Small RNA Transfectie in primaire humane Th17 cellen door Next Generation Electroporation

Published 4/13/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CD4 + T-cellen zijn cruciaal orchestrators van de adaptieve immuunrespons. Naïeve CD4 + T-cellen kunnen ontwikkelen in verschillende effector T-cellen (bijv Th1, Th2, Th17, enz.), Elk met hun eigen set van karakteristieke cytokinen en transcriptiefactoren, afhankelijk van de plaatselijke micromilieu 1. Het geslacht besluiten dat T-cellen vormen cruciaal zijn voor beschermend immuniteit en tolerantie voor zichzelf. Th17 cellen zijn een subgroep van T-cellen bekend extracellulaire bacteriën en schimmels te bestrijden, maar hun verkeerde reacties zijn ook betrokken bij de pathogenese van multiple autoimmuun- en ontstekingsziekten zoals multiple sclerose en psoriasis 2, 3. Th17 humane cellen kunnen worden gegenereerd uit naïeve CD4 + T-cellen in vitro door hen met een geschikte polariserende omgeving 4. Vario ons combinaties van de cytokines IL-1β, IL-23, TGF-P en IL-6 zijn gebruikt voor de ontwikkeling van de menselijke Th17 cellen. Menselijke Th17 cellen brengen CCR6, een chemokine receptor die gewoonlijk wordt gebruikt om deze celpopulatie en worden omschreven met hun belangrijkste transcriptiefactor RORγt (gecodeerd door RORC) 5, 6. Th17 cellen hebben de mogelijkheid om meerdere cytokinen tot expressie brengen, maar IL-17A is de lijn definiëren effector cytokine geproduceerd door deze cellen. Onderzochten we de expressie van alle drie Th17 geassocieerde markers (CCR6, RORγt, IL-17A) om de robuustheid van onze menselijke Th17 differentiatie in vitro assay te evalueren. Daarnaast hebben we gekweekte humane CD4 + -T-cellen onder niet-polariserende omstandigheden waarbij geen cytokinen of blokkerende antilichamen die aan het kweekmedium toegevoegd om als negatieve controle omdat expressie van deze markers Th17 laag of afwezig moeten zijn.

ve_content "> Een manier om normale humane T-celontwikkeling en biologie studie is om genexpressie te manipuleren tijdens de ontwikkeling. Korte interfererende RNA (siRNA) zijn synthetische kleine RNA moleculen die eiwitcoderende mRNA targeten en kan worden toegepast om genexpressie te verlagen . MicroRNAs (miRNA's) zijn endogene niet-coderende kleine RNAs bekend genexpressie posttranscriptioneel. miRNAs bleken een belangrijke rol in zowel muizen- als humane T-cel biologie spelen, met inbegrip van Th17 cellen 7, 8, 9. de is essentieel voor betrouwbare werkwijzen voor het manipuleren van kleine RNA in humane T-cellen hun effecten op genexpressie en uiteindelijk menselijke T-celbiologie bestuderen. we beschrijven hier een eenvoudig te gebruiken, consistent en betrouwbaar protocol dat we hebben ontwikkeld voor het inbrengen kleine synthetische RNAs en afgesloten nucleïnezuren (LNA's, chemisch gemodificeerde nucleïnezuren met verhoogde stabiliteit)in immuuncellen, en in het bijzonder in de menselijke Th17 cellen.

Er zijn verscheidene alternatieve werkwijzen voor het inbrengen kleine RNA's in zoogdiercellen, die in het algemeen in chemische, biologische of fysische categorieën 10 vallen. Gewoonlijk gebruikte chemische werkwijzen, waaronder op lipiden gebaseerde transfecties en calciumfosfaat transfectie, afhankelijk maken van chemisch-DNA-complexen die efficiënter door cellen genomen. Over het algemeen chemische werkwijzen niet zo efficiënt voor de transfectie van primaire T-cellen. De meest voorkomende biologische methode is om een virale vector (bijvoorbeeld retrovirus of lentivirus), dat direct ingevoegd vreemde RNA in een gastheer als onderdeel van zijn natuurlijke replicatiecyclus gebruiken. Virale transductie duurt kenmerkend langer in beslag, vooral wanneer men factoren in de tijd voor moleculaire klonering van provirale plasmiden. Daarnaast kunnen virale vectoren transductie potentieel schadelijk voor de onderzoekers. Elektroporatie is een fysiek methode induceren membraan permeabilisatie door het onderwerpen van cellen aan hoogspanningspulsen, waarbij nucleïnezuren transiënt voeren in de cel waar ze inwerken op hun doel. Traditionele elektroporatie instrumenten waren niet effectief voor het transfecteren primaire lymfocyten. Toch is geoptimaliseerd next generation elektroporatie bewezen in staat T-cellen te transfecteren met zeer hoge efficiëntie, in het bijzonder wanneer het materiaal te transfecteren klein RNA. De term generatie losjes gebruikt om de twee nieuwere platforms (bijvoorbeeld neon, Amaxa) door traditionele elektroporatie machines differentiëren. Bovendien is deze werkwijze gemakkelijk schaalbaar voor matige doorvoer screenings met tot ongeveer 120 kleine RNAs in een enkel experiment, vaak met gevalideerde synthetische reagentia. Belangrijker is dat succesvolle transfecties worden bereikt in slechts 16 uur na T-celactivering. Het nadeel van deze methode is echter dat zij niet tot stabiele genomische incorporatiop, en is daarom van voorbijgaande aard. Daarom is de extra inspanning een stabiel expressieconstruct dat kan worden verpakt in een virale vector en met succes tot expressie gebracht in T-cellen wanneer langdurige expressie van een kleine RNA nodig maken waard.

We hebben een nieuwe generatie transfectie (bijvoorbeeld Neon) gebruikt om diverse synthetische enkel- of dubbelstrengs RNA of LNA oligonucleotide gereedschappen leveren voor verschillende doeleinden 11, 12, 13. Efficiënte RNA interferentie kan worden geïnduceerd in primaire muis en menselijke T-cellen met behulp van dubbelstrengs korte interfererende RNA (siRNA). Dit protocol beschrijft geoptimaliseerde omstandigheden voor het gebruik van deze techniek in humane cellen Th17. In aanvulling op siRNA, kunnen in de handel verkrijgbare synthetische miRNA bootst en remmers worden gebruikt om miRNA winst en verlies van functie te bestuderen. miRNA bootst dubbelstrengs RNA-moleculen, vergelijkbaar met siRNA, maar designed met de sequentie van endogeen mature miRNAs. miRNA-remmers worden chemisch gemodificeerde RNA en / of LNA gebaseerd enkelstrengs oligonucleotiden die binden aan natief miRNAs en hun functie antagoniseren. We hebben ontdekt dat elk van deze instrumenten effectief kan worden gebruikt in gekweekte primaire T-lymfocyten, met inbegrip van maar niet beperkt tot de menselijke Th17 cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol houdt zich aan richtlijnen UCSF's voor de menselijke onderzoek ethiek.

1. Bereiding van T Celkweek, isolatie van CD4 + T-cellen en Th17 Polarisatie

  1. Op dag 0, laag 6-well weefselkweek platen met 1,5 ml per putje van anti-humaan CD3 (2 ug / ml) en anti-humaan CD28 (4 ug / ml) in PBS met calcium en magnesium ten minste 2 uur bij 37 ° C.
    1. Alternatief, laag de platen overnacht bij 4 ° C. Wikkel platen in parafilm.
  2. De kabel voorbereiden bloed mononucleaire cellen (CBMCs) door dichtheidsgradiënt centrifugatie instructies van de fabrikant.
    LET OP: Ga voorzichtig te werk en zorgen voor een goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) wordt gedragen bij het hanteren van menselijk bloed om elk risico van blootstelling aan door bloed overgedragen ziekteverwekkers te voorkomen.
  3. Nadat de mononucleaire cellen zijn geïsoleerd en gewassen, het uitvoeren van de menselijke CD4 + T-cellen de isolatie door negatieve Selectie behulp van een commerciële menselijke CD4 + T-cel kit.
    LET OP: Als er rode bloedcellen besmetting na mononucleaire cel isolatie, kan een optionele lysis van rode bloedcellen voorafgaand aan de CD4 + T-cel isolatie stappen worden uitgevoerd. Resuspendeer de mononucleaire cellen in 1 ml isolatie buffer (2% FBS in PBS). Voeg 5 ml 1x lyserende oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 5 ml isolatiebuffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te pelleteren.
    1. Resuspendeer de mononucleaire cellen bij een dichtheid van 50 x 10 6 per 500 pi bij de isolatie buffer in een nieuwe buis van 5 ml.
    2. Voeg 100 ul van FBS en 100 pi van het antilichaam mix per buis vervolgens elke buis incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten op een schudapparaat goed te mengen.
    3. Na de incubatie, voeg 3-4 ml isolatie buffer om de cellen te wassen. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 8 min bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. Zorgvuldig aspireren de supernatant
    4. Tijdens deze rotatie, pre-wassen van de magnetische bolletjes. Breng de gewenste hoeveelheid magnetische korrels in een nieuwe buis (gebruikt bij 1: 1 met de cellen) en voeg een gelijk volume isolatiebuffer de parels te wassen. Meng goed met een 1 ml micropipet en plaats vervolgens de slang in de magneet gedurende ten minste 1 min. zuig het supernatant voorzichtig. Resuspendeer de magnetische korrels in hetzelfde volume aanvankelijk voorafgaand overgedragen aan de was.
    5. Resuspendeer de cellen in elke buis met 500 pl van de isolatiebuffer en voeg 500 ul van voorgewassen magnetische korrels.
    6. Incubeer de cellen met de magnetische korrels gedurende 15 minuten op een rondschudapparaat bij kamertemperatuur (18 ° C tot 25 ° C) goed te mengen.
    7. Na de incubatie grondig pipet de cellen met een 1 ml micropipet ten minste 10 maal. voeg 3-4 ml isolatiebuffer en zet elke buis in de magneet gedurende 2 minuten.
    8. Zorgvuldig overdracht van de negatief geselecteerde CD4 + T-cellen die zijn inhet supernatant naar een nieuwe buis.
  4. Zodra CD4 + T-cel isolatie is voltooid, tel de cellen met een hemocytometer en houden de cellen op ijs.
  5. Was de met antilichaam beklede platen tweemaal met PBS. Voeg daarna 1,5 ml 2x mix van Th17-polariserende medium aan elk putje: anti-humaan IFN-y (20 gg / ml), anti-humaan IL-4 (20 ng / ml), humaan TGF- (10 ng / ml), humaan IL-1β (40 ng / ml), humaan IL-23 (40 ng / ml), humaan IL-6 (50 ng / mL) alle verdund in serumvrij basismedium (aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat en 100 pM 2-mercaptoethanol).
    OPMERKING: Transfectie en RNA interferentie werkt in serum-bevattende media. Het doel van het gebruik serumvrij medium met dit protocol is het beter IL-17A productie.
  6. Centrifugeer de humane CD4 + -T-cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. Zorgvuldig aspireren de supernatmier. Resuspendeer dan de cellen in serumvrij basismedium en de plaat van de cellen bij een dichtheid van 3 x 10 6 in 1,5 mL per putje zodat het uiteindelijke volume 3 ml per putje en polariserende cytokinen zijn nu op een 1 x eindconcentratie.
    1. Plaats de platen in 5% CO2, 37 ° C incubator gedurende twee dagen.

2. Elektroporatie van in vitro gepolariseerde Menselijke cellen Th17

  1. Op dag 2, laag 48-putjes weefselkweekplaten met 250 pl per putje van anti-humaan CD3 (2 ug / ml) en anti-humaan CD28 (4 ug / ml) in PBS met calcium en magnesium ten minste 2 uur bij 37 ° C.
    1. Alternatief, laag de platen overnacht bij 4 ° C. Wikkel platen in parafilm.
  2. Bereiden kleine RNAs voor transfectie. Voor elke transfectie aliquot 1 ui van een 5 pM voorraadoplossing van siRNA in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Omvatten geschikte chemie aangepaste kleine RNA control. Houd alle buizen op ijs.
  3. Was de met antilichaam beklede platen tweemaal met PBS. Voeg vervolgens 500 pi 1X Th17-polariserende medium aan elk putje: anti-humaan IFN-y (10 ug / ml), anti-humaan IL-4 (10 ng / ml), humaan TGF (5 ng / ml), humaan IL 1β (20 ng / ml), humaan IL-23 (20 ng / ml), humaan IL-6 (25 ng / mL) alle verdund in serumvrij basismedium (aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat en 100 pM 2-mercaptoethanol).
  4. Nadat de kweekplaten en transfectie reagentia bereid, resuspendeer de cellen met een 1 ml micropipet voorzichtig pipetteren maar zorgen dat alle cellen worden losgemaakt van de bodem van de putjes. de cellen zwembad in een conische buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    LET OP: Voor perioden cultuur langer dan de vier-daagse protocol hierin worden gepresenteerd, moeten de cellen worden ongeveer getransfecteerd om de 3 dagen met behulp van hetzelfde protocol. Stap 20,4 moet echter worden gewijzigd sinds het behandeld met verschillende kleine RNAs cellen niet worden samengevoegd. Alle omstandigheden getest moeten worden verzameld, geteld, en afzonderlijk getransfecteerd.
  5. Zorgvuldig aspireren het supernatans, en resuspendeer de cellen in ten minste 1 ml PBS te wassen. Tel de live-Th17 cellen (bijvoorbeeld met een hemocytometer met behulp van Trypan Blue uitsluiting van de levensvatbaarheid te beoordelen) en breng de cellen om een microcentrifugebuis.
  6. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
  7. Zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de cellen vervolgens met de meegeleverde hersuspensiebuffer van het transfectie 10 pi kit in een dichtheid van 2,5-4 x 10 7 cellen per ml. Houd cellen bij kamertemperatuur.
    LET OP: Als richtlijn, proberen om slechts zoveel cellen bereiden binnen 30 minuten kan worden getransfecteerd. Meerdere batches kunnen worden vergeleken.
  8. Voeg 9 pl van cellen aan 1 pl kleine RNA in elke MicroCentrifuge buis. Pipet keer om de cellen en kleine RNAs voor transfectie mix vervolgens geladen in de pipet elektrodepunt.
    OPMERKING: Gewoonlijk voeg 9,5 pi celsuspensie te zorgen voor voldoende het mengsel te voorkomen waardoor de bellen in de pipet elektrodepunt voor transfectie.
  9. Vul het voorzien cuvette met 3 ml kamertemperatuur elektrolytische Buffer E. Plaats de cuvet in de pipet station en plaats van de pipet in positie in de cuvette.
  10. Onmiddellijk elektroporatie elke 10 pi mix van cellen en kleine RNA met de volgende parameters: 1,500-1,550 pulsspanning V, pulsbreedte 10 ms en 3 pulsen totaal de transfectie apparaat.
  11. Na de elektroporatie is voltooid, direct het celmengsel voeg 500 ul 1X Th17-polariserende media in bereide putjes van een kweekplaat. Plaats platen in een 5% CO2, 37 ° C incubator gedurende twee dagen.
    OPMERKING: Was de pipet elektrode tip door pipetterenop en neer in PBS tussen elke transfectie.

3. Oogst Menselijke cellen Th17

  1. Resuspendeer de cellen in de cultuur media met een micropipet, pipetteren voorzichtig maar ervoor te zorgen dat alle cellen worden losgemaakt van de bodem van de putten. Bereid de cellen voor functionele en / of genexpressie-assays.
    OPMERKING: Routinematig worden genoeg cellen verkregen van een enkel putje van getransfecteerde Th17 cellen, bestemd voor flowcytometrische analyse van oppervlaktemerker en intracellulaire cytokine kleuring en transcriptiefactor of voor de bereiding van RNA voor genexpressie analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eerste stap om de ontwikkeling van een betrouwbaar systeem met succes elektroporatie humane Th17 cellen werd krachtig in vitro gedifferentieerde humane Th17 celculturen te genereren. T-cellen gekweekt onder Th17-polariserende uitgedrukte chemokine receptor CCR6 en de transcriptiefactor RORγt (Figuur 1A, links). Deze merkers werden niet tot expressie gebracht wanneer T-cellen werden gekweekt onder niet-polariserende (THN) omstandigheden (figuur 1A, rechts). T-cellen gekweekt onder Th17-polariserende omstandigheden produceerde ook IL-17A na herstimulatie (Figuur 1B, links), maar niet onder thn omstandigheden (figuur 1 B, rechts). Th17 differentiatie komt nog na transfectie met kleine RNAs, maar in sommige experimenten, is een waargenomen afname van de frequentie van IL-17A productie (Figuur 1C). Het effect van kleine RNA-transfectie op cytokineproductie toont het geïmporttance van het hebben van een chemische aangepaste kleine RNA controle voor vergelijking binnen elk experiment. Belangrijker is levensvatbaarheid behouden na transfectie met kleine RNA's en is typisch groter dan 70% (figuur 1D).

De doeltreffendheid van het protocol te bepalen, gebruikten we RNA interferentie. Het CD45-antigeen wordt gecodeerd door het PTPRC (proteïne tyrosine fosfatase, receptor type C) gen. CD45 wordt uitgedrukt op alle hematopoietische cellen en daarmee de menselijke Th17 cellen moeten stevig uitdrukken dit oppervlak marker. Transfectie van menselijke Th17 cellen op dag 2 met een pool siRNA gericht PTPRC sterk verminderde de expressie van CD45 ten opzichte van chemie gematchte controle siRNA (figuur 2A). Dit unimodaal populatie verschuiving in CD45 expressie geeft bijna 100% transfectie efficiëntie, typisch voor dit protocol voor kleine RNAs. Dit is dus een belangrijk instrument dat kan worden gebruikt voor transfectie eff beoordeleniciency tijdens protocol optimalisaties. RORC codeert RORγt de overheersende transcriptiefactor van menselijke Th17 cellen, die direct regelt IL-17A productie. Transfecteren van humane ontwikkeling Th17 cellen met siRNA bad tegen ORC sterk verminderde RORγt expressie zoals verwacht (Figuur 2B). Vermindering RORγt expressie van RNAi hadden een functioneel effect, omdat deze cellen vertoonden verlaagde IL-17A productie (Figuur 2C) vergeleken met cellen getransfecteerd met een controle siRNA. Ongepolariseerde CD4 + T-cellen moeten alle RORγt of IL-17A niet tot expressie en zijn weergegeven als een negatieve controle in deze figuur.

Figuur 1
Figuur 1: In vitro gedifferentieerde menselijke cellen Th17 Express CCR6, RORγt en IL-17A. Humane CD4 + -T-cellen geïsoleerd uit navelstrengbloed werden gekweekt under Th17 omstandigheden (IL-1β, IL-23, IL-6, en TGFp) of in niet-polariserende (THN) condities (alleen media geen polariserende cytokinen of blokkerende antilichamen toegevoegd) in vitro en op dag 4 geanalyseerd Th17 marker expressie door flow cytometrie: (A) Representatieve contourdiagrammen weergaveoppervlak CCR6 en intracellulaire RORγt co-kleuring van CD4 + T-cellen. Aantallen in kwadranten duiden procent CCR6 en / of RORγt-positieve live-singlet CD4 + cellen. (B) IL-17A en IFNy productie na opnieuw stimuleren met PMA / ionomycine. Aantallen in kwadranten duiden procent IL-17A en / of IFNy-positieve live-singlet CD4 + cellen. (C) Vertegenwoordiger hoogtelijnenplot displays CCR6 oppervlak en intracellulaire RORγt co-kleuring van CD4 + T-cellen na transfectie met kleine RNA. Getallen in kwadranten duiden procent CCR6 en / of RORγt-positieve levende singlet CD4 + cellen (links). Representatieve contourgrafiek toont IL-17A en IFNy productie na herstimulatie met PMA / ionomycine na transfectie met kleine RNA. Getallen in kwadranten duiden procent IL-17A en / of IFNy-positieve levende singlet CD4 + cellen (rechts). (D) Vertegenwoordiger contourdiagram weergegeven levensvatbaarheid van CD4 + cellen na transfectie met kleine RNA. Getal geeft procent CD4 + levend singlet cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: RNA interferentie in primaire humane cellen Th17. Humane CD4 + T-cellen uit navelstrengbloed gekweekt onder omstandigheden Th17 werden getransfecteerd op dag 2 met siRNA nontargeting control (siNeg Ctl) of gericht tegen pool PTPRC (si PTPRC) of ORC (si ORC) bestaande uit 4 afzonderlijke siRNAs. De cellen werden vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie op dag 4: (A) Oppervlakte CD45 expressie in een representatieve histogram na transfectie met si PTPRC (grijstint) of siNeg Ctl (zwarte lijn). (B) RORγt Intracellulaire expressie in een representatieve histogram na transfectie met si ORC (grijstint) of siNeg Ctl (zwarte lijn). (C) Vertegenwoordiger contourdiagrammen weergaveoppervlak CD4 en intracellulaire RORγt co-kleuring van CD4 + T-cellen (bovenste paneel) of IL-17A en IFNy productie na herstimulatie met PMA / ionomycine (onderste paneel). Getallen in kwadranten geven percentage CD4 + RORγt + of IL-17A en / of IFNy-positieve singlet levende cellen onder thn of Th17 omstandigheden getransfecteerd met siNeg Ctl of si ORC.fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol verschaft een verbeterde werkwijze voor het afleveren van kleine RNA's in humane cellen Th17. Hoewel menselijke cellen Th17 hier gebruikt, kan deze werkwijze elektroporatie van kleine RNA's worden gebruikt met andere primaire menselijke T-helper-subsets, zoals Th1, Th2 en Tregs. Het is niet goed gewerkt voor naïeve CD4 + T-cellen, zodat de cellen moeten worden geactiveerd in cultuur voorafgaand aan transfectie. Voor dit protocol, we eerst geoptimaliseerd in vitro kweeksysteem beter IL-17A productie. De grootste factor was base media. We vonden dat serum-vrije media was superieur aan de traditionele media die serum bevatten voor een betere inductie van IL-17A productie van menselijke Th17 cellen. Aangezien Th17 cellen kunnen worden gemaakt met subgroepen van TGFp cytokinen IL-1β, IL-23 en IL-6, testten we verschillende cytokine mixen. In deze studie hebben we bereikt meer robuuste IL-17A productie bij alle vier de polariserende cytokinen werden opgenomen. Daarnaast geoptimaliseerd we het verkorten van de lengte van dede cultuur om ervoor te zorgen slechts één transfectie nodig was tijdens de kweekperiode. Hoewel deze vierdaagse protocol maakt het mogelijk sneller resultaten te genereren en vereist slechts één transfectie, kon teeltduurverlenging worden verlengd om verdere toename van IL-17A productie. Een langere kweek kan zelfs nodig zijn om een ​​optimale differentiatie van andere primaire T-cel subsets te bereiken. Aangezien deze transfecties van voorbijgaande aard zijn, kunnen meerdere transfecties na verloop van tijd voor langere cultuur periodes nodig zijn. Wij stellen voor het aanvullen van kleine RNA reagentia na ongeveer 3 dagen door het opnieuw electroporating de cellen met de reagens tot verwatering over meerdere celdelingen te voorkomen. We hebben dit routinematig gedaan voor muizen CD4 + T-cellen. Hoewel het meer technisch uitdagende, omdat de cellen in elke conditie moeten worden verzameld en afzonderlijk geteld, de transfectie is succesvol en er zijn minimale effecten op de levensvatbaarheid van de cellen.

In deze experimenten, menselijke Th17 cellen weopnieuw gegenereerd via in vitro kweek van menselijke navelstrengbloed. Belangrijker is dat een alternatief voor deze differentiatie assay voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te gebruiken. Voor zowel CBMCs en PBMC's, is het nodig om CD4 + T-cellen voor het begin van de kweek te isoleren. We presenteren hier onze methode voor het zuiveren van CD4 + T-cellen door negatieve selectie, die robuust transfectie-efficiëntie opgeleverd, maar we verwachten dat andere methoden voor het bereiden van primaire menselijke CD4 + T-cellen zou even goed werken. We hebben verschillende kits die positieve of negatieve selectie te gebruiken voor de isolatie van de muis CD4 + T-cellen en beide methoden hebben geresulteerd in soortgelijke transfectie-efficiëntie geprobeerd. Een additionele overweging is het belangrijk is om naïeve T-cellen om optimaal te differentiëren in Th17 cellen. Met menselijke navelstrengbloed is voordelig om deze reden omdat het reeds een hoger percentage van naïeve T-cellen pkwalijk en daarom is het niet nodig om te sorteren of pre-verrijken naïeve T-cellen voorafgaand aan de start van de cultuur. Echter, een duidelijk nadeel van deze aanpak is de beperkte beschikbaarheid van navelstrengbloed. Alternatief sorteren van naïeve T-cellen van PBMC 14 kan worden uitgevoerd voorafgaand aan cultuur aangezien deze bron is beschikbaar, hoewel grote hoeveelheden moeten worden verkregen.

Hoewel er meerdere werkwijzen voor het transfecteren van zoogdiercellen, primaire T-cellen vaak moeilijker celtype te transfecteren. Next generation elektroporatie is een succesvolle fysische methode van tijdelijke transfectie van T-cellen die technisch eenvoudig uit te voeren en is reproduceerbaar. Eenmaal geoptimaliseerd, het heeft een zeer hoge efficiëntie van transfectie voor kleine RNAs die 100% benadert. Dit is te zien in figuur 2, waarbij de gehele unimodale populatie van CD45 + cellen (figuur 2A) en het population alle cellen die RORγt (figuur 2B) voor een lager expressieniveau. Belangrijk is dat optimale transfectie met kleine RNAs niet cellevensvatbaarheid compromitteren. We routinematig nemen meer dan 70% levensvatbaarheid na transfectie met kleine RNA's (figuur 1D). Hoewel levensvatbaarheid is geen probleem met dit protocol, de biologie van andere T-cel kenmerken, zoals cytokineproductie kan worden beïnvloed na transfectie met kleine RNAs. Daarom is het uiterst belangrijk om een ​​chemische aangepaste kleine RNA besturingselement in elk experiment.

We geoptimaliseerd beide elektroporatie parameters, hartslag en spanning voor het minimaliseren van celdood en maximale transfectie-efficiëntie. Hogere spanningen toenemen celdood tijdens transfectie. Enkele andere technische overwegingen om celdood te voorkomen en te zorgen voor een succesvolle transfectie onder minimaliseren van de hoeveelheid synthetische reagentia die gebruikt worden en het beperken van de tijd betwee n celpreparaat en elektroporatie. Geringe concentraties noodzakelijk synthetisch transfectie reagentia moeten altijd worden gebruikt om potentiële T-cel-toxiciteit en off-doeleffecten voorkomen. Reducerende cellen voorbereidingstijd voor transfectie om het tijdstip van cellen in transfectiebuffer minimaliseren bij kamertemperatuur cruciaal en kan worden bereikt door het bereiden van cellen in batches, indien nodig.

Momenteel zijn er twee commercieel verkrijgbare volgende generatie elektroporatie instrumenten. Beide systemen efficiënt kunnen transfecteren primaire T-cellen. Dit protocol werd geoptimaliseerd met het Neon transfectiesysteem. Hoewel dit transfectie systeem is meer kosteneffectief, de Amaxa systeem biedt uniek een 96-wells-adapter voor elektroporatie voor een hogere verwerkingscapaciteit. We hopen dat er extra commerciële ontwikkelingen zal blijven om de doorvoer en efficiëntie van deze transfectie systemen te vergroten, terwijl de kosten tot een minimum.

"> Nieuwe generatie elektroporatie van humane T-cellen op efficiënte kleine RNA's zoals siRNAs tegen doelgenen plaats voeren als geïllustreerd in dit protocol en miRNA nabootst of remmers. Het hoge rendement maakt het onnodig markers voor transfectie gebruikt aangezien bijna elke cel getransfecteerd met kleine RNAs. Dit in tegenstelling tot de transfectie van primaire T-cellen met DNA-plasmiden waarin typische plasmide transfecties resulteren in slechts 20-30% expressie van het merker-gen met meer dan 50% toxiciteit die toeneemt met toenemende hoeveelheden plasmide. Introductie synthetische nabootsers deze methode is toegestaan tientallen genen te screenen op functie in T-celbiologie parallel zonder dat voor moleculaire klonering 12, 13. het is ook mogelijk het testen van de functie van miRNAs door T-cellen tot expressie parallel 11 , 13. Met dit protocol, Dit soort matige throughput schermen zijn van toepassing op menselijke T-cellen. Met name werd deze techniek onlangs gebruikt om kleine RNA (gRNA) -Cas9 ribonucleoproteïne complexen in primaire menselijke T-cellen te introduceren genoom bewerking 15. Deze uiteenlopende toepassingen benadrukken het nut, flexibiliteit en kracht van het protocol hier gepresenteerd als een belangrijk instrument voor immunologen op zoek naar T-cel biologie studeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28, (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27, (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14, (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47, (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8, (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10, (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40, (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15, (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35, (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15, (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44, (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), 10437-10442 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats