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Chemistry

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Bilton, H. A., Ahmad, Z., Janzen, N., Czorny, S., Valliant, J. F. Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry. J. Vis. Exp. (120), e55188, doi:10.3791/55188 (2017).

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Abstract

Introduction

99m Tc bleibt die dominierende Radioisotop in der diagnostischen Nuklearmedizin verwendet wird , mit mehr als 50 Millionen Bildgebungsverfahren pro Jahr weltweit durchgeführt 1, 2, 3. Die Mehrheit der 99m Tc Mittel werden klinisch Perfusion Radiopharmaka. Es gibt eine begrenzte Anzahl von aktiv gezielte Verbindungen , in denen 99m Tc gerichtet ist eine spezifische Biomarker durch Ligation an ein Targeting - Konstrukt zu binden. Die Erzeugung gezielter 99m Tc - Radiopharmaka wird häufig durch den Einfluß von 99m Tc-Ligand - Komplexe auf die Fähigkeit des dirigierenden Moleküls zu binden , um die Biomarker von Interesse gehinderte oder die Isotopen - Halbwertszeit nicht lang genug ist für die Verwendung mit höherem Molekulargewicht Biomoleküle wie Antikörper. Letzteres erfordert üblicherweise mehrere Tage vor Bildern, um für das Biomolekül erworben werden von Nicht-Ziel zu löschen tiss ues. Pre-Targeting bietet einen alternativen Ansatz, diese Herausforderungen zu überwinden.

Pre-Targeting mit bioorthogonale Chemie kombiniert wurde ein effektiver Weg gezeigt werden , für die Entwicklung neuer molekularer Bildgebungssonden sowohl für Fluoreszenz und Radio-Imaging - 4, 5, 6, 7, 8. Die inversem Elektronenbedarf Diels-Alder (IEDDA) Reaktion zwischen 1,2,4,5-Tetrazin (Tz) und trans -Cycloocten (TCO) -Derivate, wie in Figur 1 gezeigt ist , hat sich als besonders wirksam 6 erwiesen. Die IEDDA Reaktion mit diesen Komponenten können schnell Kinetik in PBS (k 2 ≈ 6000 M -1 s -1) und eine hohe Selektivität aufweisen, wodurch es ideal für in - vivo - Pre-Targeting - Anwendungen macht 9, 10.

e_content "> Die am häufigsten verwendete Ansatz umfasst ein TCO-derived Targeting - Vektor Verwaltung und eine ausreichende Verzögerung Folgezeit ein radioaktiv markiertes Tetrazin verabreicht. Radiolabeled Tetrazinen basierend auf 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr und 111 In gewesen 11 berichtete, 12, 13, 14, 15. im Gegensatz dazu gibt es nur einen Bericht eines 99m ist Tz-Tc markiert, die eine HYNIC - Typ - Liganden wurde unter Verwendung von der Verwendung von Co-Liganden erfordern Protein zu verhindern Bindung und den Abbau in vivo 16. Alternativ berichten wir hier die Synthese von 99m Tc (I) markiertem Tetrazinen eine Familie von Liganden , die mit einem [99m Tc (CO) 3] + Kern stabil dreizähnige Komplexe bilden.


Abbildung 1: Die bioorthogonale IEDDA Reaktion zwischen Tetrazin und trans -Cycloocten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Familie von Liganden hergestellt enthalten dreizähnigen Chelate , die in der Polarität und der Natur der Linkergruppe zwischen der Metallbindungsbereich und dem Tz (Abbildung 2) variieren. Das Ziel war es, ein 99m zu identifizieren Tc-Tetrazin , dass effektiv lokalisieren und reagieren mit TCO-markierten Stellen in vivo konstruieren konnte und schnell klar , wenn sie nicht gebunden, um eine hohe Ziel-zu-Nichtziel - Verhältnisse zu erhalten. Um die Liganden zu testen, ein TCO-Derivat einer Bisphosphonat (TCO-BP) wurde 17 verwendet. Wir haben bereits gezeigt, dass TCO-BP zu den Bereichen der aktiven Knochenmetabolismus lokalisiert und reagieren mitradiomarkierten Tetrazinen in vivo 18. Es ist eine bequeme Reagenz neue Tetrazinen zu testen, da es in einem einzigen Schritt hergestellt werden können, und Experimente können in normalen Mäusen durchgeführt werden, in denen die Lokalisierung in erster Linie in den Gelenken (Knie und Schultern) auftritt.

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Protocol

In Tierstudien wurden von der Tierforschung Ethikrat an der McMaster University in Übereinstimmung mit Canadian Council on Animal Care (CCAC) Richtlinien zugelassen.

1. Die radioaktive Markierung von Tz-dreizähnigen Liganden mit 99m Tc

ACHTUNG: Die folgenden Verfahren erfordern die Verwendung von radioaktiven Verbindungen. Die Arbeiten sollten nur in einem zugelassenen Labor mit der Einhaltung von Sicherheits- und Entsorgungsvorschriften erfolgen. Mikrowellen-Reaktionen sollten in einer Mikrowelle durchgeführt werden, die speziell für die chemische Synthese konstruiert.

  1. Synthese von [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20
    1. In einem Mikrowellenfläschchen kombinieren 8 mg K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg Na 2 CO 3, 20 mg Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O und 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O Purge das Fläschchen für 10 Minuten mit Argongas.
    2. 4 ml 99m TcO 4 - (~ 1,100 MBq, ~ 30 mCi) in 0,9% Kochsalzlösung in das Fläschchen.
    3. Die Reaktion wird in einer Mikrowelle für 3,5 min bei 110 ° C nach 10 s Rühren eine gute Durchmischung der Reagenzien zu gewährleisten.
    4. Der pH-Wert der Lösung auf 3,5-4 mittels ~ 400 & mgr; l von 1 M HCl. Stellen Sie sicher, pH-Papier verwenden.
  2. Die radioaktive Markierung von Tetrazin - Liganden 1-5
    1. Man löst 2 mg jedes Liganden (Verbindungen 1-5) in 250 & mgr; l MeOH 21.
    2. Nach Eintragen von 250 & mgr; l [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) zu jeder Lösung.
    3. Das Reaktionsgemisch wird eine Mikrowelle für 20 min bei 60 ° C verwendet wird.
      Hinweis: dieser Schritt für alle 5 Tetrazinen identisch war.
    4. Für Verbindungen 2- 5, verdampfe das Lösungsmittel und Wieder DISSOLve die resultierenden Produkte in 1 ml 1: 1 v / v DCM: TFA.
    5. Wärme , die gelösten Reaktionsprodukte (2-5) bei 60 ° C in einer Mikrowelle für 6 min (2-4) oder 10 min (5).
    6. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur, dampfe das Lösungsmittel unter Verwendung eines Verdampfers (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) und lösen die getrocknete Verbindung in 1: 1 ACN: H 2 O oder 1: 1 MeOH: H 2 O, vor der HPLC-Reinigung.
    7. Reinige den 99m Tc-markierten Verbindungen (1-5), einschließlich des markierten Produkts von unmarkiertem Liganden Tetrazin Trennung unter Verwendung von HPLC (C18 Umkehrphase). Typischerweise verwenden eines Elutionsgradienten von 30:70 ACN: H 2 O (beide mit 0,1% TFA) bis 40:60 ACN: H 2 O über 20 min (18 min) und ein C 18 analytisches 4,6 x 100 mm Säule. Verwenden sowohl UV (254 nm) und gamma-Detektion.
      1. Nehmen Sie eine kleine Probe jedes Produkts und vergleichen ihre HPLC-Retentionszeit, die der Co-injektiert, nicht-radioaktive, Re-markierten Standards (0,125 mg in 20% Methanol-H 2 O). Die Re-markiertem Standard wird in der UV - HPLC - Spur identifiziert, und zur gleichen Zeit wie die 99m Tc-markierte Verbindung , in der γ-HPLC - Spur eluieren. Diese Co-Injektion zeigt Peaks bei vergleichbaren Retentionszeiten, die Identität der 99m Tc-Verbindung bestätigt gekennzeichnet.
    8. Dampfe das Lösungsmittel von HPLC-Fraktionen unter Verwendung eines Verdampfers (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6.000 rpm).
    9. Formulieren der gereinigten Verbindung in einer Konzentration von 7,4 kBq / & mgr; l in PBS, enthaltend 0,5% BSA und 0,01% Tween-80.
    10. Um die markierten Verbindungen sind stabil zu gewährleisten, führen Sie eine in - vitro - Stabilitätsstudie. Inkubieren der formulierten Verbindung bei 37 ° C für 1, 4 und 6 h, eine kleine Menge (3,7 MBq) der Mischung auf dem HPLC an jedem Zeitpunkt Injizieren Stabilität zu bewerten.

2. Pre-gezielte Bio-Verteilung Studies

    Vorbereitung der Tiere
    1. Mit 7-9 Wochen alt, weiblich Balb / c-Mäuse (n = 3), zu verwalten TCO-BP in Kochsalzlösung (20 mg / kg) (5 ug / ul) formuliert, über Schwanzveneninjektion.
    2. Bewegen Sie die Maus in der physischen Rückhaltevorrichtung, und identifizieren die sich Venen an den Seitenflächen des Schwanzes und wischen Sie mit einem Alkoholtupfer. Bei etwa 2 cm vom Ende des Schwanzes, legen Sie eine 30-Gauge-Nadel in einem flachen Winkel parallel zur Ader. Langsam drücken Sie den Kolben Nadel zu injizieren, entfernen und reinigen Gazeschwamm an der Injektionsstelle mit leichtem Druck, bis die Blutung aufhört gelten.
    3. Bei 1 h nach der Injektion von TCO-BP, verabreichen ~ 0,74 MBq (20 uCi) von 99m Tc-Tetrazin in 100 ul 0,5% BSA formuliert, 0,01% Tween-80 in PBS, via Schwanzveneninjektion.
  1. Bio-Verteilungsstudien
    1. Bei dem gewünschten Zeitpunkt (t = 6 h), anästhesieren die Mäuse unter Verwendung von 3% Isofluran und 2% Sauerstoff-Gasgemisch. Demonstrieren Sie ein zue Prise Rückzug auf der narkotisierten Maus, um sicherzustellen, dass sie unter chirurgische Ebene der Anästhesie sind.
    2. Sammeln Blut (1 ml) über eine Spritze Herzpunktur vorbehandelt mit Heparin verwendet wird. Bewegen Sie die Maus auf dem Rücken mit der Nase in die Nase Kegel für die weitere Anästhesie und suchen Sie den Xiphoidbasis auf das Tier.
      1. Legen Sie eine 25 G-Nadel, leicht nach links von der Mittellinie des Tieres unter dem Xiphoidbasis, bei einem Winkel von 20 °. Voll führen Sie die Nadel, und langsam auf den Kolben zurückziehen Blut in der Nadel-Ansatz, um zu sehen, ob das Herz durchbohrt wurde. Etwas die Nadel nachstellen, während der Kolben bei Bedarf halten, um das Herz zu durchbohren. ziehen langsam Blut in die Spritze.
    3. Euthanize das Tier durch Genickbruch, während der Narkose.
    4. Legen Sie jedes Tier in einen Plastikbeutel und verwenden Sie einen Dosiskalibrators (99m Tc - Einstellung) , um den ganzen Körper Aktivitätsniveau zu messen.
    5. Sammeln Sie die folgenden Gewebe und Flüssigkeiten in vorge wiegened Zählrohre: Blut, Knochen (Knie und Schulter), Gallenblase, Nieren, Leber, Magen (mit Inhalt), Dünndarm (mit Inhalt), Dickdarm und Blinddarm (mit Inhalt), der Schilddrüse und der Trachea, der Harnblase mit Urin und Schwanz.
    6. Spülen Sie geeignete Gewebe (ohne Blut, Gallenblase und Harnblase) in PBS Blut zu entfernen und trocken tupfen, bevor das Gewebe in geeigneten Zählrohre platzieren.
    7. Platzieren Sie Tierkadaver in eine Plastiktüte und messen Rest ganzen Körper Aktivität eine Dosis-Kalibrator verwenden.
    8. Wiegen Sie jedes Röhrchen eine Gewebeprobe enthält. Subtract Anfangsgewicht des Rohrs Masse des Gewebes zu erhalten.
    9. Verwenden , um eine Dosis - Kalibrator (99m Tc - Einstellung) die Menge an Aktivität in einer Testprobe (100 ul) zu der Zeit der Einspritzung für jede Maus gemessen.
      ANMERKUNG: Diese Testprobe ist gleich dem Injektionsvolumen, wodurch die Aktivitätszählung zum Zeitpunkt der Injektion geben.
    10. Zum Zeitpunkt der Gewebemessung eineliquot 5 ul des zuvor verwendeten Testprobe. Verwenden , um einen Multidetektor - Gammazähler (99m Tc - Einstellung) und zähle die Zählung pro Minute (CPM) für die 5 & mgr; l Testprobe zu erhalten.
    11. Verwenden Sie die beiden erhaltenen Werte in 2.2.9 und 2.2.10 die Aktivität und CPM - Beziehung 1 unter Verwendung der Gleichung zu berechnen einen Umrechnungsfaktor zu erhalten (CPM uCi -1).
      (1) Gleichung 1
    12. Verwenden, um die Gamma-Zähler die Menge an Radioaktivität in jedem Gewebe oder Flüssigkeitsprobe zu messen.
    13. Verwenden der Gleichung 1 die Aktivitätsmenge in jedem Gewebe oder Flüssigkeit, die zum Zeitpunkt der Messung in Bezug auf die gesamten injizierten Dosis berechnet. Dieser Wert wird dann durch Organgewicht normalisiert und als Prozent injizierte Dosis pro Gramm (dh% ID / g) Gewebe berichtet.
    14. Führen Sie die Schritte 2.1.2 bis 2.2.13 ein negatives Kontrollexperiment durchzuführen unter Verwendung der 99m Tc-markierten Tetrazin - Liganden in der Absence von TCO-BP. Opfer-Mäuse (n = 3) bei 0,5, 1, 4 und 6 h nach der Injektion und zu erhalten Gewebe oder Flüssigkeit, wie oben beschrieben.

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Representative Results

Die Liganden wurden unter Verwendung von verschiedenen Linkern synthetisiert und Chelatoren über eine einfache reduktive Aminierung Strategie (Abbildung 2), gefolgt von Kupplung des Produktes mit einem handelsüblichen Tetrazin 22, 23. Die radioaktive Markierung wurde mit der gleichen Methode für alle Verbindungen durchgeführt und war in hohem Maße reproduzierbar. Das Verfahren wurde durch Variieren des pH, der Menge an Ligand, der Reaktionszeit und Temperatur , woraufhin das 99m Tc-radiomarkierten Verbindungen optimiert 1-5 in mäßigen bis hohen radiochemischen Ausbeute erhalten wurden: 83% (1), 45% (2), 31% (3), 42% (4) und 54% (5). Folgende HPLC-Reinigung von nicht umgesetztem Liganden und Verdampfung unter Verwendung eines Verdampfers wurden formuliert, die Verbindungen in PBS 0,5% BSA und 0,01% Tween80 vor der Injektion enthält. Die spezifische Aktivität des p urified 99m Tc-markierten Tetrazin betrug ~ 1,48 MBq / ug. Studien wurden durchgeführt , um die Stabilität der 99m Tc-markierten Liganden Tetrazin vor in - vivo - Studien zu bewerten. Die Stabilität wurde bei 1, 4 durch HPLC überwacht und 6 h ohne sichtbare Verschlechterung über 6 h (R t = 14 min), wie in Figur 3 für die Verbindung 4 als Beispiel zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Die Verbindungen 1-5 wurden unter Verwendung von verschiedenen Linkern (Y) und Chelatbildnern (X) , wie gezeigt (unten) hergestellt. Alle Verbindungen wurden radiomarkiert mit [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + die gleichen Reaktionsbedingungen (oben) verwendet, mit Ausnahme von 1, die nicht Schritt erforderlich war (ii).

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Abbildung 3: Stabilitätstestergebnisse unter Verwendung von Verbindung 4. γ-HPLC Spuren 4 inkubiert in PBS bei 37 ° C für 1, 4 und 6 h.

Für die in vivo Tests, gesunde Balb / c - Mäuse wurden verwendet. Kurz gesagt, für jede Verbindung, Gruppen von Mäusen (n = 3) wurden mit TCO-BP (100 ul, 20 mg / kg) injiziert, die durch die Verabreichung der 99m Tc-markierten Verbindungen 1 h später gefolgt wurde. Bei 6 h nach der Injektion der 99m Tc - Komplexe wurden die Tiere getötet und die Aktivitätskonzentrationen in verschiedenen Geweben und Flüssigkeiten bestimmt. Die resultierenden Daten werden als Prozent injizierte Dosis pro Gramm Gewebe (% ID / g) angegeben und ist in Abbildung 4 dargestellt. Representative Verhältnisse von Knochen (Knie- oder Schulter) an Blut für jede der fünf 99m Tc-markiertem Tz Verbindungen sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Daten zeigen, clfrüh , dass die Verbindung 3 zur Verfügung gestellt optimale Targeting von Blut mit Spiel kombiniert, und dass es erhebliche Unterschiede zwischen den 99m Tc-markierten Verbindungen in Bezug auf Off-Target - Gewebelokalisierung war. Eine negative Kontroll - Studie unter Verwendung von CD1 - Mäusen (n = 3) wurde durchgeführt, in denen Mäuse mit 99m Tc-Tetrazin - Liganden in Abwesenheit von TCO-BP injiziert. Mäuse wurden mit 0,5 geopfert, 1, 4 und 6 h und% ID / g wurde für alle Gewebe und Flüssigkeiten bestimmt. Für alle getesteten Verbindungen, in denen Daten für Verbindung 2 in Figur 5 dargestellt ist, wurde keine signifikante Aufnahme in Knochen oder anderen Geweben (Herz, Lunge, Milz, Skelettmuskel) in Figur 4 nicht gezeigt gesehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Bio-Verteilung Ergebnisse für 99m Tc-markierten Tetrazinderivate 1-5 (Balken indicated). Die Daten wurden aus ausgewählten Geweben und Flüssigkeiten gezeigt, erhalten 6 Stunden nach der Injektion der radiomarkierten Derivate genommen, und die Aktivität wurde normalisiert auf Gewebe oder Flüssigkeit Gewicht als mittlere prozentuale injizierte Dosis pro Gramm Gewebe oder Flüssigkeit (% ID / g) ± SEM. Knochen Ziele werden durch • angegeben. HINWEIS: Alle restlichen Gewebe nicht hatten mittlere% ID / g dargestellt, die weniger als 1% betrug. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Bio-Verteilung Ergebnisse für Kontroll - Studie unter Verwendung von 99m Tc-markierten Tetrazin (2) ohne vorherige Injektion von TCO-BP. Bei 0,5, 1, 4 und 6 Stunden nach der Injektion von 2 von 3 Mäusen entnommen gezeigten Daten wurden aus ausgewählten Geweben und Flüssigkeiten erhalten. Die Aktivität wurde auf Gewebe normalisiert oderFluidgewicht als mittlere prozentuale injizierte Dosis pro Gramm Gewebe oder Flüssigkeit (% ID / g) ± SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Verbindung
Verhältnis 1 2 3 4 5
Schulter: Blut 3,5: 1 3,5: 1 21: 1 7,8: 1 0,8: 1
Knie: Blut 6.9: 1 5.6: 1 26: 1 12: 1 1,3: 1

Tabelle 1. Knochengewebe: Blut - Verhältnisse bestimmt aus bio-Verteilungsstudien.

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Discussion

Eine Sammlung von Tetrazin-linked dreizähnigen Chelate verschiedener Polaritäten wurde hergestellt, und die Nützlichkeit der 99m Tc - Komplexe in der IEDDA Reaktion mit einer TCO - Derivat in vivo bewertet. Eine effektive und reproduzierbare 99m Tc wurde Markierungsverfahren für fünf Tetrazin-Chelate entwickelt, wobei der Ligand - Konzentration 10 -3 M. war der Markierungsschritt durch Entfernung der Schutzgruppe von t- Butyl - Gruppen (für die Verbindungen 2-5) gefolgt wurde. Die hohe Konzentration des Liganden wurde verwendet , um die radiochemische Ausbeute zu verbessern und die Reaktionszeiten reduzieren , die 21 Abbau des Tetrazin minimiert. Das Produkt wurde isoliert und aus unmarkierten Liganden und gegebenenfalls radiochemischen Verunreinigungen durch HPLC getrennt, was zu einer radiochemischen Ausbeuten im Bereich von 31 bis 83%, wobei alle mit> 99% radiochemische Reinheit und eine hohe spezifische Aktivität von ~ 1,48 MBq / ug. Alle Verbindungen wurden als stabil gezeigt in PBS 0 enthält.5% BSA und 0,01% Tween80 bis zu 6 h (Figur 3).

Bisphosphonat-Verbindungen, wie TCO-BP, lokalisieren zu Regionen des aktiven Knochenmetabolismus oder Verletzung, die Knie- und Schultergelenke in Mäusen enthalten. TCO-BP stellt daher ein einfaches Mittel , um die Wirksamkeit neuer radiomarkierten Tetrazinen zu bewerten Isotope in vivo zu liefern. Bewertung der biologischen Verteilung aller fünf 99m Tc-Tetrazinen zeigte Aufnahme in Knie- und Schultergelenke 6 Stunden nach der Injektion, erfolgreich in vivo Knochen Pre-Targeting demonstriert (Abbildung 4). Frühere Studien bestätigt , dass radioaktiv markiertes TCO-BP am Knochen ansammelt 18, während die 99m Tc-Tetrazin - Konstrukt (2) gegeben allein nicht (Abbildung 5). Dies lässt den Schluss zu, dass die Knochenaufnahme in die IEDDA Reaktion zurückzuführen ist.

Die lipophileren Konstrukte 1 und 2 (1); 7,6 ± 2,7 (2)) ähnliche Verteilungsdaten einschließlich hohe Aufnahme hatte und die Schulter (4,6 ± 1,4 (1); 4,8 ± 1,9 (2)). Hochradioaktivität Konzentrationen wurden auch in der Gallenblase, Leber und Darm gesehen, die mit der Verteilung des lipophilen 99m Tc-Tetrazin - Verbindung 2 in Abwesenheit von TCO-BP (Abbildung 5) konsistent ist. Andere Nicht-Zielgeweben und Organen wie der Skelettmuskel und Milz zeigten keine signifikante Aufnahme (<1%) , wenn Biodistribution Studien zu den 99m Tc-Tetrazinen in Abwesenheit der TCO-BP durchgeführt wurden (Figur 5) , so wurden diese Organe für die Pre-Targeting-Experimente nicht getroffen. Zusätzlich Biodistribution Experimente mit den 99m Tc-Tetrazinen allein ergab gute Clearance von Nicht-Zielgeweben bei 6 Stunden nach der Injektion. Folglich this Zeitpunkt, der innerhalb einer Halbwertszeit des Isotops ist, wurde als Zeitpunkt gewählt, um die verschiedenen radiomarkierten Tetrazin-Liganden zu vergleichen.

Das polarere 99m Tc-Tetrazin - Verbindung 3 mit einem PEG 5 Linker Lager zeigte sehr hohe Knie- und Schulteraufnahme (16,2 ± 4,8 und 20,7 ± 4,9 beziehungsweise). Es gab auch eine geringere Aktivität in der Leber und im Darm beobachtet. Das entsprechende PEG - Derivat 10 zeigte auch an den Knochen und verringerte Aufnahme in Leber Bindung im Vergleich zu den Verbindungen 1 und 2 die meisten polaren Derivat 5, zeigten niedrigere Knochen als alle anderen Konstrukte Bindungs das aufgrund seiner schnellen Clearance wahrscheinlich ist.

Die hohe Knochenaufnahme und Knochen: Blut - Verhältnisse (Tabelle 1) , insbesondere für die Verbindungen 3 und 4 zeigen , dass das Pre-Targeting und die IEDDA Reaktion kann loc verwendet werdenalize 99m Tc-markierten Verbindungen in vivo. Die Methoden, die hier berichtet können jede radiomarkierten Tetrazin einschließlich der nächsten Generation von Tc (I) -tetrazine Liganden zu bewerten verwendet werden. Es ist zu beachten , dass für die Klasse von Liganden , die in dieser Studie verwendet wurden, können die Strukturen einfach durch Verändern der Natur der Donorgruppen und Linker zwischen dem Metallkomplex und dem Tetrazin variiert werden, ohne daß die Liganden - Syntheseverfahren 21 zu verändern. Sobald ein Lead-Molekül identifiziert wird, ein Instant-Kit-Methode, die Festphasenreinigungsverfahren wahrscheinlich enthalten wird, entwickelt werden können klinische Umsetzung zu unterstützen.

Die Tc (I) Komplexe hier berichtet schaffen die Möglichkeit , neue 99m Tc - Radiopharmaka unter Verwendung einer breiten Palette von unterschiedlichen TCO-derived Targeting - Moleküle einschließlich Antikörper herzustellen. Antikörper, trotz ihrer hervorragenden Targeting-Eigenschaften vor der Erzeugung von Technetium markierte Tetrazinen, würde nicht typically mit 99m Tc verwendet werden , wegen ihrer langsamen Clearance (Tage), was viel länger ist als die Halbwertszeit des Isotops (~ 6 h) ist. Eine weitere Anwendung der hier berichtet Chemie ist , dass die gleiche Klasse von Liganden können mit der Beta - emittierende Radionuklide 186 Re und 188 Re hergestellt werden. Die isostrukturellen Re (I) Analoga der Tc (I) Mittel, wenn sie mit dem Tumor kombinierten Eigenschaften von TCO-BP sucht, kann verwendet werden, um Knochenmetastasen zu behandeln.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Argon gas Alphagaz --- ---
Na2CO3 EMD Millipore 106395 ---
Na2B4O7·10H2O Anachemia S9640 ---
KNaC4H4O6·4H2O Anachemia 217255 ---
Technelite 99mTc generator Lantheus medical imaging --- Source of 99mTcO4-
0.9% Saline Lantheus medical imaging --- To elute generator
1 M HCl Lab Chem --- ---
MeOH Caledon --- ---
ACN Caledon --- HPLC grade
Millipore H2O Thermo Fisher Scientific Barnstead Nanopure ---
DCM Caledon --- ---
TFA Caledon --- ---
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4 1x
BSA Sigma Aldrich A7906 ---
Tween80 Sigma Aldrich P8047 ---
Isoflurane CDMV 108737 Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC Waters 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) ---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 Phenomenex 00G-4435-E0 Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 Waters  186003115 XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor  Biotage  Initiator 8 ---
Biotage V10 Evaporator Biotage  Serial # V1041 ---
Dose calibrator Capintec, Inc.  CRC-25R ---
Gamma counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter ---
Animal room scale  Mettler Toledo XP105 Delta Range ---
Microwave vials  Biotage  355629 0.5-2 mL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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