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Chemistry

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Bilton, H. A., Ahmad, Z., Janzen, N., Czorny, S., Valliant, J. F. Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry. J. Vis. Exp. (120), e55188, doi:10.3791/55188 (2017).

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Abstract

Introduction

99m Tc reste le radio - isotope dominant utilisé en médecine nucléaire diagnostique, avec plus de 50 millions de procédures d'imagerie effectuées par an dans le monde entier 1, 2, 3. La majorité des agents 99m Tc utilisés cliniquement sont radiopharmaceutiques de type perfusion. Il y a un nombre limité de composés activement ciblés dans lesquels 99m Tc est dirigé pour lier un biomarqueur spécifique à travers la ligature à une construction de ciblage. La création de 99m ciblée radiopharmaceutiques Tc est souvent entravée par l'influence de 99m complexes Tc-ligand sur la capacité de la molécule de ciblage pour lier le biomarqueur d'intérêt, ou les isotopes demi-vie est pas assez long pour une utilisation avec des biomolécules de poids moléculaire élevé telles que des anticorps. Ce dernier nécessite généralement plusieurs jours avant que les images sont acquises pour que la biomolécule pour effacer de la non-cible tiss ues. Pré-ciblage propose une approche alternative pour surmonter ces défis.

Pré-ciblage combinée avec la chimie bioorthogonal a été montré pour être un moyen efficace de développer de nouvelles sondes d'imagerie moléculaire à la fois pour la fluorescence et la radio-imagerie 4, 5, 6, 7, 8. La réaction de la demande d'électrons inverse de Diels-Alder (IEDDA) entre 1,2,4,5-tétrazine (Tz) et -cyclooctene trans (TCO) , ses dérivés, comme le montre la figure 1, a été montré comme étant particulièrement efficace 6. La réaction IEDDA avec ces composants peut présenter une cinétique rapide dans du PBS (k 2 ≈ 6.000 M -1 s -1) et une sélectivité élevée, le rendant idéal pour des applications in vivo pré-ciblage 9, 10.

e_content "> L'approche la plus couramment utilisée consiste à administrer un vecteur de ciblage TCO dérivés et à la suite d' une période de retard suffisant, un tétrazine radiomarqué est administré. tétrazines radiomarqués sur la base de 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, et 111 en ont été rapporté 11, 12, 13, 14, 15. en revanche, il n'y a qu'un seul rapport d'une 99mTc marqué Tz, qui a été préparé en utilisant un ligand de type HYNIC nécessitant l'utilisation de co-ligands pour éviter la liaison aux protéines et à la dégradation in vivo , 16. a titre d'alternative, nous rapportons ici la synthèse de 99mTc (I) marqué tétrazines en utilisant une famille de ligands qui forment des complexes stables avec un tridentate [99mTc (CO) 3] + noyau.


Figure 1: La réaction IEDDA bioorthogonal entre tétrazine et -cyclooctene trans. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La famille de ligands préparés contiennent des chélates tridentés qui varient en polarité et de la nature du groupe de liaison entre la région de liaison métallique et la Tz (figure 2). L'objectif était d'identifier un 99m Tc-tétrazine construire qui pourrait efficacement localiser et de réagir avec des sites TCO marqués in vivo et rapidement clair lorsqu'ils ne sont pas liés, afin de produire une valeur cible élevée à non-cible ratios. Pour tester les ligands, un TCO-dérivé d'un bisphosphonate (TCO-BP) a été utilisé 17. Nous avons montré précédemment que le TCO-BP se localise dans les zones du métabolisme osseux actif et peut réagir avectétrazines radiomarqués in vivo 18. Il est un réactif commode pour tester de nouveaux tétrazines, car il peut être préparé en une seule étape et les expériences peuvent être effectuées chez des souris normales lorsque la localisation a lieu principalement au niveau des articulations (genoux et des épaules).

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Protocol

Les études animales ont été approuvées par le Comité d'éthique de la recherche animale à l'Université McMaster en conformité avec Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) Lignes directrices.

1. Ligands de radiomarquage Tz-tridentate avec 99mTc

ATTENTION: Les procédures suivantes nécessitent l'utilisation de composés radioactifs. Le travail ne doit être effectué dans un laboratoire agréé par le respect des règles de sécurité et d'élimination. Les réactions à micro-ondes doivent être effectuées dans un four micro-ondes conçu spécifiquement pour la synthèse chimique.

  1. Synthèse du [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20
    1. Dans un flacon à micro - ondes, mélanger 8 mg de K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg de Na 2 CO 3, 20 mg de Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O et 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. Purge le flacon pendant 10 minutes avec du gaz argon.
    2. Ajouter 4 ml de 99m TcO 4 - (~ 1100 MBq, ~ 30 mCi) dans du sérum physiologique à 0,9% au flacon.
    3. Chauffer le mélange réactionnel dans un micro-ondes pendant 3,5 minutes à 110 ° C, après 10 s d'agitation pour assurer un mélange intime des réactifs.
    4. Ajuster le pH de la solution à 3,5-4 à l'aide ~ 400 ul de HCl 1 M. Vérifiez en utilisant du papier pH.
  2. Radiomarquage des ligands 1-5 tétrazine
    1. Dissoudre 2 mg de chaque ligand (composés 1-5) dans 250 ul de MeOH 21.
    2. Ajouter 250 ul de [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq ~ 2 mCi) à chaque solution.
    3. Chauffer le mélange réactionnel à l'aide d'un four micro-ondes pendant 20 min à 60 ° C.
      REMARQUE: Cette étape est identique pour tous les 5 tétrazines.
    4. Pour les composés 2 à 5, évaporer le solvant et re-dissolve les produits obtenus dans 1 ml de 1: 1 v / v DCM: TFA.
    5. Chauffer les produits réactionnels dissous (2-5) à 60 ° C dans un four micro - ondes pendant 6 min (2-4) ou 10 min (5).
    6. Après refroidissement à température ambiante, évaporer le solvant en utilisant un évaporateur (36 ° C, de 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) et on dissout le composé séché dans 1: 1 d' ACN: H 2 O ou 1: 1 MeOH: H 2 O, avant la purification par HPLC.
    7. Purifier les 99m Tc-composés marqués (1-5), y compris la séparation du produit marqué du ligand tétrazine non marqué, par HPLC (C 18 en phase inverse). Typiquement, en utilisant un gradient d'élution de 30:70 d' ACN: H 2 O (tous deux avec 0,1% de TFA) à 40:60 d' ACN: H 2 O de plus de 20 min (18 min) et une colonne 4,6 x 100 mm C 18 analytique. Utilisez les deux UV (254 nm) et la détection gamma.
      1. Prenez un petit échantillon de chaque produit étiqueté et de comparer son temps de rétention HPLC à celle d'un co-injète, non radioactif, norme réétiquetée (0,125 mg dans 20% de méthanol-H 2 O). La norme de Re-marqué est identifié dans la trace HPLC UV, et éluer en même temps que le 99m Tc composé marqué dans la trace γ-HPLC. Cette co-injection présente des pics aux temps de rétention comparable, ce qui confirme l'identité du composé 99m marqué par Tc.
    8. On évapore le solvant des fractions HPLC en utilisant un évaporateur (36 ° C, de 8 mbar, 3 min, 6000 rpm).
    9. Formuler le composé purifié à une concentration de 7,4 kBq / pl dans du PBS contenant 0,5% de BSA et 0,01% de Tween-80.
    10. Pour garantir que les composés marqués sont stables, effectuer une étude in vitro de la stabilité. Incuber le composé formulé à 37 ° C pendant 1, 4 et 6 h, en injectant une petite quantité (3,7 MBq) du mélange sur la HPLC à chaque point de temps pour évaluer la stabilité.

2. Les études Bio-distribution de pré-ciblés

    Préparation des animaux
    1. Utilisation de vieux 7-9 semaine souris Balb / c, femelles (n = 3), administrer TCO-BP formulé dans une solution saline (20 mg / kg) (5 ug / ul), par injection de queue veineuse.
    2. Placez la souris dans le dispositif de contrainte physique, et d'identifier les veines situées sur les surfaces latérales de la queue et essuyer avec un tampon imbibé d'alcool. À environ 2 cm de l'extrémité de la queue, à insérer une aiguille de calibre 30 à un angle faible, parallèlement à la veine. Appuyer lentement sur le piston pour injecter, retirer l'aiguille et appliquer éponge propre et de gaze sur le site d'injection avec une légère pression jusqu'à ce que le saignement cesse.
    3. À 1 h après l' injection de TCO-BP, administrer ~ 0,74 MBq (20 uCi) de 99mTc-tétrazine formulés dans 100 ul de 0,5% de BSA, 0,01% de Tween-80 dans du PBS, par injection de la veine de queue.
  1. Études Bio de distribution
    1. Au point de temps désiré (t = 6 h), anesthésier les souris en utilisant 3% d'isoflurane et le mélange de gaz d'oxygène de 2%. Démontrer àe pincée retrait sur la souris anesthésiée pour assurer qu'ils sont sous plan chirurgical de l'anesthésie.
    2. Recueillir du sang (1 ml) par ponction cardiaque en utilisant une seringue pré-traitée avec de l'héparine. Placez la souris sur le dos avec le nez dans le cône de nez pour l'anesthésie continue et de localiser le processus xiphoïde sur l'animal.
      1. Insérez une aiguille G 25, légèrement à gauche de la ligne médiane de l'animal dans le cadre du processus xiphoïde, à un angle de 20 °. Insérez complètement l'aiguille et tirez lentement sur le piston pour voir le sang dans le moyeu de l'aiguille si le cœur a été perforé. Légèrement réajuster l'aiguille tout en maintenant le piston si nécessaire, pour percer le cœur. Aspirez lentement le sang dans la seringue.
    3. Euthanasier l'animal par dislocation cervicale, alors que sous anesthésie.
    4. Placez chaque animal dans un sac en plastique et utiliser un calibrateur de dose (99m Tc de réglage) pour mesurer l'ensemble du niveau d'activité du corps.
    5. Recueillir les tissus et les fluides suivants en pré-peséeed compter tubes: le sang, les os (genou et de l'épaule), la vésicule biliaire, les reins, le foie, l'estomac (avec le contenu), l'intestin grêle (avec contenu), gros intestin et le caecum (avec contenu), de la thyroïde et de la trachée, de la vessie avec de l'urine , et la queue.
    6. Rincer les tissus appropriés (à l'exclusion du sang, de la vésicule biliaire et de la vessie) dans PBS pour éliminer le sang et le sécher avant de placer les tissus dans des tubes de comptage appropriés.
    7. Placez la carcasse de l'animal dans un sac en plastique et mesurer l'activité du corps entier résiduel en utilisant un calibrateur de dose.
    8. Peser chaque tube contenant un échantillon de tissu. Soustraire poids initial du tube pour obtenir la masse du tissu.
    9. Utiliser un calibreur de dose (99m de réglage Tc) pour mesurer la quantité d'activité dans un échantillon d'essai (100 ul) au moment de l' injection pour chaque souris.
      REMARQUE: Cet échantillon d'essai est égal au volume d'injection, ce qui donne le compte de l'activité au moment de l'injection.
    10. Au moment de la mesure de tissu, unliquot 5 ul de l'échantillon d'essai utilisé précédemment. Utilisez un compteur gamma multi-détecteur (99m de réglage Tc) et compter pour obtenir le nombre par minute (CPM) pour l'échantillon d'essai de 5 pi.
    11. Utilisez les deux valeurs obtenues en 2.2.9 et 2.2.10 pour calculer l'activité et la relation CPM en utilisant l' équation 1 pour obtenir un facteur de conversion (CPM uCi -1).
      (1) L'équation 1
    12. Utiliser le compteur de rayons gamma pour mesurer la quantité de radioactivité dans chaque échantillon de tissu ou de fluide.
    13. Utiliser l'équation 1 pour calculer la quantité d'activité dans chaque tissu ou de liquide au moment de la mesure par rapport à la dose totale injectée. Cette valeur est ensuite normalisée en fonction du poids des organes et rapportée comme dose injectée par gramme pour cent ( par exemple,% ID / g) de tissu.
    14. Suivez les étapes 2.1.2 à 2.2.13 pour mener une expérience de contrôle négatif en utilisant les 99m Tc marqué ligands tétrazine dans le Absence du TCO-BP. Sacrifice des souris (n = 3) après l'injection de 0,5, 1, 4 et 6 h, et d'obtenir un tissu ou d'un fluide tel que décrit ci-dessus.

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Representative Results

Les ligands ont été synthétisés en utilisant différents agents de liaison et des chélateurs via une stratégie simple d'amination réductrice (figure 2), suivie par le couplage du produit à un tétrazine disponible dans le commerce 22, 23. Le radiomarquage a été réalisé en utilisant la même méthode que pour tous les composés et a été hautement reproductible. Le processus a été optimisé en faisant varier le pH, la quantité de ligand, le temps de réaction et la température après quoi le 99m Tc-composés radiomarqué 1-5 ont été obtenus dans modérée à rendement radiochimique élevé: 83% (1), 45% (2), 31% (3), 42% (4) et 54% (5). À la suite de la purification par HPLC ligand qui n'a pas réagi et l'évaporation en utilisant un évaporateur, les composés ont été formulés dans du PBS contenant 0,5% de BSA et 0,01% de Tween-80 avant l'injection. L'activité spécifique de la p tétrazine 99m Tc urified marqué était ~ 1,48 MBq / pg. Des études ont été menées pour évaluer la stabilité du 99mTc-ligands marqués tétrazine avant les études in vivo. La stabilité a été suivie par HPLC à 1, 4 et 6 heures sans dégradation visible de plus de 6 heures (R t = 14 min), comme on le voit sur la figure 3 pour le composé 4 , par exemple.

Figure 2
Figure 2: Les composés 1-5 ont été produits en utilisant différents agents de liaison (Y) et des chélateurs (X) , comme indiqué ( en bas). Tous les composés ont été radiomarqués avec [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + en utilisant les mêmes conditions réactionnelles ( en haut), à l'exception de 1, ce qui ne nécessite pas l' étape (ii).

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Figure 3: Résultats des essais de stabilité en utilisant le composé 4. Les traces de γ-HPLC 4 mises en incubation dans du PBS à 37 ° C pendant 1, 4 et 6 heures.

Pour l'essai in vivo, des souris Balb / c en bonne santé ont été utilisées. En bref, pour chaque composé, les groupes de souris (n = 3) ont été injectés avec le TCO-BP (100 ul, 20 mg / kg), suivie par l' administration des composés marqués au 99mTc 1 h plus tard. À 6 heures après l'injection des complexes de Tc 99m, les animaux ont été sacrifiés et les concentrations d'activité dans divers tissus et fluides déterminés. Les données résultantes est rapportée en pour cent dose injectée par gramme de tissu (% ID / g) et est représentée sur la figure 4. Les ratios représentatifs de l' os (genou ou de l' épaule) de sang pour chacun des composés Tz cinq 99mTc marquées sont indiquées sur le tableau 1. Ces données indiquent cltôt que le composé 3 fourni optimal ciblage combinée avec un jeu à partir du sang, et qu'il y avait des variations importantes parmi les composés 99m Tc marqués en ce qui concerne la localisation hors cible tissulaire. Une étude témoin négatif en utilisant des souris CD1 (n = 3) a été effectuée, lorsque les souris ont été injectées avec des ligands 99mTc-tétrazine en l'absence de TCO-BP. Les souris ont été sacrifiées à 0,5, 1, 4 et 6 h et le% ID / g, a été déterminée pour tous les tissus et fluides. Pour tous les composés testés, où les données pour le composé 2 est présenté dans la figure 5, aucune absorption significative n'a été observée dans l' os ou d' autres tissus (coeur, poumons, la rate, le muscle squelettique) non représentés sur la Figure 4.

Figure 4
Figure 4. Résultats Bio-distribution pour 99m Tc marqué dérivés de tétrazine 1-5 (bars indicated). Les données présentées ont été obtenues à partir de tissus sélectionnés et fluides pris 6 injection h post des dérivés radiomarqués, et l'activité a été normalisée pour les tissus ou le poids de fluide, en moyenne pour cent dose par gramme de tissu ou de fluide (% ID / g) injecté ± SEM. cibles osseuses sont indiqués par •. Remarque: Tous les autres tissus non représentés ont moyen% ID / g qui est inférieure à 1%. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Résultats Bio-distribution pour l' étude de contrôle en utilisant tétrazine 99m Tc marqué (2) sans injection préalable de TCO-BP. Les données indiquées ont été obtenues à partir de certains tissus et fluides prélevés sur 3 souris à 0,5, 1, 4 et 6 h après l' injection de 2. L'activité a été étalonnée par rapport à des tissus oule poids du fluide, sous forme de dose moyenne pour cent injectée par gramme de tissu ou de fluide (% ID / g) ± ETM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Composé
Rapport 1 2 3 4 5
Épaule: Blood 3,5: 1 3,5: 1 21: 1 7,8: 1 0,8: 1
Genou: Blood 6.9: 1 5.6: 1 26: 1 12: 1 1,3: 1

Tableau 1. tissu osseux: rapports sanguins déterminés à partir des études de bio-distribution.

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Discussion

Une collection de tridentes chélates tétrazine liés de différentes polarités a été préparé, et l'utilité de leurs complexes 99m Tc dans la réaction IEDDA avec un dérivé TCO in vivo a été évaluée. Un procédé de marquage 99mTc efficace et reproductible a été développée pendant cinq tétrazine chelates, où la concentration de ligand était de 10 -3 M. L'étape de marquage est suivie par une déprotection des groupes butyle T- (pour les composés 2-5). La forte concentration de ligand a été utilisé pour améliorer le rendement radiochimique et réduire les temps de réaction qui minimisent la dégradation de l'tétrazine 21. Le produit a été isolé et séparé du ligand non marqué et les impuretés radiochimiques par HPLC, ce qui entraîne des rendements radiochimiques allant 31-83%, avec tout ayant> 99% de pureté radiochimique et une activité spécifique élevée de ~ 1,48 MBq / pg. Tous les composés se sont révélés être stables dans du PBS contenant 0.5% de BSA et 0,01% Tween - 80 pendant 6 heures (figure 3).

bisphosphonates, tels que le TCO-BP, se localisent dans des régions du métabolisme osseux actif ou une blessure, qui comprennent les articulations du genou et de l'épaule chez la souris. TCO-BP fournit donc un moyen simple d'évaluer l'efficacité des nouvelles tétrazines radiomarqués pour fournir des isotopes in vivo. L' évaluation de la bio-distribution de tous les cinq 99mTc tétrazines absorption a montré dans les articulations du genou et de l' épaule 6 après l' injection h, ce qui montre la réussite de pré-ciblage de l' os in vivo (figure 4). Des études antérieures ont confirmé que radiomarqué TCO BP accumule à l'os 18, alors que la construction 99mTc-tétrazine (2) est administré seul ne fait pas (figure 5). Ceci permet de conclure que l'absorption osseuse était due à la réaction IEDDA.

Les constructions plus lipophiles 1 et 2 (1); 7,6 ± 2,7 (2)) et l'épaulement (4,6 ± 1,4 (1); 4,8 ± 1,9 (2)). De fortes concentrations de radioactivité ont également été observés dans la vésicule biliaire, le foie et les intestins, ce qui est conforme à la répartition des lipophile 99m Tc-tétrazine composé 2 en l'absence de TCO-BP (figure 5). D' autres tissus et organes non ciblés , tels que le muscle squelettique et la rate ne montraient aucune absorption significative (<1%) lors des études de bio-distribution ont été effectuées sur les 99mTc tétrazines en l'absence de TCO-BP (figure 5) , de sorte que ces organes ne sont pas prises pour les expériences de pré-ciblage. En outre, des expériences bio-distribution avec les 99m seuls Tc-tétrazines ont révélé un bon dégagement à partir de tissus non-cibles après l'injection de 6 h. Par conséquent, this point de temps, ce qui est à moins d'un demi-vie de l'isotope, a été choisi comme point de temps pour comparer les différents ligands radiomarqués tétrazine.

Le 99m polaire composé plus Tc-tétrazine 3 portant un lieur PEG 5 montré très élevé du genou et de l' absorption de l' épaule (16,2 ± 4,8 et 20,7 ± 4,9 respectivement). Il y avait également une activité plus faible observée dans le foie et les intestins. Le dérivé de PEG 10 correspondant a également montré la liaison à l'os et l' absorption réduite dans le foie par rapport aux composés 1 et 2. Le dérivé le plus polaire 5, a montré l' os inférieur de liaison que toutes les autres constructions qui est probablement dû à son élimination rapide.

L'absorption osseuse élevée et d' os: ratios de sang (tableau 1) , en particulier pour les composés 3 et 4 démontrent que la pré-ciblage et la réaction IEDDA peuvent être utilisés pour loccomposés alize 99m Tc marqué in vivo. Les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour évaluer toute tétrazine radiomarqué y compris la prochaine génération de Tc (I) Les ligands -tetrazine. Il convient de noter que , pour la classe de ligands qui ont été utilisés dans cette étude, les structures peuvent être facilement modifiée en changeant la nature des groupes donneurs et les groupes de liaison entre le complexe métallique et le tétrazine, sans altérer de manière significative le procédé de synthèse du ligand 21. Une fois une molécule de plomb est identifié, une méthode de kit instantanée, qui comprendra probablement des procédés de purification en phase solide, peut être développée pour soutenir la traduction clinique.

Les Tc (I) complexes rapportés créent ici l'occasion de préparer de nouveaux radiopharmaceutiques 99m Tc en utilisant un large éventail de différentes molécules de TCO dérivées de ciblage , y compris des anticorps. Les anticorps, en dépit de leurs excellentes propriétés de ciblage avant la création de technétium marqué tétrazines, ne serait pas typicallié être utilisé avec 99mTc en raison de leur dégagement lent (jours) qui est beaucoup plus longue que la demi-vie de l'isotope (~ 6 h). Une application supplémentaire de la composition chimique présentée ici est que la même classe de ligands peut être préparé avec la bêta radionucléides 186 Re et 188 Re électroluminescentes. Les isostructurales Re (I) analogues des agents Tc (I) lorsqu'ils sont combinés avec la tumeur à la recherche des propriétés de TCO-BP peuvent être utilisés pour traiter les métastases osseuses.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Argon gas Alphagaz --- ---
Na2CO3 EMD Millipore 106395 ---
Na2B4O7·10H2O Anachemia S9640 ---
KNaC4H4O6·4H2O Anachemia 217255 ---
Technelite 99mTc generator Lantheus medical imaging --- Source of 99mTcO4-
0.9% Saline Lantheus medical imaging --- To elute generator
1 M HCl Lab Chem --- ---
MeOH Caledon --- ---
ACN Caledon --- HPLC grade
Millipore H2O Thermo Fisher Scientific Barnstead Nanopure ---
DCM Caledon --- ---
TFA Caledon --- ---
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4 1x
BSA Sigma Aldrich A7906 ---
Tween80 Sigma Aldrich P8047 ---
Isoflurane CDMV 108737 Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC Waters 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) ---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 Phenomenex 00G-4435-E0 Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 Waters  186003115 XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor  Biotage  Initiator 8 ---
Biotage V10 Evaporator Biotage  Serial # V1041 ---
Dose calibrator Capintec, Inc.  CRC-25R ---
Gamma counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter ---
Animal room scale  Mettler Toledo XP105 Delta Range ---
Microwave vials  Biotage  355629 0.5-2 mL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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