तैयारी और का मूल्यांकन * These authors contributed equally

Chemistry

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Bilton, H. A., Ahmad, Z., Janzen, N., Czorny, S., Valliant, J. F. Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry. J. Vis. Exp. (120), e55188, doi:10.3791/55188 (2017).

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Abstract

Introduction

-99 टीसी प्रमुख नैदानिक परमाणु चिकित्सा में इस्तेमाल रेडियो आइसोटोप, 50 लाख से अधिक इमेजिंग प्रक्रियाओं प्रति वर्ष दुनिया भर में 1, 2, 3 आयोजित साथ रहता है। -99 टीसी एजेंटों चिकित्सकीय इस्तेमाल के बहुमत छिड़काव प्रकार radiopharmaceuticals हैं। सक्रिय रूप से लक्षित यौगिकों जिसमें -99 टीसी एक लक्ष्य-निर्धारण का निर्माण करने के लिए बंधाव के माध्यम से एक विशिष्ट बायोमार्कर के लिए बाध्य करने के लिए निर्देशित किया गया है की एक सीमित संख्या में हैं। लक्षित -99 टीसी radiopharmaceuticals की रचना अक्सर निशाना बना अणु की क्षमता पर 99m टीसी ligand परिसरों के प्रभाव से रुकावट है ब्याज की बायोमार्कर के लिए बाध्य करने के लिए, या आइसोटोप आधा जीवन लंबे समय पर्याप्त नहीं उच्च आणविक भार जैविक अणुओं के उपयोग के लिए है ऐसे एंटीबॉडी के रूप में। उत्तरार्द्ध आम तौर पर कई दिनों की आवश्यकता से पहले छवियों बायोमोलिक्यूल के लिए आदेश में अर्जित कर रहे हैं Tiss गैर लक्ष्य से साफ करने के लिए ues। प्री-लक्ष्यीकरण एक वैकल्पिक दृष्टिकोण इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए प्रदान करता है।

पूर्व निशाना बना bioorthogonal रसायन विज्ञान के साथ संयुक्त दोनों प्रतिदीप्ति और रेडियो इमेजिंग 4, 5, 6, 7, 8 के लिए नए आणविक इमेजिंग जांच विकसित करने के लिए एक प्रभावी तरीका होना दिखाया गया है। 1,2,4,5-tetrazine (Tz) और ट्रांस -cyclooctene (TCO) डेरिवेटिव के बीच उलटा इलेक्ट्रॉन मांग Diels-Alder (IEDDA) प्रतिक्रिया, के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है, विशेष रूप से प्रभावी 6 होना दिखाया गया है। इन घटकों के साथ IEDDA प्रतिक्रिया पीबीएस में तेजी से कैनेटीक्स प्रदर्शन कर सकते हैं (कश्मीर 2 ≈ 6000 एम -1 एस -1) और उच्च चयनात्मकता, यह इन विवो पूर्व लक्षित कर आवेदन पत्र 9, 10 के लिए आदर्श बना रही है।

e_content "> सबसे आम इस्तेमाल किया दृष्टिकोण एक टीसीओ व्युत्पन्न को लक्षित वेक्टर प्रशासन और एक पर्याप्त देरी अवधि के बाद शामिल है, एक radiolabeled tetrazine 11 सी, 18 एफ, 64 घन, 89 Zr, और 111 में पर किया गया है आधारित प्रशासित किया जाता है। radiolabeled tetrazines 11 की रिपोर्ट, 12, 13, 14, 15। इसके विपरीत, वहाँ एक 99m टीसी लेबल TZ, जो प्रोटीन बाध्यकारी और vivo में गिरावट को रोकने के सह-ligands के उपयोग की आवश्यकता होती है एक HYNIC प्रकार ligand का उपयोग कर तैयार किया गया था का केवल एक रिपोर्ट है 16। एक विकल्प के रूप में, हम यहाँ 99m टीसी (आई) के संश्लेषण की रिपोर्ट ligands जो एक साथ स्थिर tridentate परिसरों फार्म के एक परिवार का उपयोग लेबल tetrazines [99m टीसी (सीओ) 3] कोर।


चित्रा 1: tetrazine और ट्रांस -cyclooctene के बीच bioorthogonal IEDDA प्रतिक्रिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तैयार ligands के परिवार tridentate chelates कि polarity और धातु क्षेत्र बाध्यकारी और चतुर्थ (चित्रा 2) के बीच लिंकर समूह की प्रकृति में भिन्न होते हैं। लक्ष्य के लिए एक 99m टीसी Tetrazine निर्माण कि प्रभावी ढंग से स्थानीय बनाना और इन विवो में टीसीओ लेबल साइटों और तेजी से स्पष्ट है जब बाध्य नहीं के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है की पहचान करने के क्रम में उच्च लक्ष्य करने वाली गैर लक्ष्य अनुपात की उपज में था। Ligands का परीक्षण करने के लिए, एक बिसफ़ॉस्फ़ोनेट की एक टीसीओ-व्युत्पन्न (टीसीओ-बीपी) 17 इस्तेमाल किया गया था। हम पहले से पता चला है कि टीसीओ-बीपी सक्रिय हड्डी चयापचय के क्षेत्रों के लिए localizes और साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैंविवो 18 में radiolabeled tetrazines। यह नया tetrazines परीक्षण करने के लिए एक सुविधाजनक अभिकर्मक है क्योंकि यह एक ही चरण में तैयार किया जा सकता है और प्रयोगों सामान्य चूहों जहां स्थानीयकरण मुख्य रूप से जोड़ों (घुटनों और कंधों) में होता है में प्रदर्शन किया जा सकता है।

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Protocol

जानवरों के अध्ययन पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद (CCAC) के दिशा निर्देशों के अनुसार मैकमास्टर विश्वविद्यालय में पशु अनुसंधान आचार बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. 99m टीसी के साथ TZ-tridentate ligands के radiolabeling

चेतावनी: निम्न कार्यविधियों रेडियोधर्मी यौगिकों के उपयोग की आवश्यकता है। काम केवल सुरक्षा और निपटान के नियमों के पालन के साथ एक लाइसेंस प्राप्त प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए। माइक्रोवेव प्रतिक्रियाओं एक माइक्रोवेव विशेष रासायनिक संश्लेषण के लिए डिजाइन में किया जाना चाहिए।

  1. के संश्लेषण [99m टीसी (सीओ) 3 (एच 2 ओ) 3] 19, 20
    1. एक माइक्रोवेव शीशी में, गठबंधन 8 मिलीग्राम कश्मीर 2 [बिहार 3 सीओ 2], 15 मिलीग्राम ना 2 3 सीओ, 20 मिलीग्राम ना 2 बी 4 हे 7 · 10H 2 हे, और 25 मिलीग्राम KOCO [CH (ओएच)]2 COONa · 4H 2 ओ शुद्ध आर्गन गैस के साथ 10 मिनट के लिए शीशी।
    2. शीशी के लिए 0.9% खारा में (~ 1100 MBq, ~ 30 एमसीआई) - 99m की 4 एमएल टीसीओ 4 जोड़ें।
    3. सरगर्मी से 10 S के बाद 110 डिग्री सेल्सियस पर 3.5 मिनट के लिए माइक्रोवेव में प्रतिक्रिया गर्मी अभिकर्मकों की पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए।
    4. का उपयोग कर ~ 1 एम एचसीएल के 400 μL 3.5-4 करने के लिए समाधान के पीएच को समायोजित करें। पीएच कागज का उपयोग कर पुष्टि करें।
  2. Tetrazine के radiolabeling ligands 1-5
    1. 250 μL MeOH 21 में प्रत्येक ligand के 2 मिलीग्राम (यौगिकों 1-5) भंग।
    2. के 250 μL जोड़ें [99m टीसी (सीओ) 3 (एच 2 ओ) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 एमसीआई) प्रत्येक समाधान करने के लिए।
    3. 60 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक माइक्रोवेव का उपयोग कर प्रतिक्रिया मिश्रण गर्मी।
      नोट: यह कदम सभी 5 tetrazines के लिए समान था।
    4. यौगिकों 2- 5 के लिए, लुप्त हो विलायक और फिर से dissol1 वी / वी डीसीएम: टीएफए 1 के 1 एमएल में जिसके परिणामस्वरूप उत्पादों ve।
    5. 6 मिनट (2-4) या 10 मिनट (5) के लिए एक माइक्रोवेव में 60 डिग्री सेल्सियस पर भंग प्रतिक्रिया उत्पादों (2-5) गर्मी।
    6. कमरे के तापमान को ठंडा करने के बाद, विलायक एक बाष्पीकरण का उपयोग (36 डिग्री सेल्सियस, 8 मिलीबार, 3 मिनट, 6000 आरपीएम) लुप्त हो जाना और 1 में सूखे यौगिक भंग: 1 एसीएन: एच 2 ओ या 1: 1 MeOH: एच 2 हे, एचपीएलसी शुद्धि के लिए पहले।
    7. -99 टीसी लेबल यौगिकों (1-5), लेबल हटाया गया tetrazine ligand से लेबल उत्पाद को अलग करने, एचपीएलसी (सी 18 उलट चरण) का उपयोग भी शामिल है शुद्ध। (दोनों 0.1% टीएफए) के साथ 40:60 एसीएन के लिए एच 2 ओ: एच 2 ओ 20 मिनट (18 मिनट) और एक सी 18 विश्लेषणात्मक 4.6 x 100 मिमी स्तंभ पर आमतौर पर, 30:70 एसीएन के एक क्षालन ढाल का उपयोग करें। दोनों यूवी (254 एनएम) और गामा का पता लगाने का प्रयोग करें।
      1. प्रत्येक लेबल उत्पाद का एक छोटा सा नमूना ले लो और एक सह Inj की है कि अपने एचपीएलसी अवधारण समय की तुलनाected, गैर रेडियोधर्मी, पुनः लेबल मानक (20% में 0.125 मिलीग्राम मेथनॉल-एच 2 ओ)। पुन लेबल मानक यूवी एचपीएलसी का पता लगाने में पहचान की है, और γ-एचपीएलसी का पता लगाने में 99m टीसी लेबल यौगिक के रूप में एक ही समय में elute जाएगा। यह सह इंजेक्शन, तुलनीय प्रतिधारण समय पर चोटियों से पता चलता -99 टीसी लेबल परिसर की पहचान की पुष्टि।
    8. एक बाष्पीकरण (36 डिग्री सेल्सियस, 8 मिलीबार, 3 मिनट, 6000 आरपीएम) का उपयोग एचपीएलसी अंशों से विलायक लुप्त हो जाना।
    9. 7.4 kBq / पीबीएस में μL की एकाग्रता में शुद्ध यौगिक तैयार, 0.5% BSA और 0.01% बीच 80 से युक्त।
    10. लेबल यौगिकों स्थिर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए इन विट्रो स्थिरता अध्ययन करते हैं। 1, 4 और 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तैयार यौगिक सेते हैं, हर समय बिंदु पर एचपीएलसी पर मिश्रण की एक छोटी राशि (3.7 MBq) इंजेक्शन लगाने स्थिरता का आकलन करने के लिए।

2. पूर्व लक्षित जैव वितरण अध्ययन

    जानवरों की तैयारी
    1. 7-9 सप्ताह पुरानी, ​​महिला Balb / सी का प्रयोग चूहों (एन = 3), प्रशासन टीसीओ-बीपी खारा (20 मिलीग्राम / किग्रा) (5 माइक्रोग्राम / μL) में तैयार, पूंछ-नस में इंजेक्शन के माध्यम से।
    2. शारीरिक संयम डिवाइस में माउस जगह है, और पूंछ के पार्श्व सतहों पर स्थित नसों की पहचान करने और एक शराब झाड़ू के साथ पोंछे। पूंछ के अंत से लगभग 2 सेमी में, एक उथले कोण, नस के समानांतर में एक 30 गेज सुई डालें। धीरे सवार, इंजेक्षन सुई को हटाने और खून बह रहा बंद हो जाता है जब तक थोड़ा दबाव के साथ इंजेक्शन स्थल पर साफ धुंध स्पंज लागू करने के लिए दबाना।
    3. टीसीओ-बीपी के 1 घंटे के बाद इंजेक्शन पर, प्रशासन ~ 0.74 99m टीसी tetrazine की MBq (20 μCi) 0.5% बीएसए के 100 μL में तैयार की, 0.01% बीच 80 पीबीएस में, पूंछ-नस में इंजेक्शन के माध्यम से।
  1. जैव वितरण के अध्ययन
    1. वांछित समय बिंदु (टी = 6 ज) में 3% isoflurane और 2% ऑक्सीजन गैस के मिश्रण का प्रयोग चूहों बेहोश करना। करने के लिए एक प्रदर्शन करेंanesthetized माउस पर ई चुटकी वापसी सुनिश्चित करने के लिए वे संज्ञाहरण की शल्य चिकित्सा विमान के तहत कर रहे हैं।
    2. कार्डियक पंचर एक सिरिंज हेपरिन के साथ पूर्व इलाज का उपयोग कर के माध्यम से रक्त (1 एमएल) ले लीजिए। जारी रखा संज्ञाहरण के लिए नाक शंकु में नाक के साथ अपनी पीठ पर जगह माउस और जानवर पर जिफाएडा प्रक्रिया का पता लगाने।
      1. एक 25 जी सुई एक 20 डिग्री के कोण पर, थोड़ा जिफाएडा प्रक्रिया के तहत पशु के midline के बाईं ओर, डालें। पूरी तरह से सुई डालने, और धीरे धीरे सुई हब में खून देखने के लिए अगर दिल की हवा निकाल दी गई थी सवार पर वापस खींच। यदि आवश्यक हो तो सवार धारण करते हुए, हृदय पंचर करने के लिए थोड़ा सुई बदल डालना। धीरे धीरे सिरिंज में रक्त आकर्षित।
    3. , गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से पशु euthanize जबकि संज्ञाहरण के तहत।
    4. एक प्लास्टिक की थैली में प्रत्येक पशु प्लेस और पूरे शरीर गतिविधि के स्तर को मापने के लिए एक खुराक अंशशोधक (99m टीसी सेटिंग) का उपयोग करें।
    5. निम्नलिखित ऊतकों और तरल पदार्थ में लीजिए पूर्व तौलनारक्त, हड्डी (घुटने और कंधे), पित्ताशय, गुर्दे, जिगर, पेट (सामग्री के साथ), (सामग्री) के साथ छोटी आंतों, बड़ी आंत और काएकुम (सामग्री के साथ), थायराइड और श्वासनली, मूत्र के साथ मूत्राशय: एड नलियों की गिनती और पूंछ।
    6. पीबीएस में उचित ऊतकों (रक्त, पित्ताशय, और मूत्राशय को छोड़कर) कुल्ला रक्त को दूर करने और उचित गिनती ट्यूबों में ऊतकों रखने से पहले सूखी दाग ​​है।
    7. एक प्लास्टिक की थैली में पशु शव प्लेस और एक खुराक का उपयोग कर अंशशोधक अवशिष्ट पूरे शरीर गतिविधि को मापने।
    8. एक ऊतक का नमूना युक्त प्रत्येक ट्यूब वजन। ट्यूब के घटाना प्रारंभिक वजन ऊतक की बड़े पैमाने पर प्राप्त करने के लिए।
    9. प्रत्येक माउस के लिए इंजेक्शन के समय में एक परीक्षण के नमूने (100 μL) में गतिविधि की मात्रा को मापने के लिए एक खुराक अंशशोधक (99m टीसी सेटिंग) का प्रयोग करें।
      नोट: इस परीक्षा में नमूना इंजेक्शन की मात्रा के बराबर होता है, इस प्रकार के इंजेक्शन के समय में गतिविधि गिनती दे रही है।
    10. ऊतक माप, एक के समयliquot 5 परीक्षण नमूना पहले से इस्तेमाल की μL। एक बहु-डिटेक्टर गामा काउंटर (99m टीसी सेटिंग) का प्रयोग करें और 5 μL परीक्षण के नमूने के लिए प्रति मिनट (सीपीएम) गिनती प्राप्त करने के लिए गिनती।
    11. गतिविधि और सीपीएम संबंध समीकरण 1 का उपयोग कर एक रूपांतरण कारक (सीपीएम μCi -1) प्राप्त करने के लिए गणना करने के लिए 2.2.9 और 2.2.10 में प्राप्त दो मूल्यों का प्रयोग करें।
      (1) 1 समीकरण
    12. गामा काउंटर का प्रयोग करें प्रत्येक ऊतक या तरल पदार्थ के नमूने में रेडियोधर्मिता की मात्रा को मापने के लिए।
    13. 1 समीकरण का प्रयोग कुल इंजेक्शन की खुराक के लिए माप रिश्तेदार के समय में प्रत्येक ऊतक या तरल पदार्थ में गतिविधि की राशि की गणना करने के लिए। यह मान तो अंग वजन द्वारा सामान्यीकृत और ऊतकों के ग्राम प्रति प्रतिशत इंजेक्शन की खुराक (यानी,% आईडी / छ) के रूप में सूचना दी है।
    14. Absen में 99m टीसी लेबल tetrazine ligands का उपयोग कर एक नकारात्मक नियंत्रण के प्रयोग का संचालन करने के लिए 2.2.13 2.1.2 चरणों का पालन करेंटीसीओ-बीपी के सीई। बलिदान चूहों (एन = 3) 0.5, 1, 4 और 6 घंटे के बाद इंजेक्शन पर और ऊतक या जैसा कि ऊपर वर्णित तरल पदार्थ प्राप्त करते हैं।

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Representative Results

Ligands एक सरल reductive amination रणनीति (चित्रा 2), एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध tetrazine 22, 23 के लिए उत्पाद के युग्मन के द्वारा पीछा के माध्यम से विभिन्न linkers और chelators का उपयोग कर संश्लेषित कर रहे थे। Radiolabeling सभी यौगिकों के लिए एक ही विधि का उपयोग किया जाता है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था। 83% (1), 45% (2), 31%: प्रक्रिया -99 टीसी radiolabeled यौगिकों 1-5 उच्च radiochemical उपज के लिए उदार में प्राप्त किया गया जिस ligand, प्रतिक्रिया समय और तापमान की राशि पीएच बदलती द्वारा अनुकूलित किया गया था (3), 42% (4), और 54% (5)। unreacted ligand और वाष्पीकरण से एचपीएलसी शुद्धि एक बाष्पीकरण का उपयोग कर के बाद, यौगिकों पीबीएस 0.5% BSA और 0.01% Tween80 युक्त इंजेक्शन से पहले में तैयार किए गए थे। पी के विशिष्ट गतिविधि urified -99 टीसी लेबल tetrazine ~ 1.48 MBq / माइक्रोग्राम था। अध्ययन में vivo अध्ययन करने से पहले 99m टीसी लेबल tetrazine ligands की स्थिरता का आकलन करने के लिए आयोजित की गई। स्थिरता, 6 एच (आर टी = 14 मिनट) पर नहीं दिखाई गिरावट के साथ 1, 4 और 6 घंटे में एचपीएलसी द्वारा नजर रखी थी के रूप में एक उदाहरण के रूप में यौगिक 4 के लिए 3 चित्र में देखा।

चित्र 2
चित्रा 2: यौगिकों 1-5 से पता चला (नीचे) के रूप में विभिन्न linkers (वाई) और chelators (एक्स) का उपयोग कर उत्पादन किया गया था। सभी यौगिकों, [99m टीसी (सीओ) 3 (एच 2 ओ) 3] (ऊपर) एक ही प्रतिक्रिया शर्तों का उपयोग के साथ + radiolabeled थे 1 के अपवाद है, जो कदम (द्वितीय) की आवश्यकता नहीं है।

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चित्रा 3: परिसर का उपयोग 4. 4 की γ-एचपीएलसी निशान 1, 4 और 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में incubated स्थिरता परीक्षण का परिणाम है।

इन विवो परीक्षण के लिए, स्वस्थ Balb / ग चूहों का इस्तेमाल किया गया था। संक्षेप में, प्रत्येक परिसर के लिए, चूहों के समूह (एन = 3) टीसीओ-बीपी (100 μL, 20 मिलीग्राम / किग्रा), जो 1 घंटे बाद 99m टीसी लेबल यौगिकों के प्रशासन द्वारा पीछा किया गया था के साथ इंजेक्शन थे। -99 टीसी परिसरों के 6 घंटे के बाद इंजेक्शन में, जानवरों बलिदान किया गया और विभिन्न ऊतकों और तरल पदार्थ में गतिविधि सांद्रता निर्धारित की। परिणामी डेटा ग्राम ऊतक (% आईडी / छ) प्रति प्रतिशत इंजेक्शन खुराक के रूप में सूचना दी है और 4 चित्र में दिखाया गया है। हड्डी पांच 99m टीसी लेबल Tz यौगिकों से प्रत्येक के लिए रक्त के लिए (घुटने या कंधे) के प्रतिनिधि के अनुपात में 1 टेबल पर दिखाए जाते हैं। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है सीएलप्रारंभिक कि यौगिक 3 निकासी के बंद लक्ष्य ऊतक स्थानीयकरण के संबंध में 99m टीसी लेबल यौगिकों के बीच पर्याप्त अंतर था खून से, और उस के साथ संयुक्त लक्षित इष्टतम प्रदान की है। एक नकारात्मक नियंत्रण CD1 चूहों का उपयोग अध्ययन (एन = 3), आयोजित किया गया जहां चूहों टीसीओ-बीपी के अभाव में 99m टीसी tetrazine ligands के साथ इंजेक्शन थे। चूहे 0.5, 1, 4 और 6 घंटे और% आईडी पर बलिदान किया गया / g सभी ऊतकों और तरल पदार्थ के लिए निर्धारित किया गया था। परीक्षण सभी यौगिकों, जहां परिसर 2 के लिए डेटा चित्रा 5 में प्रस्तुत किया जाता है के लिए, कोई महत्वपूर्ण तेज हड्डी या अन्य ऊतकों (हृदय, फेफड़े, तिल्ली, कंकाल की मांसपेशी) चित्रा 4 में नहीं दिखाया गया में देखा गया था।

चित्रा 4
चित्रा 4 99m टीसी लेबल tetrazine डेरिवेटिव 1-5 के लिए बायो-वितरण परिणाम (बार इंडिकाटेड)। दिखाए चयन किया ऊतकों से प्राप्त किया गया डाटा और तरल पदार्थ radiolabeled डेरिवेटिव के 6 घंटे के बाद इंजेक्शन लिया, और मतलब प्रतिशत इंजेक्शन के रूप में ऊतक या तरल पदार्थ (% आईडी / छ) के ग्राम प्रति खुराक SEM ± गतिविधि, ऊतक या तरल पदार्थ वजन करने के लिए सामान्यीकृत था। अस्थि लक्ष्यों • के संकेत हैं। नोट: दिखाया गया था मतलब% आईडी / g था कि कम से कम 1% नहीं सभी शेष ऊतकों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. टीसीओ-बीपी की पूर्व इंजेक्शन के बिना -99 टीसी लेबल tetrazine (2) का उपयोग नियंत्रण के अध्ययन के लिए बायो-वितरण का परिणाम है। 2 से 6 घंटे के बाद इंजेक्शन दिखाया गया डेटा का चयन किया ऊतकों और 0.5, 1, 4 में 3 चूहों से लिया तरल पदार्थ से प्राप्त किया गया है, और। गतिविधि ऊतक के लिए सामान्यीकृत किया गया था यातरल पदार्थ वजन, ऊतक या तरल पदार्थ (% आईडी / छ) SEM ± के प्रति ग्राम मतलब प्रतिशत इंजेक्शन खुराक के रूप में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यौगिक
अनुपात 1 2 3 4 5
कंधे: रक्त 3.5: 1 3.5: 1 21: 1 7.8: 1 0.8: 1
घुटने: रक्त 6.9: 1 5.6: 1 26: 1 12: 1 1.3: 1

तालिका 1 अस्थि ऊतक: रक्त जैव वितरण के अध्ययन से निर्धारित अनुपात।

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Discussion

अलग-अलग छोर के tetrazine से जुड़े tridentate chelates का एक संग्रह तैयार किया गया था, और इन विवो में एक टीसीओ व्युत्पन्न के साथ IEDDA प्रतिक्रिया में उनकी -99 टीसी परिसरों की उपयोगिता का आकलन किया गया था। एक प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य -99 टीसी लेबलिंग विधि पांच tetrazine-chelates, जहां ligand एकाग्रता था 10 -3 एम लेबलिंग कदम टी ब्यूटाइल समूह (यौगिकों 2-5 के लिए) की deprotection द्वारा पीछा किया गया था के लिए विकसित किया गया था। Ligand के उच्च एकाग्रता radiochemical उपज में सुधार और प्रतिक्रिया समय जो tetrazine 21 के क्षरण को कम से कम कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। उत्पाद पृथक और लेबल हटाया गया ligand और एचपीएलसी द्वारा किसी भी radiochemical दोष, radiochemical 31-83% से लेकर पैदावार में जिसके परिणामस्वरूप से अलग हो, सब होने के> 99% radiochemical पवित्रता और ~ की 1.48 MBq / माइक्रोग्राम प्रति एक उच्च विशिष्ट गतिविधि के साथ किया गया था। सभी यौगिकों पीबीएस युक्त 0 में स्थिर होना दिखाया गया था।5% BSA और अप करने के लिए 6 घंटे (चित्रा 3) के लिए 0.01% Tween80।

Bisphosphonate यौगिकों, टीसीओ-बीपी जैसी सक्रिय हड्डी चयापचय या चोट के क्षेत्रों, जो चूहों में घुटने और कंधे जोड़ों में शामिल करने के लिए स्थानीय बनाना। टीसीओ-बीपी इसलिए विवो में आइसोटोप देने के लिए नई radiolabeled tetrazines के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक सरल साधन प्रदान करता है। सभी पांच 99m टीसी tetrazines की जैव-वितरण का मूल्यांकन (चित्रा 4) 6 घंटे के बाद इंजेक्शन घुटने और कंधे के जोड़ों में तेज दिखाया, सफल विवो में हड्डी के लिए पूर्व को निशाना बनाने का प्रदर्शन है। पिछले अध्ययनों की पुष्टि की है कि radiolabeled टीसीओ-बीपी हड्डी 18 पर जम जाता है, जबकि -99 टीसी tetrazine निर्माण (2) अकेले दिया (चित्रा 5) नहीं करता है। यह एक निष्कर्ष है कि हड्डी तेज IEDDA प्रतिक्रिया के कारण था की अनुमति देता है।

अधिक lipophilic निर्माणों 1 और 2 (1); 7.6 ± 2.7 (2)) और कंधे (4.6 ± 1.4 (1); 4.8 ± 1.9 (2))। उच्च रेडियोधर्मिता सांद्रता भी पित्ताशय, यकृत और आंतों, जो टीसीओ-बीपी (चित्रा 5) के अभाव में lipophilic -99 टीसी tetrazine यौगिक 2 के वितरण के साथ संगत है में देखा गया था। अन्य गैर लक्ष्य ऊतकों और अंगों ऐसे कंकाल की मांसपेशी और तिल्ली के रूप में किसी भी महत्वपूर्ण तेज नहीं दिखा था (<1%) (चित्रा 5) जब जैव वितरण के अध्ययन टीसीओ-बीपी के अभाव में 99m टीसी tetrazines पर प्रदर्शन किया गया , ताकि इन अंगों को निशाना पूर्व प्रयोगों के लिए नहीं ले जाया गया। इसके अतिरिक्त, अकेले -99 टीसी tetrazines के साथ जैव वितरण प्रयोगों 6 घंटे के बाद इंजेक्शन पर गैर लक्ष्य ऊतकों से अच्छा क्लीयरेंस का पता चला। नतीजतन, थीएस समय बिंदु है, जो आइसोटोप से एक आधा जीवन के भीतर है, अलग अलग radiolabeled tetrazine ligands की तुलना के लिए समय बिंदु के रूप में चयनित किया गया था।

अधिक ध्रुवीय -99 टीसी tetrazine यौगिक 3 असर एक खूंटी 5 लिंकर बहुत उच्च घुटने और कंधे तेज (16.2 ± 4.8 और 20.7 ± 4.9 क्रमशः) से पता चला है। वहाँ भी कम गतिविधि जिगर और आंतों में मनाया गया। इसी खूंटी 10 व्युत्पन्न भी हड्डी और लीवर में कम तेज यौगिकों 1 और 2 के सबसे ध्रुवीय व्युत्पन्न 5 की तुलना करने के लिए बाध्य नहीं दिखाया है, अपनी तेजी से क्लीयरेंस के कारण कम हड्डी अन्य सभी निर्माणों जो की संभावना है से बाध्यकारी दिखाया।

उच्च हड्डी तेज और हड्डी: रक्त अनुपात (तालिका 1) विशेष रूप से यौगिकों 3 और 4 दिखाना है कि पूर्व लक्ष्यीकरण और IEDDA प्रतिक्रिया नियंत्रण रेखा के लिए इस्तेमाल किया जा सकताविवो में alize -99 टीसी लेबल यौगिकों। तरीकों यहां बताया टीसी (आई) -tetrazine ligands की अगली पीढ़ी सहित किसी भी radiolabeled tetrazine मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ligands कि इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया के वर्ग के लिए, संरचनाओं आसानी से धातु जटिल और tetrazine के बीच दाता समूहों और linkers की प्रकृति बदल रहा है, काफी ligand संश्लेषण विधि 21 फेरबदल के बिना द्वारा अलग किया जा सकता है। एक बार एक का नेतृत्व अणु की पहचान की है, एक पल किट विधि है, जो की संभावना ठोस चरण शुद्धि के तरीकों में शामिल होंगे, नैदानिक ​​अनुवाद का समर्थन करने के लिए विकसित किया जा सकता है।

यहाँ की सूचना दी टीसी (आई) परिसरों एंटीबॉडी सहित विभिन्न टीसीओ व्युत्पन्न को निशाना बनाने के अणुओं की एक विस्तृत सरणी का उपयोग कर नए -99 टीसी radiopharmaceuticals तैयार करने का अवसर पैदा करते हैं। एंटीबॉडी, उनके उत्कृष्ट लक्ष्यीकरण, टेक्नीशियम लेबल tetrazines बनाने के पहले होता िटिपक नहीं गुण के बावजूदसहयोगी अपनी धीमी निकासी (दिन) है, जो बहुत लंबे समय तक आइसोटोप के आधे जीवन (~ 6 घंटे) की तुलना में है क्योंकि -99 टीसी के साथ प्रयोग किया जा सकता है। रसायन विज्ञान यहां बताया कि आवेदन का एक अतिरिक्त ligands के एक ही कक्षा बीटा radionuclides 186 और 188 पुन पुन उत्सर्जन के साथ तैयार किया जा सकता है। टीसी (आई) के एजेंटों जब ट्यूमर टीसीओ-बीपी के गुणों की मांग के साथ संयुक्त isostructural रे (आई) के अनुरूप हड्डी मेटास्टेसिस के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Argon gas Alphagaz --- ---
Na2CO3 EMD Millipore 106395 ---
Na2B4O7·10H2O Anachemia S9640 ---
KNaC4H4O6·4H2O Anachemia 217255 ---
Technelite 99mTc generator Lantheus medical imaging --- Source of 99mTcO4-
0.9% Saline Lantheus medical imaging --- To elute generator
1 M HCl Lab Chem --- ---
MeOH Caledon --- ---
ACN Caledon --- HPLC grade
Millipore H2O Thermo Fisher Scientific Barnstead Nanopure ---
DCM Caledon --- ---
TFA Caledon --- ---
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4 1x
BSA Sigma Aldrich A7906 ---
Tween80 Sigma Aldrich P8047 ---
Isoflurane CDMV 108737 Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC Waters 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) ---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 Phenomenex 00G-4435-E0 Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 Waters  186003115 XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor  Biotage  Initiator 8 ---
Biotage V10 Evaporator Biotage  Serial # V1041 ---
Dose calibrator Capintec, Inc.  CRC-25R ---
Gamma counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter ---
Animal room scale  Mettler Toledo XP105 Delta Range ---
Microwave vials  Biotage  355629 0.5-2 mL 

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References

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