Differential Scanning Calorimetry - En metode for å vurdere termisk stabilitet og konformasjon av Protein Antigen

Biochemistry
 

Summary

Differensial skanningskalorimetri måler den termiske overgangstemperaturen (e) og total varmeenergi som kreves for å denaturere et protein. Oppnådde resultater er brukt for å vurdere den termiske stabilitet av proteinantigener i vaksinepreparater.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Differensiell scanning kalorimetri (DSC) er en analytisk teknikk som måler den molare varmekapasiteten av prøvene som en funksjon av temperaturen. I tilfelle av proteinprøver, DSC-profiler gir informasjon om termisk stabilitet, og til en viss grad tjener som en strukturell "fingeravtrykk" som kan brukes til å vurdere strukturelle konformasjon. Det er utført ved å bruke et differensielt scanning kalorimeter som måler den termiske overgangstemperatur (smeltetemperatur; T m), og den energi som kreves for å avbryte vekselvirkningene stabiliserings den tertiære strukturen (entalpi, AH) av proteiner. Sammenligninger er gjort mellom formuleringer samt produksjonspartier, og forskjeller i avledede verdier indikerer forskjeller i termisk stabilitet og strukturelle konformasjon. Data som illustrerer bruk av DSC i en industriell setting for stabilitetsstudier samt overvåke sentrale produksjonstrinn er gitt som bevis for effektiviteten av denne proprotokollen. I forhold til andre metoder for å vurdere den termiske stabilitet av protein konformasjoner, er DSC kostnadseffektiv, krever noen prøveopparbeidelse trinn, og gir også en komplett termodynamisk profil av proteinet utbrettingsprosessen.

Introduction

Differensiell scanning kalorimetri (DSC) er en eksperimentell metode som direkte måler forskjellen i varmeenergi opptak finner sted i en prøve i forhold til en referanse under en regulert temperaturendring 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Utføres i et kalorimeter, innebærer fremgangsmåten innføring av varme-energi inn i en prøvecelle og en referansecelle samtidig mens identisk å øke temperaturen i begge celler over tid 2, 13,14. På grunn av forskjell i sammensetningen av prøven og referansen, blir forskjellig energimengde kreves for å heve temperaturen av cellene 2, 12, 13. Således blir den overskytende mengde energi som er nødvendig for å kompensere for temperaturforskjellen mellom cellene måles og direkte korrelert til bestemte termodynamiske egenskapene til prøven 1, 3.

I 1960, MJ O'Neil og E. Watson av Perkin Eimer utviklet den første differensiell scanning kalorimeter for å måle varmestrøm av faste materialer 2, 3, 4. Parallelt PL Privalov og DR Monaseldze EL ved Institutt for fysikk, Republikken Georgia (tidligere Sovjetunionen) skapt et unikt differensial adiabatisk kalorimeter som kan brukes for biokjemisk forskning 5, 6. Deretter Andronikashvili team ved Institutt for fysikk, Republikken Georgia, melder varmekapasitet av biomolekyler som fibrøs og globular proteiner, DNA og RNA ved hjelp av DSC 7, 8, 9. Flere lag ledet av Sturtevant 10, 11, 12, Brandts 13, og Privalov 14, 15, 16 med fokus på utvikling av teori og praktiske anvendelser av DSC å undersøke termodynamiske detaljer om protein utfoldelse. Verdien av DSC i å studere store supramolekylære strukturer som fager, kloroplast, fosfolipid-flytende krystaller, og kjøttproteiner er også blitt rapportert 17 sup>, 18, 19, 20.

DSC har nå blitt vanlig i farmasøytisk forskning og utvikling for vurdering av termisk stabilitet av biomolekyler, spesielt proteiner 1, 21, 22. Dette er hovedsakelig på grunn av fremskritt når det gjelder følsomhet og automatisering av instrumentering brukes til å utføre eksperimentet 23, 24. Her er den endelige resultatet av DSC forsøket, nemlig molar varmekapasitet som en funksjon av temperatur, blir brukt til å estimere de følgende termodynamiske parametere (endring i varmekapasitet (ΔCp), entalpi (AH), entropi (D s) og Gibbs fri energi (ΔG)) ved bruk av ligningen nedenfor:

eq1.jpg "/> (1)

ligning 2 (2)

ligning 3 (3)

ligning 4 (4)

ligning 5 (5)

Hvor Cp er målt varmekapasitet; q er varmestrømmen i testmaterialet; T 0 og T er de innledende og avsluttende temperatur på overgangen henholdsvis 22, 25. Det er også verdt å merke seg at ligningene ovenfor gjelder for single-domene proteiner som kan gjennomgå to-tilstands og reversibel varme utfolder 22. Analyse av mer komplekse proteiner (for eksempel ikke-to-state-proteiner og oligomerer) have blitt rapportert av Friere et al. 26; Johnson et al. 27; og Kasimova et al. 28.

For å bestemme hvorvidt et protein som gjennomgår en to-tilstandsovergang eller danner mellomprodukter i løpet av termisk denaturering, den eksperimentelt utledet entalpi (AH, også referert til som kalorimetrisk entalpi AH Cal) sammenlignes med den entalpi utledet ved hjelp av van't Hoff ligning gitt under (også referert til som van't Hoff entalpi; AH VH):

ligning 6 (6)

Hvor T m er midtpunktet temperaturen i overgangen, R er den ideelle gasskonstant (1,987 cal mol -1 K-1) og Y er den fraksjon av proteinet befolkningen i utfoldet tilstand 16, 29. HvisAH VH er lik AH Cal; eller AH VH / AH Cal er lik 1, da proteinet gjennomgår en "alt-eller-ingen" overgang (dvs. to-stats overgang) 16, 25, 29. Men hvis AH = VH er mindre enn AH Cal; eller AH VH / AH Cal er mindre enn 1, protein gjennomgår en ikke-to-tilstandsovergangen 16, 25, 29. Forholdet AH VH / AH Cal svarer også til den andel av proteinstruktur som smelter som en termodynamisk samarbeidende enhet eller domene 26.

De termodynamiske parametre som er nevnt ovenfor, for eksempel ΔG og AH gi nyttig informasjon om den termiske stabilitet av proteiner, inkludert biologiske 30. Imidlertid vil det bli lagt på T m og AH i denne publikasjonen, som de er de rapporterte verdier for denne protokollen. T m er midtpunktet temperatur av overgangen, hvor den foldede og de utspredte tilstander av proteinet er ved likevekt (dvs. ΔG = 0) 25, 31. Jo høyere T m av en protein, jo høyere dens termiske stabilitet 31. AH tilsvarer arealet under toppen (e) av varmekapasitet sammenlignet med temperaturgraf (også kjent som termogram) som ble generert ved slutten av forsøket DSC 16, 25. Det er energien som kreves for å denaturere proteiner og som kan brukes til å estimere den aktive fraksjon (F a) i en proteinformulering (dvs. andelen av proteiner med aktiv konformasjon i en prøve) ved hjelp av følgende ligning:

jove_content "> ligning 7 (7)

Hvor AH er den eksperimentelt utledet entalpien av proteinprøven og Q er entalpien bestemt for et godt karakterisert referanse eller standardisert protein 22. Estimering av F a er vesentlig for å overvåke i sanntid stabilitet av produkter samt gjennomføre stabilitetsstudier under stress forhold som kreves av ICH retningslinjer 32. Sammenligning av AH gir også informasjon om kompakthet av tertiær struktur konformasjon av et protein 31.

Denne protokollen detaljer en fremgangsmåte for å bedømme den termiske stabilitet av proteiner i et industrielt miljø og har vært mye brukt for formulering av vaksiner. Det ble utviklet ved bruk av en automatisert differensiell scanning kalorimeter som genererer reproduserbare resultater feller proteinkonsentrasjoner så lave som 300 ug / ml.

Protocol

1. Instrument Oppstart

  1. Slå på differensiell scanning kalorimeter og øke trykket i cellene for å undertrykke koking av prøvene så vel som forhindre dannelsen bobler ved forhøyede temperaturer. Dette oppnås typisk ved å tilføre nitrogen inn i systemet.
  2. Avhengig av det som utgjør materialet i cellen (for eksempel tantal, gull, platina, etc.), justere trykket av den nitrogengasstilførselen i henhold til produsentens anbefalte trykk for å unngå skade på cellen. For eksempel angir trykket av den nitrogengasstilførselen til 45 psi for det instrument som benyttes for å utvikle denne fremgangsmåten, og trykket over 80 psi kan skade cellen.
  3. Sørg for at alle rengjøringsmiddel magasinene er fylt til ønsket volum. Rengjøringsmidler kreves inkluderer vaskemiddel og vann for å vaske og rengjøre cellen henholdsvis etter hver prøve løp.
  4. Sette temperaturen til prøveholdekammerettil en passende verdi, fortrinnsvis 5 ° C, for å opprettholde integriteten til prøven før eksperimentere.

2. Prøvepreparering

  1. Dialyser prøven mot buffer som skal brukes som referanse for forsøket. Alternativt kan elueringsbuffer oppsamlet ved siste trinn av proteinrensing (dvs. kolonne-eluering) anvendes.
  2. Bestemme konsentrasjonen av proteinprøven ved bruk av den mest egnede proteinkonsentrasjonen bestemmelsesmetode så som Kjedahl metode 33 eller 34 Lowry-metoden. For objektiv sammenligning av resultater, kan du bruke den samme metoden konsekvent innenfor den samme studien. Den nødvendige konsentrasjonsområdet kan variere avhengig av modellen av instrumentet. For det instrument som benyttes i denne protokollen, er det å foretrekke å arbeide område 0,5 til 1 mg / ml.
  3. Degas ble prøven og referansen buffer i vakuum for å kvitte seg med mikrobobler som kan forårsake volum inaccurACY. Dette trinnet kan hoppes over for nyere kalori modeller.
  4. Ved hjelp av en mikropipette og sterile tips i en laminær biocontainment kabinett, legger prøvene og deres respektive buffer i par i 96 brønners plater som er kompatible med instrumentet. Fylle de to første parene av brønner med buffer og de siste to parene med vann for buffer-buffer og vannet skanne respektivt. Buffer-buffer skanninger bekrefte egnetheten av instrumentet før prøvemåling (dvs. vurdering av instrumentering feil), så vel som å etablere en basislinje; mens vann skanninger blir drevet til å rense cellene.
  5. Dekk til 96-brønns plate med en forsegling film, og sørge for at brønnene er riktig forseglet før du tar platen ut av biosikkerhet kabinettet for å unngå kontaminering av prøver.
  6. Sett platen i prøveholdekammeret i den riktige orientering.

3. Eksperimentell Parameter Setup

Merk: Avhengig av jegnstrumentation, kan prøvene bli lastet inn i cellen enten manuelt ved hjelp av en sprøyte, eller automatisk ved hjelp av en autosampler. I dette tilfellet (dvs. en industriell innstilling), en autosampler blir brukt for å spare tid.

  1. Oppkjøps programvare, skriv prøven informasjon i den rekkefølgen platen ble lastet i henhold til kapittel 2.4. Skriv konsentrasjoner hvis tilgjengelig, ellers skriv konsentrasjonsverdier i analyseprogramvare før dataanalyse (punkt 4.2).
  2. Velg alternativet som sikrer rengjøring av celler med vaskemiddel før hver prøve scan, som bør følges av flere vann skyll skritt for å sikre at ingen såperester igjen i cellene.
  3. Angi at utgangstemperatur av forsøket til 20 ° C, men dette kan variere avhengig av tidligere kjennskap til prøven. For kjente proteiner, kan forhåndsbestemt starttemperaturen brukes, mens en lavere starttemperatur kan brukes for ukjente prøver.
  4. Sett den endelige temperaturenav eksperimentet, for eksempel 100 ° C. Sluttemperaturen kan variere avhengig av tidligere kjennskap til prøven.
  5. Still skannehastigheten av eksperimentet, for eksempel 60 ° C / t, som er den typiske skannehastighet. Imidlertid kan scanninghastighet variere avhengig av tidligere kjennskap til prøven, for eksempel 90 ° C / time, eller 120 ° C / time. Det er lurt å skanne ukjente prøver på ulike skannefrekvenser å vurdere kinetikk utfoldelse.
  6. RESCAN prøver for å undersøke om den er reversibel varme utfoldelse. Utfoldelsen av et protein som er ansett som reversible hvis oppnådd for den andre skanne entalpi er minst 80% av den entalpi verdi for den første skanning.
  7. Still post-eksperimentet termostat til 10 ° C for å bevare integriteten av kalori celler.
  8. Kontroller at forsøket oppsettparameterne er riktige før du utfører forsøket. Hvis alt er på plass, starter eksperimentet.

4. Data Analysis

  1. Hente rådata fra eksperimentet og velge en prøve ved et tidspunkt for analyse. Trekk referanse scan, dvs. buffer, fra prøven skanningen.
    MERK: Se subtraksjon utføres automatisk av nyere modeller av DSC instrumenter.
  2. Skriv inn prøvekonsentrasjon verdi hvis det ble utelatt i henhold til punkt 3.1.
  3. Monter og trekk fra baseline av den kjøpte termo å ta hensyn til forskjeller i varmekapasitet av de brettes og utfoldet tilstander av proteinet som er forårsaket av eksponering av hydrofobe grupper til vann på utfoldelse. Lineær eller kubisk kurvetilpasning kan anvendes, avhengig av formen på DSC-profilen for prøven. For konsistens, har den samme type av montering som skal brukes under en undersøkelse, f.eks sanntid stabilitetsstudie. Dette trinnet er nødvendig for å behandle kurven for toppintegrering for å oppnå entalpi av overgangen.
  4. Utfør peak integrasjon ved hjelp av ikke-lineær minste kvadrat passer. Basert på produktetkunnskap gjelder to-stats eller ikke-to-statsmodellen. To-state modellen kan brukes for enkeltsamarbeids termiske overganger, og for ukjente proteiner, gjelder ikke-to state modellen inntil videre produktkunnskap er tilgjengelig. Hvis det er aktuelt, kan du justere kurvetilpasning ved hjelp av iterative kurvetilpasningsfunksjon av utstyret programvare til Chi-kvadrat verdi forblir konstant.
  5. Resultatene viser verdiene for midtpunktet av overgangstemperaturer (Tm), kalorimetrisk entalpi (AH) og van't Hoff entalpi (AH VH) av prøven.

Representative Results

Rådata fra de fleste DSC eksperimenter er presentert som en varmestrøm versus temperatur graf, som kalorimeteret faktisk måler forskjellen i graden av varmestrømmen inn i prøveoppløsningen og buffer 35. Derfor, hvis begge cellene (dvs. prøve- og referanseceller) inneholder identiske løsninger under et eksperiment, rådata fra skanningen skal være en flat linje med ingen observerbare topper. Enhver topp observert kan tilskrives instrumentering feil (f.eks skadet eller forurenset celler), og det er derfor kjører buffer skanninger før prøveanalysen er et tilfredsstillende system egnethetstest. Figur 1 viser resultatet av en typisk buffer skanning indikerer at kalori var i god stand før prøveanalyse.

Figur 2 viser den rå data for en DSC eksperiment utført på different masse to proteinprøver. Som antydet tidligere, de observerte topper er forskjellene i varme- fluksen av prøvene og deres respektive buffere. Forskjeller i prøvekonsentrasjon kan forårsake variasjoner i varmekapasitet registrert av kalori; Men disse variasjonene er normalisert i løpet av prøveanalyse som angitt i del 4.2 i prosedyren. Høyere konsentrasjoner kan også avsløre flere termodynamiske domener ikke bidra til overgangen ved lavere konsentrasjoner. I tillegg representerer hver overgang en termodynamisk domene som kan omfatte en eller flere strukturelle domener av protein 36. I dette tilfellet, Protein 1 har tre strukturelle domener som smelter i fellesskap.

Figur 3 viser resultatene som genereres fra analysen av de rå data for protein 1 og 2 er presentert i figur 2, dvs. etter grunnlinjen subtraksjon og iterativ kurve fitte opp. De resulterende termogrammene er normalisert for skanning rate (utført automatisk ut av en pre-set algoritmen i analysen programvare) og konsentrasjon; således, å presentere resultatene fra forsøket i sammenlignbare varmekapasitet sammenlignet med temperaturgrafer. Analysen programvaren bruker data fra varmekapasitet i forhold til temperaturgrafer, for eksempel T m og ΔCp, for å utlede andre termodynamiske parametere bruker varianter av ligningene gitt ovenfor, avhengig av cooperativity av protein utfoldelse.

Når du skal teste ukjente prøver, sette den aktuelle temperaturområdet er avgjørende. Ellers kan ufullstendige termogrammer medføre, som vist i figur 4. Selv om T m fra slike profiler kan avledes, AH = kan ikke bestemmes nøyaktig. Derfor må prøven testes på nytt med et større temperaturområde for fullstendig å fange opp den termiske overgangen. Noen proteiner også readily danner aggregater etter fullstendig denaturering, noe som resulterer i en økende post-overgang varmekapasitet: dette ofte fremkommer som en ufullstendig termogram som vist i figur 2B. Imidlertid retesting med en høyere sluttemperatur kan bidra til å bekrefte hvorvidt der er en forekomst av en konformasjonell overgangs på dette område av termogrammet, eller det er bare det varmeabsorberende virkning av proteinaggregater.

Termisk stabilitet er en av de mest betydningsfulle fysikalske egenskaper av proteiner og proteinbaserte produkter i industrien 37. I legemidler, er det brukt for å bestemme stabiliteten av biologiske under forskjellige forhold, blant annet formuleringsbuffere og miljømessige faktorer slik som fuktighet og temperatur. Det er også brukes til å overvåke nøkkel fremstillingstrinn (for eksempel rensing og avgiftning) for å sikre konformasjonell overensstemmelse mellom produksjonspartier. > Figurene 5 og 6 illustrerer bruken av DSC for å undersøke effekten av kjemiske avgiftning og lagringsbetingelser henholdsvis på stabilitet og strukturell konformasjon av to forskjellige proteiner. De betydelige forskjeller i Tm og AH indikere konformasjonsendringer og protein degradering hhv. I tillegg er tapet av det tredje overgang i Figur 6 illustrerer ytterligere nedbrytning av et domene som ble bekreftet ved en nedgang i molekylvekt når prøvene ble analysert ved hjelp av Size-Exclusion Chromatography med multi-vinkel-lysspredning (SEC-MALS) ( data ikke vist).

Figur 1
Figur 1: Buffer Scans. Likheten i gradient av hver skanning uten observerbare topper indikerer at instrumentet er i god stand og genererte reproduserbare resultater.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: materialet som ble samlet fra DSC eksperimenter. Disse grafene er gode representasjoner av unanalyzed (rå) data ervervet etter eksperimentelle kjøringer (dvs. før baseline subtraksjon og kurvetilpasning). Hver linje representerer et produksjonsparti. Protein 2 har en tendens til å aggregere lettere ved oppvarming, noe som resulterer i en økning av varmekapasiteten over 100 ° C i den post-overgangsområdet av termogrammet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Analyserte DSC data. Disse grafene er gode representasjoner av analyserte DSC data (dvs. etter baseline subtraksjon og kurvetilpasning). Den blå linjen representerer den termo etter baseline subtraksjon, mens den røde linjen representerer kurven med den beste passform til termo. (A) T m og AH for Protein 1 Prøve nr 12 er 80,16 ° C og 1,69 x 10 6 cal / mol hhv. (B) T m og AH for Protein 1 Prøve nr 13 er 80,15 ° C og 1,71 x 10 6 cal / mol hhv. (C) T m og AH for Protein 2 Prøve nr 21 er 75,01 ° C og 4,08 x 10 6 cal / mol hhv. (D) T m og AH for Protein 2 Prøve nr 22 er 75,67 ° C og 4,22 x 10 6 cal / mol hhv. Klikk her for åse en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: En Ufullstendig termogram. Rådata samle for Protein en analysert ved et utilstrekkelig temperaturområde. Den endelige temperatur eksperiment ble satt til 90 ° C som ikke huse hele overgangsprofil av proteinet i forhold til eksperimentet for figur 2A som ble satt til 120 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: analysert data som viser effekten av kjemisk Avrusning på tertiære strukturen Protein 1. (A) Protein 1 er en gift i det opprinnelige konformasjon og has sin T m på 56,84 ° C og AH på 2,57 x 10 5 cal / mol. (B) Den detoksifisert form av protein 1 (dvs. toksoid) har T m og AH verdier på 81,01 ° C og 1,89 x 10 6 cal / mol hhv. Således kan det konkluderes med at den avgiftning trinnet innføres en form for variasjon til den strukturelle konformasjon av protein 1 som gir større stabilitet (høyere T m) til sin detoksifisert form. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: analysert data som viser virkningen av lagring forhold på konformasjonen til Protein 3. Disse diagrammene illustrerer effekten av lagringstemperatur (2 - 8 ° C) på stabiliteten og tertiære struktur av Pro-tein tre over 30 uker. T m og AH verdier for Protein 3 ved 8. (A) og 38 th uke (B) for lagring er gitt i tabell 1 nedenfor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Prøve Tm 1 (° C) AH 1 (cal / mol) Tm 2 (° C) AH 2 (cal / mol) Tm 3 (° C) AH 3 (cal / mol)
Protein 3 oppbevares ved 2-8 ° C i 8 uker 61.91 1,71 x 10 5 75.54 2,17 x 10 5 90,29 4,17 x 10 5
61.87 1,66 x 10 5 75,18 1,46 x 10 5 90.22 5,76 x 10 5

Tabell 1: Tm og AH Verdier for Protein tre på 8 th og 38 th Week lagring ved 2-8 ° C. Selv om T m verdier ved begge tidspunkter er like, angir forskjellen i AH verdier som den tertiære strukturen av Protein 3 er degradert i løpet av 30 uker etter den angitte lagringstilstand.

Discussion

Denne prosedyren har blitt innlemmet i ulike karaktertest pakker, inkludert stabilitet og produkt sammenlignbar studier 21. I sanntid stabilitetsstudier, blir DSC brukes til å overvåke T m, samt beregne en F av biologiske over tid for å bestemme deres holdbarhet. Med hensyn til produktet sammenlignbarhet, er det brukt for å vurdere effekten av prosessen og anlegget endring samt effekten av sentrale produksjonstrinn på den strukturelle konformasjon av produserte massevis. Dette innebærer vanligvis direkte sammenligning av AH av produsert mye til et referanseprodukt som har blitt utpekt som det ideelle produktet. I tillegg har DSC vist seg å være et nyttig analytisk verktøy for produktet formuleringsstudier 37. T m av en protein i forskjellige buffere og ved forskjellige konsentrasjoner kan brukes til å bestemme den formulering som proffers den mest stabilitet overforproteinet.

For å sikre påliteligheten av denne metoden, og objektivitet av sine resultater, er det viktig å holde testparametere konsistent fra gang til gang innen samme studie (f.eks vaksineformulering studien). Imidlertid kan fremgangsmåten bli endret for å tilpasse forskjellene i de fysikalske egenskapene til forskjellige proteiner. Et eksempel på en modifikasjon som kan foretas er å endre skannehastighet av eksperimentet 38, 39. Proteiner som var tilbøyelige til å danne aggregater når de oppvarmes ble undersøkt på en raskere skannehastighet (for eksempel 120 ° C / t) for å unngå bidraget av aggregater til den termiske overgangsprofil samt tilstopping kapillærene i kalorimeteret. Det er verdt å merke seg at skanning hastighet kan påvirke utfallet av en DSC eksperiment 38. Utvidelse av den termiske overgangen peak har blitt observert med økende skanning priser på noen proproteiner; men forble T m nokså konstant 38. Videre dialyse og avgassing trinnene for prøveopparbeidelse er også svært viktig for nøyaktige resultater 31. Dialyse sikrer at den eneste forskjell i sammensetningen av prøven og bufferen er protein; således kan alt overskuddsvarmen absorberes av prøven tilbakeføres til varmekapasiteten av proteinet. Avgassing sikrer nøyaktig volumanalyse, som ekstrapolering av den termodynamiske parameter forutsetter at utfoldelsen hendelsen skjer under konstant volum og trykk 31. Den konstante press del av forutsetningen som står for nitrogen trykk av systemet som angitt i del 1.1 av prosedyren.

I forhold til andre fremgangsmåter for å bestemme stabiliteten av protein konformasjoner som Sirkulær dikroisme (CD) og fluorescens-spektros, byr DSC en rekke fordeler i en comkommersiell setting med kostnads- og tidsbesparelser. For det første, den adiabatiske utforming av et differensial-kalorimeter tillater måling av termisk stabilitet med bedre temperatur nøyaktighet sammenlignet med målinger med instrumentering for CD og fluorescens-spektros 6. For det andre, i motsetning CD, er nøyaktigheten av DSC data ikke er avhengig av spiralformethet av proteinet 39, 40; men gir CD ytterligere informasjon om utfoldelsen av den sekundære struktur, som vil være gratis til DSC 41. I tillegg er trykksettingen av DSC-systemet gjør det mulig for testing med et bredt temperaturområde uten koking prøven; således kan et stort utvalg av proteiner bli testet ved DSC.

Mens DSC er en relativt rask og enkel måte for å bestemme den termiske stabilitet av biologiske, er det ikke uten begrensninger. Først, baselinjen subtraksjon skritt introduserer noen form for menneskelig inkonsekvens inn rådata analyse; således, vil variasjoner i resultatene observeres mellom forskjellige brukere. Sekund, differensial skanning kalori har minimum konsentrasjonsgrenser som kan være vanskelig å få til på bulk produksjon skala. For det tredje, AH for irreversibel termisk denaturering er ikke absolutte; som innebærer at avledet ΔG (en indikator for proteinstabilitet) i lignende situasjoner kan være misvisende. Videre er den metode som fungerer best for rensede prøver. Tilstedeværelsen av urenheter kan enten føre til en forskyvning i T m hvis det er en interaksjon med proteinet som undersøkes, eller fremkomst av nye termiske overganger hvis det ikke er noen interaksjon. I alle fall disse ekstra egenskaper på de termo kan feilaktig tilskrives prøver, og dermed påvirker tolkningen av resultatene. Til tross for disse begrensningene, forblir DSC en pålitelig metode som kan gi detaljert termodynamisk informasjon om the protein utbrettingsprosessen hvis implementert riktig 42.

I konklusjonen, DSC gir betydelig fordel som en konformasjonsendring avlesning verktøy for vaksineprodukter og deres mellomprodukter. De to parametere, T m og AH, innsamlet for en matrise av partier av samme produkt kan bli en empirisk grunnlinjen som kan brukes til å undersøke virkningen av prosessendringer, formulering, og lagringsbetingelser på den tertiære strukturen og stabiliteten av protein og virale antigener 21, 43.

Disclosures

Alle forfatterne er ansatte ved Sanofi Pasteur. Arbeidet ble finansiert av Sanofi Pasteur, og publiserings avgifter for denne video-artikkelen ble betalt av Sanofi Pasteur. Forfatterne har ingen relevante bevisninger eller økonomiske engasjement i enhver organisasjon eller enhet som har en økonomisk konflikt med emnet eller materiale diskutert i manuskriptet. Disse inkluderer sysselsetting, konsulentselskaper, lager eierskap eller alternativer, eller royalties.

Ingen skriftlig bistand ble brukt i produksjonen av dette manuskriptet.

Acknowledgments

Forfatterne er svært takknemlig til Joseph Mancini (tidligere med GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments begrenset) for sin rolle i installasjon og opplæring på kalorimeter, Sasmit Deshmukh og Webster Magcalas for sine diskusjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Differential Scanning Calorimeter Malvern Instruments Ltd 28428948 (Via GE Healthcare) Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100 Decon Laboratories Inc 1504 Dilute with water to 20% before use
500 µL Polypropylene round bottom 96 well plate Canadian Life Science ML072100 Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac  Malvern Instruments Ltd N/Ap provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet  Labconco Logic+ - A2 biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette Thermo Scientific 66810 or 66380 to equilibrate the sample and buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience. J. Biomol. Tech. 21, (4), 167-193 (2010).
  2. Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. Watson, E. S., O'Neil, M. J. US3263484A 02 August (1966).
  3. O'Neill, M. J. The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter. Anal. Chem. 36, (7), 1238-1245 (1964).
  4. O'Neil, M. J. Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry. Anal. Chem. 38, (10), 1331-1336 (1966).
  5. Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).
  6. Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).
  7. Andronikashvili, E. L., et al. Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor. Dokl. Akad. Nauk. 183, (1), (In Russian) 212-214 (1968).
  8. Andronikashvili, E. L., et al. Conformational Changes of Biopolymers in Solution. Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).
  9. Andronikashvili, E. L. Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures. Biofizika. 32, (5), (In Russian) 782-799 (1987).
  10. Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. Biochemistry. 18, (7), 1180-1186 (1979).
  11. Sturtevant, J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 74, (6), 2236-2240 (1977).
  12. Sturtevant, J. M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).
  13. Jackson, W. M., Brandts, J. F. Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation. Biochem. 9, (11), 2294-2301 (1970).
  14. Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin. Biopolymers. 10, (10), 1865-1890 (1971).
  15. Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol. 86, (3), 665-684 (1974).
  16. Privalov, P. L., Potekhin, S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).
  17. Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).
  18. Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations. Biochem. Mol. Biol. Int. 35, (6), 1233-1243 (1995).
  19. Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).
  20. Oreshkin, E. F., et al. Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating. Meat Science. 16, (4), 297-305 (1986).
  21. Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens. Pharm. Bioprocess. 2, (6), 491-498 (2014).
  22. Jiskoot, W., Daan, C. Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, Springer Science & Business Media. (2005).
  23. Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. A new ultrasensitive scanning calorimeter. Anal. Biochem. 250, (2), 237-244 (1997).
  24. Plotnikov, V. V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev. Technol. 1, (1), 83-90 (2002).
  25. Freire, E. Differential scanning calorimetry. Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).
  26. Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).
  27. Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor. Biochemistry. 34, (16), 5309-5316 (1995).
  28. Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. The conformational equilibrium of human growth hormone. J. Mol. Biol. 277, (2), 409-418 (1998).
  29. Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states. Biochem Edu. 22, (4), 210-211 (1994).
  30. Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).
  31. Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU). Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4, (1), 47-50 (2015).
  32. Stability testing of new drug substances and products. Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1, (2), current step. 4 (2003).
  33. Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22, (1), 366-383 (1883).
  34. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, (1), 265-275 (1951).
  35. HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. Differential Scanning Calorimetry. Springer Science & Business Media. (2003).
  36. Porter, L. L., George, D. R. A thermodynamic definition of protein domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (24), 9420-9425 (2012).
  37. Frokjaer, S., Daniel, E. O. Protein drug stability: a formulation challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).
  38. Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).
  39. Chiu, M. H., Elmar, J. P. Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions. J. Pharm. Bioallied Sci. 3, (1), 39-59 (2011).
  40. Hirst, J. D., Charles, L. B. Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins. J. Mol. Biol. 243, (2), 173-178 (1994).
  41. Kirkitadze, M. D., et al. Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact. Biochem. J. 344, (1), 167-175 (1999).
  42. Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics. Drug disc today. 18, (19), 1007-1013 (2013).
  43. Wen, J., et al. Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC. J. Pharm. Sci. 101, (3), 955-964 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics