, il trapianto di pelle è stato un modello prezioso per lo studio delle risposte immunitarie allogeniche 6,7. In questo manoscritto, vi presentiamo un modello di grandi dimensioni, non vascolarizzato, il trapianto a tutto spessore della pelle con la pelle posteriore superiore e inferiore. Vari metodi alternativi, tra cui l'uso della pelle coda o la pelle dell'orecchio del mouse come fonte innesto di tessuto, sono stati segnalati fino ad oggi 8,9. Questi modelli presentano il vantaggio della semplicità tecnica e consentono il throughput alto volume. Il deficit relativo di cellule di Langerhans epidermiche e cellule dendritiche dermiche in trapianti di pelle coda, tuttavia, porta a ritardo rifiuto nonché all'accettazione innesto facilitato dall'host, particolarmente in minori modelli disallineamento MHC 10,11. Pertanto, tutto spessore innesto cutaneo tronco è considerato un modello più robusto e più adatto per lo studio delle cellule T-mediaTed rigetto acuto 12.

Inoltre, il nostro modello utilizza tecniche semplici e non richiede abilità microchirurgia avanzata. Il tempo di funzionamento è breve (~ 10 min per mouse dal l'insorgenza di anestesia al completamento della procedura), e la morbilità e la mortalità postoperatoria è trascurabile. La mortalità operatoria globale (morte entro 24 ore dopo l'intervento chirurgico più la morte prima della rimozione del bendaggio) è stato segnalato per essere 3,8% 13. La maggior parte delle complicazioni derivano da overdose di anestesia o bende eccessivamente restrittivi, che può essere facilmente prevenuta con un attento monitoraggio della funzione respiratoria durante il periodo post-operatorio immediato e da una rapida rimozione del bendaggio ai primi segni di distress respiratorio 6,17.

Il fattore più critico nel processo di attecchimento è la rivascolarizzazione del tessuto dell'innesto dalla crescita interna dei vasi di accoglienza per l'innesto 6. La pelle raccolto richiedes preparazione accurata, e la dissezione del carnosus pannicolo è un passaggio fondamentale. Preferiamo rimuovere le carnosus Pannicolo al microscopio. Si raccomanda di iniziare la dissezione da uno dei bordi e per avanzare lentamente spingendo il muscolo separandola dalla pelle con la lama di un tenotomia curva leggermente inclinato. Il sito del letto innesto dovrebbe essere lontano da articolazioni e la colonna vertebrale. Prima di effettuare incisioni nel mouse ricevente, la spalla e l'anca devono essere spostati per visualizzare le pieghe della pelle che contribuiscono a delimitare il livello delle articolazioni. Quando si rimuove la pelle ricevente, è importante per evitare di danneggiare i vasi sanguigni che corrono superficiale al carnosus panniculus. In caso di emorragia, applicare la compressione locale e rimuovere il sangue e coaguli che possono interferire con l'attecchimento. Infine, il bendaggio non dovrebbe causare difficoltà respiratorie che il recupero compromesso, anche se deve essere sufficientemente limitano a impedire lo spostamento del trapianto e auto-muventila- durante il processo di rivascolarizzazione. Strisce di plastica cerotti sono aderenti e abbastanza forte per questo scopo. Uniamo due bende per avvolgere completamente i waist mouse e per consentire il posizionamento di una garza piegata tra la benda e l'innesto (figura 1). Il bendaggio viene rimosso tagliando la parte ventrale di esso, e il resto viene rimosso dall'animale, al fine di evitare di interrompere l'innesto nel tentativo di rimuovere il bendaggio manualmente.

In sintesi, il trapianto tutto spessore della pelle è un modello ben consolidato con abbondanti riferimenti nella letteratura. La procedura è facile da eseguire, il tempo di funzionamento è breve, e le complicazioni postoperatorie sono limitati. I punti critici sono riportate meticolosa raccolta pelle donatore e il corretto posizionamento del bendaggio destinatario. Gli studi futuri che coinvolgono biomateriali che promuovono l'angiogenesi e la riparazione dei tessuti possono migliorare ulteriormente il tasso di successo della procedura.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere R01AI077610.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight micro forceps Sigma F4017
Curved micro forceps Aesculap BD333R
Curved Stevens tenotomy scissors Aesculap BC905R
Mayo dissecting scissors Sigma S3146
Micro needle holder Aesculap BM563R
Sterile gauze Covidien 441218
6-0 Nylon suture MWI 31849
Plastic Strips Band-Aid Johnson & Johnson Obtained from pharmacy
10 cm Petri dish Fisherbrand FB0875712
PBS Quality Biological 119069131
Buprenorphine DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy
Enrofloxacin Bayer Health Care 186599

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References

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