Kleine RNA Transfektion in primären humanen Th17-Zellen durch Next Generation Elektroporation

Published 4/13/2017
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Immunology and Infection

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Summary

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Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

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Abstract

Introduction

CD4 + T - Zellen sind von entscheidender Bedeutung orchestrators der adaptiven Immunantwort. Naive CD4 + T - Zellen sind in der Lage in mehr verschiedenen Effektor - T - Zellen entwickeln (zB Th1, Th2, Th17, etc.), das jeweils mit ihrem eigenen Satz von charakteristischen Zytokinen und Transkriptionsfaktoren, abhängig von der lokalen Mikroumgebung 1. Die Linie Entscheidungen, die T-Zellen machen sind entscheidend für sowohl eine schützende Immunität und Toleranz gegenüber sich selbst. Th17 - Zellen sind eine Untergruppe von T - Zellen bekannt extrazellulären Bakterien und Pilze zu bekämpfen, aber ihre falschen Antworten werden ebenfalls in der Pathogenese von mehreren Autoimmun- und Entzündungserkrankungen, wie Multiple Sklerose und Psoriasis , 2, 3 gebracht. Menschliche Zellen können Th17 4 , indem sie mit einer geeigneten Polarisations Umgebung von naiven CD4 + T - Zellen in vitro erzeugt werden. Vario wir Kombinationen der Zytokine IL-1β, IL-23, TGF-ß und IL-6 wurden für die Entwicklung der menschlichen Th17-Zellen verwendet. Th17 menschliche Zellen exprimieren CCR6, einen Chemokin - Rezeptor, der üblicherweise verwendet wird , diese Zellpopulation zu identifizieren und werden durch die Expression ihres Haupttranskriptionsfaktor, RORγt (kodiert durch RORC) 5, 6 definiert. Th17 Zellen haben die Fähigkeit, mehrere Cytokine zu exprimieren, aber IL-17A ist die Linie definierte Effektor Cytokin von diesen Zellen produziert. Wir untersuchten die Expression aller drei Th17-assoziierter Marker (CCR6, RORγt, IL-17A) , um die Robustheit des menschlichen Th17 in vitro Differenzierungsassay zu bewerten. Zusätzlich kultivierten wir humane CD4 + T - Zellen unter nicht-polarisierenden Bedingungen, in denen keine Zytokine oder blockierende Antikörper zu dem Kulturmedium hinzugefügt wurden als Negativkontrolle zu verwenden , da die Expression dieses Th17 Marker sollte sehr niedrig sein oder fehlen.

ve_content "> Eine Möglichkeit, normale menschliche T-Zell-Entwicklung und Biologie zu studieren ist die Genexpression während ihrer Entwicklung zu manipulieren. Short-interfering RNA (siRNA) synthetische kleine RNA-Moleküle sind, die Protein-kodierenden mRNAs Ziel und verwendet werden kann, spezifische Genexpression zu reduzieren MicroRNAs. (miRNAs) sind endogene nicht-kodierenden kleine RNAs bekannt Genexpression post-transkriptionell zu modulieren. miRNAs gezeigt wurde , sowohl in der murinen und humanen T - Zell - Biologie, einschließlich in Th17 Zellen 7, 8, 9 eine wichtige Rolle spielen. Es Hier ist entscheidend, zuverlässige Methoden der Manipulation von kleinen RNA-Aktivität in menschlichen T-Zellen zu haben, um ihre Auswirkungen auf die Genexpression und letztlich auf die menschliche T-Zell-Biologie zu studieren., beschreiben wir eine einfach zu bedienende, konsistente und zuverlässige Protokoll, das wir entwickelt für die Einführung kleine synthetische RNAs und locked nucleic acids (LNA, chemisch Nukleinsäuren mit erhöhter Stabilität modifiziert)Immunzellen in und speziell in der menschliche Th17-Zellen.

Es gibt mehrere alternative Methoden der kleinen RNAs in Säugerzellen einzuführen, die in der Regel fallen chemische, biologische oder physikalische Kategorien 10. Üblicherweise verwendete chemische Verfahren, einschließlich lipidbasierten Transfektionen und Calciumphosphat-Transfektionen stützen sich chemisch-DNA-Komplexe zu schaffen, das effiziente up von Zellen aufgenommen werden. Im allgemeinen chemischen Methoden sind nicht so effizient für die Transfektion von primären T-Zellen. Die häufigste biologische Methode ist einen viralen Vektor (zB Retrovirus oder Lentivirus), zu verwenden , die direkt an fremde RNA in einen Wirt als Teil ihres natürlichen Replikationszyklus einfügt. Virale Transduktion dauert in der Regel länger, abgeschlossen vor allem, wenn man für die molekulare Klonierung von proviralen Plasmiden in Zeitfaktoren. Darüber hinaus können virale Transduktion Vektoren für die menschlichen Forscher potentiell schädlich sein. Elektroporation ist eine physikalische methode von Membranpermeabilisierung Induzieren von Zellen, um Hochspannungsimpulse zu unterziehen, so dass Nukleinsäuren in die Zelle transient einzutreten, wo sie auf ihrem Ziel wirken können. Traditionelle Elektroporation Instrumente waren nicht wirksam für die Transfektion von primären Lymphozyten. Allerdings wurde optimierte nächste Generation Elektroporation von Transfizieren T-Zellen mit sehr hohen Effizienz fähig erwiesen, vor allem, wenn das Material zu transfizierenden ist kleine RNA. Der Begriff der nächsten Generation ist lose die beiden neueren Plattformen (zB Neon, Amaxa) von den traditionellen Elektroporation Maschinen zu unterscheiden verwendet. Darüber hinaus ist dieses Verfahren leicht skalierbar für moderates Throughput-Screens mit bis zu etwa 120 kleinem RNAs in einem einzigen Experiment, oft validierten synthetische Reagenzien verwenden. Wichtig ist, dass erfolgreiche Transfektionen nach dem T-Zell-Aktivierung in weniger als 16 Stunden erreicht werden. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass es nicht in stabiler genomischen diedrei führtauf und ist daher vorübergehend. Daher lohnt es sich, den zusätzlichen Aufwand ein stabiles Expressionskonstrukt zu schaffen, die in einen viralen Vektor verpackt werden können und erfolgreich in T-Zellen in den Fällen zum Ausdruck, wo langfristige Expression eines kleinen RNA erforderlich ist.

Wir haben eine neue Generation Transfektion (zB Neon) verwendet , um diverse synthetische einzelsträngige oder doppelsträngige RNA oder LNA - Oligonukleotid für verschiedene Zwecke 11 Werkzeuge zu liefern, 12, 13. Effiziente RNA-Interferenz kann in primären murinen und humanen T-Zellen unter Verwendung von doppelsträngigen kurze interferierende RNA (siRNA) induziert werden. Dieses Protokoll beschreibt optimierte Bedingungen für die Verwendung dieser Technik in der menschlichen Th17-Zellen. Zusätzlich zu siRNAs, im Handel erhältliche synthetische miRNA-Mimetika und Inhibitoren können verwendet werden, miRNA Verstärkung und Verlust der Funktion zu untersuchen. miRNA imitiert sind doppelsträngige RNA-Moleküle sehr ähnlich siRNAs, aber designed mit der Sequenz des reifen endogenen miRNAs. miRNA-Inhibitoren sind, chemisch modifizierten RNA und / oder LNA basierten einzelsträngigen Oligonucleotiden, die zu nativem miRNAs binden und ihre Funktion antagonisieren. Wir haben festgestellt, dass alle diese Tools effektiv in kultivierten primären T-Lymphozyten verwendet werden können, einschließlich, aber nicht für die menschliche Th17 Zellen beschränkt.

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Protocol

Dieses Protokoll hält sich an UCSF-Richtlinien für die Forschung mit menschlichen Ethik.

1. Herstellung von T - Zell - Kultur, Isolierung von CD4 + T - Zellen, und Th17 Polarization

  1. Am Tag 0 Mantel 6-Well - Gewebekulturplatten mit 1,5 ml pro Vertiefung Anti-Human - CD3 (2 ug / ml) und Anti-Human - CD28 (4 ug / ml) in PBS mit Calcium und Magnesium für mindestens 2 h bei 37 ° C.
    1. Alternativ Beschichtung der Platten über Nacht bei 4 ° C. Wickeln Sie Platten in Parafilm.
  2. Bereiten Sie die Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMCs) durch Dichtegradientenzentrifugation den Anweisungen des Herstellers.
    ACHTUNG: Arbeiten Sie vorsichtig und sorgen Persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen wird, wenn menschliches Blut Handhabung das Risiko einer Exposition gegenüber Blut übertragbaren Krankheitserregern zu vermeiden.
  3. Sobald die einkernigen Zellen isoliert und gewaschen worden ist , führt die menschliche CD4 + T - Zell - Isolierung durch negative selection unter Verwendung eines kommerziellen menschlichen CD4 + T - Zell - Kit.
    HINWEIS: Wenn es rot Kontamination nach einkernigen Zellisolierung Blutkörperchen ist, eine optionale Lyse der roten Blutkörperchen an die CD4 + T - Zellen - Isolationsschritte vor durchgeführt werden kann. Resuspendieren der mononukleären Zellen in 1 ml Isolationspuffer (2% FBS in PBS). In 5 ml 1x Lyselösung. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur. Anschließend werden 5 ml Isolationspuffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C, um die Zellen zu pelletieren.
    1. Resuspendieren der mononukleären Zellen in einer Dichte von 50 x 10 6 pro 500 & mgr; L in dem Isolationspuffer in einem neuen Rohr 5 mL.
    2. Füge 100 & mgr; l FBS und 100 & mgr; l des Antikörper-Mixes pro Röhrchen anschließend jedes Röhrchen für 20 Minuten auf einem Rundschüttler bei 4 ° C inkubieren, um gut zu mischen.
    3. Nach der Inkubation wurden 3-4 ml Isolationspuffer hinzufügen, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren der Zellen bei 300 · g für 8 min bei 4 ° C, um die Zellen zu pelletieren. aspirieren vorsichtig die supernatant
    4. Während dieser Spin, vorwaschen die magnetischen Kügelchen. Übertragen, um die gewünschte Menge an magnetischen Kügelchen in ein neues Röhrchen (verwendet in einer 1: 1 mit den Zellen) und füge ein gleiches Volumen Isolationspuffer an die Kügelchen zu waschen. Gut mischen eine 1 ml-Mikropipette verwenden und dann das Rohr in den Magneten für mindestens 1 min. aspirieren vorsichtig den Überstand. Resuspendieren der magnetischen Kügelchen in dem gleichen Volumen anfänglich vor der Wäsche transferiert.
    5. Resuspendieren der Zellen in jedem Röhrchen mit 500 & mgr; L des Isolationspuffer und füge 500 ul vorgewaschene magnetischen Kügelchen.
    6. Inkubieren der Zellen mit den magnetischen Kügelchen für 15 min auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur (18 ° C bis 25 ° C) gut zu mischen.
    7. Nach der Inkubation Pipettieren gründlich die Zellen einer 1 ml-Mikropipette mindestens 10-mal verwenden. Dann fügen Sie 3-4 ml Isolationspuffer und stellen jedes Rohr in dem Magneten für 2 min.
    8. Sorgfältig übertragen die negativ selektierten CD4 + T - Zellen , die in sindder Überstand in ein neues Röhrchen.
  4. Sobald CD4 + T - Zellisolierung abgeschlossen ist, die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und die Zellen auf Eis halten.
  5. Waschen der Antikörper-beschichteten Platten zweimal mit PBS. Dann fügen Sie 1,5 ml 2x Mischung aus Th17 polarisierenden Medien in jeder Vertiefung: anti-human IFN- & ggr; (20 ug / ml), Anti-Human-IL-4 (20 & mgr; g / ml), human TGF- & bgr; (10 ng / ml), menschliche IL-1β (40 ng / ml), humane IL-23 (40 ng / ml), humanes IL-6 (50 ng / ml), die alle in einem serumfreien Basismedium verdünnt (ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat und 100 & mgr; M 2-Mercaptoethanol).
    HINWEIS: Die Transfektion und RNA-Interferenz funktioniert in serumhaltigen Medien. Der Zweck des Serum-freie Medien mit diesem Protokoll ist besser IL-17A Produktion zu erreichen.
  6. Zentrifuge die humanen CD4 + T - Zellen bei 500 · g für 5 min bei 4 ° C - Zellen zu pelletieren. Aspirieren vorsichtig die SupernatAmeise. Die Zellen in einer Dichte von 3 × 10 6 in 1,5 ml pro Vertiefung , so dass das Endvolumen beträgt 3 ml pro Vertiefung und Polarisieren Cytokine sind nun bei einer 1x Endkonzentration resuspendieren dann die Zellen in serumfreien Medien Base und Platte.
    1. Legen Sie die Platten in 5% CO 2, 37 ° C Inkubator für zwei Tage.

2. Elektroporation von In - vitro - polarisierten Menschen Th17 Zellen

  1. Am Tag 2 Mantel 48-Well - Gewebekulturplatten mit 250 & mgr; l pro Vertiefung Anti-Human - CD3 (2 ug / ml) und Anti-Human - CD28 (4 ug / ml) in PBS mit Calcium und Magnesium für mindestens 2 h bei 37 ° C.
    1. Alternativ Beschichtung der Platten über Nacht bei 4 ° C. Wickeln Sie Platten in Parafilm.
  2. Bereiten Sie kleine RNAs für die Transfektion. Für jede Transfektion Aliquot 1 & mgr; l einer 5 & mgr; M Stammlösung von siRNA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie die entsprechenden Chemie abgestimmten kleinen RNA-control. Halten Sie alle Röhrchen auf Eis.
  3. Waschen der Antikörper-beschichteten Platten zweimal mit PBS. Dann fügen 500 ul 1X Th17 polarisierenden Medien in jede Vertiefung: anti-human IFN- & ggr; (10 ug / ml), Anti-Human-IL-4 (10 & mgr; g / ml), humanes TGF- & bgr; (5 ng / ml), menschliches IL- 1β (20 ng / ml), alle humanen IL-23 (20 ng / ml), humanes IL-6 (25 ng / ml) in einem serumfreien Basismedium verdünnt (ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat und 100 & mgr; M 2-Mercaptoethanol).
  4. Nachdem die Kulturplatten und Transfektionsreagenzien hergestellt, Resuspendieren der Zellen mit einer 1 ml-Mikropipette, Pipettieren vorsichtig, aber sichergestellt wird, dass alle Zellen vom Boden der Vertiefungen losgelöst werden. Pool der Zellen in einem konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C.
    HINWEIS: Für Kulturperioden länger als das Vier-Tage-Protokoll hier vorgestellten, sollten die Zellen etwa alle 3 Tage transfiziert werden, das gleiche Protokoll. Schritt 20,4 sollte jedoch geändert werden, da die mit verschiedenen kleinen RNAs behandelten Zellen sollten nicht gepoolt werden. Alle Bedingungen getestet werden müssen separat gesammelt, gezählt und transfiziert werden.
  5. aspirieren sorgfältig den Überstand, und dann die Zellen in mindestens 1 ml PBS zu waschen. Zählen Sie die Live - Th17 Zellen (zB mit einem Hämocytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluß Lebensfähigkeit zu bewerten) und überträgt dann die Zellen in ein Reaktionsgefäß.
  6. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur um die Zellen zu pelletieren.
  7. Aspirieren sorgfältig den Überstand, und dann die Zellen resuspendieren vorgesehen Resuspensionspuffer vom Transfektionssystem 10 & mgr; l - Kit mit einer Dichte von 2,5-4 x 10 7 Zellen pro ml. Halten Zellen bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Als Richtlinie nur versuchen, so viele Zellen herzustellen, wie innerhalb von 30 Minuten transfiziert werden. Mehrere Chargen können verglichen werden.
  8. In 9 ul Zellen zu 1 & mgr; l von kleinen RNA in jeder MicroCentrifuge Röhre. Pipettieren, sobald die Zellen und kleine RNAs für die Transfektion zu mischen lädt dann in die Pipettenelektrodenspitze vorgesehen.
    HINWEIS: In der Regel wird 9,5 ul Zellsuspension hinzu, um sicherzustellen, gibt es genug von der Mischung zu schaffen Blasen in der Pipettenelektrodenspitze vor der Transfektion zu verhindern.
  9. Füllen der Küvette bereitgestellt mit 3 ml Raumtemperatur Electrolytic Buffer E. Platz die Küvette in der Pipettenstation und dann die Pipette in die Position innerhalb der Küvette.
  10. Unmittelbar jeweils 10 & mgr; l Mischung von Zellen und kleinen RNA elektroporieren die folgenden Parameter: Pulsspannung 1,500-1,550 V, Impulsbreite 10 ms, und 3 Impulse Summe der auf der Transfektionseffizienz Vorrichtung.
  11. Nachdem die Elektroporation abgeschlossen ist, direkt das Zellgemisch zu 500 ul 1X Th17 polarisierenden Medien in vorbereiteten Vertiefungen einer Kulturplatte hinzuzufügen. Ort Platte in einem 5% CO 2, 37 ° C Inkubator für weitere zwei Tage.
    HINWEIS: Waschen der Pipettenelektrodenspitze durch Pipettierennach oben und unten in PBS zwischen jedem der Transfektion.

3. Ernten Menschliche Th17 Zellen

  1. Resuspendieren der Zellen in Kulturmedien mit einer Mikropipette, vorsichtiges Pipettieren aber sichergestellt wird, dass alle Zellen vom Boden der Vertiefungen abgelöst werden. Bereiten Sie die Zellen für die funktionelle und / oder Gen-Expressionsassays.
    HINWEIS: Routinemßig genug Zellen aus einer einzelnen Vertiefung von transfizierten Zellen ergeben Th17 sind zur durchflusszytometrischen Analyse der Oberflächenmarker und intrazellulären Cytokinen und Transkriptionsfaktor-Färbung oder zur Herstellung von RNA für die Genexpressionsanalyse verwendet werden.

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Representative Results

Der erste Schritt , ein zuverlässiges System erfolgreich Elektroporation Th17 menschliche Zellen zu entwickeln , war in vitro differenzierte humane Zellkulturen Th17 robust zu erzeugen. T - Zellen, die unter Th17 polarisierenden Bedingungen exprimiert den Chemokinrezeptor CCR6 und den Transkriptionsfaktor RORγt (1A, links). Dieser Marker wurde nicht exprimiert wird, wenn T - Zellen unter nicht-polarisierenden (ThN) Bedingungen (1A, rechts) kultiviert. T - Zellen, die unter Th17 polarisierenden Bedingungen auch hergestellt IL-17A nach Restimulation (1B, links) , aber nicht unter Bedingungen ThN (1B, rechts). Th17 Differenzierung auftritt nach der Transfektion mit kleinen RNAs , aber in einigen Experimenten, gibt es eine beobachtete Verringerung der Häufigkeit von IL-17A - Produktion (1C). Die Wirkung von kleinen RNA-Transfektion auf die Cytokin-Produktion zeigt die Bedeutung von innerhalb jedes Experiments zum Vergleich eine Chemie abgestimmten kleinen RNA Steuerung aufweist. Wichtig ist, die Lebensfähigkeit nach der Transfektion mit kleinen RNAs gehalten und ist typischerweise größer als 70% (Figur 1D).

Um die Effizienz dieses Protokolls zu bestimmen, verwendeten wir RNA-Interferenz. Das CD45 - Antigen wird durch die PTPRC (Proteintyrosinphosphatase, Rezeptortyp C) -Gen codiert wird . CD45 wird auf allen hämatopoetischen Zellen exprimiert und deshalb menschliche Th17 Zellen sollten robust diese Oberflächenmarker exprimieren. Transfektion von humanen Th17 Zellen am Tag 2 mit einem siRNA - Pool Targeting PTPRC reduziert stark die Expression von CD45 im Vergleich zu einem Chemie angepassten Kontroll siRNA (2A). Diese unimodale Population Verschiebung in CD45-Expression zeigt, in der Nähe von 100% Transfektionseffizienz, die typisch für dieses Protokoll für kleine RNAs. Somit ist dies ein wichtiges Instrument, das verwendet werden kann, um die Transfektion eff zu bewertenizienz während der Protokolloptimierungen. RORC RORγt kodiert, den vorherrschenden Transkriptionsfaktor der menschlichen Th17 - Zellen, die direkt an IL-17A - Produktion reguliert. Transfizieren der Entwicklung menschliche Th17 Zellen mit einem siRNA - Pool gegen RORC stark reduziert RORγt Ausdruck wie erwartet (2B). Reduktions RORγt Expression durch RNAi hatte eine funktionale Wirkung, da diese Zellen zeigten reduzierte IL-17A - Produktion (2C) im Vergleich zu Zellen , die mit einer Steuer transfiziert siRNA. Unpolarisiertes CD4 + T - Zellen sollten keine RORγt oder IL-17A exprimieren und werden als Negativkontrolle in dieser Figur gezeigt.

Abbildung 1
Abbildung 1: In vitro Differentiated Menschliche Th17 Zellen exprimieren CCR6, RORγt und IL-17A. Human - CD4 + T aus Nabelschnurblut isoliert Zellen wurden kultiviert under Th17 Bedingungen (IL-1β, IL-23, IL-6 und TGF- & bgr;) oder nicht-polarisierenden (ThN) Bedingungen (Medien nur, keine polarisierenden Cytokine oder Antikörper hinzugefügt Blockierung) in vitro und analysiert an Tag 4 für Th17 marker durch Durchflusszytometrie expression: (A) Repräsentative Konturplots Anzeigeoberfläche CCR6 und intrazellulärer RORγt Co-Färbung von CD4 + T - Zellen. Zahlen in den Quadranten zeigen Prozent CCR6 und / oder RORγt-positive Live - Singulett - CD4 + Zellen. (B) IL-17A und IFN- & ggr; Produktion nach Restimulation mit PMA / Ionomycin. Zahlen in den Quadranten anzuzeigen Prozent IL-17A und / oder IFN - y-positive Live Singulett CD4 + Zellen. (C) Repräsentative Konturplot Displays Oberfläche CCR6 und intrazellulärer RORγt Co-Färbung von CD4 + T - Zellen nach der Transfektion mit kleiner RNA - Kontrolle. Zahlen in den Quadranten zeigen Prozent CCR6 und / oder RORγt-positive Live - Singulett - CD4 + Zellen (links). Representative Konturdiagramm zeigt IL-17A und IFNy Produktion nach Restimulation mit PMA / Ionomycin nach der Transfektion mit kleiner RNA-Kontrolle. Zahlen in den Quadranten anzuzeigen Prozent IL-17A und / oder IFN - y-positive Live Singulett CD4 + Zellen (rechts). (D) Repräsentative Konturdiagramm zeigt die Lebensfähigkeit von CD4 + Zellen nach der Transfektion mit kleiner RNA - Kontrolle. Zahl gibt Prozent CD4 + Live - Singulett - Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: RNA - Interferenz in primären humanen Th17 Zellen. Human - CD4 + T - Zellen aus Nabelschnurblut , kultiviert unter Th17 Bedingungen wurden am Tag transfiziert 2 mit einer siRNA nontargeting Steuerung (siNeg Ctl) oder Targeting - Pool gegen PTPRC (si PTPRC) oder RORC (si RORC) , bestehend aus 4 einzelnen siRNAs. Die Zellen wurden dann mittels Durchflusszytometrie analysiert am Tag 4: (A) Oberflächen CD45 - Expression in einem repräsentativen Histogramms nach Transfektion mit Si PTPRC (Grauton) oder siNeg Ctl (schwarze Linie) gezeigt. (B) Intrazelluläre RORγt Expression wird in einem repräsentativen Histogramms nach Transfektion mit Si RORC (Grauton) oder siNeg Ctl (schwarze Linie) gezeigt. (C) Repräsentative Konturplots Anzeigeoberfläche CD4 und intrazellulärer RORγt co-Färbung von CD4 + T - Zellen (oberes Feld) oder IL-17A und IFN- & ggr; Produktion nach Restimulation mit PMA / Ionomycin (unterem Feld). Zahlen in den Quadranten anzuzeigen Prozent CD4 + RORγt + oder IL-17A und / oder IFN - y-positive Zellen unter Live Singulett ThN oder Th17 Bedingungen mit siNeg Ctl oder Si RORC transfiziert.fig2large.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll stellt ein verbessertes Verfahren für die Lieferung von kleinen RNAs in humanen Zellen Th17. Obwohl menschliche Zellen Th17 hier verwendet wurden, diese Methode der Elektroporation mit kleinen RNAs mit anderen primären humanen T-Helfer-Untergruppen, wie zum Beispiel Th1, Th2 und Tregs verwendet werden. Es ist nicht gut für naive CD4 + T - Zellen gearbeitet , so müssen die Zellen vor der Transfektion in Kultur aktiviert werden. Für dieses Protokoll optimierten wir zunächst das in - vitro - Kultursystem für eine bessere IL-17A - Produktion. Der größte Faktor war Basismedien. Wir fanden, dass Serum-freien Medien überlegen waren traditionelle serumhaltigen Medien für eine bessere Induktion von IL-17A produzierenden humanen Th17-Zellen. Da können Th17-Zellen mit Untergruppen der Zytokine TGF-ß, IL-1β, IL-23 und IL-6 erzeugt werden, testeten wir verschiedene Zytokin-Mischungen. In dieser Studie konnten wir robustere IL-17A-Produktion, wenn alle vier polarisierende Zytokine enthalten waren. Darüber hinaus optimiert die Verkürzung wir die Längedie Kultur, um sicherzustellen, nur eine Transfektion während der Kulturperiode notwendig war. Während dieses viertägigen Protokoll Ergebnisse ermöglicht eine schnellere erzeugt werden und erfordert nur eine Transfektion könnte Kultur Länge weiter verlängert werden, um IL-17A Produktion zu erhöhen. Eine längere Kulturdauer kann sogar notwendig sein, eine optimale Differenzierung von anderen primären T-Zell-Untergruppen zu erreichen. Da diese Transfektionen vergänglich sind, können mehrere Transfektionen im Laufe der Zeit für lange Kulturzeiten erforderlich. Wir schlagen vor, Nachfüllen von kleinen RNA-Reagenzien nach ca. 3 Tagen wieder Elektroporation der Zellen mit dem Reagenzverdünnung über mehrere Zellteilungen zu verhindern. Wir haben routinemäßig diese für Maus - CD4 + T - Zellen durchgeführt. Obwohl es technisch anspruchsvoll ist, muss, da die Zellen in jedem Zustand getrennt gesammelt und gezählt werden, ist die Transfektion erfolgreich und es gibt nur minimale Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen.

Bei diesen Versuchen wir menschliche Th17-Zellenist durch in vitro - Kultur von menschlichen Nabelschnurblut erzeugt. Wichtig ist, wäre eine alternative Option für diese Differenzierungsassay sein menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen zu verwenden (PBMCs). Für beiden CBMCs und PBMCs, ist es notwendig , CD4 + T - Zellen vor dem Beginn der Kultur zu isolieren. Wir stellen Ihnen hier unser Verfahren zur Reinigung von CD4 + T - Zellen durch negative Selektion, die robuste Transfektionseffizienz ergab, aber wir erwarten , dass andere Methoden der primären humanen CD4 + T - Zellen , die Vorbereitung ebenso gut funktionieren würde. Wir haben mehrere Kits versucht , die entweder positive oder negative Selektion zur Isolierung von Maus - CD4 + T - Zellen und beiden Methoden haben in ähnlicher Transfektionseffizienz geführt. Eine weitere Überlegung ist die Bedeutung der Verwendung von naiven T-Zellen, um optimal in Th17-Zellen zu differenzieren. Mit Blut menschlicher Schnur ist aus diesem Grunde vorteilhaft, da sie bereits einen höheren Anteil an naiven T-Zellen pübel nehmen und daher ist es nicht notwendig, zu sortieren oder vorge bereichert für naive T-Zellen vor dem Beginn der Kultur. Allerdings ist ein klarer Nachteil dieses Ansatzes die begrenzte Verfügbarkeit von Nabelschnurblut. Alternativ 14 Sortierung von naiven T - Zellen aus PBMCs kann vor der Kultur durchgeführt werden , da diese Ressource leichter verfügbar ist, obwohl große Mengen müssen erhalten werden würden.

Zwar gibt es mehrere Methoden zur Transfektion von Säugetierzellen sind, neigen dazu, primäre T-Zellen, eine schwierigere Zelltyp zu sein, zu transfizieren. Die nächste Generation der Elektroporation ist eine erfolgreiche physikalische Methode von transient transfizieren T-Zellen, die technisch leicht durchzuführen und ist reproduzierbar. Einmal optimiert, hat es eine sehr hohe Effizienz der Transfektion für kleine RNAs, die 100% annähert. Dies ist in Abbildung 2 zu sehen ist , wo die gesamte unimodale Population von CD45 + Zellen (2A) und dem POpulation aller Zellen RORγt (2B) Verschiebung zu einem niedrigeren Expressionsniveau ausdrückt. Wichtig ist, dass optimierte Transfektion mit kleinen RNAs beeinträchtigt nicht die Lebensfähigkeit der Zellen. Wir beobachten , routinemäßig mehr als 70% Lebensfähigkeit nach der Transfektion mit kleinen RNAs (1D). Obwohl die Lebensfähigkeit mit diesem Protokoll ist kein Problem, wird die Biologie von anderen T-Zell-Eigenschaften, wie Cytokin-Produktion kann nach der Transfektion mit kleinem RNAs beeinflusst. Aus diesem Grund ist es von entscheidender Bedeutung, eine Chemie abgestimmten kleinen RNA-Kontrolle in jedem Experiment zu verwenden.

Wir optimieren die zwei Elektroporationsparameter, Puls und Spannung, für den Zelltod zu minimieren und die Transfektionseffizienz zu maximieren. Höhere Spannungen erhöhen Zelltod während der Transfektion. Einige andere technische Überlegungen zu verhindern Zelltod und gewährleisten eine erfolgreiche Transfektion umfassen die Menge an synthetischen verwendeten Reagenzien zu minimieren und die Begrenzung der Zeit zwische n Zellpräparation und Elektroporation. Minimale Konzentrationen notwendig für synthetische Transfektionsreagentien sollten immer verwendet werden, um potentielle T-Zell-Toxizität zu verhindern und Nebeneffekte. Zelle Vorbereitungszeit vor der Transfektion Verringerung der Zeit von Zellen in Transfektionspuffer zu minimieren bei Raumtemperatur entscheidend ist, und kann durch Herstellung Zellen in den Reihen, falls erforderlich erreicht werden.

Derzeit gibt es zwei im Handel erhältliche Elektroporation nächste Generation Instrumente. Beide Systeme können effizient primäre T-Zellen transfizieren. Dieses Protokoll wurde mit dem Neon Transfektionssystem optimiert. Während dieses Transfektionssystem kostengünstiger ist, bietet das amaxa System eindeutig einen 96-Well-Adapter für die Elektroporation für höhere Durchsatzanwendungen. Wir hoffen, dass zusätzliche kommerzielle Weiterentwicklungen den Durchsatz und die Effizienz dieser Transfektionssystemen wird weiter zunehmen, während die Kosten auf einem Minimum zu halten.

„> Next Generation Elektroporation von humanen T-Zellen effizient kleine RNAs mit siRNAs gegen Zielgen von Interesse einzuführen, wie in diesem Protokoll sowie miRNA imitiert oder Inhibitoren veranschaulicht. Die hohe Effizienz macht es unnötig Marker die Transfektion zu verwenden, da fast jede Zelle mit kleinen RNAs transfiziert. Es handelt sich hierbei im Gegensatz zu der Transfektion von primären T-Zellen, die mit DNA-Plasmiden, wo typische Plasmid Transfektionen in nur 20-30% der Expression des Markergens mit mehr als 50% Toxizität führen, die mit steigenden Mengen an Plasmid erhöht. Introducing synthetische Mimetika dieser Methode wurde für Dutzende von Genen erlaubt für molekulares Klonieren 12, 13 ohne die Notwendigkeit für die Funktion in T - Zell - Biologie parallel gescreent werden. Es hat sich auch Tests für die Funktion aller exprimierten miRNAs durch T - Zellen in parallelen 11 aktiviert , 13. Mit diesem ProtokollDiese Art von moderaten Durchsatz-Screenings sind auf humane T-Zellen. Bemerkenswerterweise wurde diese Technik kürzlich einzuführen kleine RNA (gRNA) -Cas9 Ribonukleoprotein - Komplexe in primären menschlichen T - Zellen für die Genom Bearbeitung 15 verwendet. Diese vielfältigen Anwendungen unterstreichen die Nützlichkeit, Flexibilität und Leistung des Protokolls hier als wichtiges Instrument präsentiert für Immunologen der Suche nach T-Zell-Biologie zu studieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

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References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28, (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27, (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14, (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47, (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8, (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10, (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40, (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15, (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35, (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15, (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44, (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), 10437-10442 (2015).

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