Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

Published 4/13/2017
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Immunology and Infection

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Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

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Abstract

Introduction

Células T CD4 + son orchestrators cruciales de la respuesta inmune adaptativa. Células T CD4 + vírgenes son capaces de desarrollar en varias células T efectoras diferentes (por ejemplo, Th1, Th2, Th17, etc.), cada uno con su propio conjunto de citocinas características y factores de transcripción, dependiendo de la microentorno local 1. Las decisiones del linaje que las células T hacen son críticos tanto para la inmunidad protectora y la tolerancia a la libre. Células Th17 son un subconjunto de células T conocidos para combatir bacterias y hongos extracelulares, pero sus respuestas incorrectas también están implicados en la patogénesis de múltiples enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como esclerosis múltiple y psoriasis 2, 3. Células Th17 humanos pueden ser generados a partir de células T CD4 + vírgenes in vitro, proporcionándoles un ambiente de polarización apropiado 4. Vario nos combinaciones de las citoquinas IL-1β, IL-23, TGF, y IL-6 se han utilizado para el desarrollo de las células Th17 humanos. Células Th17 humanos expresan CCR6, un receptor de quimioquinas que se utiliza comúnmente para identificar esta población de células y se define por la expresión de su director factor de transcripción, RORγt (codificada por RORC) 5, 6. células Th17 tienen la capacidad de expresar múltiples citocinas, pero IL-17A es la citoquina efectora linaje-definir producido por estas células. Se examinó la expresión de los tres marcadores Th17-asociado (CCR6, RORγt, IL-17A) para evaluar la solidez de nuestro ensayo de diferenciación humana Th17 in vitro. Además, se cultivaron células T CD4 + humanas en condiciones no polarización, donde no se añadieron citoquinas o anticuerpos de bloqueo a los medios de cultivo para su uso como un control negativo ya que la expresión de estos marcadores Th17 debe ser muy baja o ausente.

ve_content "> Una manera de estudiar el desarrollo humano normal T biología celular y es manipular la expresión génica durante su desarrollo.-ARN corto de interferencia (ARNsi) son pequeñas moléculas de ARN sintéticos que se dirigen a ARNm codificantes de proteínas y pueden ser utilizados para reducir la expresión de genes específicos . microARNs (miARN) son endógenos no codificantes ARN pequeños conocidos para modular la expresión del gen post-transcripcionalmente. miRNAs han sido demostrado que desempeñan un papel importante tanto en murino y la biología de células T humanas, incluso en las células Th17 7, 8, 9. se es crucial tener métodos fiables de manipulación de la actividad de ARN pequeño en las células T humanas para estudiar sus efectos sobre la expresión de genes y en última instancia, sobre la biología de células T humanas. a continuación, describimos un protocolo fácil de uso, consistente y fiable que hemos desarrollado para introducir pequeños RNAs sintéticos y ácidos nucleicos bloqueados (LNA, modificar químicamente los ácidos nucleicos con una mayor estabilidad)en células inmunes, y específicamente en células Th17 humanos.

Hay varios métodos alternativos de introducción de pequeños ARN en células de mamífero, que generalmente se dividen en categorías químicas, biológicas o físicas 10. métodos químicos normalmente usados, incluyendo transfecciones basadas en lípidos y transfecciones de calcio-fosfato, se basan en la creación de complejos de ADN-químico que se toman más eficientemente por las células. En general, los métodos químicos no son tan eficientes para la transfección de células T primarias. El método biológico más común es usar un vector viral (por ejemplo, retrovirus o lentivirus), que inserta directamente ARN extraño en un huésped como parte de su ciclo de replicación natural. transducción viral típicamente tarda más tiempo en completar, especialmente cuando se toma en cuenta el tiempo para la clonación molecular de los plásmidos proviral. Además, los vectores virales de transducción pueden ser potencialmente dañinos para los investigadores humanos. La electroporación es un m físicaétodo de inducir permeabilización de la membrana sometiendo las células a pulsos de alto voltaje, permitiendo que los ácidos nucleicos para introducir transitoriamente en la célula donde pueden actuar en su objetivo. instrumentos de electroporación tradicionales no eran eficaces para transfectar linfocitos primarios. Sin embargo, optimizado siguiente electroporación generación ha demostrado ser capaz de transfectar las células T a muy alta eficiencia, especialmente cuando el material a transfectar es pequeño ARN. El término próxima generación se utiliza libremente para diferenciar las dos plataformas más recientes (por ejemplo, neón, Amaxa) de máquinas de electroporación tradicionales. Además, este método es fácilmente escalable para pantallas de rendimiento moderados con hasta aproximadamente 120 pequeños RNAs en un solo experimento, a menudo utilizando reactivos sintéticos validados. Es importante destacar que las transfecciones con éxito se puede lograr en tan poco como 16 h después de la activación de células T. La desventaja de este método, sin embargo, es que no da como resultado de plástic genómico establesucesivamente, y es por lo tanto transitoria. Por lo tanto, vale la pena el esfuerzo extra para crear una construcción de expresión estable que puede ser empaquetado en un vector viral y se expresó con éxito en las células T en los casos en que se requiere la expresión a largo plazo de un pequeño ARN.

Hemos utilizado una próxima generación de transfección (por ejemplo, neón) para ofrecer diversas herramientas sintéticos individuales o de doble hebra de ARN o de oligonucleótidos LNA para diferentes propósitos 11, 12, 13. la interferencia de ARN eficiente puede ser inducida en el ratón primario y las células T humanas utilizando ARN-interferencia corto de doble hebra (siRNA). Este protocolo describe condiciones optimizadas para el uso de esta técnica en las células Th17 humanos. Además de siRNAs, disponibles comercialmente imita e inhibidores de miARN sintéticos pueden ser utilizados para estudiar el aumento de miARN y pérdida de función. imita miARN son moléculas de ARN de doble cadena muy similares a siRNAs, pero designed con la secuencia de miRNAs maduros endógenos. inhibidores de miARN están químicamente modificados de ARN y / o LNA basado oligonucleótidos monocatenarios que se unen a miRNAs nativas y antagonizan su función. Hemos encontrado que todas estas herramientas se pueden utilizar de manera efectiva en los linfocitos T primarias cultivadas, incluyendo pero no limitado a las células Th17 humanos.

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Protocol

Este protocolo se adhiere a las directrices de la UCSF para la ética de investigación en humanos.

1. Preparación de T cultivo celular, el aislamiento de células T CD4 + y la polarización Th17

  1. En el Día 0, capa placas de cultivo tisular de 6 pocillos con 1,5 ml por pocillo de anti-CD3 humano (2 g / ml) y CD28 anti-humano (4 mg / ml) en PBS con calcio y magnesio durante al menos 2 h en 37 ° C.
    1. Alternativamente, revestir las placas durante la noche a 4 ° C. Envolver las placas en Parafilm.
  2. Preparar las células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) por centrifugación en gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    PRECAUCIÓN: Trabajar con cuidado y asegurar que el equipo de protección personal (EPP) se utilizar para la manipulación de la sangre humana para evitar cualquier riesgo de exposición a patógenos transmitidos por la sangre.
  3. Una vez que se han aislado y se lavó las células mononucleares, lleve a cabo el aislamiento de células T CD4 + humano por sele negativocción utilizando un kit comercial de células T CD4 humano +.
    NOTA: Si hay contaminación de glóbulos rojos después del aislamiento de células mononucleares, una lisis de glóbulos rojos opcional puede llevarse a cabo antes de las etapas de aislamiento de células T CD4 +. Resuspender las células mononucleares en 1 ml de tampón de aislamiento (2% de FBS en PBS). Añadir 5 ml de solución de lisis 1x. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, añadir 5 ml de tampón de aislamiento y se centrifuga a 300 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células.
    1. Resuspender las células mononucleares a una densidad de 50 x 10 6 por 500! L en el tampón de aislamiento en un nuevo tubo de 5 ml.
    2. Añadir 100 ml de FBS y 100 l de la mezcla de anticuerpo por tubo a continuación, incubar cada tubo a 4 ° C durante 20 min en un agitador orbital a mezclar bien.
    3. Después de la incubación, añadir 34 ml de tampón de aislamiento para lavar las células. Centrifugar las células a 300 xg durante 8 minutos a 4 ° C para sedimentar las células. aspirar con cuidado la supernatant
    4. Durante este giro, antes de lavar las perlas magnéticas. Transferir la cantidad deseada de perlas magnéticas en un nuevo tubo (utilizado a 1: 1 con las células) y se añade un volumen igual de tampón de aislamiento para lavar las perlas. Mezclar bien usando una micropipeta ml 1 y luego colocar el tubo en el imán durante al menos 1 min. aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las perlas magnéticas en el mismo volumen inicialmente transferido antes de la colada.
    5. Resuspender las células en cada tubo con 500! L del tampón de aislamiento y añadir 500 l de perlas magnéticas pre-lavado.
    6. Se incuban las células con las perlas magnéticas durante 15 min en un agitador orbital a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) para mezclar bien.
    7. Después de la incubación, pipetear a fondo las células utilizando una micropipeta de 1 ml, al menos 10 veces. A continuación, añadir 34 ml de tampón de aislamiento y coloque cada tubo en el imán durante 2 min.
    8. Transferir cuidadosamente las células T CD4 + seleccionadas negativamente que se encuentran enel sobrenadante a un nuevo tubo.
  4. Una vez que se ha completado el aislamiento de células T CD4 +, contar las células con un hemocitómetro y mantener las células en hielo.
  5. Lavar las placas recubiertas de anticuerpos dos veces con PBS. A continuación, añadir 1,5 ml de 2x mezcla de medios Th17-polarizar a cada pocillo: IFN anti-humano (20 g / ml), anti-IL-4 humana (20 mg / ml), TGF humano (10 ng / ml), humana IL-1β (40 ng / ml), IL-23 (40 ng / ml), IL-6 humana (50 ng / ml) todo diluyó en un medio de base libre de suero (suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 100 mM 2-mercaptoetanol).
    NOTA: La transfección y la interferencia de ARN hace el trabajo en medios que contienen suero. El propósito de usar medios libres de suero con este protocolo es para lograr una mejor producción de IL-17A.
  6. Centrifugar las células T CD4 + humanos a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células. Aspirar con cuidado la Supernathormiga. Entonces resuspender las células en medios de base libre de suero y la placa de las células a una densidad de 3 x 10 6 en 1,5 ml por pocillo de modo que el volumen final es de 3 ml por pocillo y las citocinas polarizantes están ahora a una concentración final de 1x.
    1. Colocar las placas en 5% de CO2, 37 ° C incubadora durante dos días.

2. Las células Electroporación de In Vitro Polarized Th17 humana

  1. En el Día 2, la capa de placas de cultivo tisular de 48 pocillos con 250! L por pocillo de anti-CD3 humano (2 g / ml) y CD28 anti-humano (4 mg / ml) en PBS con calcio y magnesio durante al menos 2 h en 37 ° C.
    1. Alternativamente, revestir las placas durante la noche a 4 ° C. Envolver las placas en Parafilm.
  2. Preparar pequeños ARN para la transfección. Para cada transfección, alícuota de 1 l de una 5 M solución madre de siRNA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incluir pequeñas contr ARN química con ajuste apropiadool. Mantenga todos los tubos en hielo.
  3. Lavar las placas recubiertas de anticuerpos dos veces con PBS. A continuación, añadir 500 l de 1X Th17-polarizando medios de comunicación a cada pocillo: IFN anti-humano (10 g / ml), anti-IL-4 humana (10 mg / ml), TGF humana (5 ng / ml), IL-humana 1β (20 ng / ml), IL-23 (20 ng / ml), IL-6 humana (25 ng / ml) todo diluyó en un medio de base libre de suero (suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 100 mM 2-mercaptoetanol).
  4. Después se preparan las placas de cultivo y reactivos de transfección, resuspender las células con un 1 ml micropipeta, pipeteado suave pero que garantiza que todas las células se separan del fondo de los pocillos. Reunir las células en un tubo cónico y se centrifuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
    NOTA: Para los períodos de cultivo más largo que el protocolo de cuatro días presentado en el presente documento, las células deben transfectarse aproximadamente cada 3 días usando este mismo protocolo. Paso 20.4 debería modificarse sin embargo ya que las células tratadas con diferentes ARNs pequeños no se mezclarán. Todas las condiciones se están probando debe recogerse, contados, y se transfectaron por separado.
  5. aspirar cuidadosamente el sobrenadante, y luego volver a suspender las células en al menos 1 ml de PBS para lavar. Contar las células Th17 en vivo (por ejemplo con un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano para evaluar la viabilidad) y luego transferir las células a un tubo de microcentrífuga.
  6. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente para sedimentar las células.
  7. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, y luego resuspender las células usando el tampón de resuspensión proporcionado en el kit de sistema de transfección 10 l a una densidad de 2,5-4 x 10 7 células por ml. Mantener las células a temperatura ambiente.
    NOTA: Como pauta, tratar de preparar sólo como muchas células como se puede transfectadas dentro de 30 min. Varios lotes se pueden comparar.
  8. Añadir 9 l de células a 1 l de ARN pequeño en cada MicroCtubo entrifuge. Pipetear una vez para mezclar las células y los pequeños ARN para la transfección a continuación, cargar en la punta del electrodo pipeta proporcionado.
    NOTA: Típicamente, añadir 9,5! L de suspensión de células para asegurar que hay suficiente de la mezcla para evitar la creación de burbujas en la punta del electrodo de pipeta antes de la transfección.
  9. Llenar la cubeta proporcionado con 3 ml de temperatura ambiente electrolítico Buffer E. Place la cubeta dentro de la estación de pipeta y luego colocar la pipeta en posición dentro de la cubeta.
  10. Inmediatamente electroporar cada 10? L de la mezcla de células y pequeños ARN utilizando los siguientes parámetros: voltaje de impulso 1,500-1,550 V, anchura de impulso de 10 ms, y 3 pulsos total en el dispositivo de la transfección.
  11. Después de la electroporación es completa, añadir directamente a la mezcla de células a 500 l de medio 1X Th17 polarizante en pozos preparados de una placa de cultivo. Placas lugar en un 5% de CO2, 37 ° C incubadora durante dos días más.
    NOTA: Lavar la punta del electrodo pipeta pipeteandoarriba y abajo en PBS entre cada transfección.

3. Las células de cosecha Th17 humana

  1. Resuspender las células en medios de cultivo con una micropipeta, pipeteando suavemente pero asegurando que todas las células se separan del fondo de los pocillos. Preparar las células para ensayos de expresión funcionales y / o de genes.
    NOTA: Rutinariamente, suficientes células se produjeron a partir de un único pocillo de células Th17 transfectadas para ser utilizado para el análisis de citometría de flujo de marcador de superficie e intracelular de citoquinas y factor de transcripción tinción o para la preparación de ARN para el análisis de la expresión génica.

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Representative Results

El primer paso para desarrollar un sistema fiable de electroporación con éxito células Th17 humanos era generar robusto en cultivos de células Th17 humanos in vitro diferenciados. Las células T cultivadas en condiciones Th17-polarizantes expresan el receptor de quimiocinas CCR6 y el factor de transcripción RORγt (Figura 1A, izquierda). Estos marcadores no se expresaron cuando se cultivaron las células T en condiciones no polarizante (THN) (Figura 1A, derecha). Las células T cultivadas en condiciones Th17-polarizantes también produjeron IL-17A en la reestimulación (Figura 1B, izquierda), pero no en condiciones THN (Figura 1B, derecha). Diferenciación Th17 todavía se produce después de la transfección con ARN pequeños pero en algunos experimentos, hay una reducción observada en la frecuencia de la producción de IL-17A (Figura 1C). El efecto de la transfección de ARN pequeño de la producción de citocinas demuestra la importancia de tener un pequeño ARN de control química con ajuste para la comparación dentro de cada experimento. Es importante destacar que, la viabilidad se mantiene después de la transfección con ARN pequeños y es típicamente mayor que 70% (Figura 1D).

Para determinar la eficacia de este protocolo, se utilizó la interferencia de ARN. El antígeno CD45 está codificada por el PTPRC (proteína tirosina fosfatasa, de tipo receptor C) de genes. CD45 se expresa en todas las células hematopoyéticas y las células Th17 por lo tanto humanos debe expresar robustamente este marcador de superficie. La transfección de las células Th17 humanos en el día 2 con una piscina siRNA dirigidos PTPRC reduce fuertemente la expresión de CD45 en comparación con una química igualada de control de siRNA (Figura 2A). Este cambio de la población unimodal en la expresión de CD45 indica cerca de la eficiencia de transfección del 100%, típico de este protocolo para pequeños RNAs. Por lo tanto, esta es una herramienta importante que se puede utilizar para evaluar eff transfeccióncacia durante optimizaciones de protocolo. RORC codifica RORγt, el factor de transcripción predominante de células Th17 humanos, que regula directamente la producción de IL-17A. La transfección de las células Th17 en desarrollo humanos con piscina siRNA contra RORC reduce fuertemente la expresión RORγt como se esperaba (Figura 2B). La reducción de la expresión RORγt por RNAi tuvo un efecto funcional, ya que estas células expuestas reducen la producción de IL-17A (Figura 2C) en comparación con células transfectadas con un ARNsi de control. Células T CD4 + no polarizado no deben expresar cualquier RORγt o IL-17A y se muestran como un control negativo en esta figura.

Figura 1
Figura 1: En células diferenciadas in vitro Th17 humanos expresan CCR6, RORγt, y la IL-17A. Células T CD4 + humanas aisladas de sangre del cordón umbilical se cultivaron undecondiciones r Th17 (IL-1β, IL-23, IL-6, y TGFß) o en condiciones no polarizante (THN) (solamente los medios de comunicación, no hay citocinas polarizantes o anticuerpos bloqueantes añadidos) in vitro y analizados en el día 4 para Th17 marcador expresión por citometría de flujo de: (A) CCR6 Representante superficie de la pantalla gráficos de contorno y RORγt intracelular co-tinción de las células T CD4 +. Los números en los cuadrantes indican ciento CCR6 y / o células RORγt-positivo vivo singlete CD4 +. (B) IL-17A y IFN producción después de la reestimulación con PMA / ionomicina. Los números en los cuadrantes indican ciento IL-17A y / o singlete vivo IFN-positivas CD4 + células. (C) representativo de la trama muestra contorno de la superficie CCR6 y RORγt intracelular co-tinción de las células T CD4 + después de la transfección con ARN de control pequeño. Los números en los cuadrantes indican ciento CCR6 y / o células RORγt-positivo vivo singlete CD4 + (izquierda). Representativa gráfico de contorno muestra la producción de IL-17A y de IFN después de la reestimulación con PMA / ionomicina post-transfección con ARN de control pequeño. Los números en los cuadrantes indican ciento IL-17A y / o singlete vivo IFN-positivas CD4 + células (derecha). (D) gráfico de contorno Representante muestra la viabilidad de células CD4 + después de la transfección con ARN de control pequeño. Número indica ciento singlete células CD4 + en vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Interferencia de ARN en células primarias Th17 humano. Células T CD4 + humanas de sangre del cordón umbilical se cultiva en condiciones Th17 fueron transfectadas en el día 2 con un control de siRNA nontargeting (SINEG Ctl) o en la piscina de orientación contra PTPRC (SI PTPRC) o RORC (SI RORC) que comprende 4 siRNAs individuales. Las células fueron luego analizadas por citometría de flujo en el día 4: expresión (A) CD45 de superficie se muestra en un histograma representativo después de la transfección con Si PTPRC (tinte gris) o SINEG Ctl (línea de color negro). Expresión (B) intracelular RORγt se muestra en un histograma representativo después de la transfección con Si RORC (tinte gris) o SINEG Ctl (línea de color negro). (C) gráficos de contorno representativos presentación de superficie CD4 y RORγt intracelular co-tinción de las células T CD4 + (panel superior) o IL-17A y la producción de IFN después de la reestimulación con PMA / ionomicina (panel inferior). Los números en los cuadrantes indican por ciento células singlete vivo CD4 + RORγt + o IL-17A y / o IFN-positivos bajo condiciones THN o Th17 transfectadas con SINEG Ctl o si RORC.fig2large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo proporciona un método mejorado para el suministro de pequeños ARN en células Th17 humanos. Aunque se utilizaron células Th17 humanos aquí, este método de electroporación con pequeños ARN se puede utilizar con otros subconjuntos helper humano primario T, tales como Th1, Th2, y Tregs. No ha funcionado bien para las células T CD4 + vírgenes por lo que las células deben ser activadas en cultivo antes de la transfección. Para este protocolo, primero optimizado el sistema de cultivo in vitro para una mejor producción de IL-17A. El factor más importante fue la base para medios. Se encontró que el medio libre de suero fue superior a las células Th17 humanos medios de comunicación para una mejor inducción de IL-17A producir contienen suero tradicionales. Dado que las células Th17 se pueden generar con subconjuntos de las citoquinas TGFß, IL-1ß, IL-23, e IL-6, hemos probado diferentes mezclas de citoquinas. En este estudio, hemos logrado más robusta la producción de IL-17A cuando se incluyeron los cuatro citocinas polarizantes. Además, hemos optimizado el acortamiento de la longitud dela cultura que exista un sólo transfección fue necesario durante el período de cultivo. Si bien este protocolo de cuatro días permite que los resultados que se generen más rápido y requiere sólo una transfección, longitud cultura podría ser alargado para aumentar aún más la producción de IL-17A. Un período de cultivo más largo puede incluso ser necesario para lograr la diferenciación óptima de los otros subconjuntos de células T primarias. Dado que estas transfecciones son transitorios, múltiples transfecciones se pueden requerir más tiempo para períodos prolongados de cultivo. Se aconseja la reposición de pequeñas reactivos de ARN después de aproximadamente 3 días por la re-electroporación las células con el reactivo para evitar la dilución a través de múltiples divisiones celulares. Hemos hecho esto para rutinariamente células T CD4 + de ratón. Aunque es técnicamente más difícil, puesto que las células de cada condición deben ser recogidos y cuentan por separado, la transfección tiene éxito y hay efectos mínimos sobre la viabilidad celular.

En estos experimentos, las células Th17 humanos nosotrosre generado a través de cultivo in vitro de la sangre del cordón umbilical humano. Es importante destacar que, una opción alternativa para este ensayo de diferenciación sería el uso de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Para ambos CBMC y PBMC, es necesario aislar las células T CD4 + antes del inicio del cultivo. Presentamos aquí nuestro método para la purificación de las células T CD4 + por selección negativa, lo que produjo robusta eficiencia de la transfección, pero esperamos que otros métodos de preparación de células T CD4 + humanos primarios funcionaría igual de bien. Hemos probado varios kits que utilizan la selección ya sea positivo o negativo para el aislamiento de células T CD4 + de ratón y ambos métodos han dado lugar a la eficacia de transfección similar. Una consideración adicional es la importancia del uso de las células T vírgenes con el fin de diferenciar de manera óptima en células Th17. El uso de sangre del cordón umbilical humano es ventajoso por esta razón porque ya tiene una mayor proporción de naïve T células presienten y por lo tanto no es necesario para ordenar o pre-enriquecer las células T vírgenes antes del inicio del cultivo. Sin embargo, una clara desventaja de este método es la disponibilidad limitada de sangre del cordón umbilical. Alternativamente, la clasificación de las células T ingenuas a partir de PBMCs 14 puede ser realizado antes del cultivo ya que este recurso es más fácilmente disponible, aunque grandes cantidades tendrían que ser obtenido.

Si bien hay varios métodos para transfectar células de mamífero, células T primarias tienden a ser un tipo de célula más difíciles de transfectar. Siguiente generación electroporación es un método físico con éxito de células T transitoriamente de transfección que es técnicamente fácil de realizar y es reproducible. Una vez optimizado, tiene una muy alta eficiencia de transfección de ARN pequeños que se acerca al 100%. Esto se puede ver en la Figura 2, donde toda la población unimodal de las células CD45 + (Figura 2A) y la población de todas las células que expresan RORγt (Figura 2B) cambio a un nivel de expresión inferior. Es importante destacar que la transfección optimizada con pequeños RNAs no pone en peligro la viabilidad celular. Rutinariamente observamos mayor que 70% de viabilidad después de la transfección con ARN pequeños (Figura 1D). Aunque la viabilidad no es un problema con este protocolo, la biología de otras características de las células T, tales como la producción de citocinas, puede verse afectado después de la transfección con ARN pequeños. Por esta razón, es muy importante utilizar un control de pequeños ARN de la química de concordancia en cada experimento.

Hemos optimizado los dos parámetros de electroporación, el pulso y la tensión, para minimizar la muerte celular y la maximización de la eficiencia de transfección. voltajes más altos aumentan la muerte celular durante la transfección. Algunas otras consideraciones técnicas para prevenir la muerte celular y asegurar la transfección exitosa incluyen la minimización de la cantidad de reactivos sintéticos utilizados y limitando el tiempo betwee preparación de células n y electroporación. Las concentraciones mínimas necesarias para reactivos de transfección sintéticos siempre deben ser usados ​​para prevenir la toxicidad potencial de las células T y los efectos fuera de objetivo. Reducción del tiempo de preparación de células antes de la transfección para minimizar el tiempo de las células en tampón de transfección a temperatura ambiente es crucial y puede lograrse mediante la preparación de células en lotes, si es necesario.

Actualmente, existen dos instrumentos de electroporación de última generación disponibles en el mercado. Ambos de estos sistemas pueden transfectar eficazmente las células T primarias. Este protocolo se optimizó usando el sistema de transfección de neón. Si bien este sistema de transfección es más rentable, el sistema Amaxa único que ofrece un adaptador de 96 pocillos para la electroporación para aplicaciones de mayor rendimiento. Esperamos que los avances comerciales adicionales seguirán aumentando el rendimiento y la eficiencia de estos sistemas de transfección, manteniendo costos al mínimo.

"> Siguiente generación electroporación de células T humanas puede introducir de manera eficiente los pequeños RNAs incluyendo siRNAs contra genes diana de interés como se ejemplifica en este protocolo, así como miméticos de miARN o inhibidores. La alta eficacia hace que sea innecesario el uso de los marcadores de la transfección ya que casi todas las células es transfectadas con ARN pequeños. Esto está en contraste con la transfección de células T primarias con plásmidos de ADN donde transfecciones típicos plásmido resultan en sólo el 20-30% de expresión del gen marcador con una toxicidad mayor que 50% que aumenta con cantidades crecientes de plásmido. la introducción de imitaciones sintéticas que utilizan este método ha permitido para docenas de genes a ser examinados para la función en la biología de células T en paralelo sin necesidad de clonación molecular 12, 13. también ha permitido a las pruebas para la función de todos los miRNAs expresado por las células T en paralelo 11 , 13. Con este protocolo, Estos tipos de pantallas de rendimiento moderados son aplicables a las células T humanas. Notablemente, esta técnica se utilizó recientemente para introducir ARN pequeño (gRNA) -Cas9 ribonucleoprotein complejos en células T humanas primarias para la edición genoma 15. Estas diversas aplicaciones destacan la utilidad, la flexibilidad y el poder del protocolo presentado aquí como una herramienta importante para los inmunólogos que tratan de estudiar la biología de las células T.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
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References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28, (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27, (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14, (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47, (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8, (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10, (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40, (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15, (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35, (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15, (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44, (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), 10437-10442 (2015).

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