הכנה והערכה של * These authors contributed equally

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bilton, H. A., Ahmad, Z., Janzen, N., Czorny, S., Valliant, J. F. Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry. J. Vis. Exp. (120), e55188, doi:10.3791/55188 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

99m Tc נשאר רדיואיזוטופיים הדומיננטי בשימוש ברפואה גרעינית אבחון, עם למעלה מ -50 מיליון הליכי הדמיה שנערכו בשנת ברחבי עולם 1, 2, 3. רוב סוכני 99m Tc בשימוש קליני הם רדיואקטיביות סוג זלוף. ישנם מספר מצומצם של תרכובות ממוקדות פעיל אשר 99m Tc מופנה לאגד סמן ביולוגי ספציפי באמצעות קשירה לבנות מיקוד. יצירת רדיואקטיביות 99m Tc הממוקד מתעכבת לעתים קרובות על ידי השפעתו של 99m Tc-ליגנד מתחמים על היכולת של מולקולת המיקוד להיקשר הסמן הביולוגי של עניין, או איזוטופים מחצית החיים אינם ארוך מספיק לשימוש עם ביומולקולות משקל מולקולרי גבוה כמו נוגדנים. זה האחרון בדרך כלל דורש כמה ימים לפני תמונות נרכשות על מנת biomolecule כדי לנקות מן היעד הלא Tiss UES. מיקוד טרום מציע גישה חלופית כדי להתגבר על האתגרים אלה.

טרום מיקוד בשילוב עם כימית bioorthogonal הוכח להיות דרך יעילה לפתח בדיקות הדמיה מולקולריות חדשות לשני קרינת רדיו-הדמיה 4, 5, 6, 7, 8. הביקוש אלקטרונים הפוך- אלמון דילס (IEDDA) התגובה בין 1,2,4,5-tetrazine (טז) ו -cyclooctene טרנס (TCO) נגזרים, כפי שמוצג באיור 1, הוכח להיות יעיל במיוחד 6. התגובה IEDDA עם רכיבים אלה יכולים להפגין קינטיקה מהירה ב PBS (k 2 ≈ 6,000 M -1 s -1) סלקטיביות גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור in vivo מראש מיקוד יישומים 9, 10.

e_content "> הגישה הנפוצה ביותר בשימוש כרוך בניהול וקטור מיקוד TCO הנגזר לאחר תקופת עיכוב מספיק, tetrazine radiolabeled מנוהל. tetrazines radiolabeled מבוסס על 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 ZR, ו -111 ב כבר 11 דיווחו, 12, 13, 14, 15. לעומת זאת, יש רק אחד הדיווחים של 99m Tc שכותרתו טז, אשר הוכן באמצעות ליגנד סוג HYNIC המחייב שימוש-הליגנדים שיתוף למנוע התקשרות חלבונים והשפלה in vivo 16. כחלופה, אנו מדווחים כאן את הסינתזה של 99m Tc (I) שכותרתו tetrazines באמצעות משפחה של הליגנדים המהווים מתחמי tridentate יציבה עם [99m Tc (CO) 3] + הליבה.

גיל = "1"> איור 1
איור 1: תגובת IEDDA bioorthogonal בין tetrazine ו -cyclooctene טרנס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בני משפחתו של הליגנדים מוכן לכלול chelates tridentate שמשתנות הקוטביות ואת לאופי הקבוצה מקשר בין אזור מתכת מחייב ואת טז (איור 2). המטרה היתה לזהות 99m Tc-Tetrazine לבנות שיכול למקם ביעילות ומגיבים עם אתרים שכותרתו TCO in vivo וברור במהירות כאשר לא מחויב, על מנת להניב גבוהה היעד ל-יעד שאינו יחסי. כדי לבדוק את הליגנדים, TCO-נגזרת של ביספוספונטים (TCO-BP) שימש 17. הראינו בעבר כי TCO-BP localizes לאזורים של מטבוליזם העצם פעיל ויכול להגיב עםtetrazines radiolabeled in vivo 18. זהו מגיב נוח לבדוק tetrazines חדש, כי זה יכול להיות מוכן בשלב אחד וניסויים יכול להתבצע בעכברים נורמליים שבו לוקליזציה מתרחשת בעיקר במפרקים (ברכיים וכתפיים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי מועצת האתיקה בעלי חיים למחקר באוניברסיטת מקמאסטר בהתאם המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים (CCAC) הנחיות.

1. Radiolabeling של הליגנדים TZ-tridentate עם 99m Tc

זהירות: ההליכים הבאים מחייבים את השימוש של תרכובות רדיואקטיבי. העבודה צריכה להיעשות רק במעבדה מורשה עם דבקות תקנות הבטיחות וסילוק. תגובות מיקרוגל צריכות להתבצע במיקרוגל שתוכנן במיוחד עבור סינתזה כימית.

  1. סינתזה של [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20
    1. בבקבוקון מיקרוגל, לשלב 8 מ"ג K 2 [BH 3 CO 2], 15 מ"ג Na 2 CO 3, 20 מ"ג Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O, ו -25 מ"ג קוקו [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. טהר הבקבוקון במשך 10 דקות עם גז ארגון.
    2. הוסף 4 מ"ל של 99m TCO 4 - (~ 1,100 MBq, ~ 30 MCI) סליין 0.9% ל הבקבוקון.
    3. מחמם את התגובה במיקרוגל במשך 3.5 דקות ב 110 מעלות צלזיוס לאחר 10 שניות של ערבוב כדי להבטיח ערבוב יסודי של חומרים כימיים.
    4. התאם את ה- pH של הפתרון 3.5-4 באמצעות ~ 400 μL של 1 M HCl. אמת באמצעות נייר pH.
  2. Radiolabeling של Tetrazine הליגנדים 1-5
    1. ממיסים 2 מ"ג של כל ליגנד (תרכובות 1-5) ב 250 μL MeOH 21.
    2. הוסף 250 μL של [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 MCI) כל פתרון.
    3. מחממים את תערובת התגובה באמצעות במיקרוגל למשך 20 דקות ב 60 מעלות צלזיוס.
      הערה: שלב זה היה זהה עבור כל 5 tetrazines.
    4. עבור תרכובות 2- 5, להתאדות הממס מחדש dissolve המוצרים וכתוצאה מכך 1 מ"ל של 1: 1 v / v DCM: TFA.
    5. מחממים את תוצרי התגובה מומס (2-5) ב 60 ° C במיקרוגל במשך 6 דקות (2-4) או 10 דקות (5).
    6. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להתאדות ממס באמצעות המאייד (36 מעלות צלזיוס, 8 mbar, 3 דקות, 6,000 סל"ד) ו לפזר את המתחם מיובש 1: 1 ACN: H 2 O או 1: 1 MeOH: H 2 O, לפני טיהור HPLC.
    7. לטהר את תרכובות Tc שכותרתו 99m (1-5), כולל הפרדת מוצר שכותרתו מ ליגנד tetrazine ללא תווית, באמצעות HPLC (C 18 התהפכה פאזי). בדרך כלל, להשתמש שיפוע elution של 30:70 ACN: H 2 O (שניהם עם 0.1% TFA) כדי 40:60 ACN: H 2 O מעל 20 דקות (18 דקות) ו טור 100 מ"מ 4.6 x 18 C אנליטית. השתמש בשני UV (254 ננומטר) וזיהוי גמא.
      1. לקחת דגימה קטנה של כל מוצר שהכותרת ולהשוות זמן שמירת HPLC שלה לזה של inj-שיתוףected, שאינם רדיואקטיביים, Re-שכותרתו סטנדרטי (0.125 מ"ג ב 20% מתנול-H 2 O). התקן שכותרתו Re מזוהה עקבות UV HPLC, ויהיה elute באותו זמן כמו במתחם Tc שכותרתו 99m ב עקבות γ-HPLC. שיתוף הזרקה זה מראה פסגות בזמני שימור דומים, המאשרת את זהותו של 99m Tc שכותרתו מתחם.
    8. להתאדות הממס מתוך שברי HPLC באמצעות מאייד (36 מעלות צלזיוס, 8 mbar, 3 דקות, 6,000 סל"ד).
    9. נסח במתחם המטוהר בריכוז של 7.4 kBq / μL ב PBS, המכיל BSA 0.5% ו 0.01% Tween-80.
    10. כדי להבטיח את התרכובות שכותרתו יציבות, לבצע מחקר יציבות חוץ גופייה. דגירה למתחם ניסח ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1, 4 ו -6 שעות, הזרקת כמות קטנה (3.7 MBq) של התערובת על HPLC בכל נקודת זמן כדי להעריך את היציבות.

2. מחקרים ביו-הפצה טרום ממוקד

    הכנת חיות
    1. שימוש 7-9 בן שבוע, עכברים Balb / c נקבה (n = 3), לנהל TCO-BP מנוסחת מלוחים (20 מ"ג / ק"ג) (5 מיקרוגרם / μL), באמצעות הזרקת הזנב ורידים.
    2. העבר את העכבר בהתקן ריסון פיזי, ולזהות את הוורידים ממוקמים על המשטחים לרוחב של הזנב ולנגב עם מטלית אלכוהול. בערך בשעה 2 ס"מ מהקצה של הזנב, להכניס מחט 30-מד בזווית שטוחה, במקביל הווריד. לאט לוחץ על המתג כדי להזריק, להסיר מחט ולהחיל ספוג גזה נקי במקום ההזרקה עם לחץ קל עד עוצר דימום.
    3. בשעה 1 הזרקת שעות שלאחר של TCO-BP, לנהל ~ 0.74 MBq (20 μCi) של 99m Tc-tetrazine מנוסחת 100 μL של 0.5% BSA, 0.01% Tween-80 ב PBS, באמצעות הזרקה-וריד הזנב.
  1. מחקרים ביו-הפצה
    1. בנקודת הזמן הרצויה (t = 6 שעות), לטשטש את העכברים באמצעות 3% isoflurane תערובת גז חמצן 2%. להפגין כדידואר נסיגת קמצוץ על העכבר הרדים כדי לוודא שהם תחת מטוס של הרדמה כירורגית.
    2. איסוף דם (1 מ"ל) באמצעות לנקב לב באמצעות מזרק טרום שטופלו הפרין. מקום עכבר על גבית עם אף בחרוט אף הרדמה המשיכה ולאתר את תהליך xiphoid על החיה.
      1. הכנס מחט 25 G, מעט שמאלה של קו האמצע של החיה תחת תהליך xiphoid, בזווית 20 מעלות. הכנס את המחט, ולאט לאט למשוך בחזרה על הבוכנה לראות דם רכזת המחט אם הלב היה מנוקב. מעט מחדש את המחט תוך כדי לחיצה על הבוכנה במידת הצורך, כדי לנקב את הלב. לאט להקיז דם לתוך המזרק.
    3. להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם, בעוד בהרדמה.
    4. מניח כל חיה בתוך שקית פלסטיק ולהשתמש כיל מנה (הגדרת Tc 99m) כדי למדוד את רמת פעילות הגוף כולו.
    5. אסוף את רקמות ונוזלים הבאים טרום לשקולed לספור צינורות: דם, עצמות (ברך וכתף), כיס מרה, כליות, כבד, קיבה (עם תוכן), מעי דק (עם תוכן), מעי גס ואת מעי אטום (עם תוכן), בלוטת תריס ואת קנה נשימה, שלפוחית ​​שתן עם שתן , וזנב.
    6. לשטוף רקמות מתאימות (למעט דם, כיס מרה, ואת שלפוחית ​​שתן) ב PBS להסיר דם כתם יבש לפני הנחת רקמות צינורות ספירה מתאימות.
    7. מניחים פגר חיה בתוך שקית ניילון ולמדוד פעילות הגוף כולו שיורית באמצעות כיל מנה.
    8. לשקול כל שפופרת המכילה דגימת רקמה. המשקל ההתחלתי הפחת של הצינור כדי לקבל מסה של רקמה.
    9. השתמש כיל מנה (הגדרת Tc 99m) כדי למדוד את כמות פעילות מדגם בדיקה (100 μL) בעת ההזרקה עבור כל עכבר.
      הערה: זה מדגם בדיקה שווה את עוצמת הזריקה, ובכך נותן את ספירת הפעילות בזמן ההזרקה.
    10. בעת מדידת רקמות,liquot 5 μL של מדגם הבדיקה השתמש בעבר. השתמש דלפק גמא רב-גלאי (הגדרת Tc 99m) ולספור להשיג הספירה לדקה (CPM) עבור מדגם בדיקת 5 μL.
    11. השתמש בשני הערכים שהתקבלו ב 2.2.9 ו 2.2.10 לחשב את הפעילות ואת קשר CPM בעזרת משוואת 1 להשיג מקדם מרה (CPM μCi -1).
      (1) משוואה 1
    12. השתמש הדלפק גמא למדוד את כמות רדיואקטיביות בכל רקמה או מדגם נוזל.
    13. השתמש במשוואה 1 כדי לחשב את הסכום של הפעילות בכל רקמה או נוזל בזמן יחסית המדידה מהחומר המוזרק הכולל. ערך זה מנורמל אז לפי משקל איבר כפי שדווח מהחומר המוזרק אחוזים לגרם (כלומר,% מזהה / g) של רקמות.
    14. בצע את השלבים 2.1.2 כדי 2.2.13 לנהל ניסוי ביקורת שלילית באמצעות הליגנדים tetrazine Tc שכותרתו 99m ב absence של TCO-BP. עכברי קורבן (n = 3) ברמה של 0.5, 1, 4 ו -6 הזרקת שעות שלאחר ולקבל רקמה או נוזל כמתואר לעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הליגנדים היו מסונתזים באמצעות linkers ו chelators השונים באמצעות אסטרטגית amination רדוקטיבי פשוטה (איור 2), ואחריו צימוד של המוצר אל tetrazine הזמין מסחרי 22, 23. Radiolabeling בוצע תוך שימוש באותה השיטה לכל התרכובות והיה מאוד לשחזור. התהליך היה מותאם על ידי שינוי pH, סכום של ליגנד, זמן תגובה וטמפרטורה שבעקבותיה 99m Tc-רדיואקטיבי תרכובות 1-5 התקבלו בינונית עד התשואה radiochemical גבוהה: 83% (1), 45% (2), 31% (3), 42% (4), ו -54% (5). לאחר טיהור HPLC מ ליגנד ואידוי unreacted באמצעות המאייד, תרכובות גובשו PBS המכיל BSA 0.5% ו 0.01% Tween80 לפני הזריקה. הפעילות הספציפית של p 99m urified Tc שכותרתו tetrazine היה ~ 1.48 MBq / מיקרוגרם. מחקרים נערכו כדי להעריך את היציבות של הליגנדים tetrazine Tc שכותרתו 99m לפני מחקרי in vivo. היציבות הייתה פיקוח על ידי HPLC בבית 1, 4 ו 6 שעות ללא שפלה נראית לעין מעל 6 שעות (R t = 14 דק '), כפי שניתן לראות באיור 3 עבור מתחם 4 כדוגמא.

איור 2
איור 2: תרכובות 1-5 הופקו באמצעות linkers שונים (Y) chelators (X) כמתואר בתרשים (למטה). כל התרכובות היו radiolabeled עם [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + באמצעות אותם תנאי התגובה (למעלה), למעט 1, אשר לא דורש צעד (ii).

</ Html"איור 3" src = "/ files / ftp_upload / 55,188 / 55188fig3.jpg" />
איור 3: תוצאות הבדיקה יציבות באמצעות תרכובת 4. עקבות γ-HPLC של 4 וטופחו PBS ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1, 4 ו -6 שעות.

כדי לבצע את בדיקות in vivo, עכברי Balb / c בריאות שמשו. בקצרה, לכל המתחם, קבוצות של עכברים (n = 3) הוזרקו TCO-BP (100 μL, 20 מ"ג / ק"ג), אשר לוותה על ידי הממשל של 99m Tc שכותרתו תרכובות 1 h מאוחר יותר. לאחר 6 שעות לאחר הזרקה של מתחמי Tc 99m, החיות הוקרבו ואת ריכוזי הפעילות שונות רקמות ונוזלים נקבעו. כתוצאה הנתונים הוא כפי שדווח מהחומר המוזרק אחוזים לכל רקמה גרם (% מזהה / g) ו מוצג באיור 4. יחסי נציג של עצם (ברך או כתף) לדם לכל מתחמי Tz החמישה 99m Tc שכותרתו מוצגים על לוח 1. נתונים אלו מעידים CLמוקדם כי מתחם 3 הניתנים אופטימליים מיקוד בשילוב עם אישור מרשות דם, וכי יש וריאציה משמעותית בין תרכובות Tc שכותרתו 99m לגבי לוקליזציה רקמות מחוץ היעד. מחקר שליטה שלילי באמצעות עכברים CD1 (n = 3) נערך, שבו עכברים הוזרקו הליגנדים 99m Tc-tetrazine בהעדר TCO-BP. עכברים הוקרבו על 0.5, 1, 4 ו -6 שעות ו% מזהה / g נקבע לכל רקמות ונוזלים. עבור כל התרכובות הנבחנות, שבו נתונים עבור מתחם 2 מוצגים באיור 5, ללא גידול משמעותי נצפה עצם או רקמות אחרות (לב, ריאות, טחול, שרירי שלד) לא שמוצגות באיור 4.

איור 4
איור 4. תוצאות ביו-הפצה עבור נגזרים tetrazine Tc שכותרתו 99m 1-5 (מוטות אינדיקהטד). הנתונים המוצגים התקבלו מרקמות שנבחרו ונוזלים לקחו 6 שעות שלאחר הזרקה של הנגזרים רדיואקטיבי, והפעילות הייתה מנורמלת לרקמות או משקל נוזל, כממוצע אחוז מוזרק במינון לגרם של רקמה או נוזל (% מזהה / g) ± SEM. מטרות עצם מסומנות על ידי •. הערה: כל הרקמות שנותרו לא מוצגות% הממוצע היה מזהה / g כי היה פחות מ -1%. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. תוצאות ביו-הפצה ללימוד שליטה באמצעות 99m Tc שכותרתו tetrazine (2) ללא הזרקה מראש של TCO-BP. הנתונים המוצגים התקבלו מרקמות שנבחרו ונוזלים שנלקחו 3 עכברים ב 0.5, 1, 4, ו -6 לאחר ההזרקה h של 2. פעילות הייתה מנורמלת רקמות אומשקל נוזל, כממוצע מהחומר המוזרק אחוזים לגרם של רקמה או נוזל (% מזהה / g) ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מתחם
יַחַס 1 2 3 4 5
כתף: דם 3.5: 1 3.5: 1 21: 1 7.8: 1 0.8: 1
ברך: דם 6.9: 1 5.6: 1 26: 1 12: 1 1.3: 1

טבלת 1. עצם רקמה: יחסי דם נקבעו ממחקרים ביו-הפצה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אוסף של chelates tridentate צמוד tetrazine של קטבים שונים הוכן, ואת השירות של המתחמים שלהם 99m Tc תגובת IEDDA עם נגזרת TCO in vivo הוערך. שיטת תיוג יעילה לשחזור 99m Tc פותחה במשך חמש tetrazine-chelates, שבו הריכוז ליגנד היה 10 -3 M. שלב התיוג לווה deprotection של T- קבוצות בוטיל (עבור תרכובות 2-5). הריכוז הגבוה של ליגנד שימש כדי לשפר את התשואה radiochemical ולקצר את זמני התגובה אשר ממוזער השפלה של tetrazine 21. המוצר היה מבודד ומופרד ליגנד ללא תווית וכל זיהומים radiochemical ידי HPLC, וכתוצאה מכך התשואות radiochemical החל 31-83%, עם כל> שיש טוהר radiochemical 99% וכן פעילות ספציפית גבוהה של ~ 1.48 MBq / מיקרוגרם. כל התרכובות הוצגו להיות יציב PBS המכיל 0.BSA 5% ו 0.01% Tween80 עד 6 שעות (איור 3).

תרכובות בביספוספונטים, כמו TCO-BP, בתרגום לאזורים של מטבוליזם או פציעת עצם הפעיל, הכוללים מפרקים בברך ובכתף בעכברים. TCO-BP ולכן מספק אמצעי פשוט להעריך את האפקטיביות של tetrazines radiolabeled חדשות לספק איזוטופים in vivo. ההערכה ביו-ההפצה של כל החמישה 99m Tc-tetrazines הראתה לספיגת מפרקים בברך ובכתף 6 הזרקת שעות שלאחר, הוכחה מוצלחת מראש מיקוד עצם in vivo (איור 4). מחקרים קודמים אישר כי radiolabeled TCO-BP מצטבר על העצם 18, ואילו מבנה Tc-99m tetrazine (2) נתון לבד לא (איור 5). זה מאפשר להסיק כי ספיגת עצם נבעה תגובת IEDDA.

קונסטרוקציות lipophilic יותר 1 ו -2 (1); 7.6 ± 2.7 (2)) ואת הכתף (4.6 ± 1.4 (1); 4.8 ± 1.9 (2)). ריכוזים רדיואקטיביות גבוהה נראו גם כיס המרה, הכבד והמעיים, אשר עולה בקנה אחד עם חלוקת 99m lipophilic Tc-tetrazine מתחם 2 בהעדר TCO-BP (איור 5). רקמות היעד הלא אחרים ואיברים כגון שרירי שלד וטחול לא הראו שום גידול משמעותי (<1%) כאשר מחקרים-הפצת ביו בוצעו על 99m Tc-tetrazines בהעדר של TCO-BP (איור 5) , כך האיברים האלה לא נלקחו הניסויים הקדם-מיקוד. בנוסף, ניסויים-הפצה ביו עם 99m Tc-tetrazines לבד חשף אישור טוב מרקמות יעד שאינו ב הזרקת 6 שעות שלאחר. כתוצאה מכך, תינקודת הזמן של שנמצאת בתוך זמן מחצית חיים אחד איזוטופ, נבחרה כנקודת הזמן להשוואת הליגנדים tetrazine radiolabeled השונה.

המתחם קוטבי יותר 99m Tc-tetrazine 3 ועליו מקשר PEG 5 הראה הברך גבוה מאוד ספיגת הכתף (16.2 ± 4.8 ו -20.7 ± 4.9 בהתאמה). היתה גם פעילות נמוכה שנצפתה הכבד והמעיים. נגזר 10 PEG המתאימים גם הראה מחייבים עד העצם הספיג מופחת בכבד לעומת תרכובות 1 ו -2 הנגזר הקוטבי ביותר 5, הראה עצם נמוך יותר מחייב מאשר כל מבנים האחרים אשר צפוי עקב האישור המהיר שלה.

ספיגת העצם הגבוהה ועצמות: יחסי דם (לוח 1) במיוחד עבור תרכובות 3 ו -4 להוכיח כי מראש מיקוד ותגובת IEDDA יכולים לשמש כדי locAlize 99m Tc שכותרתו תרכובות in vivo. השיטות דיווחו כאן יכול לשמש כדי להעריך כל tetrazine רדיואקטיבי כולל הדור הבא של Tc (I) הליגנדים -tetrazine. יצוין כי עבור המעמד של הליגנדים ששימשו במחקר זה, המבנים יכולים להיות מגוונים בקלות באמצעות שינוי אופיו של קבוצות התורם linkers בין מורכבות מתכת ואת tetrazine, בלי משמעותית לשנות את שיטת הסינתזה ליגנד 21. לאחר מולקולה להוביל מזוהית, שיטת ערכה מיידית, שתכלול שיטות טיהור שלב מוצקות להניח, ניתן לפתח כדי לתמוך תרגום קליני.

הקלים TC (I) המתחמים דיווחו כאן ליצור ההזדמנות להכין רדיואקטיביות חדשה 99m Tc באמצעות מערך רחב של מולקולות מיקוד TCO נגזרות שונות כולל נוגדנים. נוגדנים, למרות תכונות המיקוד שלהם מעולה לפני הקמתה של tetrazines שכותרתו טכנציום, לא typicברית לשמש עם 99m Tc בגלל החיסול האיטי שלהם (ימים), וזה הרבה יותר את זמן מחצית החיים של איזוטופ (~ 6 שעות). יישום נוסף של הכימיה דיווחה כאן הוא מאותו הסוג של הליגנדים ניתן להכין עם בטא פולטות רדיונוקלידים 186 Re ו -188 Re. מחדש isostructural (I) אנלוגים של הסוכנים Tc (I) בשילוב עם הגידול המבקשים המאפיינים של TCO-BP יכול לשמש לטיפול גרורות בעצמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Argon gas Alphagaz --- ---
Na2CO3 EMD Millipore 106395 ---
Na2B4O7·10H2O Anachemia S9640 ---
KNaC4H4O6·4H2O Anachemia 217255 ---
Technelite 99mTc generator Lantheus medical imaging --- Source of 99mTcO4-
0.9% Saline Lantheus medical imaging --- To elute generator
1 M HCl Lab Chem --- ---
MeOH Caledon --- ---
ACN Caledon --- HPLC grade
Millipore H2O Thermo Fisher Scientific Barnstead Nanopure ---
DCM Caledon --- ---
TFA Caledon --- ---
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4 1x
BSA Sigma Aldrich A7906 ---
Tween80 Sigma Aldrich P8047 ---
Isoflurane CDMV 108737 Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC Waters 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) ---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 Phenomenex 00G-4435-E0 Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 Waters  186003115 XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor  Biotage  Initiator 8 ---
Biotage V10 Evaporator Biotage  Serial # V1041 ---
Dose calibrator Capintec, Inc.  CRC-25R ---
Gamma counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter ---
Animal room scale  Mettler Toledo XP105 Delta Range ---
Microwave vials  Biotage  355629 0.5-2 mL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jurisson, S. S., Lydon, J. D. Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals. Chem. Rev. 99, (9), 2205-2218 (1999).
  2. Kluba, C. A., Mindt, T. L. Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals. Molecules. 18, 3206-3226 (2013).
  3. Amato, I. Nuclear Medicines Conundrum. Chem. Eng. News. 87, (36), 58-70 (2009).
  4. Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications. J. Nucl. Med. 28, (8), 1294-1302 (1987).
  5. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity. J. Am. Chem. Soc. 130, (41), 13518-13519 (2008).
  6. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging. Bioconjugate Chem. 19, (12), 2297-2299 (2008).
  7. Rossin, R., et al. In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angew. Chem., Int. Ed. 49, (19), 3375-3378 (2010).
  8. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Mol. Pharmaceutics. 12, (10), 3575-3587 (2015).
  9. Rossin, R., et al. Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems. Bioconjugate Chem. 24, (7), 1210-1217 (2013).
  10. Rossin, R., Robillard, M. S. Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice. Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).
  11. Denk, C., et al. Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging. Angew. Chem., Int. Ed. 53, (36), 9655-9659 (2014).
  12. Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation. Chem. Commun. 49, (36), 3805-3807 (2013).
  13. Li, Z., et al. Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes. Chem. Commun. 46, (42), 8043 (2010).
  14. Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. 68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers. Chem. Commun. 50, (40), 5215-5217 (2014).
  15. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. J. Nucl. Med. 54, (8), 1389-1396 (2013).
  16. García, M. F., et al. 99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging. Bioorg. Med. Chem. 24, (6), 1209-1215 (2016).
  17. Russell, R. G. G. Bisphosphonates: The First 40 Years. Bone. 49, (1), 2-19 (2011).
  18. Yazdani, A., et al. A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines. J. Med. Chem. (2016).
  19. Alberto, R., et al. A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand. J. Am. Chem. Soc. 120, (31), 7987-7988 (1998).
  20. Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3. J. Am. Chem. Soc. 123, (13), 3135-3136 (2001).
  21. Lu, G., et al. Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, (5), 1557-1563 (2013).
  22. Maresca, K. P., et al. Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics. Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).
  23. Bartholomä, M. D., et al. Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes. ChemMedChem. 5, (9), 1513-1529 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics