अगली पीढ़ी Electroporation द्वारा प्राथमिक मानव Th17 कोशिकाओं में छोटे आरएनए अभिकर्मक

Published 4/13/2017
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Immunology and Infection

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Summary

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Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

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Abstract

Introduction

सीडी 4+ टी कोशिकाओं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के महत्वपूर्ण वाद्यवृंदकार हैं। भोली सीडी 4+ टी कोशिकाओं कई अलग अलग effector टी कोशिकाओं (जैसे Th1, Th2, Th17, आदि) के रूप में विकसित करने में सक्षम हैं, विशेषता साइटोकिन्स और प्रतिलेखन कारक, स्थानीय सूक्ष्म पर्यावरण 1 पर निर्भर करता है की अपनी सेट के साथ प्रत्येक। वंश निर्णय है कि टी कोशिकाओं बनाने के दोनों सुरक्षात्मक उन्मुक्ति और स्वयं की सहिष्णुता के लिए महत्वपूर्ण हैं। Th17 कोशिकाओं टी कोशिकी बैक्टीरिया और कवक मुकाबला करने के लिए जाना जाता है कोशिकाओं में से एक सबसेट हैं, लेकिन उनके अनुचित प्रतिक्रियाएं भी इस तरह के मल्टिपल स्क्लेरोसिस और सोरायसिस 2, 3 के रूप में कई स्व-प्रतिरक्षित और भड़काऊ रोगों के रोगजनन में फंसा रहे हैं। मानव Th17 कोशिकाओं उन्हें एक उचित ध्रुवीकरण पर्यावरण 4 के साथ उपलब्ध कराने के द्वारा इन विट्रो में भोली सीडी 4+ टी कोशिकाओं से उत्पन्न किया जा सकता है। Vario हमें साइटोकिन्स के संयोजन आईएल 1β, आईएल 23, TGFβ और आईएल -6 मानव Th17 कोशिकाओं के विकास के लिए इस्तेमाल किया गया है। मानव Th17 कोशिकाओं CCR6, एक केमोकाइन रिसेप्टर कि है आमतौर पर और इस सेल आबादी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल उनके प्रिंसिपल प्रतिलेखन कारक, RORγt (RORC द्वारा इनकोडिंग) 5, 6 की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित कर रहे व्यक्त करते हैं। Th17 कोशिकाओं कई साइटोकिन्स व्यक्त करने की क्षमता है, लेकिन आईएल 17A वंश को परिभाषित प्रेरक साइटोकाइन इन कोशिकाओं द्वारा निर्मित है। हम अपने मानव Th17 इन विट्रो भेदभाव परख की मजबूती का आकलन करने के सभी तीन Th17 जुड़े मार्कर (CCR6, RORγt, आईएल 17 ए) की अभिव्यक्ति की जांच की। इसके अतिरिक्त, हम गैर ध्रुवीकरण की स्थिति है, जहां कोई साइटोकिन्स या अवरुद्ध एंटीबॉडी संस्कृति मीडिया में जोड़ा गया था एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए के बाद से इन Th17 मार्करों की अभिव्यक्ति बहुत कम या अनुपस्थित होना चाहिए के तहत मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं संवर्धित किया।

ve_content "> सामान्य मानव टी सेल विकास और जीव विज्ञान का अध्ययन करने के एक तरीका यह उनके विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए है। लघु दखल शाही सेना (siRNA) सिंथेटिक छोटे आरएनए अणुओं है कि प्रोटीन-कोडिंग mRNAs लक्षित करते हैं और विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति को कम करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । MicroRNAs (miRNAs) अंतर्जात गैर-कोडिंग छोटे जीन अभिव्यक्ति व्यवस्थित करने के लिए बाद transcriptionally जाना जाता RNAs हैं। miRNAs, दोनों murine और मानव टी कोशिका जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है Th17 कोशिकाओं 7, 8, 9 में भी शामिल है। यह जीन अभिव्यक्ति पर और अंत में मानव टी कोशिका जीव विज्ञान पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए मानव टी कोशिकाओं में छोटे आरएनए गतिविधि से छेड़छाड़ के विश्वसनीय तरीकों के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम एक आसान से उपयोग सुसंगत और विश्वसनीय प्रोटोकॉल है कि हम शुरू करने के लिए विकसित किया वर्णन छोटे सिंथेटिक आरएनए और बंद न्यूक्लिक एसिड (LNAs, रासायनिक स्थिरता के साथ न्यूक्लिक एसिड संशोधित)प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, और विशेष रूप से मानव Th17 कोशिकाओं में।

वहाँ स्तनधारी कोशिकाओं है, जो आम तौर पर, रासायनिक, जैविक, या शारीरिक श्रेणियों 10 में गिर में छोटे RNAs शुरू करने के कई विकल्प तरीके हैं। लिपिड आधारित transfections और कैल्शियम फॉस्फेट transfections सहित आमतौर पर इस्तेमाल किया रासायनिक विधियों, रासायनिक डीएनए परिसरों कि और अधिक कुशलता से कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है बनाने पर भरोसा करते हैं। सामान्य तौर पर, रासायनिक विधियों प्राथमिक टी कोशिकाओं की अभिकर्मक के लिए के रूप में कुशल नहीं हैं। सबसे आम जैविक विधि एक वायरल वेक्टर (जैसे रेट्रोवायरस या lentivirus) है, जो सीधे अपनी प्राकृतिक प्रतिकृति चक्र के एक भाग के रूप में एक मेजबान में विदेशी शाही सेना सम्मिलित करता है उपयोग करने के लिए है। वायरल पारगमन आम तौर पर पूरा करने के लिए समय लेता है, खासकर जब एक proviral प्लास्मिड की आणविक क्लोनिंग के लिए समय प्रभावित होती है। साथ ही, वायरल पारगमन वैक्टर संभावित मानव शोधकर्ताओं के लिए हानिकारक हो सकता है। इलेक्ट्रोपोरेशन एक भौतिक मीटर हैउच्च वोल्टेज दालों के लिए कोशिकाओं विषय, न्यूक्लिक एसिड क्षणिक सेल, जहां वे अपने लक्ष्य पर काम कर सकता है में प्रवेश करने की अनुमति देकर झिल्ली permeabilization उत्प्रेरण की ethod। पारंपरिक इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरणों प्राथमिक लिम्फोसाइटों परासंक्रमित के लिए प्रभावी नहीं थे। हालांकि, अनुकूलित अगली पीढ़ी इलेक्ट्रोपोरेशन, बहुत उच्च दक्षता पर टी कोशिकाओं परासंक्रमित करने में सक्षम होने के लिए विशेष रूप से जब सामग्री ट्रांसफ़ेक्ट किया जा करने के लिए छोटे आरएनए है साबित कर दी है। अवधि अगली पीढ़ी शिथिल पारंपरिक इलेक्ट्रोपोरेशन मशीनों से दो नए प्लेटफॉर्म (जैसे, नियॉन, Amaxa) अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। साथ ही, इस विधि एक प्रयोग में लगभग 120 छोटे RNAs, अप करने के लिए अक्सर मान्य सिंथेटिक अभिकर्मकों उपयोग करने के साथ मध्यम throughput स्क्रीन के लिए आसानी से स्केलेबल है। महत्वपूर्ण रूप से, सफल transfections में टी सेल सक्रियण के बाद एच के रूप में छोटे रूप में 16 प्राप्त किया जा सकता। इस विधि का नुकसान यह है कि यह स्थिर जीनोमिक incorporati भी नहीं होती हैपर, और इसलिए क्षणिक है। इसलिए, यह एक स्थिर अभिव्यक्ति निर्माण कि एक वायरल वेक्टर में पैक किया जा सकता है और सफलतापूर्वक मामलों में जहां एक छोटे से शाही सेना की लंबी अवधि के एक्सप्रेशन की आवश्यकता होगी में टी कोशिकाओं में व्यक्त बनाने के लिए अतिरिक्त प्रयास के लायक है।

हम विभिन्न प्रयोजनों के 11, 12, 13 के लिए विविध सिंथेटिक एकल या डबल असहाय शाही सेना या LNA oligonucleotide उपकरण वितरित करने के लिए एक अगली पीढ़ी अभिकर्मक (जैसे, नियॉन) का इस्तेमाल किया है। कुशल आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग कर दोहरे धागे कम दखल शाही सेना (siRNA) प्राथमिक माउस और मानव टी कोशिकाओं में प्रेरित किया जा सकता। यह प्रोटोकॉल मानव Th17 कोशिकाओं में इस तकनीक का इस्तेमाल के लिए अनुकूलित की स्थिति का वर्णन है। siRNAs के अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिंथेटिक miRNA की नकल करता है और अवरोधकों miRNA लाभ और समारोह के नुकसान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। miRNA की नकल करता है बहुत siRNAs के समान दोहरे धागे आरएनए अणुओं रहे हैं, लेकिन तैयार बनाया गयाअंतर्जात परिपक्व miRNAs के अनुक्रम के साथ डी। miRNA अवरोधकों रासायनिक संशोधित कर रहे हैं शाही सेना और / या LNA आधारित एकल असहाय ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स कि देशी miRNAs के लिए बाध्य और उनके कार्य के विरोध। हमने पाया है कि इन उपकरणों के सभी सहित सुसंस्कृत प्राथमिक टी लिम्फोसाइट्स में प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन मानव Th17 कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल मानव अनुसंधान आचार-संहिता के लिए UCSF के दिशा निर्देशों का पालन करता है।

1. टी सेल संस्कृति, सीडी 4+ टी कोशिकाओं के अलगाव, और Th17 ध्रुवीकरण की तैयारी

  1. 0 दिवस पर, कोट 6-अच्छी तरह से विरोधी मानव CD3 (2 माइक्रोग्राम / एमएल) और विरोधी मानव CD28 की अच्छी तरह से प्रति 1.5 एमएल के साथ टिशू कल्चर प्लेट (4 माइक्रोग्राम / एमएल) में कम से कम 2 घंटे के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पीबीएस में 37 डिग्री सेल्सियस।
    1. वैकल्पिक रूप से, कोट रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें। parafilm में लपेटें प्लेटें।
  2. गर्भनाल रक्त कोशिकाओं mononuclear (CBMCs) निर्माता के निर्देशों के अनुसार घनत्व ढाल centrifugation द्वारा तैयार करें।
    चेतावनी: ध्यान से काम करते हैं और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) सुनिश्चित पहना जाता है जब मानव रक्त से निपटने रक्त जनित रोगज़नक़ों के लिए जोखिम के किसी भी जोखिम से बचने के लिए।
  3. एक बार जब mononuclear कोशिकाओं को अलग किया गया है और धोया, नकारात्मक Sele से मानव CD4 + T कोशिकाओं अलगाव प्रदर्शनction एक वाणिज्यिक मानव CD4 + T कोशिकाओं किट का उपयोग।
    नोट: यदि mononuclear सेल अलगाव के बाद लाल रक्त कोशिका संदूषण है, एक वैकल्पिक लाल रक्त सेल CD4 + T कोशिकाओं अलगाव चरणों करने से पहले किया जा सकता है। अलगाव बफर (पीबीएस में 2% एफबीएस) का 1 एमएल में कोशिकाओं mononuclear Resuspend। 1x lysing समाधान के 5 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। फिर अलगाव बफर और अपकेंद्रित्र 5 एमएल गोली कोशिकाओं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर जोड़ें।
    1. एक नया 5 एमएल ट्यूब में अलगाव बफर में 50 x 10 6 के एक घनत्व प्रति 500 μL में कोशिकाओं mononuclear Resuspend।
    2. एफबीएस के 100 μL और एंटीबॉडी मिक्स प्रति ट्यूब तो एक कक्षीय शेकर पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक ट्यूब सेते हैं अच्छी तरह से मिश्रण करने के 100 μL जोड़ें।
    3. ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को धोने के लिए अलगाव बफर के 3-4 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं गोली कोशिकाओं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। ध्यान से supe aspiraternatant।
    4. इस स्पिन के दौरान, चुंबकीय मोती पूर्व धोने। एक नया ट्यूब (1 प्रयोग किया है: कोशिकाओं के साथ 1) में चुंबकीय मोतियों की इच्छित मात्रा स्थानांतरण और मोती धोने के लिए अलगाव बफर की एक समान मात्रा में जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं 1 मिलीलीटर micropipette का उपयोग कर और फिर कम से कम 1 मिनट के लिए चुंबक में ट्यूब जगह। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate। उसी मात्रा शुरू में धोने से पहले हस्तांतरित में चुंबकीय मोती Resuspend।
    5. अलगाव बफर के 500 μL के साथ प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं Resuspend और पूर्व धोये चुंबकीय मोतियों के 500 μL जोड़ें।
    6. अच्छी तरह से मिश्रण करने कमरे के तापमान (18 डिग्री सेल्सियस 25 डिग्री सेल्सियस तक) पर एक कक्षीय शेकर पर 15 मिनट के लिए चुंबकीय मोतियों के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
    7. ऊष्मायन के बाद, अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर micropipette कम से कम 10 बार का उपयोग कर कोशिकाओं pipet। फिर अलगाव बफर के 3-4 एमएल जोड़ें और 2 मिनट के लिए चुंबक में प्रत्येक ट्यूब जगह।
    8. ध्यान से नकारात्मक चयनित सीडी 4+ टी कोशिकाओं है कि में हैं हस्तांतरणएक नया ट्यूब सतह पर तैरनेवाला।
  4. CD4 + T कोशिकाओं अलगाव पूरा होने के बाद, एक hemocytometer साथ कोशिकाओं की गिनती और बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
  5. एंटीबॉडी में लिपटे प्लेटों पीबीएस के साथ दो बार धोएं। फिर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1.5 2x की एमएल Th17-ध्रुवीकरण मीडिया के मिश्रण जोड़ें: विरोधी मानव IFNγ (20 माइक्रोग्राम / एमएल), विरोधी मानव आईएल 4 (20 माइक्रोग्राम / एमएल), मानव TGFβ (10 एनजी / एमएल), मानव आईएल 1β (40 एनजी / एमएल), मानव आईएल 23 (40 एनजी / एमएल), मानव आईएल -6 (50 एनजी / एमएल) सभी एक सीरम मुक्त आधार मीडिया (2 मिमी एल glutamine के साथ पूरक में पतला, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट और 100 माइक्रोन 2-mercaptoethanol)।
    नोट: अभिकर्मक और आरएनए हस्तक्षेप सीरम युक्त मीडिया में काम करता है। इस प्रोटोकॉल के साथ सीरम मुक्त मीडिया का उपयोग करने का उद्देश्य बेहतर आईएल 17A उत्पादन प्राप्त करने के लिए है।
  6. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं गोली कोशिकाओं के लिए। ध्यान से supernat aspirateचींटी। फिर सीरम मुक्त आधार मीडिया में कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से इतना है कि अंतिम मात्रा में अच्छी तरह से प्रति 3 एमएल और ध्रुवीकरण साइटोकिन्स एक 1x अंतिम एकाग्रता पर अब कर रहे हैं 1.5 एमएल में 3 x 10 6 के एक घनत्व में कोशिकाओं resuspend और थाली।
    1. 5% में प्लेटें प्लेस सीओ 2, 37 दो दिनों के लिए डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर।

2. इन विट्रो के electroporation ध्रुवीकृत मानव Th17 प्रकोष्ठों

  1. दिन 2 पर, कोट 48-अच्छी तरह से विरोधी मानव CD3 (2 माइक्रोग्राम / एमएल) और विरोधी मानव CD28 की अच्छी तरह से प्रति 250 μL के साथ टिशू कल्चर प्लेट (4 माइक्रोग्राम / एमएल) में कम से कम 2 घंटे के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पीबीएस में 37 डिग्री सेल्सियस।
    1. वैकल्पिक रूप से, कोट रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें। parafilm में लपेटें प्लेटें।
  2. अभिकर्मक के लिए छोटे RNAs तैयार करें। प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, विभाज्य 1 एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में siRNA के एक 5 माइक्रोन स्टॉक समाधान के μL। उचित रसायन शास्त्र से मिलान किए गए छोटे आरएनए contr शामिल करेंol। बर्फ पर सभी ट्यूबों रखें।
  3. एंटीबॉडी में लिपटे प्लेटों पीबीएस के साथ दो बार धोएं। विरोधी मानव IFNγ (10 माइक्रोग्राम / एमएल), विरोधी मानव आईएल 4 (10 माइक्रोग्राम / एमएल), मानव TGFβ (5 एनजी / एमएल), मानव IL-: फिर 500 प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1X Th17-ध्रुवीकरण मीडिया के μL जोड़ने 1β (20 एनजी / एमएल), मानव आईएल 23 (20 एनजी / एमएल), मानव आईएल -6 (25 एनजी / एमएल) सभी एक सीरम मुक्त आधार मीडिया (2 मिमी एल glutamine, 100 यू के साथ पूरक में पतला / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट और 100 माइक्रोन 2-mercaptoethanol)।
  4. बाद संस्कृति प्लेटें और अभिकर्मक अभिकर्मकों तैयार कर रहे हैं, 1 मिलीलीटर micropipette, pipetting के साथ कोशिकाओं धीरे लेकिन यह सुनिश्चित करना कि सभी कोशिकाओं कुओं के नीचे से अलग कर रहे हैं फिर से निलंबित। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर एक शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं पूल।
    नोट: इस के साथ साथ प्रस्तुत चार दिवसीय प्रोटोकॉल से अधिक समय संस्कृति अवधि के लिए, कोशिकाओं लगभग हर 3 दिन इसी प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना चाहिए। चरण 2.4 हालांकि संशोधित किया जाना चाहिए के बाद से विभिन्न छोटे RNAs के साथ इलाज किया कोशिकाओं जमा नहीं किया जाना चाहिए। स्थिति परीक्षण किया जा रहा सब के सब, एकत्र किया जाना चाहिए गिना, और अलग से ट्रांसफ़ेक्ट।
  5. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate, और फिर पीबीएस के कम से कम 1 एमएल धोने के लिए में कोशिकाओं resuspend। और उसके बाद एक microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण (एक hemocytometer Trypan ब्लू बहिष्करण का उपयोग करने व्यवहार्यता का आकलन करने के साथ जैसे) गणना लाइव Th17 कोशिकाओं।
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं के लिए।
  7. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate, और उसके बाद प्रति मिली 2.5-4 x 10 7 कोशिकाओं की एक घनत्व पर अभिकर्मक प्रणाली 10 μL किट से प्रदान की मेजबान बफर का उपयोग कर कोशिकाओं resuspend। कमरे के तापमान पर कोशिकाओं रखें।
    नोट: एक दिशानिर्देश के रूप में, के रूप में 30 मिनट के भीतर ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है के रूप में ही कई कोशिकाओं को तैयार करने का प्रयास करें। एकाधिक बैचों तुलना की जा सकती।
  8. प्रत्येक MicroC में छोटे आरएनए के 1 μL के लिए कोशिकाओं के 9 μL जोड़ेंentrifuge ट्यूब। Pipet एक बार कोशिकाओं और अभिकर्मक के लिए छोटे RNAs मिश्रण तो प्रदान की पिपेट इलेक्ट्रोड टिप में लोड।
    नोट: आमतौर पर, यह सुनिश्चित करने के मिश्रण के लिए पर्याप्त pipet इलेक्ट्रोड टिप अभिकर्मक से पहले में बुलबुले बनाने को रोकने के लिए है कोशिका निलंबन की 9.5 μL जोड़ें।
  9. के कमरे के तापमान विद्युत्-बफर ई प्लेस 3 एमएल पिपेट स्टेशन के अंदर क्युवेट के साथ प्रदान की क्युवेट भरें और फिर क्युवेट अंदर स्थिति में पिपेट जगह।
  10. इसके तत्काल बाद कोशिकाओं और छोटे आरएनए निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर के प्रत्येक 10 μL मिश्रण electroporate: पल्स वोल्टेज 1,500-1,550 वी, नाड़ी 10 एमएस चौड़ाई, और 3 दालों अभिकर्मक डिवाइस पर कुल।
  11. इलेक्ट्रोपोरेशन पूर्ण होने पर, सीधे एक संस्कृति थाली के लिए तैयार कुओं में 1X Th17-ध्रुवीकरण मीडिया के 500 μL करने के लिए सेल मिश्रण जोड़ें। एक 5% सीओ 2, दो और दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें प्लेटें।
    नोट: pipetting द्वारा पिपेट इलेक्ट्रोड टिप धोऊपर और नीचे पीबीएस में में प्रत्येक अभिकर्मक के बीच।

3. फसल काटने वाले मानव Th17 प्रकोष्ठों

  1. एक micropipette के साथ संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं Resuspend, धीरे pipetting लेकिन यह सुनिश्चित करना कि सभी कोशिकाओं कुओं के नीचे से अलग कर रहे हैं। कार्यात्मक और / या जीन अभिव्यक्ति assays के लिए कोशिकाओं को तैयार करें।
    नोट: नियमित रूप से, पर्याप्त कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट Th17 कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से सामने आए कर रहे हैं सतह मार्कर और intracellular साइटोकाइन और प्रतिलेखन कारक धुंधला के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए शाही सेना की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा रहा।

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Representative Results

सफलतापूर्वक मानव Th17 कोशिकाओं electroporating का एक विश्वसनीय प्रणाली विकसित करने के लिए पहला कदम इन विट्रो विभेदित मानव Th17 कोशिका संवर्धन में मजबूत उत्पन्न करने के लिए किया गया था। टी कोशिकाओं Th17-ध्रुवीकरण परिस्थितियों में संवर्धित किया केमोकाइन रिसेप्टर CCR6 और प्रतिलेखन कारक RORγt (चित्रा 1 ए, बाएं) व्यक्त किया। इन मार्करों व्यक्त नहीं कर रहे थे जब टी कोशिकाएं गैर ध्रुवीकरण (THN) की शर्तों के तहत संवर्धित किया गया (चित्रा 1 ए, दाएं)। टी कोशिकाओं Th17-ध्रुवीकरण परिस्थितियों में संवर्धित भी restimulation पर आईएल 17A का उत्पादन (चित्रा 1 बी, बाएं) नहीं बल्कि THN परिस्थितियों में (चित्रा 1 बी, दाएं)। Th17 भेदभाव अभी भी छोटे RNAs साथ अभिकर्मक के बाद होता है, लेकिन कुछ प्रयोगों में, वहाँ आईएल 17A उत्पादन की आवृत्ति (चित्रा 1C) में एक कमी प्रेक्षित है। साइटोकाइन उत्पादन पर छोटे आरएनए अभिकर्मक का असर महत्व को दर्शाता हैप्रत्येक प्रयोग के भीतर तुलना के लिए एक रसायन शास्त्र से मिलान किए गए छोटे आरएनए नियंत्रण रखने की हैैं। महत्वपूर्ण रूप से, व्यवहार्यता छोटे RNAs साथ अभिकर्मक के बाद बनाए रखा और आम तौर पर 70% से अधिक (चित्रा 1 डी) है।

इस प्रोटोकॉल की क्षमता का निर्धारण करने के लिए, हम आरएनए हस्तक्षेप का इस्तेमाल किया। CD45 प्रतिजन PTPRC द्वारा एन्कोड किया गया है (प्रोटीन tyrosine फॉस्फेट, रिसेप्टर प्रकार सी) जीन। CD45 सभी hematopoietic कोशिकाओं पर व्यक्त किया जाता है और इसलिए मानव Th17 कोशिकाओं मजबूती के साथ इस सतह मार्कर व्यक्त करना चाहिए। एक siRNA पूल को लक्षित PTPRC के साथ 2 दिन पर मानव Th17 कोशिकाओं के अभिकर्मक दृढ़ता से कम एक रसायन विज्ञान की तुलना में CD45 की अभिव्यक्ति का मिलान नहीं हुआ नियंत्रण siRNA (चित्रा 2A)। CD45 अभिव्यक्ति में यह unimodal आबादी पारी 100% अभिकर्मक दक्षता, छोटे RNAs के लिए इस प्रोटोकॉल के विशिष्ट पास इंगित करता है। इस प्रकार, इस एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि अभिकर्मक eff आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैप्रोटोकॉल अनुकूलन के दौरान iciency। RORC RORγt, मानव Th17 कोशिकाओं का प्रमुख प्रतिलेखन कारक, जो सीधे आईएल 17A उत्पादन को नियंत्रित करता है encodes। RORC के खिलाफ एक siRNA पूल के साथ परासंक्रमित विकासशील मानव Th17 कोशिकाओं दृढ़ता से RORγt अभिव्यक्ति कम उम्मीद के रूप में (चित्रा 2 बी)। कम करना RORγt अभिव्यक्ति आरएनएआई द्वारा एक कार्यात्मक प्रभाव नहीं पड़ा के रूप में इन कोशिकाओं का प्रदर्शन किया आईएल 17A उत्पादन (चित्रा 2C) एक नियंत्रण siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की तुलना में कम कर दिया। गैर-ध्रुवीकृत सीडी 4+ टी कोशिकाओं किसी भी RORγt या आईएल 17A व्यक्त नहीं करना चाहिए और यह आंकड़ा में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में दिखाए जाते हैं।

आकृति 1
चित्र 1: इन विट्रो विभेदित मानव Th17 कोशिकाओं एक्सप्रेस CCR6, RORγt, और आईएल 17A में। गर्भनाल रक्त से अलग मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं unde संवर्धित किया गयाआर Th17 की स्थिति (आईएल 1β, आईएल 23, आईएल -6, और TGFβ) या गैर ध्रुवीकरण (THN) की स्थिति में (मीडिया केवल, कोई ध्रुवीकरण साइटोकिन्स या जोड़ा एंटीबॉडी अवरुद्ध) इन विट्रो में और Th17 मार्कर के लिए 4 दिन का विश्लेषण किया फ्लो द्वारा अभिव्यक्ति: (ए) प्रतिनिधि समोच्च भूखंडों प्रदर्शन सतह CCR6 और intracellular RORγt सीडी 4+ टी कोशिकाओं के सह धुंधला। चतुर्थ भाग में नंबर प्रतिशत CCR6 और / या RORγt पॉजिटिव लाइव सिंग्लेट सीडी 4 + कोशिकाओं से संकेत मिलता है। (बी) पीएमए / ionomycin साथ restimulation के बाद आईएल 17A और IFNγ उत्पादन। चतुर्थ भाग में नंबर प्रतिशत आईएल 17A और / या IFNγ पॉजिटिव लाइव सिंग्लेट सीडी 4 + कोशिकाओं से संकेत मिलता है। (सी) प्रतिनिधि समोच्च साजिश को प्रदर्शित करता है सतह CCR6 और intracellular RORγt सीडी 4+ टी कोशिकाओं के सह धुंधला छोटे आरएनए नियंत्रण के साथ के बाद अभिकर्मक। चतुर्थ भाग में नंबर प्रतिशत CCR6 से संकेत मिलता है और / या RORγt पॉजिटिव लाइव सिंग्लेट सीडी 4 + कोशिकाओं (बाएं)। प्रतिनिधिसक्रिय समोच्च साजिश पीएमए / छोटे आरएनए नियंत्रण के साथ के बाद अभिकर्मक ionomycin साथ restimulation के बाद प्रदर्शित करता है आईएल 17A और IFNγ उत्पादन। चतुर्थ भाग में नंबर से संकेत मिलता है प्रतिशत आईएल 17A और / या IFNγ पॉजिटिव लाइव सिंग्लेट सीडी 4 + कोशिकाओं (दाएं)। (डी) प्रतिनिधि समोच्च साजिश सीडी 4 + कोशिकाओं की व्यवहार्यता छोटे आरएनए नियंत्रण के साथ के बाद अभिकर्मक प्रदर्शित करता है। संख्या प्रतिशत सीडी 4 + लाइव सिंग्लेट कोशिकाओं इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: प्राथमिक मानव Th17 कोशिकाओं में आरएनए हस्तक्षेप। गर्भनाल रक्त Th17 परिस्थितियों में संवर्धित से मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं एक siRNA nontargeting नियंत्रण (siNeg सीटीएल) या लक्ष्यीकरण पूल के खिलाफ के साथ 2 दिन ट्रांसफ़ेक्ट गया PTPRC (सी PTPRC) या RORC (सी RORC) 4 अलग-अलग siRNAs शामिल हैं। (ए) सतह CD45 अभिव्यक्ति सी PTPRC (ग्रे रंग) या siNeg सीटीएल (काला लाइन) के साथ अभिकर्मक के बाद एक प्रतिनिधि हिस्टोग्राम में दिखाया गया है: कोशिकाओं तो cytometry दिन 4 पर प्रवाह द्वारा विश्लेषण किया गया। (बी) इंट्रासेलुलर RORγt अभिव्यक्ति सी RORC (ग्रे रंग) या siNeg सीटीएल (काला लाइन) के साथ अभिकर्मक के बाद एक प्रतिनिधि हिस्टोग्राम में दिखाया गया है। (सी) प्रतिनिधि समोच्च भूखंडों पीएमए / ionomycin (नीचे पैनल) के साथ restimulation के बाद सतह सीडी 4 और intracellular RORγt सीडी 4+ टी कोशिकाओं के सह धुंधला (शीर्ष पैनल) या आईएल 17A और IFNγ उत्पादन प्रदर्शित करते हैं। चतुर्थ भाग में नंबर THN या Th17 स्थिति siNeg सीटीएल या सी RORC साथ ट्रांसफ़ेक्ट तहत प्रतिशत सीडी 4 + RORγt + या आईएल 17A और / या IFNγ पॉजिटिव लाइव सिंग्लेट कोशिकाओं से संकेत मिलता है।fig2large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल छोटे RNAs के वितरण मानव Th17 कोशिकाओं में के लिए एक बेहतर तरीका प्रदान करता है। हालांकि मानव Th17 कोशिकाओं यहां इस्तेमाल किया गया, छोटे RNAs साथ इलेक्ट्रोपोरेशन की इस पद्धति में इस तरह के Th1, Th2, और Tregs के रूप में अन्य प्राथमिक मानव टी सहायक सबसेट, के साथ प्रयोग किया जा सकता है। यह अच्छी तरह से भोली सीडी 4+ टी कोशिकाओं के लिए काम नहीं किया है तो कोशिकाओं अभिकर्मक से पहले संस्कृति में सक्रिय होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल के लिए, हम पहले बेहतर आईएल 17A उत्पादन के लिए इन विट्रो संस्कृति प्रणाली अनुकूलित। सबसे बड़ा कारक आधार मीडिया था। हमने पाया है कि सीरम मुक्त मीडिया पारंपरिक सीरम युक्त उत्पादन आईएल 17A के बेहतर शामिल करने के लिए मीडिया मानव Th17 कोशिकाओं से बेहतर था। Th17 कोशिकाओं साइटोकिन्स TGFβ, आईएल 1β, आईएल 23, और आईएल -6 के सबसेट के साथ उत्पन्न किया जा सकता बाद से, हम विभिन्न साइटोकाइन घोला जा सकता है परीक्षण किया गया। इस अध्ययन में, हम और अधिक मजबूत आईएल 17A उत्पादन जब सभी चार ध्रुवीकरण साइटोकिन्स शामिल थे हासिल की। इसके अतिरिक्त, हम की लंबाई को छोटा अनुकूलितसंस्कृति सुनिश्चित करने के लिए केवल एक ही अभिकर्मक संस्कृति की अवधि के दौरान जरूरी हो गया था। इस चार दिवसीय प्रोटोकॉल की अनुमति देता है परिणाम तेजी से उत्पन्न होते हैं और केवल एक अभिकर्मक जरूरी किया जाना है, संस्कृति लंबाई आगे आईएल 17A उत्पादन बढ़ाने के लिए लम्बे जा सकता है। एक लंबे समय तक संस्कृति की अवधि भी अन्य प्राथमिक टी सेल सबसेट के इष्टतम भेदभाव को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है। चूंकि इन transfections क्षणिक होते हैं, कई transfections लंबा संस्कृति अवधि के लिए समय के साथ आवश्यक हो सकता है। हम अभिकर्मक कई कोशिका विभाजन से अधिक कमजोर पड़ने को रोकने के लिए के साथ कोशिकाओं को फिर से electroporating द्वारा लगभग 3 दिनों के बाद छोटे आरएनए अभिकर्मकों तरह बढ़ाने के सुझाव देते हैं। हम नियमित रूप से माउस सीडी 4+ टी कोशिकाओं के लिए यह किया है। हालांकि यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है प्रत्येक हालत में कोशिकाओं एकत्र किया जाना चाहिए के बाद से और गिना अलग, अभिकर्मक सफल रहा है और वहाँ सेल व्यवहार्यता पर न्यूनतम प्रभाव हैं।

इन प्रयोगों में, मानव Th17 कोशिकाओं हममानव गर्भनाल रक्त में इन विट्रो संस्कृति के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं। महत्वपूर्ण रूप से, इस भेदभाव परख के लिए एक वैकल्पिक विकल्प मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) का उपयोग करने के लिए होगा। दोनों CBMCs और PBMCs के लिए, यह सीडी 4+ टी कोशिकाओं संस्कृति के शुरू होने से पहले अलग करने के लिए आवश्यक है। हम यहाँ नकारात्मक चयन, जो मजबूत अभिकर्मक दक्षता झुकेंगे द्वारा सीडी 4+ टी कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए हमारे विधि प्रस्तुत करते हैं, लेकिन हम प्राथमिक मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं की तैयारी समान रूप से अच्छी तरह से काम करेगा के अन्य तरीकों की उम्मीद है। हम कई किट है कि माउस सीडी 4+ टी कोशिकाओं और दोनों तरीकों में से अलगाव के लिए तो सकारात्मक या नकारात्मक चयन का उपयोग समान अभिकर्मक दक्षता के परिणामस्वरूप की कोशिश की है। एक अतिरिक्त ध्यान क्रम में भोली टी कोशिकाओं का उपयोग कर बेहतर Th17 कोशिकाओं में अंतर करने के लिए का महत्व है। मानव गर्भनाल रक्त का प्रयोग इस कारण से यह पहले से ही भोली टी कोशिकाओं पी के एक उच्च अनुपात है, क्योंकि के लिए फायदेमंद हैक्रोध और इसलिए यह सॉर्ट करने के लिए या सीधी सादी टी कोशिकाओं संस्कृति के शुरू होने से पहले के लिए पूर्व को बेहतर बनाने के आवश्यक नहीं है। हालांकि, इस पद्धति का एक स्पष्ट नुकसान गर्भनाल रक्त की सीमित उपलब्धता है। वैकल्पिक रूप से, PBMCs 14 से भोला-भाला टी कोशिकाओं की छंटाई, संस्कृति करने से पहले किया जा सकता है क्योंकि इस संसाधन अधिक आसानी से उपलब्ध है, हालांकि बड़ी मात्रा में प्राप्त किया जा करना होगा।

जबकि वहाँ स्तनधारी कोशिकाओं परासंक्रमित के लिए कई तरीके हैं, प्राथमिक टी कोशिकाओं transfect करने के लिए एक और अधिक कठिन कोशिका प्रकार हो जाते हैं। अगली पीढ़ी इलेक्ट्रोपोरेशन क्षणिक परासंक्रमित टी कोशिकाओं की एक सफल शारीरिक विधि को करने के लिए तकनीकी रूप से आसान है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। एक बार अनुकूलित किया है, यह छोटे RNAs कि 100% दृष्टिकोण के लिए अभिकर्मक की एक बहुत ही उच्च क्षमता है। इस चित्र 2 में देखा जा सकता है जहां CD45 + कोशिकाओं (चित्रा 2A) और पो के पूरे unimodal जनसंख्यासभी कोशिकाओं को व्यक्त करने RORγt (चित्रा 2 बी) एक कम अभिव्यक्ति के स्तर में बदलाव की pulation। महत्वपूर्ण रूप से, छोटे RNAs के साथ अनुकूलित अभिकर्मक सेल व्यवहार्यता समझौता नहीं करता। हम नियमित रूप से छोटे RNAs (चित्रा 1 डी) के साथ 70% से अधिक व्यवहार्यता के बाद अभिकर्मक का निरीक्षण। हालांकि व्यवहार्यता इस प्रोटोकॉल, इस तरह के साइटोकाइन उत्पादन के रूप में अन्य टी सेल विशेषताओं, के जीव विज्ञान के साथ कोई समस्या नहीं है, छोटे RNAs साथ अभिकर्मक के बाद प्रभावित हो सकता है। इस कारण से, यह हर प्रयोग में एक रसायन विज्ञान से मिलान किए गए छोटे आरएनए नियंत्रण का उपयोग करने के गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है।

हम दो इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर, नाड़ी और वोल्टेज अनुकूलित किया है, कोशिका मृत्यु को कम करने और अभिकर्मक दक्षता बढ़ाने के लिए। उच्च वोल्टेज अभिकर्मक दौरान कोशिका मृत्यु वृद्धि हुई है। कुछ अन्य तकनीकी कारणों से कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए और यह सुनिश्चित सफल अभिकर्मक सिंथेटिक इस्तेमाल किया अभिकर्मकों की मात्रा को कम करने और समय betwee सीमित शामिल करने के लिए n सेल तैयार करने और इलेक्ट्रोपोरेशन। मिनिमल सिंथेटिक अभिकर्मक अभिकर्मकों के लिए आवश्यक सांद्रता हमेशा संभावित टी सेल विषाक्तता और ऑफ-टारगेट प्रभाव को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। अभिकर्मक को कम करना सेल तैयारी के समय से पहले अभिकर्मक बफर में कोशिकाओं के समय को कम करने के लिए कमरे के तापमान पर महत्वपूर्ण है और, बैचों में कोशिकाओं की तैयारी यदि आवश्यक हो तो द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

वर्तमान में, दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अगली पीढ़ी इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरणों रहे हैं। इन प्रणालियों के दोनों कुशलतापूर्वक प्राथमिक टी कोशिकाओं transfect कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल नियॉन अभिकर्मक प्रणाली का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था। हालांकि यह अभिकर्मक प्रणाली अधिक लागत प्रभावी है, Amaxa प्रणाली विशिष्ट उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए एक 96-अच्छी तरह अनुकूलक प्रदान करता है। हमें उम्मीद है कि अतिरिक्त वाणिज्यिक प्रगति, प्रवाह और इन अभिकर्मक प्रणाली की दक्षता बढ़ाने के लिए है, जबकि कम से कम लागत रखने के लिए जारी रहेगा।

"मानव टी कोशिकाओं की> अगली पीढ़ी इलेक्ट्रोपोरेशन कुशलता से ब्याज की लक्ष्य जीन के खिलाफ siRNAs सहित छोटे RNAs लागू कर सकते हैं के रूप में इस प्रोटोकॉल के साथ-साथ miRNA की नकल करता है या अवरोधकों में एक उदाहरण प्रस्तुत किया। उच्च दक्षता यह अनावश्यक के बाद से लगभग हर कोशिका है संक्रमण की सबसे मार्कर का उपयोग करने के लिए बनाता है छोटे RNAs साथ ट्रांसफ़ेक्ट। यह डीएनए प्लास्मिड के साथ प्राथमिक टी कोशिकाओं जहां ठेठ प्लाज्मिड transfections कि प्लाज्मिड की बढ़ती मात्रा के साथ बढ़ जाती है 50% से अधिक विषाक्तता के साथ मार्कर जीन का केवल 20-30% अभिव्यक्ति में परिणाम की अभिकर्मक के विपरीत है। परिचय इस पद्धति का उपयोग सिंथेटिक की नकल करता है के लिए जीन के दर्जनों आण्विक क्लोनिंग 12, 13 के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना समानांतर में टी कोशिका जीव विज्ञान में समारोह के लिए जांच की अनुमति दी गई है। यह भी समानांतर 11 में टी कोशिकाओं द्वारा व्यक्त सभी miRNAs के समारोह के लिए परीक्षण में सक्षम बनाया है 13 इस प्रोटोकॉल के साथ।मध्यम throughput स्क्रीन के इन प्रकार के मानव टी कोशिकाओं के लिए लागू कर रहे हैं। विशेष रूप से, इस तकनीक हाल ही में जीनोम संपादन 15 के लिए प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में छोटे आरएनए (gRNA) -Cas9 ribonucleoprotein परिसरों लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इन विविध अनुप्रयोगों उपयोगिता, लचीलापन और टी कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने की मांग प्रतिरक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की शक्ति पर प्रकाश डाला।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

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References

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