Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation

Published 4/13/2017
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Immunology and Infection

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Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

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Abstract

Introduction

Cellules T CD4 + sont orchestrateurs essentiels de la réponse immunitaire adaptative. Naïf cellules T CD4 + sont capables de se développer en plusieurs différentes cellules T effectrices (par exemple , Th1, Th2, Th17, etc.), chacun avec son propre ensemble de cytokines caractéristiques et des facteurs de transcription, en fonction du micro - environnement local 1. Les décisions de la lignée que les cellules T font sont essentielles tant pour l'immunité protectrice et la tolérance à l'auto. Les cellules Th17 sont un sous - ensemble de cellules T connues pour lutter contre les bactéries extracellulaires et les champignons, mais les réponses inappropriées sont également impliqués dans la pathogenèse de multiples maladies auto - immunes et inflammatoires telles que la sclérose en plaques et le psoriasis 2, 3. Th17 cellules humaines peuvent être générées à partir de cellules naïves T CD4 + in vitro en leur fournissant un environnement approprié de polarisation 4. Vario nous combinaisons ont été utilisées des cytokines IL-1β, IL-23, TGFß, et l'IL-6 pour le développement des cellules Th17 humaines. Th17 cellules humaines expriment CCR6, un récepteur de chimiokine qui est couramment utilisé pour identifier cette population de cellules et sont définies par l'expression de leur facteur de transcription principale, RORγt (codée par RORC) 5, 6. les cellules Th17 ont la capacité d'exprimer des cytokines multiples, mais IL-17A est la cytokine effectrice définissant lignée produite par ces cellules. Nous avons examiné l'expression des trois marqueurs associés Th17 (CCR6, RORγt, IL-17A) pour évaluer la solidité de notre essai de différenciation Th17 in vitro humaine. De plus, nous avons cultivé des cellules T CD4 + humains dans des conditions non-polarisation, où aucune des cytokines ou des anticorps bloquants ont été ajoutés aux milieux de culture à utiliser comme contrôle négatif puisque l' expression de ces marqueurs Th17 devrait être très faible ou absente.

ve_content "> Une façon d'étudier le développement normal des cellules T humaines et de la biologie est de manipuler l'expression génique au cours de leur développement. ARN court interférent (ARNsi) sont des petites molécules d'ARN synthétiques qui ciblent les ARNm codant pour des protéines et peuvent être utilisés pour réduire l'expression d'un gène spécifique . Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants endogènes connus pour moduler miARN post-transcriptionnelle l' expression génique. ont été montré à jouer un rôle important dans les deux murin et la biologie des cellules T humaines, y compris dans les cellules Th17 7, 8, 9. Il est essentiel de disposer de méthodes fiables de manipulation petite activité d'ARN dans les cellules T humaines pour étudier leurs effets sur l'expression des gènes et, finalement, sur la biologie des cellules T humaines. ici, nous décrivons un outil facile à utiliser, protocole cohérent et fiable que nous avons développé pour l'introduction les petits ARN et des acides nucléiques verrouillés (LNA synthétiques, des acides nucléiques modifiés chimiquement avec une stabilité accrue)dans les cellules immunitaires, et plus spécifiquement dans les cellules Th17 humaines.

Il existe plusieurs méthodes alternatives de l' introduction de petits ARN dans les cellules de mammifères, qui se situent généralement dans des catégories chimiques, biologiques ou physiques 10. Couramment utilisés méthodes chimiques, y compris transfections à base de lipides et transfections calcium-phosphate, reposent sur la création de complexes ADN chimique qui sont plus efficacement absorbé par les cellules. En général, les méthodes chimiques ne sont pas aussi efficaces pour la transfection de cellules T primaires. Le procédé biologique la plus courante consiste à utiliser un vecteur viral (par exemple, retrovirus ou lentivirus), qui insère directement l' ARN étranger dans un hôte en tant que partie de son cycle de replication naturel. transduction virale prend généralement plus de temps, en particulier lorsque l'on tient compte du temps pour le clonage moléculaire des plasmides proviraux. En outre, des vecteurs de transduction viraux peuvent être potentiellement dangereux pour les chercheurs humains. L'électroporation est une physique méthode d'induire la perméabilisation de la membrane en soumettant les cellules à des impulsions à haute tension, ce qui permet d'entrer des acides nucléiques de manière transitoire dans la cellule où ils peuvent agir sur leur cible. Les instruments traditionnels de électroporation ne sont pas efficaces pour transfecter les lymphocytes primaires. Cependant, l'électroporation de la prochaine génération optimisée est avérée être capable de transfecter des cellules T à un rendement très élevé, en particulier lorsque le matériau à transfecter est un petit ARN. Le terme de nouvelle génération est vaguement utilisé pour différencier les deux nouvelles plates - formes (par exemple, Neon, Amaxa) de machines d'électroporation traditionnelles. En outre, cette méthode est facilement extensible pour des écrans de débit modéré avec jusqu'à environ 120 petits ARN en une seule expérience, souvent en utilisant des réactifs de synthèse validés. Il est important, transfections succès peut être atteint en moins de 16 h après l'activation des lymphocytes T. L'inconvénient de cette méthode, cependant, est qu'il ne donne pas lieu à incorporati génomique stablesur, et est donc transitoire. Par conséquent, il vaut l'effort supplémentaire pour créer une construction d'expression stable qui peut être emballé dans un vecteur viral et exprimé avec succès dans les cellules T dans les cas où l'expression à long terme d'un petit ARN est nécessaire.

Nous avons utilisé une transfection de prochaine génération (par exemple, le néon) pour délivrer ARN simple brin ou double brin synthétiques ou divers outils oligonucléotides LNA à des fins différentes 11, 12, 13. L'interférence ARN efficace peut être induite chez la souris et les cellules T primaires humains en utilisant l'ARN court interférant double brin (siRNA). Ce protocole décrit les conditions optimales pour l'utilisation de cette technique dans les cellules Th17 humaines. En plus de siARN, imitateurs miARN synthétiques et les inhibiteurs disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour étudier le gain miARN et la perte de la fonction. imite miARN sont des molécules d'ARN double brin très semblables à ARNsi, mais designed avec la séquence de miARN matures endogènes. les inhibiteurs de miARN sont d'ARN modifiés chimiquement et / ou LNA à base d'oligonucléotides simple brin qui se lient aux miRNAs natifs et antagonisent leur fonction. Nous avons constaté que tous ces outils peuvent être utilisés efficacement dans les lymphocytes T primaires en culture, y compris, mais sans s'y limiter, les cellules Th17 humaines.

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Protocol

Ce protocole est conforme aux directives de l'UCSF pour l'éthique de la recherche humaine.

1. Préparation de T culture cellulaire, l' isolement des cellules T CD4 +, et Th17 Polarisation

  1. Le jour 0, le manteau 6 puits des plaques de culture de tissu avec 1,5 ml par puits d'anti-CD3 humain (2 pg / ml) et du CD28 anti-humain (4 pg / mL) dans du PBS avec du calcium et du magnésium pendant au moins 2 h à 37 ° C.
    1. En variante, revêtir les plaques pendant une nuit à 4 ° C. Envelopper les plaques dans parafilm.
  2. Préparer les cellules mononucléaires de sang de cordon (CBMCs) par centrifugation à gradient de densité selon les instructions du fabricant.
    ATTENTION: Travailler avec soin et assurer l'équipement de protection individuelle (EPI) est porté lors de la manipulation du sang humain afin d'éviter tout risque d'exposition à des agents pathogènes transmissibles par le sang.
  3. Une fois que les cellules mononucléaires ont été isolées et lavées, effectuer CD4 + humaines isolement des cellules T par SELE négativection utilisant un kit commercial CD4 humain + T cellulaire.
    NOTE: En cas de contamination de globules rouges après l' isolement des cellules mononucléaires, une lyse des globules rouges en option peut être effectuée avant les étapes d'isolement des cellules T CD4 +. Remettre en suspension les cellules mononucléaires dans 1 ml de tampon d'isolement (FBS à 2% dans du PBS). Ajouter 5 ml de solution 1x lyser. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Puis ajouter 5 ml de tampon d'isolement et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules.
    1. Remettre en suspension les cellules mononucléaires à une densité de 50 x 10 6 par 500 ul dans le tampon d'isolement dans un nouveau tube de 5 ml.
    2. Ajouter 100 pl de FBS et 100 ul du mélange d'anticorps par tube puis incuber chaque tube à 4 ° C pendant 20 min sur un agitateur orbital pour bien mélanger.
    3. Après l'incubation, ajouter 3-4 ml de tampon d'isolement pour se laver les cellules. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 8 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules. Aspirer soigneusement le supernatant
    4. Au cours de cette rotation, pré-laver les billes magnétiques. Transférer la quantité voulue de billes magnétiques dans un nouveau tube (utilisé à 1: 1 avec les cellules) et ajouter un volume égal de tampon d'isolement pour laver les perles. Bien mélanger à l'aide d'une micropipette de 1 ml, puis placer le tube dans l'aimant pendant au moins 1 min. Aspirer délicatement le surnageant. Remettre en suspension les billes magnétiques dans le même volume initialement transféré avant le lavage.
    5. Resuspendre les cellules dans chaque tube 500 ul du tampon d'isolement et ajouter 500 ul de billes magnétiques prélavés.
    6. Incuber les cellules avec les billes magnétiques pendant 15 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante (18 ° C à 25 ° C) pour bien mélanger.
    7. Après l'incubation, pipeter soigneusement les cellules en utilisant une micropipette de 1 ml au moins 10 fois. Puis ajouter 3-4 ml de tampon d'isolement et de placer chaque tube dans l'aimant pendant 2 min.
    8. Transférer délicatement les cellules T CD4 + négativement sélectionnés qui sontle surnageant dans un nouveau tube.
  4. Une fois CD4 + T isolement cellulaire est terminée, compter les cellules avec un hémocytomètre et maintenir les cellules sur la glace.
  5. Laver les plaques revêtues d'anticorps deux fois avec du PBS. Puis ajouter 1,5 ml de 2 x mélange de médias Th17-polarisation dans chaque puits: IFNy anti-humain (20 ug / mL), IL-4 (20 ug / mL), le TGFß humain (10 ng / ml), anticorps anti-humain IL-1β (40 ng / mL), IL-23 (40 ng / mL), IL-6 (50 ng / mL) humain tout dilué dans un milieu de base exempt de sérum (supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 humaine U / mL de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 10 mM de HEPES, du pyruvate de sodium 1 mM et 100 pM de 2-mercaptoéthanol).
    REMARQUE: Transfection et l'interférence ARN ne fonctionne dans un milieu contenant du sérum. Le but de l'utilisation des milieux sans sérum avec ce protocole est de parvenir à une meilleure production d'IL-17A.
  6. Centrifuger les cellules T CD4 + humaines à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C pour les cellules pastille. Aspirer soigneusement le supernatfourmi. Ensuite , remettre en suspension les cellules dans des milieux de base sans sérum et plaquer les cellules à une densité de 3 x 10 6 à 1,5 ml par puits de sorte que le volume final est de 3 mL par puits et cytokines polarisantes sont maintenant à une concentration finale 1x.
    1. Placer les plaques dans 5% de CO2, 37 ° C incubateur pendant deux jours.

2. électroporation in vitro humaine Th17 cellules polarisants

  1. Le jour 2, le manteau 48 puits des plaques de culture tissulaire de 250 ul par puits d'anti-CD3 humain (2 pg / ml) et du CD28 anti-humain (4 pg / mL) dans du PBS avec du calcium et du magnésium pendant au moins 2 h à 37 ° C.
    1. En variante, revêtir les plaques pendant une nuit à 4 ° C. Envelopper les plaques dans parafilm.
  2. Préparer les petits ARN pour la transfection. Pour chaque transfection, une aliquote ul d'une solution mère de 5 pM de siRNA dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Inclure petit ARN Contr adapté de la chimie appropriéeol. Gardez tous les tubes sur la glace.
  3. Laver les plaques revêtues d'anticorps deux fois avec du PBS. Ensuite, ajouter 500 ul de milieux 1X Th17 polarisant à chaque puits: IFNy anti-humain (10 ug / mL), IL-4 anti-humain (10 ug / ml), le TGFß humain (5 ng / ml), IL-humain 1β (20 ng / mL), IL-23 (20 ng / mL) humaine, l'IL-6 (25 ng / mL) humain tout dilué dans un milieu de base exempt de sérum (supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 10 mM de HEPES, du pyruvate de sodium 1 mM et 100 pM de 2-mercaptoéthanol).
  4. Après que les plaques de culture et les réactifs de transfection sont préparés, remettre en suspension les cellules avec 1 mL d'une micropipette, mais un léger pipetage assurant que toutes les cellules sont détachées du fond des puits. Regrouper les cellules dans un tube conique et centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
    NOTE: Pour les périodes de culture plus longues que le protocole de quatre jours présenté ici, les cellules doivent être transfecté environ tous les 3 jours en utilisant ce même protocole. Étape 2.4 devrait être modifié cependant, puisque ne doivent pas être mis en commun les cellules traitées avec différentes petits ARN. Toutes les conditions à l'essai doivent être collectées, comptées, et transfectés séparément.
  5. Aspirer délicatement le surnageant, puis remettre les cellules dans au moins 1 ml de PBS à laver. Compter les cellules Th17 vivantes (par exemple , avec un hémocytomètre en utilisant l' exclusion Trypan Bleu pour évaluer la viabilité) et ensuite transférer les cellules à un tube de microcentrifugeuse.
  6. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un culot des cellules.
  7. Aspirer soigneusement le surnageant, remettre en suspension et ensuite les cellules en utilisant le tampon de remise en suspension fourni par le système de transfection kit 10 ul à une densité de 2,5-4 x 10 7 cellules par ml. Gardez les cellules à la température ambiante.
    NOTE: À titre indicatif, essayez de préparer uniquement autant de cellules que peuvent être transfectées dans les 30 minutes. Plusieurs lots peuvent être comparés.
  8. Ajouter 9 uL de cellules à 1 ul de petits ARN dans chaque MicroCTube entrifuge. Pipeter une fois pour mélanger les cellules et les petits ARN pour la transfection puis charger dans l'embout avec l'électrode de pipette
    NOTE: En règle générale, ajouter 9,5 ul de suspension de cellules pour assurer qu'il y a suffisamment du mélange pour éviter la formation de bulles dans la pointe de l'électrode de pipette avant la transfection.
  9. Remplir la cuvette fournie avec 3 ml de la température ambiante tampon E. Placer Electrolytic la cuvette dans la station de pipette, puis placer la pipette en position à l'intérieur de la cuvette.
  10. Immédiatement électroporation chaque mélange 10 pl de cellules et de petits ARN en utilisant les paramètres suivants: tension d'impulsion 1,500-1,550 V, largeur d'impulsion de 10 ms, et 3 impulsions du total sur le dispositif de transfection.
  11. Après l'électroporation est terminée, ajouter directement le mélange de cellules à 500 pi de milieu polarisant Th17 1X dans des puits préparés d'une plaque de culture. Placer les plaques dans 5% de CO 2, incubateur à 37 ° C pendant deux jours.
    REMARQUE: Lavez la pointe d'électrode de pipette par pipetagede haut en bas dans du PBS entre chaque transfection.

3. Récolte Th17 cellules humaines

  1. Resuspendre les cellules dans des milieux de culture avec une micropipette, un léger pipetage, mais faire en sorte que toutes les cellules sont détachées du fond des puits. Préparer les cellules pendant fonctionnels et / ou des essais d'expression génique.
    NOTE: En routine, on obtient des résultats suffisamment de cellules à partir d'un seul puits de cellules transfectées Th17 à utiliser pour l'analyse cytométrique d'écoulement du marqueur de surface et de cytokine intracellulaire et coloration facteur de transcription ou pour la préparation de l'ARN pour l'analyse de l'expression génique.

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Representative Results

La première étape pour l' élaboration d' un système fiable de électroporation avec succès les cellules Th17 humaines était de générer in vitro robuste différenciées des cultures de cellules Th17 humaines. Les cellules T cultivées dans des conditions de polarisation de Th17 ont exprimé le récepteur de chimiokine CCR6 et le facteur de transcription RORγt (figure 1A, gauche). Ces marqueurs ne sont pas exprimés lorsque les lymphocytes T ont été cultivées dans des conditions non-polarisant (THN) (Figure 1A, à droite). Les cellules T cultivées dans des conditions de polarisation de Th17 ont également produit IL-17A sur restimulation (figure 1B, à gauche) , mais pas dans des conditions THN (figure 1B, à droite). La différenciation Th17 persiste après la transfection avec de petits ARN mais dans certaines expériences, il y a une réduction observée de la fréquence de la production d' IL-17A (Figure 1C). L'effet de la petite transfection d'ARN sur la production de cytokines démontre l'importance d'avoir une petite commande de l'ARN identifié de la chimie pour la comparaison dans chaque expérience. Fait important, la viabilité est maintenue après la transfection avec de petits ARN et est typiquement supérieure à 70% (Figure 1D).

Pour déterminer l'efficacité de ce protocole, nous avons utilisé l'interférence ARN. L'antigène CD45 est codée par la PTPRC (protéine tyrosine phosphatase, type récepteur C) gène. CD45 est exprimé sur toutes les cellules hématopoïétiques et donc les cellules Th17 humaines doit exprimer ce marqueur avec vigueur surface. Transfection de cellules Th17 humains au jour 2 avec une piscine siRNA ciblant PTPRC réduit fortement l'expression de CD45 par rapport à une composition chimique adaptée siRNA contrôle (figure 2A). Ce changement de la population unimodale dans l'expression CD45 indique près de 100% d'efficacité de transfection, typique de ce protocole pour les petits ARN. Ainsi, c'est un outil important qui peut être utilisé pour évaluer la transfection effcacité au cours des optimisations du protocole. RORC code RORγt, le facteur de transcription prédominant de cellules Th17 humains, qui régit directement la production d' IL-17A. Transfecter développement des cellules Th17 humaines avec une piscine siRNA contre RORC fortement réduit l' expression RORγt comme prévu (figure 2B). La réduction de l' expression RORγt par RNAi a un effet fonctionnel, que ces cellules présentaient réduit la production d' IL-17A (figure 2C) par rapport à des cellules transfectées avec un siRNA contrôle. CD4 non polarisés + cellules T ne devraient pas exprimer une RORγt ou IL-17A et sont présentés en tant que témoin négatif dans cette figure.

Figure 1
Figure 1: in vitro cellules différentiées Th17 humaine express CCR6, RORγt et IL-17A. Human cellules T CD4 + isolées à partir du sang du cordon ombilical ont été cultivées under conditions Th17 (IL-1β, IL-23, IL-6, et TGFß) ou dans des conditions de non-polarisation (THN) (médias seulement, pas de cytokines polarisantes ou de blocage d' anticorps ajoutés) in vitro et analysés au jour 4 pour le marqueur Th17 expression par cytométrie de flux: (A) la surface d'affichage de tracés de contour représentant CCR6 et la co-coloration RORγt intracellulaire de cellules T CD4 +. Les chiffres indiquent pour cent quarts de cercle CCR6 et / ou des cellules CD4 RORγt positives singlet en direct +. (B) de production d' IL-17A et IFNy après restimulation avec PMA / ionomycine. Les chiffres en quadrants pour cent indiquent IL-17A et / ou singulet direct IFNy positif des cellules CD4 +. (C) tracé de contour représentatives affiche surface CCR6 et la co-coloration RORγt intracellulaire de lymphocytes T CD4 + après la transfection avec une petite commande de l' ARN. Les chiffres indiquent pour cent quarts de cercle CCR6 et / ou des cellules CD4 RORγt positives singlet en direct + (gauche). Representatracé de contour tive affiche la production d'IL-17A et IFNy après restimulation avec PMA / ionomycine post-transfection avec une petite commande de l'ARN. Les chiffres en quadrants pour cent indiquent IL-17A et / ou singulets en direct IFNy-positives cellules CD4 + ( à droite). (D) tracé de contour représentatif présente une viabilité des cellules CD4 + après la transfection avec une petite commande de l' ARN. Nombre indique pour cent cellules CD4 + singlet en direct. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: ARN interférence dans les cellules primaires humaines Th17. Les cellules T CD4 + humains du sang du cordon ombilical cultivées dans des conditions Th17 ont été transfectés le jour 2 avec un siRNA contrôle nontargeting (siNeg ctrl) ou le ciblage piscine contre PTPRC (si PTPRC) ou RORC (si RORC) comprenant 4 siRNA individuels. Les cellules ont ensuite été analysées par cytométrie de flux au jour 4: (A) Surface expression de CD45 représenté sur un histogramme représentant après transfection avec si PTPRC (teinte grise) ou siNeg Ctl (ligne noire). (B) expression intracellulaire RORγt est représenté dans un histogramme représentant après transfection avec si RORC (teinte grise) ou siNeg Ctl (ligne noire). (C) des tracés de contours représentatifs afficher RORγt CD4 et intracellulaire surface co-coloration des cellules T CD4 + (panneau supérieur) ou IL-17A et la production d' IFNy après restimulation avec PMA / ionomycine (panneau inférieur). Les chiffres en quadrants pour cent indiquent CD4 + RORγt + ou IL-17A et / ou des cellules de singulet en direct IFNy-positifs dans des conditions THN ou Th17 transfectées avec siNeg Ctl ou si RORC.fig2large.jpg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ce protocole fournit un procédé amélioré pour la livraison de petits ARN dans des cellules Th17 humains. Bien que les cellules Th17 humains ont été utilisés ici, cette méthode de électroporation avec de petits ARN peut être utilisé avec d'autres sous-ensembles T auxiliaires humain primaire, comme Th1, Th2 et Treg. Il n'a pas bien fonctionné pour naïfs cellules T CD4 + de sorte que les cellules doivent être activées dans la culture avant la transfection. Pour ce protocole, nous avons optimisé le système de culture in vitro pour une meilleure production d' IL-17A. Le plus grand facteur était les médias base. Nous avons constaté que des milieux sans sérum était supérieure aux médias traditionnels contenant du sérum pour une meilleure induction de l'IL-17A production de cellules Th17 humaines. Etant donné que les cellules Th17 peuvent être générés avec des sous-ensembles des cytokines TGFß, IL-1 ß, l'IL-23 et IL-6, nous avons testé différents mélanges de cytokines. Dans cette étude, nous avons réalisé la production d'IL-17A plus robuste lorsque les quatre cytokines polarisantes ont été inclus. De plus, nous avons optimisé raccourcir la longueur dela culture pour assurer une seule transfection était nécessaire pendant la période de culture. Bien que ce protocole de quatre jours permet des résultats de générer plus rapidement et nécessite une seule transfection, la longueur de la culture pourrait être rallongée pour augmenter encore la production d'IL-17A. Une période de culture plus longue peut même être nécessaire pour obtenir une différenciation optimale des autres sous-ensembles de cellules T primaires. Étant donné que ces transfections sont transitoires, plusieurs transfections peuvent être nécessaires au fil du temps pour de longues périodes de culture. Nous vous suggérons de réapprovisionner les petits réactifs d'ARN après environ 3 jours par re-électroporation les cellules avec le réactif pour éviter la dilution sur plusieurs divisions cellulaires. Nous avons régulièrement fait pour souris des cellules T CD4 +. Bien qu'il soit techniquement plus difficile, car doivent recueillir les cellules dans chaque état et comptées séparément, la transfection est réussie et il y a des effets minimes sur la viabilité des cellules.

Dans ces expériences, les cellules Th17 humaines nousre produite par la culture in vitro du sang de cordon ombilical humain. Fait important, une option alternative pour cet essai de différenciation serait d'utiliser des cellules mononucléaires de sang périphérique humain (PBMC). Pour les deux CBMCs et CMSP, il est nécessaire d'isoler les cellules T CD4 + avant le début de la culture. Nous présentons ici notre méthode de purification de cellules T CD4 + par sélection négative, ce qui a donné l' efficacité de transfection robuste, mais nous nous attendons à d' autres méthodes de préparation de cellules T CD4 + primaires humaines fonctionnerait aussi bien. Nous avons essayé plusieurs kits qui utilisent soit la sélection positive ou négative pour l'isolement de souris des cellules T CD4 + et les deux méthodes ont donné lieu à l' efficacité de transfection similaire. Une autre considération est l'importance d'utiliser des cellules T naïves afin de différencier de manière optimale dans les cellules Th17. L'utilisation du sang de cordon humain est avantageux pour cette raison, car il a déjà une proportion plus élevée de cellules T naïves pet donc renvoyé est pas nécessaire de trier ou de pré-enrichissement pour les cellules T naïves avant le début de la culture. Cependant, un inconvénient évident de cette approche est la disponibilité limitée du sang du cordon ombilical. Alternativement, le tri des cellules T naïves de PBMC 14 peut être réalisée avant la culture car cette ressource est plus facilement disponible, bien que de grandes quantités devraient être obtenues.

Bien qu'il existe plusieurs méthodes pour la transfection de cellules de mammifères, les cellules T primaires ont tendance à être un type cellulaire plus difficile à transfecter. La prochaine génération électroporation est une méthode physique réussie de cellules T qui est transfecter transitoirement techniquement facile à réaliser et est reproductible. Une fois optimisé, il a une très grande efficacité de transfection pour les petits ARN qui approche les 100%. Cela peut être vu dans la figure 2 , où l'ensemble de la population unimodale de cellules CD45 + (figure 2A) et la population de toutes les cellules exprimant le décalage RORγt (figure 2B) à un niveau d'expression plus faible. Fait important, la transfection optimisée avec de petits ARN ne compromet pas la viabilité cellulaire. Nous observons régulièrement plus de 70% après la transfection de viabilité avec petits ARN (figure 1D). Bien que la viabilité est pas un problème avec ce protocole, la biologie des autres caractéristiques des cellules T, telles que la production de cytokines, peut être affectée après la transfection avec de petits ARN. Pour cette raison, il est extrêmement important d'utiliser un petit ARN contrôle adapté chimie dans chaque expérience.

Nous avons optimisé deux paramètres d'électroporation, le pouls et la tension, pour minimiser la mort cellulaire et de maximiser l'efficacité de transfection. Tensions plus élevées augmentent la mort cellulaire lors de la transfection. D'autres considérations techniques pour prévenir la mort cellulaire et assurer une transfection réussie comprennent en minimisant la quantité de réactifs de synthèse utilisés et en limitant le temps betwee n préparation de cellules et l'électroporation. Les concentrations minimales nécessaires pour les réactifs de transfection de synthèse doivent toujours être utilisés pour prévenir la toxicité potentielle des cellules T et les effets hors-cible. La réduction du temps de préparation de la cellule avant transfection de minimiser le temps de cellules dans du tampon de transfection à la température ambiante est cruciale et peut être réalisé en préparant des cellules en lots, si nécessaire.

À l'heure actuelle, il existe deux instruments d'électroporation de nouvelle génération disponibles dans le commerce. Ces deux systèmes peuvent efficacement transfecter des cellules T primaires. Ce protocole a été optimisé à l'aide du système de transfection au néon. Bien que ce système de transfection est plus rentable, le système unique Amaxa offre un adaptateur à 96 puits pour l'électroporation pour les applications de débit plus élevé. Nous espérons que les progrès commerciaux supplémentaires continueront d'augmenter le débit et l'efficacité de ces systèmes de transfection, tout en gardant les coûts au minimum.

« > La prochaine génération électroporation des cellules T humaines peut introduire efficacement les petits ARN dont ARNsi contre les gènes cibles d'intérêt comme en témoigne dans ce protocole, ainsi que imitateurs miRNA ou inhibiteurs. Le rendement élevé, il est inutile d'utiliser des marqueurs de transfection depuis presque toutes les cellules est transfectée avec de petits ARN. Ceci est en contraste avec la transfection de cellules T primaires avec des plasmides d'ADN où transfections plasmidiques typiques conduisent à seulement 20 à 30% l'expression du gène marqueur avec plus de 50% la toxicité qui augmente avec des quantités croissantes de plasmide. Présentation imite synthétiques à l' aide de cette méthode a permis de douzaines de gènes à être criblés pour fonction dans la biologie des cellules T en parallèle sans qu'il soit nécessaire pour le clonage moléculaire 12, 13. Il a également des tests activé pour la fonction de tous les miRNAs exprimé par les cellules T en parallèle 11 13. Avec ce protocole, Ces types d'écrans de débit modérés sont applicables aux cellules T humaines. En particulier, cette technique a récemment été utilisée pour introduire des petits ARN (gARN) complexes -Cas9 ribonucléoprotéiques dans les cellules T humaines primaires pour l' édition du génome 15. Ces diverses applications mettent en évidence l'utilité, la flexibilité et la puissance du protocole présenté ici comme un outil important pour les immunologistes qui cherchent à étudier la biologie des lymphocytes T.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

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References

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