차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

Published 4/13/2017
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Immunology and Infection

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Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

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Abstract

Introduction

CD4 + T 세포는 적응 면역 반응의 중요한 관현악입니다. 나이브 CD4 + T 세포는 여러 이펙터 T 세포 (예받은 Th1, TH2, Th17 등)로 현상 할 수있는 로컬 미세 1에 따라 특성 사이토킨 및 전사 인자의 그 자신의 세트 각각. T 세포가 만들어 계보 결정은 자기에게 모두 보호 면역 관용에 대한 중요합니다. Th17 세포 외 박테리아 및 곰팡이를 방지하기 위해 공지 된 T 세포의 서브 세트 중 하나이지만, 그 부적절한 반응은 또한 다발 경화증, 건선과 2, 3과 같이 다수의자가 면역 및 염증성 질환의 병인에 연루되어있다. 인간 Th17 세포는 적절한 환경 편광판 (4)을 제공함으로써 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 생성 될 수있다. 바리오 사이토 카인의 우리 조합은 IL-1β, IL-23, TGFβ, 및 IL-6는 인간의 Th17 세포의 개발을 위해 사용되어왔다. 인간 Th17 세포 CCR6, 통상이 세포 집단을 식별하는 데 사용되며, 그 주요 전사 인자 (RORC 의해 코딩) RORγt (5, 6)의 식에 의해 정의된다 케모카인 수용체 발현. Th17 세포는 여러 사이토 카인을 발현하는 능력을 가지고 있지만, IL-17A는 이들 세포에 의해 생성 된 계통 정의 이펙터 사이토 카인이다. 우리는 우리의 인간 Th17 체외 분화 분석의 견고성을 평가하기 위해 세 가지 Th17 관련 마커 (CCR6, RORγt, IL-17A)의 발현을 조사 하였다. 또한, 우리는이 Th17 마커의 발현이 매우 낮은 또는 부재이어야 이후에는 사이토 카인이나 차단 항체를 음성 대조군으로 사용하는 배지에 첨가되지 않았다 비 편광 조건 하에서 인간 CD4 + T 세포를 배양 하였다.

ve_content는 "> 정상적인 인간 T 세포의 발달 및 생물학을 연구하는 하나의 방법은 개발 중에 유전자 발현을 조작 할 수있다. 짧은 간섭 RNA (siRNA와)는 단백질을 코딩하는 mRNA를 타겟팅 특정 유전자의 발현을 감소시키기 위해 이용 될 수있는 합성 작은 RNA 분자이다 . 마이크로 RNA (miRNA가)는 포스트 - 전사적 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 내인성 비 코딩 작은 RNA를이다.의 miRNAs는 Th17 전지 7, 8, 9를 포함하여 쥐와 인간 T 세포 생물학 모두에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 이는 유전자 발현에 궁극적으로 인간 T 세포 생물학에 미치는 영향을 연구하기 위해 인간 T 세포에서 작은 RNA 활동을 조작하는 신뢰할 수있는 방법을 가지고 매우 중요하다. 여기에서, 우리는 우리가 도입 용으로 개발 된, 사용하기 쉽고 일관되고 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명 작은 합성 RNA를 잠긴 핵산 (LNA들에서는 화학적 안정성이 증가 된 핵산을 개질)면역 세포로, 특히 인간의 Th17 세포로.

일반적으로, 생물 화학적 또는 물리적 카테고리 (10)에 속하는 포유 동물 세포 내로 RNA를 작은 도입 여러 다른 방법들이있다. 지질 계 형질 감염, 칼슘 포스페이트 형질 비롯한 일반적으로 사용되는 화학적 방법이 더 효율적으로 세포에 의해 흡수되는 화학-DNA 복합체를 만드는 방법에 의존한다. 일반적으로, 화학적 방법은 일차 T 세포의 형질 감염에 대해서는 비효율적이다. 가장 일반적인 생물학적 방법은 직접 자연 복제주기의 일환으로 호스트에 외국 RNA를 삽입하는 바이러스 벡터 (예 : 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스)를 사용하는 것입니다. 바이러스 성 전달은 일반적으로 하나가 프로 바이러스 플라스미드의 분자 클로닝 시간에 요인 특히, 완료하는 데 시간이 오래 걸립니다. 또한, 바이러스 전달 벡터는 인간의 연구자들에게 잠재적으로 해로울 수 있습니다. 전기 물리적 인 m핵산은 일시적으로 그들의 타겟에 작용할 수있는 세포에 들어갈 수 있도록, 고전압 펄스에 세포를 실시함으로써 막 permeabilization 유도 ethod. 전통적인 전기 장비는 차 림프구를 형질 감염에 효과가 없었다. 그러나, 최적화 된 차세대 전기가 작은 물질 인 RNA 형질 감염 될 때, 특히 매우 높은 효율로 T 세포를 형질 감염 할 수있는 것으로 입증되었다. 용어 차세대 느슨하게 기존의 전기 기계에서 두 개의 새로운 플랫폼 (예를 들어, 네온, Amaxa의)를 구분하는 데 사용됩니다. 또한,이 방법은 하나의 실험에서 약 120 작은 RNA를, 최대 종종 검증 합성 시약을 사용하여 함께 적당한 처리량 스크린의 확장이 용이하다. 중요한 것은, 성공적인 형질 감염은 T 세포 활성화 후 적게 16 시간 후에 달성 될 수있다. 이 방법의 단점은, 그러나, 안정한 유전자 incorporati 초래하지 않는다는 점이다에, 그리고 것은 그러므로 과도이다. 따라서, 그것은 바이러스 벡터에 패키지 성공적으로 작은 RNA의 장기 발현이 요구되는 경우에 T 세포에서 발현 할 수있는 안정적인 발현 구조를 만들 수있는 여분의 노력이 가치가있다.

우리는 서로 다른 목적으로 11, 12, 13에 대한 다양한 합성 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 LNA 올리고 뉴클레오티드 도구를 제공하는 차세대 형질 (예를 들어, 네온)을 사용했다. 효율적인 RNA 간섭은 이중 가닥 짧은 간섭 RNA (siRNA에)를 사용하여 기본 마우스와 인간 T 세포에서 유도 할 수있다. 이 프로토콜은 인간 Th17 세포에서이 기술을 사용하기위한 최적의 조건을 설명한다. siRNA를 외에도 시판 합성 miRNA의 모방 및 억제제 miRNA의 이득 및 기능 상실을 연구하는데 사용될 수있다. miRNA의 모방은 siRNA를 매우 유사 이중 가닥 RNA 분자하지만 고안은성숙한 miRNAs는 내생의 시퀀스 D. miRNA의 억제제는 고유의 miRNA에 결합하여 그 기능을 길항하는 RNA 및 / 또는 LNA 기초하여 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 화학적으로 변성된다. 우리는이 모든 도구가 포함 배양 차 T 림프구에서 효과적으로 사용하지만 인간 Th17 세포에 국한되지 될 수 있다는 것을 발견했다.

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Protocol

이 프로토콜은 인간의 연구 윤리에 대한 UCSF의 지침을 준수합니다.

T 세포 배양, CD4 + T 세포의 분리와 Th17 분극 1. 제조

  1. 0 일에, CD3에게 항 - 인간 (2 ㎍ / ㎖) 및 항 - 인간 CD28의 웰 당 1.5 ㎖의 코트 6 웰 조직 배양 플레이트 (4 ㎍ / ㎖), 적어도 2 시간 동안 칼슘 및 마그네슘에 함께 PBS에서 37 ° C.
    1. 대안 적으로, 코트 밤새 39 ° C에서 플레이트. 파라 필름에서 접시를 감싸.
  2. 제조업체의 지침에 따라 밀도 구배 원심 분리하여 제대혈 단핵 세포 (CBMCs)를 준비합니다.
    주의 :주의 깊게 작업 및 혈액 매개 병원균에 노출의 위험을 피하기 위해 인간의 피를 처리 할 때 착용 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 확인합니다.
  3. 단핵 세포를 분리하여 세척 한 후, 음극 실리 의해 인간 CD4 + T 세포의 분리를 수행ction 특 상업용 인간 CD4 + T 세포를 이용하여 키트.
    참고 : 단핵 세포 분리 후 적혈구 오염이있는 경우, 옵션 적혈구 세포 용해가 CD4 + T 세포의 분리 단계 이전에 수행 될 수있다. 차단 완충액 (PBS 2 % FBS)의 1 mL의 단핵 세포를 재현 탁. 1 배 용균 솔루션의 5 ML을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. 그런 다음 세포 펠렛 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 차단 완충액 원심 5 mL를 추가한다.
    1. 새로운 5 ㎖ 튜브에 차단 완충액 500 μL 당 50 × 106의 밀도에서 단핵 세포를 재현 탁.
    2. FBS 100 μL 후 잘 섞어 오비탈 진탕 기에서 20 분 동안 4 ℃에서 각각 배양 튜브를 튜브 당 항체 믹스 100 μL를 추가한다.
    3. 배양 후, 세포를 세척 버퍼 분리 3-4 mL를 첨가. 세포 펠렛을 39 ° C에서 8 분간 300 XG에 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 공중으로 대기음rnatant.
    4. 이 회전하는 동안, 자기 구슬을 미리 씻는다. (1에서 사용했을 때 세포로 1) 새로운 튜브에 자성 비드의 원하는 양을 옮기고 비드를 세척 완충액 분리 동량을 추가한다. 1 mL의 마이크로 피펫을 사용하여 잘 혼합 한 다음, 적어도 1 분 동안 자석에 튜브를 놓는다. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 초기 세척 전에 전송 된 동일한 부피의 자성 비드를 재현 탁.
    5. 분리 완충액 500 μL 각 튜브에 세포를 재현 탁 및 사전 세정 자성 비드 500 μL를 추가한다.
    6. 잘 섞어 상온 (25 ° C 내지 18 ° C)에서 오비탈 진탕 기에서 15 분 동안 자성 비드와 세포를 인큐베이션.
    7. 인큐베이션 후, 충분히 1 mL의 마이크로 피펫을 적어도 10 배를 사용하여 세포를 피펫. 이어서 분리 버퍼 3-4 mL를 첨가하고 2 분 동안 상기 자석의 각각의 튜브를 배치했다.
    8. 조심스럽게에있는 부정적인 선택 CD4 + T 세포를 전송새로운 튜브에 뜨는.
  4. CD4 + T 세포의 분리가 완료되면, 혈구와 세포를 계산하고 얼음에 세포를 유지한다.
  5. PBS와 항체 코팅 된 플레이트를 두 번 씻으십시오. 이어서 각 웰에 Th17 - 편광 미디어 1.5ml의 배의 혼합물을 추가 항 - 인간 IFNγ (20 ㎍ / ㎖), 항 인간 IL-4 (20 ㎍ / ㎖) 인간 TGFβ (10 NG / ㎖) 인간 IL-1β (40 ng의 / ㎖) 인간 IL-23 (40 ng의 / ㎖) 인간 IL-6 (50 NG / ㎖) 총 2 mM의 L- 글루타민이 보충 된 무 혈청베이스 미디어 (희석 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 100 μM 2- 머 캅토 에탄올).
    참고 : 형질 및 RNA 간섭 혈청 함유 미디어에서 작업을 수행합니다. 이 프로토콜과 혈청이없는 미디어를 사용하는 목적은 더 나은 IL-17의 생산을 달성하는 것입니다.
  6. 원심 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 인간 CD4 + T 세포는 세포 펠렛. 조심스럽게 supernat를 대기음개미. 그런 다음, 최종 부피가 웰 당 3 ㎖이고 편광 사이토킨은 1X 최종 농도 이제 잘되도록 1.5 mL의 3 × 106의 밀도로 세포를 무 혈청베이스 미디어 세포를 재현 탁하고 접시.
    1. 5 % CO 2에서, 이틀 동안 37 ° C의 배양기 판을 놓는다.

2. 일렉트로 체외 편광 인간 Th17 세포

  1. 제 2 일, CD3에게 항 - 인간 (2 ㎍ / ㎖) 및 항 - 인간 CD28의 웰 당 250 μL로 코팅 48- 웰 조직 배양 플레이트 (4 ㎍ / ㎖), 적어도 2 시간 동안 칼슘 및 마그네슘에 함께 PBS에서 37 ° C.
    1. 대안 적으로, 코트 밤새 39 ° C에서 플레이트. 파라 필름에서 접시를 감싸.
  2. 형질 전환을위한 작은 RNA를 준비. 각 형질 1.5 ML의 마이크로 원심 튜브에 siRNA를 5 μM 스톡 용액의 분취 액 1 μL. 적절한 화학 - 일치하는 작은 RNA의 제어 방식을 포함OL. 얼음의 모든 튜브를 유지합니다.
  3. PBS와 항체 코팅 된 플레이트를 두 번 씻으십시오. 인간 TGFβ (5 NG / ㎖) 인간 IL-항 인간 IFNγ (10 ㎍ / ㎖), 항 인간 IL-4 (10 ㎍ / ㎖) : 500 μL 1X 각 웰 미디어 Th17가 - 편광의 추가 1β (20 ng의 / ㎖) 인간 IL-23 (20 ng의 / ㎖) 인간 IL-6 (25 NG / ㎖) 모두 2 mM L- 글루타민, 100 U 보충 된 무 혈청베이스 미디어 (희석 / mL의 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 100 μM 2- 머 캅토 에탄올).
  4. 배양 플레이트와 형질 전환 시약을 제조 한 후, 1 ㎖의 마이크로 피펫, 피펫으로 부드럽게 세포를 제외한 모든 세포가 웰의 바닥으로부터 분리되는 것을 보장을 재현 탁. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원추형 원심 분리 튜브에 세포를 풀.
    참고 : 여기에 제시된 나흘 프로토콜 이상 문화 기간의 경우, 세포는이 같은 프로토콜을 사용하여 3 일마다 약 형질 전환되어야한다. 2 단계다른 작은 RNA를 처리 한 세포를 풀링 안 보낸 .4 그러나 수정되어야한다. 시험되는 조건이 모두 수집 계산, 별도로 형질 전환해야합니다.
  5. 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 PBS 세척 중 적어도 1 mL 중에 세포를 재현 탁. 다음 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송 (생존 능력을 평가하기 위해 트리 판 블루 배제를 사용하여 혈구와 예) 라이브 Th17 세포를 계산합니다.
  6. 세포 펠렛을 실온에서 5 분 동안 500 XG 원심 분리기.
  7. 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 용액 당 2.5-4 X 107 세포의 밀도로 형질 감염 시스템 10 μL 키트에서 제공 재현 탁 완충액을 사용하여 세포를 재현 탁. 실온에서 세포를 유지합니다.
    참고 : 가이드 라인으로, 30 분 내에 형질 전환 될 수만큼의 세포를 준비하려고합니다. 다수의 배치는 비교 될 수있다.
  8. 각는 MicroC 작은 RNA 1 μL에 세포의 9 μL를 추가entrifuge 튜브. 피펫은 한번 설치 후 피펫 팁 전극에로드 형질 세포 작은 RNA를 혼합한다.
    주 : 일반적으로, 형질 감염 이전 피펫 팁 전극에 거품을 만드는 것을 방지하기 위해 충분히 혼합가되도록 세포 현탁액 9.5 μL를 추가한다.
  9. 실온 전해 버퍼 E. 장소 3 ㎖ 피펫 스테이션 큐벳 내부로 제공 큐벳을 기입 한 후, 큐벳 내부의 위치에 배치 피펫.
  10. 바로 다음의 파라미터를 이용하여 셀과 작은 RNA 각각 10 μL를 혼합 electroporate : 1,500-1,550 펄스 전압을 V, 펄스 폭 10 밀리 초, 3 펄스 형질 장치 합계.
  11. 일렉트로가 완료되면 바로 1X 배양 플레이트의 웰에 제조 된 미디어 Th17가 편광-500 μL에 세포 혼합액을 추가한다. 5 % CO 2 개의 일 이상 37 ℃ 인큐베이터에 넣어 판.
    참고 : 피펫 팅하여 피펫 전극의 끝 부분을 세척위아래로 PBS에서의 각 형질 사이.

3. 인간 수확 Th17 세포

  1. 부드럽게 피펫 팅하지만 모든 세포가 웰의 바닥으로부터 분리되는 것을 보장하는, 마이크로 피펫으로 배양 배지에서 세포를 재현 탁. 기능적 및 / 또는 유전자 발현의 분석을 위해 세포를 준비한다.
    주 : 일상적 충분한 세포가 형질 Th17 세포의 단일 웰에서 수득되는 표면 마커 및 세포 내 사이토 카인 및 전사 인자 염색 유세포 분석 또는 유전자 발현 분석 RNA의 제조에 사용된다.

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Representative Results

성공적으로 인간의 Th17 세포를 electroporating의 신뢰할 수있는 시스템을 개발하는 첫 번째 단계는 체외 차별화 된 인간의 Th17 세포 배양에서 강력한 생성하는 것이었다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 케모카인 수용체 CCR6 및 전사 인자 RORγt (도 1a 왼쪽)을 나타냈다. T 세포 (오른쪽 그림 1A) 비 편광 (THN) 조건에서 배양했을 때 이러한 마커는 발현되지 않았다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 재 자극시 IL-17A를 생성하지만 THN 조건 (도 1B, 우측) (좌측도 1b). Th17 분화 여전히 작은 RNA를 가진 형질 전환 후에 발생하지만, 일부 실험에서, IL-17의 생산의 주파수 (도 1C)에서 관측 된 환원있다. 사이토 카인 생산에 작은 RNA 형질 감염의 효과를 보여 impor의각 실험 내에서 비교를위한 화학 정합 작은 RNA 제어를 갖는 tance. 중요한 생존 작은 RNA들로 형질 감염 한 후에 유지 전형적 70 % 이상 (도 1d)이다.

이 프로토콜의 효율성을 결정하기 위해, 우리는 RNA 간섭을 사용했습니다. 의 CD45 항원 (단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입 C) PTPRC 유전자에 의해 코딩된다. CD45는 조혈 세포 모두에서 발현되고, 따라서 인간 Th17 세포 견고이 표면 마커를 발현한다. PTPRC 타겟팅 siRNA를 완비 2 일에 인간 Th17 세포의 형질 강하게 화학에 비해 CD45의 발현이 조절 된 siRNA (도 2A)를 일치 감소. CD45 발현이 단봉 인구 이동은 작은 RNA를위한이 프로토콜의 전형적인 100 %의 형질 전환 효율, 근처에 나타냅니다. 따라서,이 형질 EFF을 평가하는데 사용될 수있는 중요한 도구이다프로토콜 최적화 동안 iciency. RORC는 RORγt 직접 IL-17의 생산을 조절하는 인간 Th17 세포의 주된 전사 인자를 암호화한다. (도 2B)가 예상대로 RORC siRNA에 대하여 풀과 현상 Th17 인간 세포를 형질 RORγt 강하게 발현을 감소시켰다. 전시 된 이들 세포는 제어 siRNA를 형질 감염된 세포에 비해 IL-17의 생산 (도 2C)를 환산하여 RNAi를 감소 RORγt 발현은 기능적 효과가 있었다. 비 편광 된 CD4 + T 세포는 RORγt 또는 IL-17A 표현 안되며이 도면에서 음성 대조군으로 나타내었다.

그림 1
도 1 : 시험 관내 인간 Th17 분화 세포 익스프레스 CCR6, RORγt, 및 IL-17A에서. 제대혈에서 분리 된 인간 CD4 + T 세포가 운데 배양 하였다R Th17 조건 (IL-1β, IL-23, IL-6, TGFβ) 또는 비 편광 (THN) 조건 (용지 만, 아니 편광 사이토킨 또는 첨가 된 항체 차단) 시험 관내 및 Th17 마커에 대해 4 일에 분석 유동 세포 계측법에 의해 식 (A) 주제 콘타 디스플레이 표면 CCR6 및 CD4 + T 세포의 세포 RORγt 공동 염색. 사분면에있는 숫자는 %의 CCR6 및 / 또는 RORγt 양성 라이브 단일의 CD4 + 세포를 나타냅니다. (B) PMA / 이오 노마 이신과 함께 재 자극 후 IL-17A 및 IFNγ 생산. 사분면에있는 숫자는 %의 IL-17A 및 / 또는 IFNγ 양성 라이브 단일 CD4 + 세포를 나타냅니다. (C) 대표 등고선 플롯 표시 작은 RNA 컨트롤 CCR6 및 CD4 + T 세포의 세포 RORγt 공동 염색 후 형질 표면. 사분면에있는 숫자는 %의 CCR6를 표시 및 / 또는 RORγt 양성 라이브 단일의 CD4 + 세포 (왼쪽). Representa적인 윤곽 플롯 작은 RNA 컨트롤 후 형질 이오 노마 이신 PMA / 함께 재 자극 후 IL-17A 및 IFNγ 생산을 표시한다. 사분면에있는 숫자는 %의 IL-17A 및 / 또는 IFNγ 양성 라이브 단일 CD4 + 세포 (오른쪽)을 나타냅니다. (D) 주제 등고선 플롯은 CD4 + 세포의 생존율은 작은 RNA 컨트롤 후 형질 표시한다. 번호 %의 CD4 + 살아있는 단일 세포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 : 1 차 인간 Th17 세포에서 RNA 간섭. Th17 조건 하에서 배양 제대혈로부터 인간 CD4 + T 세포는 siRNA를 nontargeting 제어 (siNeg는 Ctl) 또는 풀에 대한 표적으로 하루 2에 형질 감염시켰다 PTPRC (SI PTPRC) 또는 RORC (SI RORC)가 4 개 개인 된 siRNA를 포함하는 방법. SI PTPRC (회색 색조)이나 siNeg FET의 (검은 선)를 형질 전환 한 후 대표적인 히스토그램에 나타낸 (A) 표면 CD45 발현 : 세포 계측법 후 4 일째 흐름으로 분석 하였다. (B) 세포 내 발현 RORγt SI RORC (회색 색조)이나 siNeg FET의 (검은 선)를 형질 전환 한 후 대표적인 히스토그램에 도시되어있다. (C) 대표 등고선 플롯은 PMA / 이오 노마 이신 (하단 패널)로 재 자극 한 후 표면 CD4 및 CD4 + T 세포의 세포 RORγt 공동 염색 (상단 패널) 또는 IL-17A 및 IFNγ 생산을 표시. 사분면 숫자 siNeg FET의 또는 Si RORC 형질 THN 또는 Th17 조건 퍼센트 CD4 + RORγt + 또는 IL-17A 및 / 또는 양성 IFNγ 라이브 단일 셀을 나타낸다.fig2large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 인간 Th17 세포로 소형의 RNA 전달하기위한 개선 된 방법을 제공한다. 인간 Th17 세포가 여기에 사용되었지만, 소형 RNA를 가진 전기의 방법은받은 Th1, TH2 및 Tregs 다른 기본 인간 T 헬퍼 집합으로 사용될 수있다. 세포가 이전에 형질 전환에 문화를 활성화해야합니다 그래서 순진한 CD4 + T 세포에 대해 잘 작동되지 않았습니다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 먼저 더 나은 IL-17의 생산을 위해 체외 배양 시스템을 최적화. 가장 큰 요인은 기본 미디어이었다. 우리는 혈청이없는 미디어는 기존의 혈청 함유 생산 IL-17A의 더 나은 유도를 위해 미디어를 인간의 Th17 세포에 우수한 것을 알았다. Th17 세포가 사이토킨 TGFβ, IL-1β, IL-23 및 IL-6의 서브 세트에 의해 발생 될 수 있기 때문에, 우리는 다른 시토 킨의 혼합물을 시험했다. 네 편광 사이토 카인이 포함 된 경우 본 연구에서는보다 강력한 IL-17의 생산을 달성했다. 또한, 우리는의 길이를 단축 최적화 된문화는 하나의 형질 전환은 배양 기간 동안 필요하다고 보장합니다. 이 나흘 프로토콜은 결과를 빠르게 생성하고 하나 개의 형질을 필요로 할 수 있지만, 문화, 길이는 더 IL-17의 생산을 증가하기 위해 길게 할 수있다. 더 긴 배양 기간에도 다른 프라이 머리 T 세포 서브 세트의 최적의 분화를 달성 할 필요가있다. 이러한 형질이 과도하기 때문에, 여러 형질이 긴 배양 기간 동안 시간이 지남에 따라 필요할 수 있습니다. 우리는 여러 세포 분열을 통해 희석을 방지하기 위해 시약과 세포를 다시 electroporating에 의해 약 3 일 후에 작은 RNA 시약을 보충하는 것이 좋습니다. 우리는 일상적으로 마우스 CD4 + T 세포에 대한 이런 짓을했는지. 각 조건에서 세포를 별도로 수집 및 계산해야하기 때문에 좀 더 기술적으로 도전하지만, 형질 전환에 성공하고 세포 생존에 미치는 효과가있다.

이 실험에서, 인간의 Th17 세포 우리를인간 탯줄 혈액의 체외 배양을 재생성. 중요한 것은,이 분화 분석을위한 대안 옵션은 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하는 것이다. 두 CBMCs와 PBMC를 들어, 배양 개시 전에 CD4 + T 세포를 분리 할 필요가있다. 우리는 강력한 형질 전환 효율을 산출 부정적인 선택에 의해 CD4 + T 세포를 정제 여기에 우리의 방법을 제시한다, 그러나 우리는 똑같이 잘 작동 주 인간의 CD4 + T 세포를 제조하는 다른 방법을 기대합니다. 우리는 비슷한 형질 전환 효율 이어질 마우스 CD4 + T 세포와 두 가지 방법의 분리에 대한 긍정적 또는 부정적 선택을 사용하는 여러 키트를 시도했다. 추가적인 고려하여 최적 Th17 세포로 분화시키기 위해 나이브 T 세포를 사용하는 것이 중요하다. 사람의 제대혈을 사용하는 것은 이미 나이브 T 세포 (P)의 높은 비율을 가지고 있기 때문에, 이러한 이유로 유리하다원망하고 따라서 정렬하거나 문화의 시작에 앞서 순진 T 세포에 대한 사전 풍부하게 할 필요는 없습니다. 그러나이 방법의 명확한 단점은 제대혈의 제한된 가용성이다. 이 자원에 더 용이하게 사용할 수 있기 때문에 많은 양이 얻어 질해야하지만 다르게, PBMC를 14 나이브 T 세포로 분류하면, 배양하기 전에 수행 될 수있다.

포유류 세포를 형질 감염을위한 다양한 방법이 있지만, 일차 T 세포는 형질 더 어려운 세포 유형 경향이있다. 차세대 전기 수행 기술적으로 용이하며 재현 일시적 형질 감염 T 세포의 성공적인 물리적 방법이다. 최적화 된 후에는 100 %에 가까워 작은 RNA를위한 형질 감염의 매우 높은 효율을 갖는다. 이는도 2에서 알 수있는 CD45 + 세포 (도 2a) 및 포 전체 인구 단봉낮은 발현 수준 RORγt (도 2B) 시프트를 발현하는 모든 세포의 pulation. 중요한 것은, 작은 RNA를 최적화 된 형질 전환 세포 생존 능력을 손상하지 않습니다. 우리는 일상적으로 작은 RNA를 (그림 1D)와 70 % 이상 생존 포스트 형질을 관찰합니다. 생존이 프로토콜, 예컨대 사이토 카인 생산과 같은 다른 T 세포 특성의 생물학에 문제가되지 않지만, 작은 RNA를 가진 형질 감염 후에 영향을받을 수있다. 이러한 이유로, 모든 실험에서 화학 일치 작은 RNA 제어를 사용하는 것이 매우 중요하다.

우리는 세포 사멸을 최소화하고 형질 전환 효율을 극대화하기위한 두 개의 전기 매개 변수, 펄스 전압을 최적화. 높은 전압이 형질 전환시 세포 사멸을 증가시킨다. 다른 어떤 기술적 고려는 세포 사멸을 방지하고 성공적인 형질 사용 합성 시약의 양을 최소화하고 시간 betwee을 제한하는 등 보장 N 전지 제조 및 전기. 형질 전환 시약의 합성에 필요한 최소 농도는 항상 잠재적 인 T 세포 독성 및 오프 - 타겟 효과를 방지하기 위해 사용되어야한다. 실내 온도가 매우 중요하고, 필요한 경우 일괄 적으로 세포를 제조함으로써 달성 될 수로 형질 감염 전에 셀 제조 시간을 단축하는 형질 세포의 버퍼 시간을 최소화한다.

현재,이 개 상업적으로 이용 가능한 차세대 전기 장비가있다. 이러한 시스템은 모두 효율적으로 차 T 세포에 감염 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 네온 형질 전환 시스템을 사용하여 최적화되었다. 이 형질 전환 시스템이보다 비용 효과가 있지만, Amaxa의 시스템은 고유의 높은 처리량 애플리케이션을위한 전기에 대한 96 웰 어댑터를 제공합니다. 우리는 추가적인 상업 발전은 최소 비용을 유지하면서, 이러한 형질 전환 시스템의 처리량과 효율성을 계속 증가 할 수 있기를 바랍니다.

이 프로토콜뿐만 아니라 miRNA의 모방 또는 억제제에 예시 된 바와 같이 "인간 T 세포의> 차세대 전기를 효율적으로 관심 대상의 유전자에 대한 siRNA를 포함 작은 RNA를 도입 할 수있다. 높은 효율이 불필요 거의 모든 세포이기 때문에 형질 마커를 사용할 수있게 작은 RNA를 형질. 이것은 전형적인 플라스미드 형질 플라스미드의 양이 증가함에 따라 증가 50 % 초과의 독성 표지 유전자의 20 ~ 30 % 발현 될 DNA 플라스미드 일차 T 세포의 형질 대조적이다. 등장 이 방법을 사용하여 합성 모방 유전자 수십 분자 클로닝 (12, 13)을위한 필요없이 병렬 T 세포 생물학 함수 상영 할 수있다. 또한, 11 병렬 T 세포에 의해 발현 모두의 miRNAs 기능에 대한 테스트를 가능하게했다 13.이 프로토콜적당한 처리량 화면의 이러한 유형의 인간 T 세포에 적용 할 수있다. 특히,이 기술은 최근 게놈 편집 15 차 인간 T 세포에 작은 RNA (gRNA) -Cas9 리보 핵산 단백질 복합체를 소개 하였다. 이러한 다양한 응용 프로그램은 T 세포 생물학을 연구하고자하는 면역 학자를위한 중요한 도구로 여기에 제시된 프로토콜의 유틸리티, 유연성과 기능을 강조 표시합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

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References

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